145
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN JAMU SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh: Sugiarto Adji Soenarso NIM: 108114020 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI · FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • Upload
    others

  • View
    20

  • Download
    1

Embed Size (px)

Citation preview

OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN

JAMU

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Sugiarto Adji Soenarso

NIM: 108114020

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN

JAMU

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Sugiarto Adji Soenarso

NIM: 108114020

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

Persetujuan Pembimbing

OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN

JAMU

Skripsi yang diajukan oleh:

Sugiarto Adji Soenarso

NIM: 108114020

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. Tanggal…………………………..

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

Pengesahan Skripsi Berjudul

OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN

JAMU

Oleh:

Sugiarto Adji Soenarso

NIM: 108114020

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal…………………………….

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Aris Widayati, M.Si., Apt. PhD.

Panitia Penguji Tanda tangan:

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ……………………

2. Jeffry Julianus, M.Si. ……………………

3. F. Dika Octa Riswanto, M.Sc. ……………………

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Jangan pernah menganggap belajar sebagai suatu

kewajiban, tetapi anggaplah ia sebagai suatu kesempatan

menyenangkan untuk membebaskan diri dalam mempelajari

alam dan kehidupan. Belajar adalah untuk kebahagiaanmu

sendiri dan akan memberikan keuntungan bagi masyarakat

tempatmu bekerja nanti – Albert Einstein

Kita hidup dalam dunia yang penuh dengan keindahan dan

petualangan. Tidak ada akhir dari petualangan-

petualangan yang dapat kita jalani hanya jika kita

mencari petualangan-petualangan baru dengan mata yang

terbuka – Jawaharlal Nehru

Orang-orang serius hanya punya ide-ide terbatas.

Orang-orang yang punya banyak ide tidak pernah serius

– Paul Vallery

Iman akan Allah tidak memberikan solusi instan atas

semua persoalan dan ketidakpastian hidup, tetapi

melengkapi kita untuk mengatasinya – Daniel Louw

Karya ini kudedikasikan untuk orang tuaku, adikku,

kekasihku, teman-temanku, dan almamaterku.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini

tidak memuat karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan

daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarism dalam naskah ini,

maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 7 Januari 2015

Penulis

Sugiarto Adji Soenarso

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertandatangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata

Dharma:

Nama : Sugiarto Adji Soenarso

NIM :108114020

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN

JAMU

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di internet atau media lain

untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini yang mana saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal:

Yang menyatakan

(Sugiarto Adji Soenarso)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vii

PRAKATA

Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya

dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi

Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet dan Jamu”. Skripsi ini disusun guna

memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program

Studi Farmasi (S.Farm).

Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan

berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Apt. PhD. selaku Dekan dan segenap staf serta

karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam

proses penyusunan skripsi ini.

3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan

saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.

4. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Penguji skripsi yang

telah memberikan saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.

5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.Si., Apt. atas bantuannya untuk membantu

penulis mendapatkan senyawa baku dan waktu yang diluangkan untuk

memberikan masukan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

viii

6. PT IFARS Solo yang telah memberikan baku kepada penulis untuk penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini.

7. Phebe Hendra, M.Si., Apt., Ph.D. selaku dosen pembimbing akademik atas

pendampingan dan perhatiannya terhadap perkembangan saya selama

perkuliahan ini.

8. Dewi Setyaningsih dan Sanjaya, M.Si. atas bantuan selama menghadapi

masalah dalam penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan

selama kuliah.

9. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

atas ilmu, pengalaman, semangat, dan persahabatan yang telah dibagikan.

10. Mas Bimo, Mas Kunto, dan Pak Parlan yang telah banyak membantu selama

penelitian di laboratorium.

11. Keluarga tercinta Papa, Mama, dan Sugeng terima kasih atas dukungan doa

yang selalu tulus untukku yang membuatku berani bangkit lagi di kala

terpuruk.

12. Keluarga Papa dan Mama yang selalu mendoakan segala perjuanganku.

13. Ria Kusuma Dewi dan Meta Kartika Sari teman seperjuangkanku yang telah

dengan sabar menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan

menyemangati aku selama masa-masa terpuruk di lab.

14. Kawan-kawan seperjuangan di lab: Bakti, Naomi, Kezia, Ita atas kerja sama

dan kebersamaan, dukungan dan keceriaan di lab selama penelitian ini.

15. Fr. B. Aris Ferdinan, SCJ yang selalu menyemangati penulis saat penulis

merasa terpuruk dalam menyelesaikan skripsi ini.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ix

16. Jo dan Nety atas bantuannya yang mau membantu aku saat aku bertanya

tentang skripsiku ini.

17. Agatha Herny Sekar Natalia untuk momen-momen kebersamaan kita dan

terima kasih buat dukungan dan doa serta semangat yang diberikan.

18. Teman-teman FST dan FKK 2010 yang selalu memberi bantuan, dukungan,

dan berbagi keceriaan untuk selesainya skripsi ini.

19. Teman-teman KKN terima kasih atas keluangan waktu untuk bersama pergi

sejenak dari penatnya skripsi.

20. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini baik

dalam bentuk doa, semangat yang menyertai penulis dari awal penelitian

sampai penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan

dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu

penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir

kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.

Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi

PRAKATA .............................................................................................. vii

DAFTAR ISI ........................................................................................... x

DAFTAR TABEL ................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xvii

INTISARI ................................................................................................ xix

ABSTRACT .............................................................................................. xx

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................ 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

1. Permasalahan .................................................................................. 4

2. Keaslian penelitian.......................................................................... 5

3. Manfaat penelitian .......................................................................... 5

B. Tujuan ................................................................................................. 6

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ....................................................... 7

A. Obat Tradisional .................................................................................. 7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xi

B. Jamu.................................................................................................... 8

C. Asam Urat ........................................................................................... 9

D. Alopurinol ........................................................................................... 10

1. Sifat fisika kimia ............................................................................. 10

2. Dosis .............................................................................................. 10

3. Peringatan dan pencegahan ............................................................. 11

4. Efek samping .................................................................................. 11

5. Penetapan kadar ............................................................................. 11

E. Ekstraksi ............................................................................................. 12

F. Solid Phase Extraction (SPE) .............................................................. 12

1. Prosedur SPE .................................................................................. 12

2. Pengembangan metode ................................................................... 14

G. Spektrofotometri UV ........................................................................... 15

1. Transisi sigma–sigma star (σ → σ*) ................................................ 16

2. Transisi non bonding elektron–sigma star (n → σ*) ........................ 16

3. Transisi n → π* dan transisi π → π* ............................................... 17

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ........................... 19

I. Landasan Teori .................................................................................... 26

J. Hipotesis ............................................................................................. 28

BAB III METODE PENELITIAN ........................................................... 29

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 29

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ....................................... 29

1. Variabel .......................................................................................... 29

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xii

2. Definisi operasional ........................................................................ 29

C. Bahan Penelitian.................................................................................. 30

D. Alat Penelitian ..................................................................................... 30

E. Tata Cara Penelitian ............................................................................ 31

1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan

spektrofotometri UV ....................................................................... 31

2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE ............................................ 33

3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X ............ 34

4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan

HPLC ............................................................................................. 37

5. Validasi metode clean up SPE MCX ............................................... 40

6. Penggunaan kembali SPE MCX ...................................................... 42

F. Analisis Hasil ...................................................................................... 43

1. Analisis hasil optimasi penyaringan dengan spektrofotometri UV ... 43

2. Analisis hasil optimasi clean up yang dilanjutkan dengan HPLC .... 43

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 44

1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan

spektrofotometri UV ....................................................................... 44

2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE ............................................ 50

3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X ............ 52

4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan

HPLC ............................................................................................. 66

5. Validasi metode clean up SPE MCX ............................................... 69

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xiii

6. Penggunaan kembali SPE MCX ...................................................... 73

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................... 77

A. Kesimpulan ......................................................................................... 77

B. Saran ................................................................................................... 77

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 78

LAMPIRAN ............................................................................................ 82

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 124

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity

beberapa pelarut HPLC .......................................................... 22

Tabel II. Optimasi loading sampel dan volume eluen SPE MCX .......... 35

Tabel III. Pengulangan pencucian SPE .................................................. 42

Tabel IV. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet .............................. 45

Tabel V. Hasil bobot alopurinol, SD, dan % CV ................................... 49

Tabel VI. Optimasi kapasitas kolom ...................................................... 56

Tabel VII. Optimasi volume eluen .......................................................... 60

Tabel VIII. Tabel tR dan AUC hasil ekstraksi cair-cair ............................ 65

Tabel IX. Perbandingan tR dan AUC blanko dan sampel adisi ............... 68

Tabel X. Hasil perolehan kembali dan CV ............................................ 71

Tabel XI. Perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat

konsentrasi analit ................................................................... 72

Tabel XII. CV yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit

berdasarkan AOAC PVM ...................................................... 72

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur alopurinol .............................................................. 10

Gambar 2. Proses skematik prosedur SPE ............................................. 13

Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik........................................ 16

Gambar 4. (A) Pengaruh pelarut polar terhadap transisi π → π*

(B) Transisi n → π* ............................................................. 18

Gambar 5. Dasar pemisahan kromatografi partisi .................................. 20

Gambar 6. Diagram sistem HPLC secara umum ................................... 20

Gambar 7. Skema sampler KCKT. (A) – posisi load, sampel diinjeksikan

dan terisolasi dari fase gerak. (B) – posisi inject, sampel

terbawa fase gerak dan memasuki kolom ............................ 24

Gambar 8. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH ........................ 46

Gambar 9. Perubahan warna indicator fenolftalein dari bening menjadi

pink ..................................................................................... 46

Gambar 10. Hasil standarisasi NaOH dengan menggunakan kalium

biftalat ................................................................................. 47

Gambar 11. Kromatogram hasil ekstraksi cair-cair sampel blanko

(A) replikasi 1 (B) replikasi 2 .............................................. 51

Gambar 12. Interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE ................ 54

Gambar 13. Kromatogram alopurinol dalam fraksi asam asetat setelah

proses pencucian SPE .......................................................... 56

Gambar 14. Kurva hubungan volume loading ekstrak VS AUC .............. 57

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xvi

Gambar 15. Kromatogram alopurinol pada optimasi kapasitas kolom

SPE MCX (A) 500 μL (B) 750 μL (C) 1000 μL (D) baku

alopurinol dengan fase gerak metanol : aquabidest/amonium

hidroksida 0,1% (10:90) ...................................................... 57

Gambar 16. Kurva hubungan volume eluen VS AUC ............................. 60

Gambar 17. Kromatogram alopurinol pada optimasi volume eluen

(A) 5 mL (B) 7.5 mL (C) 12.5 mL yang dilakukan dengan

mengelusi 10 mL (C1) dan dilanjutkan dengan elusi 2.5 mL (C2)

(D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :

aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90) ..................... 61

Gambar 18. Reaksi pembentukkan garam alopurinol .............................. 63

Gambar 19. Reaksi pembentukkan ion alopurinol ................................... 64

Gambar 20. Kromatogram alopurinol hasil ekstraksi cair-cair dengan variasi

pengulangan penambahan kloroform (A) 2x3 mL (B) 3x3 mL

(C) 4x3 mL dengan fase gerak HPLC metanol : aquabidest/

amonium hidroksida 0,1% (10:90) ....................................... 64

Gambar 21. Perbandingan puncak (A) puncak baku alopurinol (B1 dan B2)

puncak blanko dan sampel alopurinol yang sudah ditambahkan

dengan baku alopurinol dalam 3 level konsentrasi ............... 67

Gambar 22. Kromatogram alopurinol hasil clean up dengan menggunakan

SPE bekas yang sudah diuji (A) 1x (B) 2x (C) 3x dengan fase

gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90) 74

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol ................................... 83

Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX ........................................... 84

Lampiran 3. Penimbangan keseragaman bobot tablet alopurinol ......... 85

Lampiran 4. Penimbangan sampel A tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot ......................................................... 86

Lampiran 5. Penimbangan sampel B tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot ......................................................... 87

Lampiran 6. Penimbangan sampel C tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot ......................................................... 88

Lampiran 7. Penimbangan kalium biftalat ........................................... 89

Lampiran 8. Standarisasi NaOH 0.1 N ................................................ 89

Lampiran 9. Gambar hasil pembakuan NaOH 0.1 N ........................... 89

Lampiran 10. Perhitungan penimbangan sampel tablet alopurinol ......... 90

Lampiran 11. Penimbangan optimasi penyaringan ................................ 90

Lampiran 12. Bobot alopurinol, SD dan %CV hasil .............................. 91

Lampiran 13. Penimbangan sampel tanpa SPE...................................... 91

Lampiran 14. Kromatogram sampel tanpa SPE ..................................... 92

Lampiran 15. Penimbangan optimasi kapasitas kolom SPE ................... 93

Lampiran 16. Kromatogram optimasi kapasitas kolom SPE .................. 94

Lampiran 17. Tabel optimasi kapasitas kolom SPE ............................... 100

Lampiran 18. Penimbangan optimasi volume eluen SPE ....................... 100

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xviii

Lampiran 19. Kromatogram optimasi volume eluen SPE ...................... 101

Lampiran 20. Tabel optimasi volume eluen SPE ................................... 105

Lampiran 21. Penimbangan optimasi volume kloroform ....................... 106

Lampiran 22. Kromatogram optimasi volume kloroform ...................... 107

Lampiran 23. Penimbangan baku untuk validasi SPE ............................ 110

Lampiran 24. Penimbangan sampel untuk validasi SPE ........................ 110

Lampiran 25. Kromatogram validasi SPE ............................................. 111

Lampiran 26. Hasil recovery dan % CV validasi SPE ........................... 119

Lampiran 27. Penimbangan baku untuk pencucian SPE ........................ 120

Lampiran 28. Kromatogram hasil pencucian SPE ................................. 120

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xix

INTISARI

Telah dilakukan penelitian tentang alopurinol dalam sampel obat, matriks

biologis dan penelitian BKO dalam sediaan jamu sebelumnya pernah dilakukan

dengan menggunakan sampel metampiron. Penelitian ini ingin mengetahui

optimasi isolasi alopurinol dalam sampel tablet dan jamu untuk mengurangi

berbagai matriks yang terdapat dalam sampel tablet dan jamu sehingga dapat

digunakan untuk determinasi alopurinol. Optimasi isolasi dilakukan dengan

optimasi penyaringan, ektraksi cair-cair dan Solid Phase Extraction (SPE).

Pada sampel tablet isolasi alopurinol dilakukan dengan penyaringan dan

dideterminasi dengan metode Spektrofotometri UV karena alopurinol memiliki

gugus kromofor dan auksokrom, sedangkan pada sampel jamu isolasi alopurinol

dilakukan dengan clean up yang meliputi ekstraksi cair-cair dan Solid Phase

Extraction (SPE) dan dideterminasi dengan metode High Performance Liquid

Chromatography (HPLC).

Pada sampel tablet, volume penyaringan yang digunakan 10 mL x 2.

Pada sampel jamu, volume kloroform yang digunakan pada ekstraksi cair-cair

adalah 3x3 mL, pada SPE volume loading sampel yang digunakan adalah 1000

µL, volume eluen yang digunakan adalah 10 mL amonium hidroksida 5% dalam

metanol. Kondisi tersebut merupakan kondisi optimal dalam isolasi alopurinol

dari sampel tablet dan jamu.

Kata kunci : alopurinol, jamu, tablet, BKO, ekstraksi, clean up, SPE, HPLC,

Spektrofotometri UV.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xx

ABSTRACT

There had been research on allopurinol in drug samples, biological

matrix and BKO research in herbal preparations using sample methampyrone.

This research investigates the optimal isolation of allopurinol in tablet and herbal

samples to reduce the matrix contained in tablet and herbal samples, so later they

can be used for the determination of allopurinol. Isolation optimization is done

with filtration optimization, liquid-liquid extraction and Solid Phase Extraction

(SPE).

In tablet samples, allopurinol isolation was performed by filtration and

determined by UV spectrophotometry method because allopurinol has a

chromophore and auxochrome group, whereas the allopurinol isolation of herbal

samples performed with clean up that includes liquid-liquid extraction and Solid

Phase Extraction (SPE) and determined by the High Performance Liquid

Chromatography (HPLC).

In tablet samples, the filtration volume used was 10 mL x 2. In herbal

samples, the volume of chloroform used in liquid-liquid extraction is 3x3 mL, at

SPE sample loading volume used was 1000 mL, while the volume of eluent used

was 10 mL ammonium hydroxide 5% in methanol. This condition is the optimal

condition in allopurinol isolation from tablet and herbal samples.

Keywords: allopurinol, herbal samples, tablets, BKO, extraction, clean-up, SPE,

HPLC, Spectrophotometry UV.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Akhir-akhir ini kesadaran masyarakat akan kesehatan semakin

meningkat, itu terlihat dari usaha masyarakat untuk mencegah penyakit baik

secara modern maupun tradisional. Pada sebagian masyarakat, usaha untuk

mencegah penyakit masih menggunakan cara tradisional. Selain itu

kecenderungan masyarakat untuk kembali ke alam (back to nature) yang dalam

beberapa hal lebih menguntungkan jika dibandingkan dengan pengobatan dengan

obat sintetik atau obat modern, membuat penggunaan obat tradisional semakin

meningkat. Selain itu, harga obat tradisional juga lebih terjangkau dibandingkan

dengan obat sintetik. Obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang

berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik)

atau campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan

untuk pengobatan, dan dapat diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku di

masyarakat (PerMenKes, 2012).

Obat tradisional telah digunakan selama ribuan tahun dengan kontribusi

besar yang dibuat oleh praktisi kesehatan manusia, khususnya sebagai penyedia

perawatan kesehatan primer di tingkat masyarakat. TM (Traditional Medicine)

telah mempertahankan popularitasnya di seluruh dunia. Sejak tahun 1990-an

penggunaannya telah meningkat di banyak negara maju dan berkembang

(Anonimb, 2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2

Produk obat tradisional yang telah banyak digunakan oleh masyarakat

adalah jamu. Banyak masyarakat minum jamu untuk mencegah penyakit tertentu

karena mudah penggunaannya dan harganyapun juga terjangkau oleh masyarakat.

Selama beberapa tahun terakhir, penggunaan obat tradisional di dunia semakin

meningkat. Menurut WHO, 65-80% populasi dunia menggunakan obat tradisional

sebagai perlindungan untuk kesehatan (Yee, 2003).

Namun banyak kendala yang terjadi pada produk sediaan jamu seperti,

pengolahan bahan baku yang belum terstandar terutama mutu dan kualitasnya,

serta industri jamu yang tidak jujur sering kali menambahkan bahan kimia obat

(BKO) ke dalam jamu sehingga menimbukan efek yang merugikan.

Karena tidak semua bahan baku untuk jamu dibudidayakan dengan baik

dan benar sehingga seringkali tanaman obat tertentu hilang di pasaran karena

ketidaktersediaan bahan baku yang dibutuhkan. Kurangnya penelitian ilmiah

mengenai keefektifan dari jamu dan juga efek samping yang ditimbulkan melalui

uji praklinis dan uji klinis oleh pihak terkait.

Dampak lain yang menyebabkan efek samping yang merugikan dari

penggunaan obat tradisional adalah penambahan bahan kimia obat (BKO) tanpa

takaran yang jelas sehingga dapat membahayakan bagi kesehatan konsumen

terlebih lagi apabila obat yang ditambahkan tergolong dalam obat keras yang

penggunaanya harus dengan resep dokter. Penggunaan BKO pada sediaan obat

tradisional sangat dilarang sesuai dengan Keputusan Kepala Badan POM No.

HK.00.05.41.1384 tahun 2005.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3

Menurut PerMenKes RI no. 007 tahun 2012 obat tradisional tidak boleh

mengandung bahan kimia obat atau hasil sintesis yang berkhasiat sebagai obat.

BKO yang biasanya ditambahkan dalam sediaan obat tradisional antara lain

parasetamol (menghilangkan rasa sakit), fenilbutazon (mengatasi rematik dan

menyegarkan tubuh), natrium diklofenak (mengatasi rematik), sildenafil sitrat

(mengatasi disfungsi ereksi dan meningkatkan libido), sibutramin HCl

(melangsingkan tubuh), dan alopurinol (menghilangkan asam urat).

Banyak masyarakat menggunakan obat modern untuk menyembuhkan

penyakit yang mana pada obat modern dosis obatnya sudah diketahui secara pasti

karena melihat bahaya jamu yang ditambahkan BKO. Salah satu penyakit yang

biasa dialami oleh sebagian masyarakat adalah asam urat, sehingga banyak

masyarakat menggunakan obat asam urat yaitu alopurinol untuk menyembuhkan

asam urat.

Menurut Depkes RI (1974), metode baku analisis alopurinol dilakukan

dalam sampel tablet dan diukur secara spektrofotometri UV. Pada sampel tablet

memiliki matriks yang lebih sederhana, oleh karena itu untuk dapat mengisolasi

alopurinol dari matriks dapat dilakukan dengan menggunakan penyaringan. Pada

penelitian ini dilakukan pengembangan metode analisis alopurinol dalam sampel

jamu.

Pada sampel jamu memiliki matriks yang lebih kompleks daripada dalam

sampel tablet, maka untuk mengisolasi alopurinol dari matriks jamu diperlukan

metode clean up yaitu dengan menggunakan ekstraksi cair-cair dan Solid Phase

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

4

Extraction (SPE) serta dilanjutkan dengan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC).

Metode clean up alopurinol dalam jamu dengan ekstraksi cair-cair dan

Solid Phase Extraction (SPE) diperlukan optimasi. Pada optimasi ekstraksi cair-

cair dilakukan dengan mengubah komposisi volume kloroform, sedangkan pada

optimasi SPE dilakukan dengan mengubah komposisi volume loading ekstrak dan

volume eluen.

Penelitian ini merupakan bagian dari serangkaian penelitian yang

meliputi “Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam Matriks

Tablet Obat Secara Spektrofotometri UV dan Matriks Sampel Jamu Asam Urat

Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” dan “Validasi Metode Analisis

Alopurinol Dalam Matriks Tablet Secara Spektrofotometri dan Matriks Jamu

Asam Urat Secara KCKT Fase Terbalik serta Aplikasinya.”

Sejauh penelusuran literatur oleh penulis penelitian tentang penetapan

kadar alopurinol dalam jamu belum pernah dilakukan, sedangkan untuk penelitian

bahan BKO lain seperti parasetamol dan fenilbutason sudah banyak dilakukan dan

penelitian alopurinol dalam matriks biologis menggunakan metode cation

exchange chromatography sudah pernah dilakukan. Untuk penelitian alopurinol di

dalam tablet sudah pernah dilakukan.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang maka timbul permasalahan yaitu bagaimana

optimasi proses isolasi alopurinol dalam sediaan tablet secara spektrofotometri

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5

UV dan isolasi alopurinol dalam sediaan jamu asam urat dengan menggunakan

SPE MCX yang dilanjutkan dengan HPLC fase terbalik?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran literatur, penelitian terhadap alopurinol telah

dilakukan dalam suatu obat. Namun penelitian sejenis yaitu penetapan kadar

bahan kimia obat metampiron dalam jamu yang pernah dilakukan oleh

Mayasari (2009), penelitian tentang alopurinol dalam metabolit biologis

dengan cation exchange chromatography pernah dilakukan oleh Sweetman dan

Nyhan (1969), dan penelitian tentang alopurinol dalam tablet secara

spektrofotometer menggunakan CT Complex pernah dilakukan oleh Refat, dkk

(2010). Demikian, maka dapat dipastikan bahwa perbandingan optimasi

metode analisis secara HPLC dan Spektrofotometri UV alopurinol dalam jamu

asam urat dan dalam sediaan tablet belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi mengenai optimasi isolasi alopurinol dalam sediaan tablet secara

spektrofotometer UV dan isolasi alopurinol dalam jamu asam urat dengan

menggunakan SPE MCX yang dilanjutkan dengan HPLC.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

terkait komposisi volume penyaringan, komposisi volume ekstraksi,

komposisi loading sampel, komposisi eluen SPE yang terbaik untuk proses

isolasi alopurinol dalam sediaan tablet dan dalam jamu asam urat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

6

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui proses optimasi isolasi alopurinol

dalam sediaan tablet dan dalam jamu asam urat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Obat Tradisional

Obat tradisional adalah bahan atau ramuan yang berupa bahan tumbuhan,

bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan

tersebut yang secara turun-temurun telah digunakan untuk pengobatan dan dapat

diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku di masyarakat (PerMenKes RI No.

007 Tahun 2012).

Sediaan obat tradisional ini perlu dilakukan berbagai jenis pengujian

untuk mengetahui mutu dari sediaan obat tradisional yang akan diproduksi. Jenis

pengujian ini meliputi pengujian mutu dan pengujian keamanan. Pengujian mutu

meliputi organoleptik, kemasan, makroskopis, kebenaran simplisia, kadar air dan

keseragaman bobot. Pengujian keamanan meliputi uji cemaran logam berat,

cemaran pestisida, cemaran mikroba, zat tambahan yang diizinkan seperti bahan

pengawet, cemaran aflatoksin dan penetapan ada tidaknya bahan kima obat yang

ditambahkan dalam sediaan obat tradisional (KepMenKes RI no

661/MENKES/SK/VII/1994).

Menurut Keputusan Badan POM RI No. 00.05.4.2411 tahun 2004,

berdasarkan cara pembuatan serta klaim penggunaan dan tingkat pembuktian

khasiat, Obat Bahan Alam Indonesia dikelompokkan menjadi 3 jenis yaitu:

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

8

1. Jamu (obat tradisional warisan nenek moyang).

2. Obat Herbal Terstandar (telah dikembangkan berdasarkan bukti-bukti ilmiah,

uji praklinis dan standarisasi bahan baku).

3. Fitofarmaka (telah melewati uji klinis dan standariasasi bahan baku).

B. Jamu

Jamu merupakan obat tradisional warisan nenek moyang yang dapat

dibedakan menjadi 2 yaitu obat dalam dan obat luar. Obat dalam biasa dijumpai

dalam bentuk herbal kering siap rebus, dalam bentuk segar rebusan dalam bentuk

jamu gendong, dalam bentuk serbuk kering siap seduh. Obat luar bisa

dimanfaatkan dengan cara dioles, digosok, direndam atau ditempel (Harmita,

2006).

Menurut PerMenKes No. 003 Tahun 2010, jamu harus memenuhi

kriteria:

1. Aman sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan.

2. Klaim khasiat dibuktikan berdasarkan data empiris.

3. Memenuhi persyaratan mutu yang berlaku.

Menurut Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun

2005 di dalam jamu dilarang digunakan:

1. Bahan kimia hasil isolasi atau sintetik yang berkhasiat obat.

2. Narkotika atau psikotropika.

3. Hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan

perundang-undangan yang berlaku.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9

Persyaratan mengenai jamu belum begitu mantap dan tegas, namun

pemerintah telah mengeluarkan beberapa petunjuk yaitu:

1. Kadar air tidak lebih dari 10%. Ini untuk mencegah berkembangnya bakteri,

kapang, dan khamir.

2. Jumlah kapang dan khamir tidak lebih dari 10000

3. Jumlah bakteri non patogen tidak lebih dari 1 juta

4. Bebas dari bakteri patogen

5. Tidak boleh tercemar atau diselundupi bahan kimia berkhasiat (Harmita, 2006).

C. Asam Urat

Asam urat merupakan senyawa kimia hasil akhir dari metabolism nucleic

acid atau metabolisme purin dalam tubuh. Berdasarkan penyelidikan bahwa 90%

dari asam urat merupakan hasil katabolisme purin yang dibantu oleh enzim

guanase dan xanthine oksidase (Suhendi, Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna, 2011).

Asam urat akan dibawa ke ginjal melalui aliran darah untuk dikeluarkan

bersama air seni. Ginjal akan mengatur kadar asam urat dalam darah agar selalu

dalam keadaan normal. Namun, asam urat yang berlebihan tidak akan tertampung

dan termetabolisme seluruhnya oleh tubuh, maka akan terjadi peningkatan kadar

asam urat dalam darah (Suhendi, Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna, 2011).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

10

D. Alopurinol

Gambar 1. Struktur alopurinol (1H-Pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ol)

(DepKesehatan RI, 1995)

1. Sifat fisika kimia

Alopurinol mengandung tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari

101,0% C5H4N4O dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian

berupa serbuk halus putih hingga hampir putih dan berbau lemah. Alopurinol

sangat sukar larut dalam air dan etanol, larut dalam larutan kalium dan natrium

hidroksida, praktis tidak larut dalam kloroform dan dalam eter (DepKes RI,

1995).

2. Dosis

Pada dewasa, dosis harian rata-rata adalah 2-10 mg/kgBB, 100-200 mg

untuk kondisi ringan, 300-600 mg untuk kondisi cukup parah dan 700-900 mg

untuk kondisi parah (Apotex NZ Ltd, 2011).

Pada anak-anak, dosis harian rata-rata adalah 10-20 mg/kgBB sampai

maksimal 400 mg per hari. Penggunaan pada anak-anak jarang diindikasikan

kecuali dalam kondisi tertentu dan gangguan enzim tertentu (Apotex NZ Ltd,

2011).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

11

3. Peringatan dan pencegahan

Hati-hati pemberian pada penderita yang hipersensitif dan wanita hamil.

Hindari penggunaan pada penderita dengan gagal ginjal atau penderita

hiperurisemia asimptometik. Hentikan pengobatan dengan alopurinol bila

timbul kulit kemerahan atau demam. Penggunaan jangka panjang dapat

menyebabkan katarak. Selama pengobatan dianjurkan melakukan pemeriksaan

mata secara berkala, hentikan pengobatan jika terjadi kerusakan lensa mata.

Penggunaan pada wanita hamil, hanya bila ada pertimbangan manfaat

dibandingkan resikonya. Alopurinol dapat meningkatkan frekuensi serangan

artritis gout akut sehingga sebaiknya obat antiinflamasi atau kolkisin diberikan

bersama pada awal terapi. Hati-hati bila diberikan bersama dengan vidarabin

(DechaCare, 2014).

4. Efek samping

Reaksi hipersensitifitas: ruam mokulopapular didahului pruritus,

urtikaria, eksofoliatif dan lesi pupura, dermatitis, nefritis, faskulitis dan

syndrome poliartrtis. Demam, eosinophilia, kegagalan hati dan ginjal, mual,

muntah, diare, rasa mengantuk, sakit kepala dan rasa logam (DechaCare,

2014).

5. Penetapan kadar

Alopurinol dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan

spektrofotometer UV dengan panjang gelombang kurang lebih 250 nm.

Alopuriol dilarutkan dalam NaOH 0,4% b/v dan HCl 1% v/v (DepKes RI

1974).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

12

E. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu

campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent

(Harborne, 1987). Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat

dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung

simplisia (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986).

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).

F. Solid Phase Extraction (SPE)

1. Prosedur SPE

Ada dua strategi untuk melakukan penyiapan sampel menggunakan SPE

ini. Strategi pertama adalah dengan melakukan pemilihan pelarut yang mampu

menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara

untuk senyawa - senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang

tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut

organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini beramanfaat

jika analit yang dituju berkadar rendah. Strategi lain adalah dengan

mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara untuk

senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2010).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

13

Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan

penjerap dengan pelarut yang sesuai. Penjerap nonpolar seperti C18 dan

penjerap penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol

lalu dengan akuades. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi

recovery analit. Penjerap - penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika

harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida (Gandjar dan

Rohman, 2010).

Gambar 2. Proses skematik prosedur SPE (Wells, M.J.M., 2000)

Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:

a. Pengkondisian

Kolom (cartridge) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi

permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga

perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel

dimasukkan dapat dihindari.

Conditioning Loading Washing Elution

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

14

b. Retensi (tertahannya) sampel

Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang

diharapakan, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan

komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang diharapkan terelusi.

c. Pembilasan

Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak

tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi

Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang

dikehendaki jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Gandjar dan

Rohman, 2010).

2. Pengembangan metode

Pendekatan empirik untuk melakukan pengembangan metode SPE

melibatkan screening penjerap yang tersedia. Langkah pertama adalah

menetukan penjerap mana yang paling baik dalam hal menahan analit yang

dituju. Pertimbangan kedua adalah pelarut apa yang dibutuhkan untuk

mengelusi analit yang dituju. Langkah ketiga adalah menguji matriks sampel

blanko untuk mengevaluasi adanya pengganggu yang mungkin ada, dan

akhirnya (langkah keempat) adalah menentukan recovery dengan menambah

analit dalam jumlah tertentu harus dilakukan (Gandjar dan Rohman, 2010).

Polaritas pelarut yang meningkat dibutuhkan untuk mengelusi senyawa

yang tertahan dalam penjerap silika, sementara unutk senyawa yang tertahan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

15

dalam penjerap nonpolar (seperti C18) digunakan pelarut nonpolar (Gandjar dan

Rohman, 2010).

G. Spektrofotometri UV

Spektrofotometeri UV merupakan salah satu teknik analisis spektroskopik

yang menggunakan radiasi elektromagnetik UV dekat dengan menggunakan alat

spektrofotometer (Skogg, West dan Holler, 1994). Radiasi elektromagnetik pada

daerah UV dan visibel biasanya ditulis dalam satuan nanometer. Ketika sampel

mengabsorbsi radiasi elektromagnetik (foton), terjadi perubahan energi pada

sampel tersebut. Energi yang diserap mempunyai hubungan terhadap Persamaan

Planck (Harvey, 2000).

Molekul yang dikenakan gelombang radiasi elektromagnetik pada

frekuensi yang sesuai dapat terjadi penyerapan/absorpsi, adanya serapan tersebut

menghasilkan perbedaan energi serapan. Selisih energi tersebut setara dengan

energi foton yang diserap. Energi yang melompat dari keadaan dasar (ground

state) ke keadaan tereksitasi (excited state) disebut dengan transisi.

Dimana, E1= energi pada keadaan dasar/lebih rendah

E2= energi pada keadaan tereksitasi/lebih tinggi

h = konstanta Planck

υ = frekuensi foton yang diabsorpsi/diserap

λ = panjang gelombang

c = kecepatan

(1)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

16

Transisi yang terjadi antar molekul tidaklah sama, hal ini menyebabkan perbedaan

spektra absorpsinya. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan

analisis kualitatif dan banyaknya molekul yang menyerap radiasi pada panjang

gelombang tertentu setara dengan sinar yang diabsorpsi sehingga spektra juga

dapat digunakan sebagai bahan analisis kuantitatif (Gandjar dan Rohman, 2010).

Pada analisis dengan spektrofometer, dilakukan pembacaan absorbansi

yang disebut sebagai absorban (A) yang tidak memiliki satuan (Mulja dan

Suharman, 1995). Spektrum absorpsi merupakan plot absorbansi analit yang

merupakan fungsi dari panjang gelombang (Skogg, West dan Holler, 1994).

Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik (Gandjar dan Rohman, 2010)

Penyerapan foton yang dialami molekul mengakibatkan terjadinya eksitasi

elektron-elektron ikatan. Transisi elektronik yang terjadi antara tingkat energi

suatu molekul ada empat, yakni:

1. Transisi sigma–sigma star (σ → σ*)

Energi pada transisi ini terletak pada daerah < 180nm atau terjadi pada

daerah UV vakum dan kurang begitu bermanfaat untuk analisis

spektrofotometri UV-VIS (Gandjar dan Rohman, 2010).

2. Transisi non bonding elektron–sigma star (n → σ*)

Energi yang diperlukan untuk jenis transisi ini lebih kecil dibandingkan

transisi σ → σ*, sehingga sinar yang diserap memiliki panjang gelombang

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

17

yang lebih panjang (150–250nm). Kebanyakan transisi ini terjadi pada panjang

gelombang < 200nm (Gandjar dan Rohman, 2010).

3. Transisi n → π* dan transisi π → π*

Transisi ini terjadi pada molekul organik yang memiliki gugus fungsional

tidak jenuh, ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang

diperlukan. Transisi jenis ini paling cocok digunakan dalam analisis

menggunakan spektrofotometri UV–visibel karena berada diantara panjang

gelombang 200–700 nm (Gandjar dan Rohman, 2010).

Pelarut dapat memberikan pengaruh transisi n → π* dan π → π*, hal ini

berkaitan dengan adanya perbedaan kemampuan dari pelarut untuk mensolvasi

antara keadaan dasar dengan keadaan tereksitasi. Pada transisi π → π*, molekul

yang berada dalam keadaan dasar akan relatif non polar dan keadaan

tereksitasinya lebih polar dibandingkan dari keadaan dasar. Penggunaan pelarut

polar akan menyebabkan interaksi lebih kuat saat keadaan tereksitasi

dibandingkan keadaan dasar sehingga perbedaan energi transisi π → π* lebih

kecil. Akibat yang ditimbulkan atas peristiwa ini ialah pergeseran ke panjang

gelombang yang lebih besar dari semula. Berbeda dengan transisi n → π*, pada

keadaan dasar molekul relatif lebih polar dibandingkan keadaan tereksitasi.

Pelarut yang berinteraksi hidrogen akan berinteraksi secara lebih kuat dengan

pasangan elektron yang tak berpasangan pada keadaan dasar dibandingkan

molekul pada keadaan tereksitasi. Hal ini mengakibatkan transisi n → π* akan

mempunyai energi yang lebih besar sehingga panjang gelombang akan bergeser

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

18

lebih pendek dibandingkan semula akibat kemampuan membentuk interaksi

hidrogen (polaritas) pelarut meningkat (Gandjar dan Rohman, 2010).

Gambar 4. (A) Pengaruh pelarut polar terhadap transisi π → π* dan (B) Transisi n

→ π* (Gandjar dan Rohman, 2010)

Dalam memilih panjang gelombang terkait hubungan sifat optik cuplikan

dan pelarut. Penyerapan radiasi UV atau visibel terkait dari elektron terluar atau

elektron valensi dari molekul dan tergantung pula pada jenis ikatan kimia dalam

molekul, adanya ikatan kimia penyebab terjadinya serapan sinar UV-Vis disebut

kromofor (Johnson dan Stevenson, 1978). Sinar UV mempunyai panjang

gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar visibel mempunyai panjang gelombang

400-750 nm (Gandjar dan Rohman, 2010).

(A)

(B)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

19

Kromofor merupakan ikatan rangkap tak jenuh selang-seling yang

menyerap radiasi pada daerah UV dan visibel, sedangkan aukosokrom merupakan

gugus jenuh yang terikat pada kromofor dapat menyebabkan adanya perubahan

panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah

gugusan heteroatom seperti –OCH3, -Cl, OH, dan NH2. Penambahan auksokrom

menyebabkan pergeseren batokromik. Pergeseran batokromik merupakan

pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih panjang akibat adanya subsitusi

gugus atau atom atau adanya pengaruh pelarut (Sastrohamidjojo, 2001).

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut

terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena solut-solut ini melewati suatu

kolom kromatografi. Pemisahan ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak

dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2010).

HPLC dapat menghasilkan pemisahan yang cepat, dengan keunggulan

zat yang tidak menguap atau zat yang tidak tahan panas dapat dipisahkan tanpa

terurai atau tanpa perlu diderivatisasi. Pada kromatografi partisi digunakan fase

gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar

dan fase diam bersifat nonpolar maka disebut sebagai kromatografi fase terbalik,

senyawa nonpolar yang larut dalam hidrokarbon dengan BM < 1000 dapat

dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam (Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 1995).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

20

Gambar 5. Dasar pemisahan kromatografi partisi (Lennan, 2010)

Kromatografi partisi merupakan metode pemisahan analit berdasarkan

kemampuan partisinya diantara fase diam dan fase gerak yang melewati fase

diam. Analit yang mempunyai afinitas lebih besar pada fase diam (gambar 3 -

bulatan merah) relatif lebih tertahan di fase diam daripada analit yang kurang

tertahan pada fase diam (gambar 3 - bulatan hijau) (Lennan, 2010).

Gambar 6. Diagram sistem HPLC secara umum (Harvey, 2000)

Secara umum instrument HPLC terdiri atas beberapa komponen, yaitu

wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

21

kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan

suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2010).

Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah ini biasanya mampu

menampung fase gerak antara 1-2 liter pelarut. Fase gerak harus di degasing

(penghilangan gas) dulu sebelum digunakan karena adanya gas akan berkumpul

dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan

mengacaukan analisis. Pada saat membuat fase gerak, maka sangat dianjurkan

untuk memilih fase gerak dengan kemurnian yang tinggi agar tingkat pengotor

rendah dan tidak merusak sistem HPLC (Gandjar dan Rohman, 2010).

Fase gerak pada HPLC biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur dan secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan berdasarkan polaritas pelarut, polaritas fase diam

dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar

daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas

pelarut. Sedangkan untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase

gerak), kemampuan elusi akan menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut

(Gandjar dan Rohman, 2010).

Dasar pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan yaitu

berdasarkan pada indeks polaritas (P’) campuran fase gerak tersebut. Semakin

besar nilai indeks polaritas pelarut menyatakan semakin polar fase gerak yang

digunakan. Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau

lebih campuran pelarut yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

22

gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks

polaritas fase gerak (Harvey, 2000).

𝑃′𝐴𝐵 Φ𝐴. 𝑃′𝐴 + Φ𝐵. 𝑃′𝐵 (2)

Dengan ΦA dan ΦB merupakan fraksi volume pelarut yang digunakan

pada pelarut A dan B, sedangkan P’A dan P’B merupakan indeks polaritas pelarut

yang digunakan pada pelarut A dan B (Harvey, 2000).

Tabel 1. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut HPLC

(Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010)

Pompa yang digunakan untuk memompa fase gerak pada sistem HPLC

memiliki syarat seperti wadah pelarut yakni inert terhadap fase gerak. Pompa

yang digunakan sebaiknya memiliki kemampuan memberikan tekanan hingga

5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak hingga 3 mL/min. Penggunaan

pompa ialah untuk dapat menjamin proses penghantaran fase gerak yang

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

23

berlangsung dengan tepat, reprodusibel, konstan dan bebas gangguan (Gandjar

dan Rohman, 2010).

Metode pencampuran fase gerak dibedakan menjadi dua, yakni metode

isokratik dan metode gradien. Metode isokratik merupakan metode pencampuran

fase gerak secara manual dengan tangan dan saat memasuki sistem HPLC tidak

dibutuhkan adanya pencampuran fase gerak kembali dan dilakukan dengan satu

pompa. Metode gradien merupakan metode pencampuran fase gerak yang

dilakukan di dalam sistem HPLC, dimana beberapa pompa digunakan untuk

memompa pelarut ke dalam wadah pencampuran fase gerak dan hasil

pencampuran fase gerak tersebut yang dialirkan ke dalam kolom (Snyder,

Kirkland, dan Dolan, 2010).

Penyuntikan sampel pada HPLC dilakukan secara langsung ke dalam

fase gerak yang mengalir menuju kolom (Gandjar dan Rohman, 2010).

Pada sistem HPLC, penyuntikan sampel melalui loop injector yang dapat

menyimpan volume dari 0,5 μL - 2 mL. Pada posisi load, loop sampler terisolasi

dari fase gerak. Ketika katup dipindahkan ke posisi loading, injektor berpindah ke

posisi inject dan saat itu pula fase gerak mengaliri sampel dan terbawa memasuki

kolom (Harvey, 2000).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

24

Gambar 7. Skema sampler KCKT. (A) – posisi load, sampel diinjeksikan dan terisolasi dari

fase gerak. (B) – posisi inject, sampel terbawa fase gerak dan memasuki kolom (Harvey,

2000)

Kolom pada HPLC memuat fase diam, kebanyakan merupakan silika

yang dimodifikasi secara kimiawi. Permukaan silika merupakan permukaan yang

polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Modifikasi

secara kimia akan menutupi gugus silanol dan menggantinya dengan gugus

fungsional lain. Hasil reaksi kimiawi tersebut akan menghasilkan silika yang

stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan siloksan (Si-O-Si) (Gandjar dan

Rohman, 2010).

Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan dalam memisahkan senyawa dengan tingkat kepolaran rendah hingga

tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk analit yang

polar. Analit polar terutama yang bersifat basa akan memberikan puncak yang

mengekor (tailing peak), hal ini terjadi karena adanya interaksi dengan residu

silanol ataupun pengotor logam yang terdapat pada silika (Gandjar dan Rohman,

2010).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

25

Deteksi pada KCKT dibagi menjadi empat secara umum, yakni bulk

property, sample specific, mobile-phase modification, dan hyphenated

techiniques.

a. Bulk property detector. Detektor ini dianggap sebagai detektor universal yang

dapat mengukur banyak komponen. Detektor ini memiliki keuntungan karena

dapat mendeteksi semua senyawa, sekaligus memiliki kelemahan karena semua

senyawa dari sampel yang terelusi akan terbaca sebagai sinyal. Secara umum,

detektor universal memiliki sensitivitas yang rendah (Snyder, Kirkland, dan

Dolan, 2010).

b. Sample specific detectors. Detektor ini merespon terhadap keunikan

karakteristik yang dimiliki suatu analit karena beberapa karakteristik sampel

mempunyai sifat unik yang mana tidak secara umum dimiliki oleh semua

analit. Detektor UV merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan

merespon analit yang mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang

tertentu. Selain detektor UV, terdapat detektor lain seperti fluoresen dan

detektor conduct electricity (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010). Detektor

UV-VIS dapat mengukur analit yang memiliki struktur kromoforik pada daerah

panjang gelombang 190 – 800 nm. Detektor UV-VIS ini dapat berupa detektor

dengan panjang gelombang tetap ataupun bervariasi (Gandjar dan Rohman,

2010).

c. Mobile–phase modification detectors. Detektor ini mengubah fase gerak

setelah kolom HPLC menghasilkan pengubahan karakteristik analit, seperti

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

26

perubahan reaksi analit dan detektor spektrometrik masa (Snyder, Kirkland,

dan Dolan, 2010).

d. Hyphenated techniques. Teknik ini mengacu pada kopling dari analisis HPLC

yang dipadukan dengan teknik lain, seperti LC-MS dan LC-IR (Snyder,

Kirkland, dan Dolan, 2010).

Detektor pada HPLC idealnya memiliki beberapa karakteristik sebagai

berikut:

Respon terhadap analit cepat dan reprodusibel

Mampu mendeteksi analit hingga kadar yang sangat kecil

Stabil saat dioperasikan/digunakan

Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita.

Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran

luas/AUC

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Komputer atau integrator merupakan alat yang dihubungkan dengan

detektor unuk mengukur sinyal yang dihasilkan dan diplotkan sebagai suatu

kromatogram sehingga dapat dievaluasi oleh peneliti (Gandjar dan Rohman,

2010).

I. Landasan Teori

Jamu merupakan sediaan obat tradisional yang digunakan secara turun

temurun oleh masyarakat untuk mengobati suatu penyakit tertentu. Salah satu

jenis jamu yang sering digunakan adalah jamu asam urat. Regulasi mengenai jamu

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

27

belum diterapkan secara semestinya sehingga mendorong beberapa pihak yang

kurang bertanggung jawab untuk meningkatkan omsetnya dengan menambahkan

bahan-bahan kimia obat untuk dapat memperoleh efek terapi yang cepat.

Penyakit asam urat banyak dialami oleh banyak masyarakat, oleh karena

itu agar penyembuhannya cepat banyak masyarakat menggunakan obat. Obat

untuk menyembuhkan asam urat adalah alopurinol.

Pada sampel tablet, digunakan pengukuran secara spektrofotometri UV

untuk mengukur kadar alopurinol dalam matriks tablet. Sampel tablet disaring lalu

diencerkan dan diukur dengan spektrofotometer UV. Parameter pengukuran

dengan spektrofotometer UV, yaitu nilai presisi yang baik.

Sampel dipisahkan dengan cara ekstraksi cair-cair, dimana sampel jamu

dilarutkan dalam NaOH karena kelarutan alopurinol terbesar terdapat dalam

NaOH, kemudian diekstraksi dengan kloroform agar senyawa-senyawa organik

larut dalam klorofom tetapi tidak melarutkan analit karena perbedaan polaritas,

lalu dibuang fase organiknya kemudian dipisahkan lagi dengan Solid Phase

Extraction MCX (Mixed Cation Exchanger) karena analit akan berikatan dengan

SO3- dari fase diam SPE. Setelah analit berikatan dengan fase diam MCX, matriks

sampel dikeluarkan dengan mengaliri asam asetat dan metanol kemudian

dilakukan elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.

Optimasi clean up partisi dan SPE dilakukan untuk memperoleh analit

yang bersih dari senyawa lainnya (selain alopurinol) dan didapatkan kandungan

alopurinol terbanyak. Hasil ekstraksi diinjeksikan pada sistem HPLC fase terbalik

yang sudah teroptimasi dan dilihat kromatogramnya. Parameter pemisahan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

28

dengan SPE yang menunjukkan hasil optimum yaitu berkurangnya puncak-

puncak senyawa selain alopurinol, Area Under Curve (AUC) alopurinol yang

terbesar, resolusi tercapai ≥ 1,5 pada kromatogram

J. Hipotesis

1. Isolasi alopurinol dalam sampel tablet dilakukan dengan ekstraksi berulang

dapat menghasilkan presisi yang baik.

2. Isolasi alopurinol dalam sampel jamu dilakukan dengan ekstraksi cair-cair dan

dilanjutkan dengan SPE MCX dapat memberikan efisiensi clean up yang baik

dengan berkurangnya puncak-puncak selain alopurinol, AUC terbesar, dan

nilai resolusi ≥ 1,5.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

29

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis dan rancangan penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat

perlakuan terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi volume

kloroform, loading sampel, fase gerak (eluen), dan volume penyaringan.

b. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah absorbansi alopurinol,

efisiensi clean up, nilai resolusi, dan AUC alopurinol.

c. Variabel pengacau terkendali

Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan mengunakan

pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi, sediaan tablet

alopurinol, dan sampel jamu asam urat.

2. Definisi operasional

a. Alopurinol yang dianalisis merupakan senyawa aktif yang berada dalam

sediaan tablet dan sampel jamu asam urat.

b. Optimasi penyaringan dilakukan secara kuantitatif dan tidak kuantitatif

kemudian diukur secara Spektrofotometri UV.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

30

c. Sistem SPE yang digunakan adalah seperangkat alat Solid Phase Extraction

(SPE) dengan fase diam Mixed Cation Exchanger (MCX).

d. Optimasi volume ekstraksi kloroform dilakukan dengan memvariasikan

volume kloroform, optimasi volume fase gerak dilakukan dengan mengubah

volume fase gerak (eluen) dan optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan

mengubah volume (loading) sampel yang masuk ke dalam kolom SPE.

e. Parameter pemisahan komponen dengan metode SPE dilanjutkan dengan

HPLC fase terbalik adalah dengan jumlah impurities yang sedikit, bentuk

peak, retention time, nilai resolusi, nilai tailing factor, dan nilai AUC

alopurinol.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku alopurinol yang diperoleh

dari PT IFARS Solo, metanol p.a (E, Merck), ammonium hidroksida p.a (E,

Merck), aquabides, aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmasi USD,

tablet alopurinol dan sampel jamu asam urat.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (OHAUS

Carat Series PAJ 1003, max 60/120g, min 0,1 mg, d=0,01/0,1 mg, e = 1 mg),

seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan sistem isokratik dengan detektor

ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No.

25EE181KS (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk

Dell B6RDZIS Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer

HP Deskjet D2566-000 625730), alat ultrasonifikasi (Retsch tipe T640 No.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

31

935922013), Spektrofotometer UV-Vis Mini Shimadzu, seperangkat catridge

Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam Mixed Cation Exchanger (MCX)

merek Waters (60 mg, 3 cc, ukuran partikel 30 μm), desilator aquabidest merek

Thermo Scientific, organic and anorganic solvent membrane filter (Whatman)

dengan ukuran pori 0,45 μm, syringe, mikropipet Socorex, milipore filter, rotary

evaporator dan seperangkat alat-alat gelas (Pyrex).

E. Tata Cara Penelitian

1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan

spektrofotometri UV

a. Penyiapan sampel tablet alopurinol

Menyiapkan 20 tablet alopurinol. Tablet kemudian ditimbang satu per

satu untuk menguji keseragaman bobot. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot,

tablet alopurinol dihomogenkan dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk

kemudian disimpan dalam wadah yang kering.

b. Pembuatan dan pembakuan larutan NaOH 0,1 N

Sejumlah 1 gram pelet NaOH dilarutkan dengan aquadest hingga

semua larut sempurna dan dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL lalu

diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas.

Ditimbang lebih kurang 400 mg kalium biftalat secara seksama yang

sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120oC selama 2 jam dan

larutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu tambahkan 2 tetes indikator fenolftalein

dan titrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi warna merah muda

mantap.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

32

N NaOH =

(DepKes RI, 1995)

c. Optimasi penyaringan alopurinol

1) Optimasi penyaringan dengan menggunakan baku alopurinol

Penyaringan tanpa pembilasan. Baku sejumlah 50,0 mg ditimbang,

dilarutkan dengan 20 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring dan

dimasukkan ke dalam labu 50 mL diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.

Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke

dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL

diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.

Kemudian larutan ini disebut dengan larutan A.

Penyaringan diikuti dengan pembilasan. Baku sejumlah 50,0 mg

ditimbang, dilarutkan dengan 10 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring, di

dalam beaker glass dibilas lagi dengan 10 mL NaOH lalu disaring lagi dan

dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda

batas. Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke

dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL

diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.

Kemudian larutan ini disebut dengan larutan B.

Absorbansi larutan A dan B dibandingkan untuk mengetahui pengaruh

perbedaan cara penyaringan larutan baku alopurinol.

2) Optimasi penyaringan dengan menggunakan tablet alopurinol

Penyaringan tanpa pembilasan. Sampel tablet sejumlah 77 mg

ditimbang, dilarutkan dengan 20 mL NaOH disaring dengan kertas saring dan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

33

dimasukkan ke dalam labu 25 mL diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.

Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke

dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL

diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.

Kemudian larutan ini disebut dengan larutan C.

Penyaringan diikuti dengan pembilasan. Sampel tablet sejumlah 77

mg ditimbang, dilarutkan dengan 10 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring,

di dalam beaker glass dibilas lagi dengan 10 mL NaOH, disaring lagi dan

dimasukkan ke dalam labu 25 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda

batas. Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke

dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL

diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.

Kemudian larutan ini disebut dengan larutan D.

Absorbansi larutan C dan D dibandingkan untuk mengetahui pengaruh

perbedaan cara penyaringan tablet alopurinol.

2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jumlah senyawa

pengotor yang terdapat dalam ekstrak cair-cair. Langkah kerja yang dilakukan

adalah menimbang sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X kemudian

dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan

menggunakan pengulangan volume kloroform 3 x 3 mL, fase NaOH diambil dan

ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

34

Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk

menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah

4 mL. Setelah disaring, sampel tidak dilewatkan pada SPE MCX. Sampel

dipekatkan seluruhnya lalu dilarutkan dengan amonium hidroksida 5% dalam

metanol sebanyak 10 mL, disaring dengan milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.

Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18,

komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90),

kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan

volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram yang didapat

dibandingkan dengan kromatogram yang diperoleh pada langkah 3c.

3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X

a. Penyiapan sampel jamu asam urat merek X

Menyiapkan 20 bungkus jamu asam urat merek X. Serbuk jamu

kemudian ditimbang satu per satu untuk menguji keseragaman bobot. Setelah

dilakukan uji keseragaman bobot, serbuk jamu dihomogenkan dengan

menggunakan mortir dan stamper. Serbuk kemudian disimpan dalam wadah yang

kering.

b. Optimasi clean up SPE MCX

Pada penelitian ini dilakukan optimasi kapasitas kolom dan volume

eluen dengan menggunakan metode SPE penukar kation dengan fase diam MCX

(Mixed Cation Exchanger) (Waters).

Optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan melakukan variasi

volume pengisian (loading) ekstrak sampel. Optimasi volume eluen dilakukan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

35

dengan memvariasi volume eluen yang digunakan untuk mengelusi SPE MCX.

Kedua variasi tersebut dilakukan sesuai dengan Tabel II.

Langkah kerja yang dilakukan adalah menimbang sebanyak 0,5 g

sampel jamu asam urat merek X kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1

N. Sampel diekstraksi dengan menggunakan volume kloroform 3x3 mL, fase

NaOH diambil dan ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.

Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk

menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah

4 mL. SPE MCX disiapkan, dikondisikan (conditioning) dengan berturut-turut

mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest ke dalam kolom SPE MCX

kemudian tetesan ditampung pada flakon.

Tabel II. Optimasi loading sampel dan volume eluen SPE MCX

Loading ekstrak sampel (μL) Volume eluen (mL)

500

5

7.5

10 + 2.5

750

5

7.5

10 + 2.5

1000

5

7.5

10 + 2.5

Diantara tahapan loading sampel dan elusi dilakukan pencucian SPE

dengan cara mengaliri berturut-turut dengan 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL

metanol p.a. melalui kolom SPE MCX, tetesan eluen ditampung pada flakon. Lalu

dilakukan pengelusian sesuai tabel II. Fraksi hasil elusi dipekatkan seluruhnya

lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak

10 mL, disaring dengan milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

36

Sampel hasil pengelusian diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik

dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium

hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan

panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).

Hasil kromatogram yang didapat, diamati bentuk peak dan nilai AUC untuk

mengetahui hasil yang optimal dari proses optimasi clean up SPE MCX.

c. Optimasi ekstraksi cair-cair

Pada penelitian ini dilakukan optimasi clean up cair-cair dengan

memvariasi pengulangan ekstraksi cair-cair dengan pelarut organik, yaitu 2x3 mL,

3x3 mL, dan 4x3 mL.

Langkah kerja yang dilakukan adalah menimbang sebanyak 0,5 g

sampel jamu asam urat merek X kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1

N. Sampel diekstraksi dengan menggunakan jumlah pengulangan ekstraksi

dengan pelarut organik yang berbeda-beda, yaitu 2x3 mL, 3x3 mL, dan 4x3 mL,

fase NaOH diambil dan ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.

Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk

menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah

4 mL. Setelah disaring, sampel diloading ke dalam SPE dan dielusi sesuai dengan

hasil optimasi pada langkah 3b. Sampel dipekatkan seluruhnya lalu dilarutkan

dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL, disaring dengan

milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.

Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18,

komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90),

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

37

kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan

volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram yang didapat,

diamati bentuk peak dan nilai AUC untuk mengetahui hasil yang optimal dari

proses optimasi ekstraksi cair-cair.

4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC

Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alopurinol dalam sampel

jamu dengan menggunakan HPLC. Cara yang dilakukan adalah dengan cara

membandingan waktu retensi, bentuk puncak, dan nilai AUC antara baku

alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel jamu yang ditambah baku alopurinol

yang bertujuan untuk mengetahui apakah dalam sampel jamu terdapat alopurinol.

Langkah kerja yang dilakukan adalah

a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih

kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan

dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga

tanda.

b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan

konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan

stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.

c. Pembuatan larutan baku alopurinol dengan konsentrasi 30 μg/mL. Diambil

sejumlah 600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian dimasukkan ke

dalam labu ukur 10 mL. Labu ukur diencerkan dengan amonium hidroksida 5%

dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 30 μg/mL.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

38

Larutan baku alopurinol diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan

kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida

0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang

gelombang 274 nm (Sari, 2014).

d. Penyiapan blanko sampel jamu

Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan

dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL

sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas),

tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.

Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan

endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil

penyaringan adalah 4 mL.

SPE dikondisikan dengan mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL

aquabidest, lalu dilakukan loading ekstrak sampel sebanyak 1000 μL ke dalam

kolom SPE. Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2%

dan 2 mL metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida

5% dalam metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan

kembali dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu

disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15

menit. Diinjeksikan sebanyak 20 µl ke dalam HPLC fase terbalik dengan

kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida

0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang

gelombang 274 nm (Sari, 2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

39

e. Penyiapan sampel dalam matriks jamu

Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan

dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL

sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas),

tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.

Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan

endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil

penyaringan adalah 4 mL.

Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200

μL pada konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL dan 100 μL, 200 μL, dan

300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang

ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan

mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading

ekstrak sampel sebanyak 1000 μL ke dalam kolom SPE. Kolom SPE MCX

dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya

dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi hasil

elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida

5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan menggunakan

milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Sampel diinjeksikan ke

dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol :

aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit,

detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm (Sari, 2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

40

Hasil kromatogram yang didapat dari langkah 4c, 4d, dan 4e, diamati waktu

retensi, bentuk peak, dan nilai AUC alopurinol lalu dibandingkan antara baku

alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel yang ditambah baku alopurinol.

5. Validasi metode clean up SPE MCX

Validasi dilakukan pada hasil optimasi kapasitas kolom dan volume

eluen. Proses validasi dilakukan dengan menghitung akurasi dan presisi. Akurasi

dinyatakan dengan % perolehan kembali. Sampel ditambah dengan baku sebanyak

200 µl pada 3 level konsentrasi yaitu 5 µg/mL, 15 µg/mL, 30 µg/mL, dan 100 μL,

200 μL, dan 300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol

yang ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng (dilakukan 5 kali

replikasi). % perolehan kembali dihitung dengan menggunakan rumus:

% perolehan kembali = ( ) ( )

x 100%

Presisi dinyatakan dengan % CV yang menunjukkan persentase

penyimpangan data yang terjadi. Koefisien variasi (CV) dihitung pada setiap

replikasi dengan rumus:

% CV =

x 100%

Langkah kerja yang dilakukan adalah

a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih

kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan

dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga

tanda.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

41

b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan

konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan

stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.

c. Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah 100 μL, 300 μL, dan

600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan

ke dalam labu ukur 10 mL. Masing-masing labu ukur diencerkan dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh

konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, dan 30 μg/mL.

d. Penyiapan sampel dalam matriks jamu

Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan

dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform hasil

optimasi ekstraksi cair-cair. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air

(bagian atas), tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N

hingga pH 2. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk

menghilangkan endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa

sehingga hasil penyaringan adalah 4 mL.

Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200

μL pada konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL dan 100 μL, 200 μL, dan

300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang

ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan

mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading

ekstrak sampel sesuai dengan hasil optimasi langkah 3b ke dalam kolom SPE.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

42

Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL

metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam

metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan

menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit.

Diinjeksikan sebanyak 9 µl untuk adisi 5 µg/mL, 20 µl untuk adisi 15 µg/mL

dan 21 µl untuk adisi 30 µg/mL ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom

C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%

(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang

274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram

yang didapat, diamati nilai AUC lalu dihitung nilai akurasi dan presisi.

6. Penggunaan kembali SPE MCX

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah SPE yang telah

dipakai dapat digunakan kembali dengan cara melakukan pencucian SPE

bekas/yang sudah pernah dipakai kembali setelah dicuci menurut suatu siklus

pencucian. Pada penelitian ini digunakan variasi pengulangan pencucian SPE

seperti yang tertera pada tabel III.

Tabel III. Pengulangan pencucian SPE

Variasi

pengulangan

Urutan siklus pencucian

1x Dalam 1x siklus pencucian SPE dilakukan dengan cara

berturut-turut mengaliri SPE dengan metanol p.a.; aquabidest;

NaOH 0,1N; HCl 0,1N; aquabidest; dan metanol p.a.

2x

3x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

43

Setelah pencucian SPE, SPE digunakan sesuai dengan tata cara

penelitian langkah 3b. Tahap loading ekstrak sampel dimasukkan 1000 μL larutan

baku alopurinol dengan konsentrasi 30 μg/mL yang akan dijelaskan berikutnya

pada langkah 4.

Fraksi hasil elusi diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan

kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%

(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang

274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).

Hasil kromatogram yang didapat pada pencucian SPE 1x, 2x, dan 3x

dibandingkan untuk mengetahui sampai berapa kali pencucian SPE dilakukan

agar SPE dapat dipakai kembali.

F. Analisis Hasil

1. Analisis hasil optimasi penyaringan dengan spektrofotometri UV

Data absorbansi yang diperoleh dari hasil optimasi penyaringan

ditetapkan nilai presisi dari penyaringan alopurinol dalam matriks tablet.

2. Analisis hasil optimasi clean up yang dilanjutkan dengan HPLC

Data kromatogram yang diperoleh dari hasil optimasi clean up

ditentukan untuk menetapkan pemisahan alopurinol dalam matriks jamu asam urat

yang dapat dilihat dari banyaknya puncak, waktu retensi baku alopurinol dengan

fraksi hasil elusi SPE, dan nilai resolusi yang dihasilkan. Dari hasil optimasi SPE

ditetapkan nilai akurasi dan presisi dari metode SPE untuk memisahkan alopurinol

dalam matriks jamu asam urat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

44

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan

spektrofotometri UV

Penetapan kadar alopurinol dalam tablet (DepKes RI 1974) dilakukan

pengembangan metode dengan melarutkan alopurinol dalam NaOH 0,1 N dan

dilakukan pengenceran 2500 kali. Larutan intermediet disaring dan diukur pada

panjang gelombang maksimum secara spektrofotometri UV.

a. Penyiapan sampel tablet alopurinol

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sediaan tablet

alopurinol yang banyak beredar di pasaran. Analit yang ingin dianalisis adalah

alopurinol yang terdapat dalam tablet. Pertama-tama menyiapkan 20 tablet

alopurinol, lalu kemudian sampel ditimbang satu per satu untuk uji keseragaman

bobot dimana fungsi dari uji keseragaman bobot adalah untuk memastikan bobot

tablet yang seragam karena dengan seragamnya bobot tablet maka dosis yang

terkandung juga seragam.

Menurut FI IV, penyimpangan bobot rata-rata yang harus dipenuhi

adalah tidak lebih dari 2 tablet yang bobotnya menyimpang sebesar 5% bobot

rata-rata dan tidak boleh 1 bobot tablet pun yang bobotnya menyimpang sebesar

10% dari bobot rata-rata. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet dapat dilihat

pada tabel IV.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

45

Hasil bobot rata-rata tablet alopurinol yang diperoleh adalah 306 mg

dengan nilai CV sebesar 0.9% (lampiran 3). Dari hasil yang diperoleh telah

memenuhi persyaratan karena tidak ada bobot tablet yang menyimpang sebesar

5% dan 10% dari bobot rata-rata.

Setelah diuji keseragaman bobot, tablet digerus. Tujuan dari digerus

ini adalah untuk menghomogenkan dan memperkecil ukuran partikel tablet

sehingga dengan homogennya sampel tablet dan kecilnya ukuran partikel akan

memperluas area kontak antara pelarut dengan sampel sehingga sampel dapat

larut pada pelarut yang digunakan.

b. Pembuatan dan pembakuan NaOH 0,1 N

Pembakuan NaOH bertujuan untuk menentukan konsentrasi larutan

NaOH secara teliti karena NaOH merupakan baku sekunder yang perlu dibakukan

menjadi baku primer. NaOH bersifat higroskopis yang dapat menyerap air dari

lingkungan sekitar yang dapat menyebabkan pengenceran sehingga mengalami

perubahan konsentrasi, oleh karena itu maka NaOH perlu dibakukan. Selain itu

juga NaOH dapat bereaksi dengan gas CO2 dari udara dengan reaksi sebagai

berikut (Mursyidi dan Rohman, 2008):

NaOH + CO2 Na2CO3 + H2O

Bobot rata-rata (mg) Penyimpangan bobot rata-rata

A B

25 atau kurang 15% 30%

26 sampai dengan 150 10% 20%

151 sampai dengan 300 7,5% 15%

Lebih dari 300 5% 10%

Tabel IV. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet (DepKes RI, 1995)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

46

Pembakuan NaOH dilakukan dengan menggunakan kalium biftalat

sebagai baku primer. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH adalah sebagai

berikut (Mursyidi dan Rohman, 2008):

Indikator yang digunakan pada proses pembakuan NaOH adalah

fenolftalein yang memiliki trayek pH 8,2-10 (Jenkins, 1967) untuk mengetahui

terjadinya TAT (Titik Akhir Titrasi). Pada saat tercapai TAT telah terjadi

perubahan warna dari bening menjadi pink. Digunakan indikator fenolftalein

karena indikator fenolftalein memiliki trayek perubahan warna disekitar titik akhir

teoritis. Fenolftalein pada suasana basa akan memberikan warna merah muda.

Pada penelitian ini, terjadi perubahan warna dari bening menjadi pink

mantap. Warna pink tersebut terjadi karena telah melewati TAT (Titik Akhir

Gambar 9. Perubahan warna indikator fenolftalein dari bening menjadi pink

(Gandjar dan Rohman 2010)

Gambar 8. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH (Mursyidi dan Rohman, 2008)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

47

Titrasi). Volume titran yang diperoleh adalah 21.35 mL dan normalitas yang

diperoleh adalah 0.0917 N (lampiran 8).

c. Optimasi penyaringan alopurinol

Tujuan penelitian ini adalah untuk memisahkan alopurinol dari

matriks tablet. Langkah awal dilakukan penyaringan tanpa pembilasan. Baku

alopurinol ditimbang sebanyak 50,0 mg, dilarutkan dengan NaOH sebanyak 20

mL karena alopurinol mudah larut dalam NaOH dan disaring dengan kertas

saring. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan

diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 50 mL tersebut diambil

1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga

tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke

dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian

larutan ini disebut dengan larutan A.

Langkah berikutnya dilakukan penyaringan yang diikuti dengan

pembilasan. Baku alopurinol ditimbang sebanyak 50,0 mg, dilarutkan dengan 10

mL NaOH terlebih dahulu kemudian disaring dengan kertras saring. Sisa

Gambar 10. Hasil standarisasi NaOH dengan menggunakan kalium biftalat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

48

alopurinol yang masih tertinggal di beaker glass dibilas lagi dengan NaOH 10 mL

dan disaring dengan kertas saring agar tidak ada sisa alopurinol dalam beaker

glass. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan

diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 50 mL tersebut diambil

1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga

tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke

dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian

larutan ini disebut dengan larutan B.

Sampel tablet alopurinol ditimbang 77 mg. Langkah pertama

dilakukan penyaringan tanpa pembilasan. Sampel tablet alopurinol dilarutkan

dalam NaOH karena alopurinol mudah larut dalam NaOH sebanyak 20 mL,

disaring dengan kertas saring. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam

labu 25 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 25 mL

tersebut diambil 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan

NaOH hingga tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL,

dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.

Kemudian larutan ini disebut dengan larutan C.

Sampel tablet alopurinol ditimbang lagi sebanyak 77 mg, dilarutkan

dengan 10 mL NaOH terlebih dahulu kemudian disaring dengan kertras saring.

Sisa alopurinol yang masih tertinggal di beaker glass dibilas lagi dengan NaOH

10 mL dan disaring dengan kertas saring agar tidak ada sisa alopurinol dalam

beaker glass. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 25 mL dan

diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 25 mL tersebut diambil

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

49

1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga

tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke

dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian

larutan ini disebut dengan larutan D.

Dari larutan A, B, C, D diukur dengan menggunakan spektrofotometer

UV pada panjang gelombang 257 nm. Hasil absorbansi yang didapatkan

kemudian dihitung dengan persamaan regresi linier kurva baku y = 0,05246x +

0,04479 (Dewi, 2014). Hasil yang didapatkan dapat dilihat pada tabel V.

Tabel V. Hasil bobot alopurinol, SD, dan % CV

Cara

Penyaringan

Replikasi Absorbansi

Bobot

Alopurinol (mg)

Rata-

rata

SD % CV

Baku

10 mL x 2

1 0.545 23.8

24.4 0.60 2.4 2 0.555 24.3

3 0.569 25.0

20 mL x 1

1 0.540 23.6

23.2 0.32 1.4 2 0.529 23.1

3 0.526 23.0

Sampel

10 mL x 2

1 0.502 21.8

21.8 0.20 0.9 2 0.499 21.6

3 0.505 22.0

20 mL x 1

1 0.491 21.3

21.2 0.06 0.3 2 0.490 21.2

3 0.490 21.2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

50

Dari tabel V diketahui nilai %CV dari ekstraksi berulang (2x) lebih

besar dari ekstraksi 1x, yang mana seharusnya presisi dari ekstraksi berulang lebih

baik daripada ekstraksi 1x. Penyebab terjadinya hasil tersebut belum diketahui

oleh peneliti.

Menurut Sari (2014), metode spektrofotometri UV kurang tepat

digunakan untuk determinasi alopurinol dalam jamu sehingga digunakan metode

HPLC untuk determinasi alopurinol dalam jamu karena pada metode

spektrofotometri UV kurang sensitif dibandingkan dengan metode HPLC dan

dalam sampel jamu juga terdapat matriks yang kompleks.

2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE

Untuk mengetahui bagaimana pengaruh proses clean up menggunakan

SPE MCX, maka dilakukan perbandingan kromatogram hasil ekstraksi cair-cair

dengan ekstraksi cair-cair yang dilanjutkan dengan ekstraksi cair padat. Tujuan

dilakukan cara ini adalah untuk mengetahui apakah SPE MCX mampu

mengurangi jumlah senyawa selain analit yang ikut terekstraksi (koekstraktan).

Koekstraktan bisa mengganggu proses determinasi suatu analit, oleh karena itu

sebisa mungkin jumlah koekstraktan dikurangi.

Pada penelitian, sampel diekstraksi cair-cair menggunakan volume

kloroform 3x3 mL, lalu dilakukan penambahan HCl sampai pH menjadi 2.

Sampel disaring menggunakan kertas saring untuk menahan pengotor yang timbul

saat dilakukan penambahan HCl, kemudian sampel disaring dengan milipore dan

diultrasonifikasi 15 menit. Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik

dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

51

Gambar 11. Kromatogram hasil ekstraksi cair-cair sampel blanko (A) replikasi 1

(B) replikasi 2

hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan

panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).

Hasil kromatogram yang didapatkan ditunjukkan oleh gambar 11.

A

B

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

52

Dari gambar 11 terlihat bahwa terdapat banyak peak. Alopurinol

memiliki waktu retensi 4,9 menit, tetapi pada gambar tidak terlihat. Oleh karena

itu diperlukan SPE untuk mengurangi jumlah peak matriks dalam sampel jamu

agar peak alopurinol dapat terdeteksi dengan baik.

3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X

a. Penyiapan sampel jamu asam urat merek X

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jamu asam urat

merek “X” yang banyak beredar di pasaran. Analit yang ingin dianalisis adalah

alopurinol yang terdapat dalam jamu asam urat. Pertama-tama menyiapkan 20

bungkus sampel jamu dengan nomor batch yang sama untuk mendapatkan kriteria

homogenitas karena sampel dengan nomor batch yang sama mengalami satu

proses produksi yang sama. Sampel ditimbang satu per satu untuk uji

keseragaman bobot dimana fungsi dari uji keseragaman bobot adalah untuk

memastikan bobot serbuk yang seragam karena dengan seragamnya bobot serbuk

maka dosis yang terkandung juga seragam.

Serbuk jamu diambil kemudian diekstraksi. Sebelum dilakukan

ekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair, serbuk jamu digerus dahulu. Tujuan

dari digerus ini adalah untuk menghomogenkan serbuk jamu karena dalam serbuk

jamu terlihat ada kristal. Setelah serbuk dihomogenkan, serbuk jamu disimpan

dalam wadah yang kering.

b. Optimasi clean up SPE MCX

Pada penelitian ini alopurinol diekstraksi kemudian diasamkan sampai

pH 2 sehingga membentuk ion yang bermuatan positif, karena itu digunakan clean

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

53

up dengan menggunakan Solid Phase Extraxtion (SPE) Mixed Cation Exchanger

(MCX). Untuk mengetahui sistem yang optimal dari SPE MCX, maka perlu

dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan terhadap kapasitas loading ekstrak

sampel pada SPE MCX dan volume eluen yang digunakan untuk mengelusi

alopurinol dari fase diam SPE MCX.

Digunakan SPE MCX karena alopurinol merupakan senyawa basa

yang dapat membentuk ion positif saat ditambahkan senyawa asam berlebih

sehingga alopurinol terprotonasi. Oleh karena itu digunakan SPE MCX karena

spesifik untuk senyawa basa yang memiliki pKa antara 2-10 (nilai pKa alopurinol

9,4) dan kolom SPE MCX memiliki ion negatif (SO3-) sehingga spesifik untuk

menjerap analit yang memiliki ion positif.

Clean up dengan SPE MCX ini dilakukan dengan tujuan untuk

mengurangi senyawa-senyawa selain analit yang ikut terekstraksi (ko-ekstraktan)

selama proses ekstraksi cair-cair. Pentingnya proses clean up dilakukan karena

ko-ekstraktan dapat mengganggu proses determinasi analit, dalam hal ini

alopurinol.

Tahap-tahap yang dilakukan dalam SPE adalah pertama dilakukan

pengkondisian. Pengkondisian kolom ion exchange dilakukan dengan mengaliri

metanol lalu dengan aquabidest (Waters, 2008). Pada penelitian juga dilakukan

pengkondisian dengan mengaliri 1 mL metanol p.a. lalu dengan 1 mL aquabidest.

Tahapan selanjutnya adalah retensi sampel. Ekstrak air dalam HCl 0,1

N sampai pH 2 dilewatkan ke kolom SPE untuk dapat tertahan pada fase diam

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

54

SPE, sementara komponen lain terelusi keluar. Interaksi antara analit dengan fase

diam SPE adalah sebagai berikut:

Gambar 12. Interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE

Dari gambar 12 terlihat bahwa adanya interaksi ionik antara

alopurinol dengan fase diam SPE yang mana nantinya saat dielusi dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol akan terjadi pertukaran ion dimana gugus

+NH3 akan berikatan dengan gugus SO3

- dari fase diam SPE sehingga alopurinol

dapat terelusi keluar.

Berikutnya pencucian kolom SPE, tahap ini penting untuk

menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh fase diam selama

tahap retensi. Proses pencucian kolom SPE ini digunakan asam asetat dan

metanol p.a. untuk menghilangkan pengotor yang tidak tertahan oleh fase diam.

Tahap berikutnya adalah elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam

metanol untuk mengambil analit yang tertahan pada fase diam karena alopurinol

dapat larut dalam amonium hidroksida 5% dalam metanol. Amonium hidroksida

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

55

5% dalam metanol (NH4+) dapat mengelusi alopurinol dari fase diam SPE MCX

karena dilihat dari nilai pKa antara alopurinol dengan ion NH4+, dimana

alopurinol memiliki nilai pKa 9,4 dan ion NH4+ memiliki nilai pKa 8,86 sehingga

ion NH4+ memiliki keasaman yang lebih kuat daripada alopurinol sehingga ion

SO3- dari fase diam SPE MCX akan lebih terikat dengan ion NH4

+ dan alopurinol

terelusi keluar.

Hasil dari elusi SPE kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase

terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : akuabides/amonium

hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan

panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).

Yang dioptimasi adalah kapasitas kolom dan volume eluen SPE MCX.

1) Optimasi kapasitas kolom SPE MCX

Penentuan kapasitas kolom SPE bertujuan untuk mengetahui

kemampuan kolom SPE dalam menahan sampel dalam jumlah tertentu. Dalam hal

ini bertujuan untuk mencari batasan volume sampel yang boleh dimasukkan ke

dalam kolom SPE agar mampu tertahan di kolom. Penentuan kapasitas kolom ini

dilakukan dengan mengubah volume sampel yang dimasukkan ke dalam kolom

SPE dari 500 μL, 750 μL, dan 1000 μL. Sampel dibilas dengan asam asetat 2%,

dilanjutkan dengan metanol kemudian dielusi dengan amonium hidroksida 5%

dalam metanol sebanyak 10 mL.

Hasil dari elusi SPE kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase

terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium

hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

56

Tabel VI. Optimasi kapasitas kolom

panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Jika

muncul peak alopurinol (waktu retensi alopurinol sekitar menit 4,9) dalam fraksi

asam asetat maka menunjukkan bahwa kolom SPE tidak bisa menahan sampel.

Gambar 13 merupakan gambar kromatogram fraksi asam asetat hasil

pencucian SPE yang menunjukkan bahwa fraksi asam asetat tersebut tidak dapat

mengelusi analit. Hal ini ditunjukkan dengan tidak munculnya peak alopurinol

pada sekitar menit 4,9 sedangkan peak yang muncul adalah peak pengotor yang

terdeteksi pada menit 5,76. Asam asetat tidak mengelusi alopurinol dari kolom

SPE karena alopurinol lebih terikat pada kolom SPE. Hasil optimasi kapasitas

kolom dapat dilihat pada tabel VI dan gambar 14.

Volume loading ekstrak

+ 156 µg alopurinol

Volume

eluen Replikasi AUC AUC rata-rata

500 µl

10 mL

1 2790210 2802516

2 2814822

750 µl 1 2967215

2968156 2 2969097

1000 µl 1 3416997

3417248 2 3417498

Gambar 13. Kromatogram alopurinol dalam fraksi asam asetat setelah

proses pencucian SPE

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

57

Dari tabel VI dan gambar 14 terlihat bahwa kolom SPE masih mampu

menahan alopurinol dalam ekstrak sampel hingga volume loading 1000 μL

bahkan diduga mampu menahan alopurinol lebih banyak. Hal ini ditunjukkan

dengan masih terjadinya peningkatan AUC seiring dengan meningkatnya

volume loading ekstrak. Perolehan kembali yang didapatkan sebesar 114.1%.

Dalam penelitian ini hanya dilakukan loading ekstrak hingga volume 1000 μL.

Adapun kromatogram hasil optimasi kapasitas kolom SPE adalah sebagai

berikut:

A

Gambar 14. Kurva hubungan volume loading ekstrak VS AUC

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0 200 400 600 800 1000 1200

AU

C

Volume ekstrak HCl (µL)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

58

Gambar 15. Kromatogram alopurinol pada optimasi kapasitas kolom SPE MCX

(A) 500 μl (B) 750 μl (C) 1000 μl (D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :

aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)

Dari hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa puncak

alopurinol sudah tampak dan tidak terganggu oleh matriks sampel. Resolusi antara

puncak alopurinol dengan matriks sampel sudah baik karena nilai resolusinya

lebih dari 1,5. Nilai resolusi dari gambar 15A, 15B, dan 15C berturut-turut adalah

3,2; 3,0; dan 3,1. Hasil resolusi menunjukkan bahwa alopurinol sudah terpisah

dengan baik dari matriks sampel.

B

C

D

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

59

Dari kromatogram di atas juga menunjukkan bahwa eluen amonium

hidroksida 5% dalam metanol dapat mengelusi analit. Hal ini ditunjukkan dengan

munculnya peak pada sekitar menit 4,9 dimana puncak tersebut adalah puncak

alopurinol karena memiliki waktu retensi yang mirip dengan baku alopurinol

(gambar 15D). Amonium hidroksida 5% dalam metanol mampu mengelusi

alopurinol dari fase diam.

2) Optimasi volume eluen SPE MCX

Tujuan dilakukan optimasi volume eluen adalah untuk mendapatkan

berapa volume eluen (amonium hidroksida 5% dalam metanol) yang dibutuhkan

agar semua analit terelusi dari kolom SPE. Dengan mengetahui seberapa jumlah

volume amonium hidroksida 5% dalam metanol yang dibutuhkan maka

diharapkan mampu mengefisienkan penggunaan sejumlah amonium hidroksida

5% dalam metanol sebagai eluen.

Berdasarkan hasil optimasi kapasitas kolom, maka volume loading

ekstrak yang dimasukkan ke dalam kolom SPE adalah sebanyak 1000 µL. Kolom

kemudian dibilas dengan menggunakan asam asetat 2% lalu dilanjutkan dengan

metanol dan dielusi dengan amonium hidrosida 5% dalam metanol sejumlah 5

mL; 7,5 mL; dan 12,5 mL yang dielusi 10 mL dahulu lalu dilanjutkan dengan

elusi 2,5 mL untuk mengetahui apakah masih ada alopurinol yang tertahan di

dalam kolom SPE.

Hasil dari elusi SPE diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali

dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol, disaring dengan milipore

dan diultrasonifikasi 15 menit. Kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

60

terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium

hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan

panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).

Hasil optimasi kapasitas kolom dapat dilihat pada tabel VII dan gambar 16.

Dari tabel VII dan gambar 16 terlihat bahwa dengan kenaikan volume

eluen hingga 10 mL masih terjadi kenaikan AUC. Tabel VIII juga menunjukkan

Volume loading ekstrak

+ 156 µg alopurinol

Volume

eluen (mL) Replikasi AUC AUC rata-rata

1000 µl

5 1 3020511

3022990 2 3025468

7.5 1 3392390

3391966 2 3391542

12.5

10 1 3557676

3555910 2 3554143

2.5 1 0

0 2 0

Tabel VII. Optimasi volume eluen

Gambar 16. Kurva hubungan volume eluen VS AUC

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0 2 4 6 8 10 12

AU

C

Volume eluen (mL)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

61

bahwa pada penambahan volume 2,5 mL setelah elusi 10 mL tidak terdapat

alopurinol. Perolehan kembali yang didapatkan sebesar 118.1%. Adapun

kromatogram hasil optimasi volume eluen adalah sebagai berikut:

A

B

C1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

62

Gambar 17. Kromatogram alopurinol pada optimasi volume eluen (A) 5 mL (B) 7.5

mL (C) 12.5 mL yang dilakukan dengan mengelusi 10 mL (C1) dan dilanjutkan

dengan elusi 2.5 mL (C2) (D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :

aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)

Dari hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa resolusi antara

puncak alopurinol dengan matriks sampel sudah baik karena nilai resolusinya

lebih dari 1,5. Nilai resolusi dari gambar 17A, 17B, dan 17C1 berturut-turut

adalah 1,8; 3,2; dan 3,3. Hasil resolusi menunjukkan bahwa alopurinol sudah

terpisah dengan baik dari matriks sampel.

c. Optimasi ekstraksi cair-cair

Metode cair-cair yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi

cair-cair. Ekstraksi cair-cair adalah suatu metode untuk praperlakuan sampel

untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin

mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Selain itu, ekstraksi pelarut

C2

D

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

63

juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel dengan jumlah

kecil sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi atau

kuantifikasinya. Sistem partisi yang digunakan untuk pemilihan pelarut adalah

pelarut yang memiliki kelarutan rendah dalam air (<10%) dan dapat menguap

sehingga memudahkan penguapan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi.

Pada penelitian, pertama-tama sampel jamu dilarutkan dahulu dalam

pelarut yang sesuai. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel serbuk

adalah NaOH karena alopurinol mudah larut dalam NaOH. Reaksinya adalah:

Gambar 18. Reaksi pembentukkan garam alopurinol

Setelah terbentuk garam alopurinol, sampel diekstraksi dengan menggunakan

pelarut organik yang tidak melarutkan alopurinol. Menurut Farmakope Indonesia

IV, alopurinol praktis tidak larut dalam kloroform sehingga pelarut yang

digunakan untuk melakukan proses ekstraksi adalah kloroform.

Proses optimasi ekstraksi menggunakan kloroform untuk mengetahui

efisiensi ekstraksi dengan variasi pengulangan ekstraksi 2x3 mL, 3x3 mL, dan

4x3 mL. Pada proses ekstraksi terbentuk 2 fase yaitu fase air yang bersifat alkalis

dan fase organik dimana fase yang diambil adalah fase air yang bersifat alkalis

yang berada di lapisan atas dan fase organiknya dibuang.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

64

Fase air hasil ekstraksi cair-cair yang didapat, ditambahkan HCl

hingga pH menjadi 2 dengan tujuan untuk mengubah analit (alopurinol) menjadi

bentuk ion positif yang dapat dijerap pada fase diam SPE MCX. Berikut reaksi

pembentukkan ion alopurinol:

Gambar 19. Reaksi pembentukkan ion alopurinol

Setelah ditambahkan HCl, timbul endapan lalu disaring dengan kertas saring agar

endapan yang tidak larut dapat tertahan dalam kertas saring. Hasil penyaringan

dilanjutkan proses clean up dengan SPE MCX yang telah teroptimasi.

Adapun hasil kromatogram yang didapat adalah sebagai berikut:

A

B

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

65

Adapun data tR dan AUC dari masing-masing kromatogram ditunjukkan pada

Tabel VIII.

Tujuan ekstraksi cair-cair adalah untuk mengurangi jumlah matriks

pada sampel atau jumlah matriks sesedikit mungkin. Pada hasil yang didapatkan

terlihat bahwa pada volume kloroform yang 2x3 mL masih banyak terdapat peak,

berbeda dengan ekstraksi yang menggunakan volume kloroform 3x3 mL dan 4x3

mL. Pada ekstraksi yang menggunakan volume kloroform 3x3 mL dan 4x3 mL

jumlah peak berkurang.

Volume

Kloroform

tR

(menit) AUC

2 x 3mL

2.695 3808

3.630 2324611

5.524 2867009

6.728 28814

6.822 69803

7.616 8529

3 x 3mL 4.965 3567388

7.147 44048

4 x 3mL 4.964 3558201

7.161 37100

Gambar 20. Kromatogram alopurinol hasil ekstraksi cair-cair dengan variasi

pengulangan penambahan kloroform (A) 2x3 mL (B) 3x3 mL (C) 4x3 mL dengan

fase gerak HPLC metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)

Tabel VIII. Tabel tR dan AUC hasil ekstraksi cair-cair

C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

66

Menurut Gandjar dan Rohman (2010), efisiensi proses ekstraksi

tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada volume relatif kedua

fase. Pada analit dengan nilai distribusi yang kecil, adanya ekstraksi berulang

akan meningkatkan efisiensi ekstraksi yang dapat dihitung dengan rumus:

(Caq)n = Caq[

]

n (3)

Keterangan: (Caq)n = banyaknya analit dalam fase air mula-mula

Caq = banyaknya analit dalam fase air setelah n kali ekstraksi

Vaq = banyaknya volume fase air (fase NaOH)

Vorg = banyaknya volume fase organik (fase CHCl3)

n = banyaknya (frekuensi) ekstraksi

Berdasarkan rumus diatas, semakin banyak dilakukan pengulangan ekstraksi

maka konsentrasi matriks pada fase air akan semakin sedikit. Pada penelitian,

sampel yang digunakan adalah ekstrak air yang mengandung analit dan matriks,

matriks dalam ekstrak air tersebut ingin diambil dengan kloroform. Dengan

semakin banyak pengulangan ekstraksi dengan kloroform, maka konsentrasi

matriks dalam ekstrak air akan semakin sedikit sehingga aman digunakan untuk

ekstraksi alopurinol, hasil ini sesuai dengan persamaan (3).

4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC

Penetapan kadar alopurinol dalam jamu tidak dapat diukur dengan

menggunakan metode spektrofotometri UV karena metode spektrofotometer UV

kurang sensitif dibandingkan dengan metode HPLC dan dalam sampel jamu juga

terdapat matriks yang kompleks (Sari, 2014). Pada pengukuran dengan

menggunakan metode HPLC diperlukan ekstrak sampel yang bersih dari matriks

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

67

Blanko

sampel agar tidak mengganggu pengukuran, oleh karena itu diperlukan clean up

sampel dengan menggunakan Solid Phase Extraction (SPE).

Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alopurinol untuk mengetahui

apakah dalam sampel jamu terdapat alopurinol atau tidak. Identifikasi alopurinol

dalam sampel jamu pada penelitian ini dilakukan dengan menambahkan massa

alopurinol sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng yang bertujuan untuk

menentukkan puncak blanko dan sampel yang telah ditambahkan dengan baku

alopurinol yang dibandingkan dengan puncak baku alopurinol. Hal tersebut

ditunjukkan pada gambar 21.

A

B1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

68

Dari gambar 21 terlihat bentuk puncak, waktu retensi, dan kenaikan

AUC yang mirip pada puncak yang diduga alopurinol sehingga diketahui bahwa

puncak tersebut adalah puncak alopurinol. Dari hasil penambahan baku alopurinol

ke dalam sampel, dibandingkan juga nilai AUC antara blanko dengan sampel

adisi. Pada tabel VI, blanko sampel terdapat alopurinol sehingga diketahui nilai

AUC blanko dan pada sampel adisi terjadi peningkatan AUC dengan jumlah yang

sesuai pada standar adisi alopurinol yang ditambahkan. Tabel perbandingan waktu

retensi dan AUC, tertera pada tabel IX.

Dari waktu retensi yang dibandingkan antara blanko dan sampel

dengan adisi (tabel IX) diketahui bahwa pada blanko ditemukan alopurinol karena

tR

(menit) AUC

Blanko 4,895 17983

Sampel adisi 5 µg/mL 4,968 272522

Sampel adisi 15 µg/mL 4,995 1595477

Sampel adisi 30 µg/mL 4,997 3564357

Tabel IX. Perbandingan tR dan AUC blanko dan sampel adisi

B2

Gambar 21. Perbandingan puncak (A) puncak baku alopurinol (B1 dan B2) puncak blanko

dan sampel alopurinol yang sudah ditambahkan dengan baku alopurinol dalam 3 level

konsentrasi

Adisi 156 ng

Adisi 103 ng

Adisi 51 ng

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

69

muncul puncak pada waktu retensi sekitar 4.8 menit, sedangkan pada sampel

dengan adisi memiliki waktu retensi yang hampir sama dimana berkisar antara

4.968-4.997 menit. Pergeseran waktu retensi ini terjadi akibat dari pengaruh

matriks yang terdapat pada sampel (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010).

Seharusnya pada blanko sampel tidak terdapat alopurinol, tetapi dari

hasil penelitian menunjukkan bahwa pada blanko sampel jamu asam urat merek X

muncul puncak yang mirip dengan puncak baku alopurinol. Sehingga dapat

disimpulkan bahwa pada jamu asam urat merek X mengandung BKO yaitu

alopurinol yang seharusnya tidak boleh ada BKO dalam jamu menurut Keputusan

Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun 2005.

5. Validasi metode clean up SPE MCX

Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur penjaminan

bahwa metode analisis yang digunakan dapat diterima dan terpercaya sehingga

dapat digunakan untuk tujuan analisis tertentu. Pada penelitian ini, proses validasi

yang dilakukan adalah dengan menambahkan baku alopurinol ke dalam sampel

(standar adisi). Fungsi penambahan baku alopurinol di sini adalah untuk

mengetahui jumlah analit dalam matriks sampel karena dalam matriks sampel

terdapat berbagai macam senyawa yang tidak diketahui secara pasti sehingga

tidak dapat ditetapkan secara langsung.

Parameter validasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah akurasi

dan presisi. Akurasi merupakan suatu parameter validasi metode analisis yang

menyatakan kaitan antara kedekatan suatu data yang diperoleh melalui penelitian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

70

yang dilakukan dengan data sebenarnya (data teoritis) (Ahuja and Rasmussen,

2007).

Parameter akurasi pada penelitian ini dilihat dari nilai % perolehan

kembali sampel yang ditambahkan dengan baku alopurinol lalu dibandingkan

dengan kadar sebenarnya yang diperoleh dari hasil penelitian. Presisi merupakan

parameter validasi yang menerangkan kedekatan antara suatu hasil yang didapat

dalam beberapa kali seri pengukuran dalam satu sampel homogen (Ahuja and

Rasmussen, 2007).

Validasi metode pada penelitian ini dilakukan dengan menambahkan

massa alopurinol sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng dengan masing-masing

direplikasi 5 kali. Nilai AUC yang diperoleh kemudian dihitung dengan

persamaan regresi linier kurva baku y = 43683,7x – 470009,5 (Dewi, 2014). Hasil

perhitungan perolehan kembali dapat dilihat pada tabel X.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

71

Replikasi

Jumlah loading

alopurinol

dalam ekstrak

sampel (ng)

AUC

Bobot

alopurinol

(ng)

%

Recovery

Rata-rata

%

Recovery

SD %

CV

1

-

17983 11.17

- - - -

2 18710 11.19

3 18677 11.19

4 - 10.76

5 - 10.76

Rata-rata 11.01

1

11.5

274265 17.04 52.39

51.93 0.57 1.09

2 272643 17.00 52.07

3 272522 17.00 52.04

4 266917 16.87 50.93

5 272972 17.01 52.13

1

51.5

1585120 47.05 69.97

70.31 0.19 0.28

2 1594483 47.26 70.38

3 1595477 47.28 70.43

4 1595455 47.28 70.43

5 1593767 47.24 70.35

1

81.9

3566872 92.41 99.39

99.36 0.07 0.07

2 3562306 92.31 99.26

3 3564357 92.35 99.32

4 3567888 92.43 99.42

5 3568361 92.45 99.43

Tabel X. Hasil perolehan kembali dan CV

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

72

Menurut Gonzalez dan Herrador tahun 2007, % recovery untuk

konsentrasi 100 ppb adalah 80% – 110%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

pada level konsentrasi tinggi memenuhi persyaratan dan pada level konsentrasi

rendah dan sedang tidak memenuhi persyaratan karena pada konsentrasi yang

kecil lebih sulit mendapatkan nilai perolehan kembali daripada konsentrasi analit

yang lebih besar.

Tabel XI. Perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi

analit menurut Gonzales & Herrador (2007)

Tabel XII. CV yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit

berdasarkan AOAC PVM (cit., Gonzales & Herrador, 2007)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

73

Menurut AOAC PVM (Peer Verified Method) untuk konsentrasi 100

ppb adalah 15%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai CV yang diperoleh

memenuhi persyaratan pada semua level konsentrasi.

Hasil perolehan kembali yang didapatkan dengan metode SPE MCX

rendah kemungkinan disebabkan karena kemungkinan kekuatan interaksi antara

alopurinol dengan fase diam SPE MCX yang terlalu kuat atau terlalu lemah. Jika

interaksi alopurinol dengan fase diam SPE MCX kuat, menyebabkan tidak semua

alopurinol dapat keluar atau terelusi dari fase diam SPE MCX, sedangkan jika

interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE MCX lemah, dapat

menyebabkan alopurinol keluar saat proses loading ekstrak yang tidak terdeteksi

pada HPLC. Kemungkinan lain yang menyebabkan hasil perolehan kembali

rendah adalah pengaruh matriks dari sampel jamu yang menutupi sisi aktif fase

diam SPE MCX sehingga alopurinol tidak terikat dengan sisi aktif fase diam SPE

MCX dan keluar dari kolom saat proses loading ekstrak.

6. Penggunaan kembali SPE MCX

Tujuan dilakukan pencucian SPE MCX yang digunakan adalah untuk

mengetahui apakah SPE MCX yang digunakan dapat dipakai berulang kali atau

hanya satu kali pakai saja. Apabila SPE dapat digunakan berulang kali, maka

diharapkan mampu mengefisienkan penggunaan jumlah SPE yang digunakan

untuk clean up.

SPE yang telah digunakan dikondisikan dengan dialiri metanol p.a.

dan aquabidest. Ditambah NaOH 0,1 N untuk mengeluarkan pengotor-pengotor

yang masih terikat pada fase diam, dilanjutkan dengan penambahan HCl 0,1 N

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

74

untuk mengikat NaOH yang masih ada pada fase diam dengan membentuk garam

yang larut dalam air. Kolom SPE dibilas dengan aquabidest untuk menghilangkan

garam yang terbentuk dan dialiri metanol p.a. agar mikroba tidak dapat tumbuh

pada fase diam serta menjaga kondisi fase diam agar tetap baik.

SPE bekas yang telah dicuci, diuji apakah masih dapat digunakan atau

tidak. SPE dikondisikan dengan mengaliri metanol p.a. dan aquabidest. Loading

sampel menggunakan baku alopurinol dengan konsentrasi 30 µg/mL sebanyak

1000 µL. Kolom SPE dicuci dengan mengaliri asam asetat 2% dan metanol lalu

dielusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.

Hasil elusi SPE dinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan

kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%

(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang

274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Kromatogram alopurinol

hasil clean up ditunjukkan oleh gambar 22.

A

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

75

Gambar 22 menunjukkan bahwa pada kromatogram eluat hasil clean

up dengan menggunakan SPE bekas yang telah dicuci dengan 3x siklus pencucian

terdapat peak alopurinol, sedangkan SPE bekas yang hanya dicuci 1x dan 2x

siklus pencucian tidak terdapat peak alopurinol. Hal ini kemungkinan karena pada

pencucian dengan 1x dan 2x siklus, fase diam masih kotor sehingga alopurinol

tidak terikat pada fase diam dan langsung keluar dari SPE pada tahap loading dan

pencucian dengan asam asetat serta metanol p.a, sehingga pada saat elusi dengan

amonium hidroksida 5% dalam metanol sudah tidak ada lagi alopurinol dalam

fraksi ini.

Gambar 22. Kromatogram alopurinol hasil clean up dengan menggunakan SPE bekas

yang sudah diuji (A) 1x (B) 2x (C) 3x dengan fase gerak metanol : aquabidest/amonium

hidroksida 0,1% (10:90)

B

C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

76

Pada SPE bekas yang sudah dicuci dengan 3x siklus pencucian

muncul peak alopurinol, hal ini disebabkan karena pengotor yang terdapat pada

fase diam telah hilang sehingga alopurinol dapat terikat pada fase diam dan saat

elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol alopurinol ikut terelusi

keluar.

Pada gambar 22 terlihat bahwa pada pencucian 1x, 2x, dan 3x selalu

muncul peak pada sekitar waktu 6,7 menit. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan

bahwa metode pencucian hanya mampu mengelusi alopurinol dari fase diam SPE

tapi tidak mampu mengelusi pengotor dari fase diam. Oleh karena itu, peneliti

merekomendasikan untuk menggunakan SPE satu kali pakai saja.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

77

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Optimasi isolasi alopurinol dari tablet dan jamu asam urat adalah sebagai

berikut: volume penyaringan dengan ekstraksi 1x (20 mL) dapat memberikan

presisi yang baik. Volume kloroform pada ekstraksi cair-cair yang baik untuk

memisahkan analit dari matriks adalah 3x3 mL, pada SPE MCX volume loading

sampel 1000 µl dan volume eluen amonium hidroksida 5% dalam metanol 10 mL

merupakan metode optimum untuk ekstraksi dan clean up sampel jamu

B. Saran

Perlu dilakukan otomatisasi untuk mengurangi human error (kesalahan

peneliti) pada penelitian.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

78

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S. dan Rasmussen, H., 2007, HPLC Method Developments for

Pharmaceutical, Elsevier Academic Press, Italy, pp.14,15,472.

Anonima, 2013, Allopurinol, http://www.chemicalize.org/structure/#!mol=allopuri

nol&source=fp, diakses tanggal 25 November 2013.

Anonimb, 2014, Traditional Medicine, http://www.who.int/topics/traditional_medi

cine/en/, diakses tanggal 8 April 2014.

Apotex NZ Ltd, 2011, APO-Allopurinol, Apotex NZ Ltd, New Zealand.

DechaCare, 2014, Allopurinol, http://www.dechacare.com/Allopurinol-

P630.htmL, diakses tanggal 8 April 2014.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979, Farmakope Indonesia, jilid III,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 73, 299, 1010.

Dewi, R.K., 2014, Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara

Spektrofotometri Dan Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase

Terbalik Serta Aplikasinya, Skripsi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, hal. 53-55, 137, 379-400.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan¸ ITB, Bandung, hal. 7-8

Harmita, 2006, Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi,

Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Depok, pp. 157-165.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

79

Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill Companies, USA,

pp. 578-586.

Jenkins, G.L., 1967, Quantitative Chemical Analysis 2nd

, W.H. Freeman and

Company, New York.

Johnson, E.L., Stevenson,R., 1978, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 22-24, 99.

Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No 661/MENKES/SK/

VII/1994, Tentang Persyaratan Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta.

Lennan, A.G.M., 2010, Practical Biochemistry for Medical Student, Rapid

analytical techniques for diagnosing and managing diabetes: Theory,

http://www.liv.ac.uk/~agmclen/Medpracs/practical_4/theory_4.htmL, diakses

tanggal 25 November 2013.

Martindale, 1999, The Complete Drug Reference, Pharmaceutical Press, USA, pp.

390-392.

Mayasari, 2009, Analisis Kandungan Metampiron di Kota Medan Tahun 2009,

Skripsi, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Sumatra Utara.

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,

Surabaya, hal. 26.

Mursyidi, A. dan Rohman, A., 2008, Pengantar Kimia Analisis Farmasi

Volumetri dan Gravimetri, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, hal

108-109.

Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2004, Tentang Ketentuan Pokok

Pengelompokan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia, Departemen

Kesehatan RI, Jakarta.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

80

Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2005, Kriteria dan Tata Laksana

Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka,

Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 003 Tahun 2010, Tentang

Saintifikasi Jamu Dalam Penelitian Berbasis Pelayanan Kesehatan,

Departemen Kesehatan RI, Jakarta

Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 007 tahun 2012, Tentang

Registrasi Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta

Refat, M.S., Mohamed, G.G., and Fathi, A., 2010, Spectrophotometric

Determination of Allopurinol Drug in Tablets: Spectroscopic

Characterization of the Solid CT Complexes, Bull Korean Chem Soc, 31(6),

1535-1542.

Rouessac F. dan Rouessac A., 2007, Chemical Analysis Modern Instrumentation

Methods and Techniques, 2nd

ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 18

Sari, M.K., 2014, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam

Matriks Tablet Obat Secara Spektrofotometri UV dan Matriks Sampel Jamu

Asam Urat Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, 2001, Dasar-Dasar Spektroskopi, Cetakan II, Penerbit Liberty,

Yogyakarta, pp. 22-23.

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition,

Saunders College Publishing, USA, pp. 383.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W., 2010, Introduction of Modern Liquid

Chromatography, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. Xl.

25, 28, 33, 40-42, 51-52, 71, 109, 151-152, 316, 327, 331.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

81

Suhendi, A., Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna EM., 2011, Aktivitas

Antihiperurisemia Ekstrak Air Jinten Hitam (Coleus ambonicus Lour) Pada

Mencit Jantan Galur Balb-C dan Standarisasinya, Majalah Farmasi

Indonesia 22(2), 78.

Sweetman L. and Nyhan W.L., 1969, Quantitation Of Oxypurines & Alopurinol

Metabolites In Biological Fluids By Cation Exchange Chromatography,

University of Miami School of Medicine.

Waters, 2008, OASIS SAMPLE PREPARATION, Waters Corporation, USA, pp. 7.

Yee, S.K., 2003, Regulatory Control Of Chinese Propretary Medicines in

Singapore, J.Healthy Policy, 15(2) pp. 71, 133-149.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

82

LAMPIRAN

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

83

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

84

Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

85

Lampiran 3. Penimbangan keseragaman bobot tablet alopurinol

No. Bobot tablet (mg) No. Bobot tablet (mg)

1. 307,9 11. 307,1

2. 310,1 12. 303,9

3. 311,4 13. 305,9

4. 306,4 14. 310,0

5. 307,5 15. 302,0

6. 305,6 16. 302,0

7. 306,0 17. 302,7

8. 309,2 18. 304,1

9. 305,6 19. 303.2

10. 304,4 20. 304,8

= 6119.8 SD = 2,74

= 306 CV = 0,9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

86

Lampiran 4. Penimbangan sampel A tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot

No. Bobot Sampel

Terukur (g)

Bobot Sampel Pada

Kemasan (g)

Selisih Bobot

Sampel (g)

1. 7.1548 7 0.1548

2. 7.0398 7 0.0398

3. 7.1258 7 0.1258

4. 7.2351 7 0.2351

5. 7.1984 7 0.1984

6. 6.9781 7 0.0219

7. 7.0983 7 0.0983

8. 7.1763 7 0.1763

9. 7.2063 7 0.2063

10. 6.9857 7 0.0143

11. 7.1049 7 0.1049

12. 6.9143 7 0.0857

13. 7.0936 7 0.0936

14. 7.0143 7 0.0143

15. 7.1254 7 0.1254

16. 7.0989 7 0.0989

17. 7.1259 7 0.1259

18. 6.9897 7 0.0103

19. 7.1560 7 0.1560

20. 7.1589 7 0.1589

7.0990 7 0.1122

SD = 0.0865

CV = 1.2184%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

87

Lampiran 5. Penimbangan sampel B tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot

No. Bobot Sampel

Terukur (g)

Bobot Sampel Pada

Kemasan (g)

Selisih Bobot

Sampel (g)

1. 7.1125 7 0.1125

2. 6.9402 7 0.0598

3. 7.1235 7 0.1235

4. 7.1987 7 0.1987

5. 6.9817 7 0.0183

6. 7.1994 7 0.1994

7. 7.0329 7 0.0329

8. 7.0104 7 0.0104

9. 6.9307 7 0.0693

10. 7.0129 7 0.0129

11. 7.0187 7 0.0187

12. 7.0998 7 0.0998

13. 7.0178 7 0.0178

14. 6.9109 7 0.0891

15. 7.1368 7 0.1368

16. 7.0954 7 0.0954

17. 7.1336 7 0.1336

18. 7.1824 7 0.1824

19. 6.9749 7 0.0251

20. 7.1992 7 0.1992

7.0656 7 0.0917

SD = 0.0942

CV = 1.3332%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

88

Lampiran 6. Penimbangan sampel C tiap kemasan untuk perhitungan

keseragaman bobot

No. Bobot Sampel

Terukur (g)

Bobot Sampel Pada

Kemasan (g)

Selisih Bobot

Sampel (g)

1. 7.1874 7 0.1874

2. 7.0298 7 0.0298

3. 7.1477 7 0.1477

4. 7.1939 7 0.1939

5. 6.9912 7 0.0088

6. 7.1478 7 0.1478

7. 6.9069 7 0.0931

8. 7.0495 7 0.0495

9. 7.1556 7 0.1556

10. 7.0474 7 0.0474

11. 7.1593 7 0.1593

12. 7.0814 7 0.0814

13. 6.9743 7 0.0257

14. 7.1141 7 0.1141

15. 7.1355 7 0.1355

16. 7.1302 7 0.1302

17. 7.1007 7 0.1007

18. 6.9148 7 0.0852

19. 7.0832 7 0.0832

20. 7.1959 7 0.1959

7.0873 7 0.1086

SD = 0.0876

CV = 1.2360%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

89

Lampiran 7. Penimbangan kalium biftalat

Penimbangan Kalium biftalat (g)

Berat kertas 0.4374

Berat kertas + zat 0.8375

Berat kertas + sisa 0.4377

Berat zat 0.3998

Lampiran 8. Standarisasi NaOH 0.1 N

Diketahui: bobot kalium biftalat : 0.3998 g = 399.8 mg

BM kalium biftalat : 204.2

Valensi kalium biftalat : 1

Volume NaOH : 21.35 mL

Rumus: N NaOH =

=

= 0.0917 N

Lampiran 9. Gambar hasil pembakuan NaOH 0.1 N

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

90

Lampiran 10. Perhitungan penimbangan sampel tablet alopurinol

Diketahui : Bobot rata-rata 20 tablet = 306 mg

Dosis obat = 100 mg

Penimbangan alopurinol setara 25 mg

Cara perhitungan:

= 77 mg

Lampiran 11. Penimbangan optimasi penyaringan

1. Baku untuk volume 10 mL x 2

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat kertas 0.3945 0.4011 0.3998

Berat kertas + zat 0.4451 0.4514 0.4502

Berat kertas + sisa 0.3949 0.4016 0.4003

Berat zat 0.0502 0.0498 0.0499

2. Baku untuk volume 20 mL x 1

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat kertas 0.4128 0.4229 0.4173

Berat kertas + zat 0.4630 0.4733 0.4675

Berat kertas + sisa 0.4132 0.4232 0.4176

Berat zat 0.0498 0.0501 0.0499

3. Sampel untuk volume 10 mL x 2

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat kertas 0.4211 0.4321 0.4403

Berat kertas + zat 0.4978 0.5089 0.5169

Berat kertas + sisa 0.4215 0.4324 0.4405

Berat zat 0.0763 0.0765 0.0764

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

91

4. Sampel untuk volume 20 mL x 1

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat kertas 0.4322 0.4215 0.4347

Berat kertas + zat 0.5091 0.4981 0.5114

Berat kertas + sisa 0.4326 0.4217 0.4349

Berat zat 0.0765 0.0764 0.0765

Lampiran 12. Bobot alopurinol, SD dan %CV

Cara

Penyaringan Replikasi Absorbansi

Bobot

Alopurinol (mg)

Rata-

rata SD % CV

Baku

10 mL x 2

1 0.545 23.8

24.4 0.60 2.4 2 0.555 24.3

3 0.569 25.0

20 mL x 1

1 0.540 23.6

23.2 0.32 1.4 2 0.529 23.1

3 0.526 23.0

Sampel

10 mL x 2

1 0.502 21.8

21.8 0.20 0.9 2 0.499 21.6

3 0.505 22.0

20 mL x 1

1 0.491 21.3

21.2 0.06 0.3 2 0.490 21.2

3 0.490 21.2

Lampiran 13. Penimbangan sampel tanpa SPE

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2891 0.2825

Berat kertas + zat 0.7896 0.7835

Berat kertas + sisa 0.2893 0.2831

Berat zat 0.5003 0.5004

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

92

Lampiran 14. Kromatogram sampel tanpa SPE

1. Replikasi 1

2. Replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

93

Lampiran 15. Penimbangan optimasi kapasitas kolom SPE

1. Kapasitas kolom 500 µl

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2713 0.2537

Berat kertas + zat 0.7725 0.7547

Berat kertas + sisa 0.2718 0.2543

Berat zat 0.5007 0.5004

2. Kapasitas kolom 750 µl

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2681 0.2782

Berat kertas + zat 0.7689 0.7791

Berat kertas + sisa 0.2684 0.2787

Berat zat 0.5005 0.5004

3. Kapasitas kolom 1000 µl

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2655 0.2893

Berat kertas + zat 0.7662 0.7899

Berat kertas + sisa 0.2658 0.2896

Berat zat 0.5004 0.5003

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

94

Lampiran 16. Kromatogram optimasi kapasitas kolom SPE

1. Fraksi asam asetat pada 500 μL sampel replikasi 1

2. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 500 μL sampel replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

95

3. Fraksi asam asetat pada 500 μL sampel replikasi 2

4. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 500 μL sampel replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

96

5. Fraksi asam asetat pada 750 μL sampel replikasi 1

6. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 750 μL sampel replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

97

7. Fraksi asam asetat pada 750 μL sampel replikasi 2

8. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 750 μL sampel replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

98

9. Fraksi asam asetat pada 1000 μL sampel replikasi 1

10. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 1000 μL sampel replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

99

11. Fraksi asam asetat pada 1000 μL sampel replikasi 2

12. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 1000 μL sampel replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

100

Lampiran 17. Tabel optimasi kapasitas kolom SPE

Volume loading ekstrak

+ 156 µg alopurinol

Volume

eluen Replikasi AUC AUC rata-rata

500 µl

10 mL

1 2790210 2802516

2 2814822

750 µl 1 2967215

2968156 2 2969097

1000 µl 1 3416997

3417248 2 3417498

Lampiran 18. Penimbangan optimasi volume eluen SPE

1. Volume eluen 5 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2643 0.2752

Berat kertas + zat 0.7651 0.7759

Berat kertas + sisa 0.2646 0.2755

Berat zat 0.5005 0.5004

2. Volume eluen 7.5 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2786 0.2714

Berat kertas + zat 0.7792 0.7719

Berat kertas + sisa 0.2788 0.2716

Berat zat 0.5004 0.5003

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

101

3. Volume eluen 12.5 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2739 0.2817

Berat kertas + zat 0.7745 0.7826

Berat kertas + sisa 0.2741 0.2822

Berat zat 0.5004 0.5004

Lampiran 19. Kromatogram optimasi volume eluen SPE

1. Volume eluen 5 mL amonia 5% dalam metanol

a. Replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

102

b. Replikasi 2

2. Volume eluen 7,5 mL amonia 5% dalam metanol

a. Replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

103

b. Replikasi 2

3. Volume eluen 12.5 mL amonia 5% dalam metanol

a. Replikasi 1 (10 mL)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

104

b. Replikasi 1 (2.5 mL)

c. Replikasi 2 (10 mL)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

105

d. Replikasi 2 (2.5 mL)

Lampiran 20. Tabel optimasi volume eluen SPE

Volume loading ekstrak

+ 156 µg alopurinol

Volume

eluen (mL) Replikasi AUC AUC rata-rata

1000 µl

5 1 3020511

3022990 2 3025468

7.5 1 3392390

3391966 2 3391542

12.5

10 1 3557676

3555910 2 3554143

2.5 1 0

0 2 0

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

106

Lampiran 21. Penimbangan optimasi volume kloroform

1. Sampel 2 x 3 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2874 0.2983

Berat kertas + zat 0.7886 0.7989

Berat kertas + sisa 0.2879 0.2985

Berat zat 0.5007 0.5004

2. Sampel 3 x 3 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2637 0.2589

Berat kertas + zat 0.7654 0.7595

Berat kertas + sisa 0.2645 0.2593

Berat zat 0.5009 0.5002

3. Sampel 4 x 3 mL

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)

Berat kertas 0.2766 0.2541

Berat kertas + zat 0.7771 0.7548

Berat kertas + sisa 0.2769 0.2545

Berat zat 0.5002 0.5003

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

107

Lampiran 22. Kromatogram optimasi volume kloroform

1. Kloroform 2 x 3 mL

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

108

2. Kloroform 3 x 3 mL

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

109

3. Kloroform 4 x 3 mL

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

110

Lampiran 23. Penimbangan baku untuk validasi SPE

Penimbangan

Rep

lik

asi

1

(g)

Rep

lik

asi

2

(g)

Rep

lik

asi

3

(g)

Rep

lik

asi

4

(g)

Rep

lik

asi

5

(g)

Berat kertas 0.2874 0.2769 0.2813 0.2798 0.2886

Berat kertas + zat 0.3124 0.3019 0.3063 0.3048 0.3136

Berat kertas + sisa 0.2874 0.2769 0.2813 0.2798 0.2886

Berat zat 0.0250 0.0250 0.0250 0.0250 0.0250

Lampiran 24. Penimbangan sampel untuk validasi SPE

Penimbangan

Rep

lik

asi

1

(g)

Rep

lik

asi

2

(g)

Rep

lik

asi

3

(g)

Rep

lik

asi

4

(g)

Rep

lik

asi

5

(g)

Berat kertas 0.2938 0.2897 0.2911 0.2931 0.2908

Berat kertas + zat 0.7945 0.7904 0.7919 0.7939 0.7915

Berat kertas + sisa 0.2941 0.2899 0.2916 0.2934 0.2912

Berat zat 0.5004 0.5005 0.5003 0.5005 0.5003

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

111

Lampiran 25. Kromatogram validasi SPE

1. Konsentrasi 5 ppm replikasi 1

2. Konsentrasi 5 ppm replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

112

3. Konsentrasi 5 ppm replikasi 3

4. Konsentrasi 5 ppm replikasi 4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

113

5. Konsentrasi 5 ppm replikasi 5

6. Konsentrasi 15 ppm replikasi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

114

7. Konsentrasi 15 ppm replikasi 2

8. Konsentrasi 15 ppm replikasi 3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

115

9. Konsentrasi 15 ppm replikasi 4

10. Konsentrasi 15 ppm replikasi 5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

116

11. Konsentrasi 30 ppm replikasi 1

12. Konsentrasi 30 ppm replikasi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

117

13. Konsentrasi 30 ppm replikasi 3

14. Konsentrasi 30 ppm replikasi 4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

118

15. Konsentrasi 30 ppm replikasi 5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

119

Lampiran 26. Hasil recovery dan % CV validasi SPE

Replikasi

Jumlah loading

alopurinol

dalam ekstrak

sampel (ng)

AUC

Bobot

alopurinol

(ng)

%

Recovery

Rata-rata

%

Recovery

SD %

CV

1

-

17983 11.17

- - - -

2 18710 11.19

3 18677 11.19

4 - 10.76

5 - 10.76

Rata-rata 11.01

1

11.5

274265 17.04 52.39

51.91 0.57 1.09

2 272643 17.00 52.07

3 272522 17.00 52.04

4 266917 16.87 50.93

5 272972 17.01 52.13

1

51.5

1585120 47.05 69.97

70.31 0.19 0.28

2 1594483 47.26 70.38

3 1595477 47.28 70.43

4 1595455 47.28 70.43

5 1593767 47.24 70.35

1

81.9

3566872 92.41 99.39

99.36 0.07 0.07

2 3562306 92.31 99.26

3 3564357 92.35 99.32

4 3567888 92.43 99.42

5 3568361 92.45 99.43

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

120

Lampiran 27. Penimbangan baku untuk pencucian SPE

Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat kertas 0.2741 0.2822 0.2796

Berat kertas + zat 0.2993 0.3075 0.3049

Berat kertas + sisa 0.2743 0.2825 0.2799

Berat zat 0.0250 0.0250 0.0250

Lampiran 28. Kromatogram hasil pencucian SPE

1. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 1 elusi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

121

2. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 1 elusi 2

3. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 2 elusi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

122

4. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 2 elusi 2

5. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 3 elusi 1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

123

6. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 3 elusi 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

124

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul Optimasi Isolasi Alopurinol

Dalam Sediaan Tablet dan Jamu memiliki nama lengkap

Sugiarto Adji Soenarso. Penulis dilahirkan di Jakarta

pada tanggal 20 Februari 1992 sebagai anak pertama

dari dua bersaudara, dari pasangan Paulus Heru Adji

Soenarso dan Lucia Leni. Pendidikan formal yang

pernah ditempuh penulis adalah menyelesaikan

pendidikannya di SDK Triana II Bekasi (1998-2004),

SMP Marsudirini Marganingsih Muntilan (2004-2007),

SMA Marsudirini Muntilan (2007-2010). Penulis

melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2010. Selama menempuh

pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis aktif dalam

berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas

(BEMF) Farmasi sebagai koordinator divisi Teknologi Informasi (TI) tahun 2011-

2012, Ketua Expo Paingan Festival 2011, Pelepasan Wisuda sebagai seksi

dokumentasi tahun 2011 dan ketua panitia tahun 2013, Panitia Seminar Nasional

sebagai koordinator seksi perlengkapan tahun 2011, Panitia Photo Exhibition

sebagai seksi perlengkapan tahun 2010. Di bidang non akademik, penulis pernah

mengikuti perlombaan basket. Di bidang akademik, penulis pernah menjadi

asisten dosen praktikum Kimia Analisis (2013 dan 2014), Analisis Farmasi

(2014), Validasi Metode Analisis (2014), dan Pharmaceutical Analysis (2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI