of 74 /74
PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Anna Karina Algustie NIM : 058114012 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIKeywords:lymphocyte proliferation,malerat,ethanolic extract,neem’s leaf PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN

  • Author
    others

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIKeywords:lymphocyte proliferation,malerat,ethanolic...

  • PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

    (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

    PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

    SKRIPSI

    Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

    Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

    Program Studi Ilmu Farmasi

    Oleh :

    Anna Karina Algustie

    NIM : 058114012

    FAKULTAS FARMASI

    UNIVERSITAS SANATA DHARMA

    YOGYAKARTA

    2009

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • ii

    PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

    (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

    PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

    SKRIPSI

    Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

    Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

    Program Studi Ilmu Farmasi

    Oleh :

    Anna Karina Algustie

    NIM : 058114012

    FAKULTAS FARMASI

    UNIVERSITAS SANATA DHARMA

    YOGYAKARTA

    2009

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • iii

    PERSETUJUAN PEMBIMBING

    PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

    (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

    PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

    Yang diajukan oleh :

    Anna Karina Algustie

    NIM : 058114012

    Skripsi ini telah disetujui oleh:

    Pembimbing

    (Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)

    Tanggal: 5 Desember 2008

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • iv

    Pengesahan Skripsi

    Berjudul

    PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

    (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

    PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

    Oleh :

    Anna Karina Algustie

    NIM : 058114012

    Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

    Fakultas Farmasi

    Universitas Sanata Dharma

    pada tanggal : 10 Januari 2009

    Mengetahui

    Fakultas Farmasi

    Universitas Sanata Dharma

    Dekan

    (Rita Suhadi, M.Si.,Apt.)

    Pembimbing

    (Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)

    Panitia Penguji:

    1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt. 1……………………

    2. Rm. Drs. P. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J. 2……………………

    3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. 3……………………

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • v

    Dalam hidup ini meminta sesuatu adalah suatu hal biasa

    namun memberi dan mensyukuri segala sesuatu adalah

    suatu hal lain yang luar biasa

    Legenda Pribadi datang menghampiri semua

    orang, namun hanya beberapa saja yang berani

    menjawab panggilannya…

    Aku ingin bermimpi, kemudian...berlayar!!!

    Karya ini kupersembahkan untuk

    Tuhan Yesus yang selalu menemani setiap lamgkah hidupku

    Mami, Papi, De’Donny, De’Puput, De’Sasa Hikoza-ku, I love you

    Almamaterku

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

    UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

    Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

    Nama : Anna Karina Algustie

    Nomor Mahasiswa : 058114012

    Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

    Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Pengaruh Ekstrak

    Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss) terhadap Proliferasi Sel

    Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar beserta perangkat yang diperlukan

    (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas

    Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain,

    mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan

    mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis

    tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya

    selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

    Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

    Dibuat di Yogyakarta

    Pada tanggal: 11 Januari 2009

    Yang menyatakan,

    (Anna Karina Algustie)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • vi

    PRAKATA

    Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan

    berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh

    Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap Proliferasi

    Sel Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi

    salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi

    Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

    Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bimbingan,

    bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin

    mengucapkan terima kasih kepada:

    1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing, yang

    selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama

    penyusunan skripsi.

    2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah

    berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan

    yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik.

    3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan

    menguji dan memberikan masukan dan saran.

    4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam

    identifikasi dan determinasi tumbuhan.

    5. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata

    Dharma.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • vii

    6. Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Kayat, Mas Yuwono, Mas

    Andri, Mas Sigit, Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi

    Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan

    bantuan.

    7. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Mbak Istini, dan segenap karyawan LPPT UGM

    yang telah banyak membantu dan menemani dalam penelitian skripsi ini.

    8. Mami, Papi, dan adik-adikku yang selalu menyemangatiku dan

    mendoakanku. Untuk kasih sayang yang luar biasa.

    9. Agustinus Titis Iswara atas cinta yang luar biasa dan motivasi untuk tidak

    pernah menyerah.

    10. Illon, Rias, Yesika, Anni atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh

    kesah selama penyusunan skripsi ini.

    11. Sekar, Nolen, Lina “boy”, Tami, Anni, Imelda, Mitha, teman-teman UKK

    “A”, teman-teman FKK ‘05 dan teman-teman kost atas dukungan,

    kebersamaan, dan kesediannya untuk berbagi suka dan duka selama ini.

    12. Nur’aniyah, Ratna, Cawas, Cicil atas masukan yang sangat berguna dalam

    penyelesaian skripsi ini.

    13. Teman-teman angkatan 2005 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

    atas kebersamaannya.

    14. Semua pihak yang telah banyak memberikan dukungan dalam

    penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • viii

    Penulis menyadari tulisan ini masih banyak kekurangan dan kesalahan.

    Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atas tulisan ini. Penulis

    berharap tulisan ini berguna untuk perkembangan ilmu kefarmasian.

    Penulis

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • ix

    PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

    Saya menyatakan bahwa sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

    memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

    kutipan dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.

    Yogyakarta, 6 November 2008

    Penulis,

    Anna Karina Algustie

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • x

    ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

    mg : miligram

    ml : mililiter

    rpm : rotasi per menit

    FBS : Fetal Bovine Serum

    MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

    reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

    RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

    SDS : Sodium Dodesil Sulfat

    96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat

    menanam sel pada uji sitotoksisitas

    ADCC : Antibody Dependent Cytotoxic Cell

    CTL : Cell T Lymphocyte

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xi

    INTISARI

    Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap suatu penyakit.

    Tanaman mimba adalah salah satu tanaman yang diduga dapat meningkatkan

    sistem imun tubuh. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa

    eksrak air daun dan kulit batang mimba berkhasiat meningkatkan sistem imun.

    Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik daun mimba

    terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit dan berapa besar persentase

    peningkatan proliferasi sel limfosit.

    Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan

    acak lengkap pola satu arah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak

    etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B.

    Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menghitung

    kultur sel limfosit yang diambil dari limpa tikus jantan dengan metode MTT (3-

    (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh

    kemudian diolah secara statistik dengan uji Kruskal Wallis.

    Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba

    mempunyai aktifitas imunostimulan dengan meningkatkan proliferasi sel limfosit.

    Peningkatan proliferasi sel limfosit terjadi pada kelompok perlakuan dosis 35

    mg/kgBB, 70 mg/kgBB dan 140 mg/kgBB dengan peningkatan proliferasi sel

    limfosit sebesar 56,83%; 62,30 % dan 59,18% terhadap kontrol negatif.

    Kata kunci : proliferasi sel limfosit, tikus jantan, ekstrak etanolik, daun mimba

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xii

    ABSTRACT

    Immune system protects the body from many diseases. Neem is plant

    which is expected to increase immune system. Various researches had been done

    previously show that water extract of neem’s bark increased immune system. The

    purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf

    on lymphocyte proliferation and to determine the percentage of the increasing of

    lymphocyte proliferation.

    This research is a pure experimental research with the complete random

    design one way pattern. Wistar male rats were given ethanolic extract of neem’s

    leaf and induced by hepatitis B vaccine. Lymphocyte proliferation was measured

    by using MTT method (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

    bromide). The result was analysed statistically by using Kruskal-Wallis test.

    The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf shows

    immunostimulant activity to lymphocyte proliferation. Immunostimulant effect is

    achieved at the dose of 35;70;140 mg/kgBB with the percentage of proliferation

    increase are 56,83%; 62,30% and 59,18%, respectively.

    Key words: lymphocyte proliferation, male rat, ethanolic extract, neem’s leaf

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xiii

    DAFTAR ISI

    Halaman

    HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii

    HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... iii

    HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv

    HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v

    PRAKATA.................................................................................................... vi

    PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

    ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ............................................. x

    INTISARI ..................................................................................................... xi

    ABSTRACT.................................................................................................... xii

    DAFTAR ISI................................................................................................. xiii

    DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi

    DAFTAR GAMBAR.................................................................................... xvii

    DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii

    BAB I PENGANTAR.................................................................................. 1

    A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

    1. Rumusan masalah ....................................................................... 2

    2. Keaslian penelitian...................................................................... 3

    3. Manfaat penelitian ...................................................................... 3

    B. Tujuan .................................................................................................. 4

    1. Tujuan umum……...................................................................... 4

    2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xiv

    BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 5

    A. Azadirachta indica A. Juss .................................................................. 5

    B. Sistem Imun.......................................................................................... 7

    C. Imunomodulator……………............................................................... 9

    D. Limfosit……….................................................................................... 9

    E. Antigen................................................................................................. 10

    1. Vaksin Hepatitis.......................................................................... 11

    2. Hepavax-Gene®........................................................................... 11

    F. Ekstraksi............................................................................................... 12

    G. MTT ..................................................................................................... 13

    H. Kerangka Pemikiran............................................................................. 14

    I. Hipotesis .............................................................................................. 14

    BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 15

    A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 15

    B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional................................... 15

    1. Variabel bebas............................................................................. 15

    2. Variabel tergantung..................................................................... 15

    3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 15

    4. Variabel pengacau tak terkendali................................................ 16

    5. Definisi operasional .................................................................... 16

    C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 16

    1. Alat ............................................................................................ 16

    2. Bahan .......................................................................................... 17

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xv

    D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 18

    1. Determinasi tanaman................................................................... 18

    2. Pengumpulan daun mimba.......................................................... 18

    3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba .................................. 18

    4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji...... 18

    5. Induksi antigen............................................................................ 19

    6. Kulturisasi sel limfosit ................................................................ 19

    7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit......................... 20

    E. Analisis Hasil....................................................................................... 20

    BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22

    A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia........................ 22

    B. Hasil Ekstraksi ..................................................................................... 23

    C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji ................................................... 24

    D. Hasil Isolasi Sel Limfosit..................................................................... 27

    E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit.............. ..................... 28

    BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 33

    A. Kesimpulan .......................................................................................... 33

    B. Saran .................................................................................................... 33

    DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 35

    LAMPIRAN.................................................................................................. 38

    BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 55

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xvi

    DAFTAR TABEL

    Halaman

    Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar

    Deviasi Setelah Inkubasi selama 72 jam..................................... 29

    Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit

    Kelompok Perlakuan Dibandingkan Kelompok Kontrol............ 31

    Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan

    Selama Masa Perlakuan .............................................................. 41

    Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan

    Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba................................... 42

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xvii

    DAFTAR GAMBAR

    Halaman

    Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh......................... 8

    Gambar 2. Skema Kerja Penelitian............................................................ 21

    Gambar 3. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama

    Masa Perlakuan....................................................................... 25

    Gambar 4. Foto Histologi Hepar................................................................ 27

    Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup ....................................................... 28

    Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan ................................... 29

    Gambar 7. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan

    Perlakuan.................................................................................. 30

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • xviii

    DAFTAR LAMPIRAN

    Halaman

    Lampiran 1. Perhitungan Dosis ................................................................. 39

    Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu ............................. 41

    Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit ............................................... 42

    Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif…………………....……. 42

    Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Shapiro Wilk dan Uji

    Homogenitas Data................................................................. 45

    Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis ... 46

    Lampiran 7. Uji Kruskal Wallis Kelompok Perlakuan Daun Mimba ....... 46

    Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit…. 47

    Lampiran 9. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)……………… 48

    Lampiran 10. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss) ……………........ 49

    Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba……………………….….…………… 50

    Lampiran 12. Ekstrak Etanolik Daun Mimba.............................................. 50

    Lampiran 13. 96-Well Plate ........................................................................ 51

    Lampiran 14. ELISA reader SLT 340 ATC............................................... 51

    Lampiran 15. Surat Pengesahan Determinasi.............................................. 52

    Lampiran 16. Hasil Histologi Hepar ............................................................. 53

    Lampiran 17. Surat Keterangan Penelitian ................................................... 54

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 1

    BAB I

    PENGANTAR

    A. Latar Belakang

    Dewasa ini banyak penyakit baru yang berkembang dan tingkat kematian

    karena berbagai penyakit tersebut terus meningkat. Hal ini dapat dicegah apabila

    tubuh mempunyai imunitas yang baik. Imunitas merupakan resistensi

    (pertahanan) tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas ini

    bersifat alami (bawaan) atau diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas

    yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non

    spesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh setelah

    pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat

    diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Oleh karena pentingnya imunitas

    tubuh, menurut pusat penelitian imun (Center for Immune Research) maka perlu

    adanya pemeliharaan sistem imun untuk mengurangi resiko melemahnya sistem

    imun tubuh, antara lain dengan: mengurangi stress, banyak berolahraga, asupan

    gizi yang cukup (buah, sayur, produk rendah lemak, suplemen makanan), dan

    istirahat yang cukup (Anonim, 2008a). Sistem imun tubuh yang baik akan

    meningkatkan respon imun terhadap antigen atau agen penyebab infeksi sehingga

    mencegah terjadinya gejala penyakit atau dapat juga mempercepat penyembuhan

    penyakit, dan dengan imunitas tubuh yang baik, secara umum diharapkan adanya

    peningkatan kesehatan masyarakat.

    Salah satu cara peningkatan sistem imun tubuh dengan suplemen

    makanan. Senyawa-senyawa yang diketahui dapat meningkatkan sistem imun

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 2

    disebut sebagai imunostimulan. Kebutuhan imunostimulan di masyarakat

    mulai meningkat dan untuk memenuhi kebutuhan tersebut telah dikembangkan

    beberapa produk herbal. Adanya peningkatan kebutuhan ini mendorong pencarian

    tanaman obat yang mempunyai efek imunostimulan. Salah satu tanaman yang

    telah dikenal mempunyai banyak manfaat kesehatan adalah tanaman mimba

    (Azadirachta indica A. Juss). Hampir semua bagian dari tanaman ini mempunyai

    manfaat bagi keseimbangan kehidupan, antara lain: pengusir serangga,

    antidiabetes, antimikroba, antifertilitas, antikanker dan diduga dapat pula

    meningkatkan sistem imun tubuh (Biswas, 2002). Sebelumnya telah diketahui

    bahwa kulit batang tanaman mimba mempunyai efek sebagai imunostimulan

    (Biswas, 2002). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba

    dapat meningkatkan antibodi (Ray, 1996).

    Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak

    etanolik daun mimba dalam peningkatan proliferasi sel limfosit yang berperan

    sebagai sel imunitas tubuh. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji

    dan in vitro dengan pengkulturan sel limfosit kemudian diukur perbedaan

    proliferasi sel limfosit dengan metode MTT.

    Dari penelitian ini diharapkan adanya pengembangan sediaan herbal

    yang mampu meningkatkan sistem imun sehingga imunitas tubuh meningkat dan

    tubuh dalam kondisi siap dalam menghadapi penyakit.

    1. Rumusan masalah

    a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel

    limfosit tikus jantan galur wistar?

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 3

    b. Berapa besar peningkatan proliferasi sel limfosit hewan uji dengan

    pemberian ekstrak etanolik daun mimba?

    2. Keaslian Penelitian

    Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian

    tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam meningkatkan proliferasi

    sel limfosit tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait

    dengan efek imunostimulan tanaman mimba antara lain: Efek Imunomodulator

    dari Minyak Mimba (Azadirachta indica A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi

    respon imun humoral dan seluler oleh Azadirachta indica (Mimba) pada mencit

    (Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM-76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak

    Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang

    Menghambat Perkembangan Murine Erlich Carcinoma dan B16 Melanoma

    (Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas

    anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).

    3. Manfaat Penelitian

    Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel

    limfosit ini diharapkan bermanfaat antara lain:

    a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu

    pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem

    imun tubuh dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

    b. manfaat praktis penelitian ini adalah pemanfaatan daun mimba sebagai

    peningkat sistem imun atau dapat dikembangkan menjadi sediaan herbal

    suplemen imunostimulan.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 4

    B. Tujuan

    1. Tujuan umum

    Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta

    indica A. Juss.) mempunyai efek imunostimulan.

    2. Tujuan Khusus

    a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat

    meningkatkan proliferasi sel limfosit

    b. Untuk mengetahui berapa besar peningkatan proliferasi sel dengan

    pemberian ekstrak etanolik

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 5

    5

    BAB II

    PENELAAHAN PUSTAKA

    A. Mimba

    1. Keterangan botani

    Pohon mimba dideskripsikan dengan nama A.indica pada awal 1830 oleh

    De Jussieus (Biswas, 2002). Posisi taksonomik mimba sebagai berikut:

    Divisi : Spermatophyta

    Subdivisi : Angiospermae

    Class : Dicotyledonae

    Ordo : Rutales

    Family : Meliaceae (keluarga mahogany)

    Genus : Azadirachta

    Species : Azadirachta indica A. Juss (Hutapea, 1993)

    Nama daerah : imba, mimba, membha, mempheuh (Anonim, 1989).

    Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10-15 m; Batang tegak, berkayu,

    bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong,

    melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan

    menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris;

    Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang,

    coklat (Hutapea, 1993).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 6

    2. Khasiat Mimba

    Selama ini, mimba digunakan sebagai pupuk tanah, repelan, insektisida,

    lubrikan, sabun, produk hygiene mulut, dan pengobatan tradisional. Bagian yang

    paling banyak diteliti dari mimba adalah digunakan dalam agrikultur sebagai

    biopestisida. Fraksi kasar dari berbagai bagian tanaman mimba yang terisolasi

    telah diketahui mempunyai efek sebagai antiinflamasi, antirematik, antiartitis,

    antipiretik, antimalaria, antimikroba, depresi sistem saraf pusat (SSP), antiulcer,

    antidiabetes, antitumor, antifertilitas, imunostimulan dan efek kardiovaskuler.

    Kandungan mimba dapat dibagi menjadi dua kelas mayor : isoprenoid dan

    lainnya. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid termasuk protomeliacin,

    limonoid, azadirone dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, tipe kandungan

    vilasinin dan C secomeliacins seperti nimbin, salanin dan azadirachtin.

    Kandungan nonisoprenoid meliputi protein (asam amino) dan karbohidrat

    (polisakarida), konponen sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya,

    dihidrocalcone, kumarin dan tannin, komponen alifatik, dan lainnya. Pada kulit

    batang mimba mengandung catechin dan NB II Peptidoglycan yang diduga

    mempunyai aktivitas imunomodulator (Biswas, 2002). Kandungan senyawa pada

    daun mimba antara lain: karbohidrat, β- sitosterol, calsium, fiber, magnesium,

    nimbaflavon, nimbolide, phosphorus, protein, quercetin, rutin (Duke, 1996).

    Penelitian tanaman mimba sebagai imunomodulator sudah banyak

    dilakukan, antara lain: Efek imunomodulator minyak mimba pada mencit

    menunjukkan adanya peningkatan proliferasi limfosit (Upadhyay, 1992); Ekstrak

    air daun mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 7

    menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody

    antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator dari NIM-76,

    suatu fraksi volatile dari biji mimba pada tikus. Pada pemberian NIM-76 dengan

    dosis 120 mg/kgBB terdapat peningkatan aktivitas makrofag dan respon

    proliferasi limfosit tikus (Sairam, 1997); Ekstrak air dari daun mimba

    meningkatkan sistem imun tubuh baik dengan peningkatan humoral (antibodi) dan

    sistem imun tergantung sel (Biswas, 2002) ; Preparat daun mimba dapat

    meningkatkan aktivasi imun yang menghambat perkembangan murine erlich

    carcinoma dan B16 melanoma dengan induksi proliferasi limfosit pada mencit

    galur swiss dan C57BL/6 (Baral, 2004). Preparat daun mimba meningkatkan

    respon imun Th 1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara

    dengan hasil peningkatan antibodi tergantung sel sitotoksik (ADCC) dan sel T

    sitotoksik (CTL) (Mandal, 2007).

    B. Sistem Imun

    Imunitas adalah suatu keadaan dimana tubuh resisten terhadap penyakit

    terutama penyakit infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan

    dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun sedangkan reaksi yang

    dikoordinasi sel-sel dan molekul-molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya

    disebut respon imun (Baratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan

    didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh

    melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan

    imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap

    suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 8

    sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam

    reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991).

    Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau

    monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari

    sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan

    merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri

    dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh

    antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang

    menghasilkan antibodi, sedangkan sel T (thymus derived) akan tersensitisasi

    menjadi sensitized T cells menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping

    itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada

    kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel

    plasma dan sensitized T cells (gambar 1). Memori imunologik dapat berada dalam

    bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan,

    1991).

    Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh (Anonim, 2008b)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 9

    C. Imunomodulator

    Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau

    sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen-

    komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi

    individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini

    menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit

    (Juyal, 2003).

    Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu

    imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah

    pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai

    komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).

    Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan

    resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah

    suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).

    Senyawa-senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain:

    rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat,

    asam oleanolik, asam ursolic. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan

    antara lain: phosphorus (Duke, 1996).

    D. Limfosit

    Limfosit adalah leukosit mononukleus dan tidak bergranula yang

    mempunyai inti berwarna gelap yang mengandung kromatin tebal dan sitoplasma

    yang berwarna biru pucat, suatu sel berinti satu berdiameter 7-12 µm yang

    mengandung inti dengan kromatin padat dan lingkaran kecil sitoplasma

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 10

    (Anonim,1998). Limfosit mencakup sel T dan sel B, yang mempunyai peran

    utama dalam imunitas (Brooks, 1995). Peningkatan dan penurunan konsentrasi sel

    ini mempengaruhi kesehatan (imunitas) tubuh untuk mengenali antigen asing dan

    penurunan respon imun (Dhote, 2005). Untuk terjadinya respons imun efektif

    harus terjadi peristiwa seluler yang rumit yang berurutan. Antigen harus terikat

    dan bila perlu diproses oleh sel penyaji antigen yang kemudian berhubungan dan

    mengaktifkan sel B dan sel T. Sel T helper harus membantu sel B dan prekursor

    sel T sitotoksik tertentu dan diperlukan mekanisme yang mampu melipatgandakan

    jumlah sel efektor berpotensi dengan cara proliferasi dan berdiferensiasi, untuk

    menghasilkan mediator imunitas humoral dan seluler. Integrasi dari interaksi

    seluler yang rumit yang terjadi in vivo, yang merupakan dasar respons imun,

    terjadi pada jaringan limfoid perifer atau sekunder, yang arsitekturnya teratur;

    yaitu kelenjar getah bening, limpa (Roitt, 1994)..

    E. Antigen

    Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat

    merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang

    sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi

    antibodi (Baratawidjaja, 2004). Secara fungsional antigen dibagi menjadi

    imunogen dan hapten. Hapten adalah molekul kecil yang dapat merangsang

    respon imun apabila diika oleh molekul besar. Kompleks antara hapten dan

    molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai

    imunogen (Baratawidjaja, 2004). Tidak semua antigen menimbulkan respon

    imunogenik, namun semua imunogen adalah antigen (Janeway, 1994). Bagian

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 11

    daerah hipervariabel antibodi yang berkontak dengan antigen diberi istilah paratop

    dan bagian antigen yang berkontak dengan paratop disebut epitop (Roitt, 1994).

    Antigen eksogen adalah antigen yang masuk dari luar tubuh, misalnya

    dengan inhalasi, ingesti atau injeksi. Oleh endositosis atau fagositosis, antigen ini

    kemudian dipresentasikan pada antigen presenting cells (APCs) dan diproses

    menjadi fragmen-fragmen. APCs kemudian mempresentasikan fragmen-fragmen

    tersebut pada sel T helper (CD4+) dengan menggunakan molekul

    histocompatibility kelas II pada permukaannya. Beberapa sel T spesifik terhadap

    peptida: komplek MHC. Mereka kemudian diaktifkan dan mulai menghasilkan

    sitokin. Sitokin adalah substansi yang dapat mengaktifkan limfosit T sitotoksik

    (CTL), antibodi dari sel B, makrofag, dan partikel lain (Anonim, 2008c).

    1. Vaksin Hepatitis B

    Vaksin hepatitis B adalah vaksin yang dikembangkan untuk mencegah

    infeksi virus hepatitis B. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan

    rekayasa genetik galur Saccharomyces cereviceae yang mengandung plasmid atau

    gen untuk antigen HbsAg (Baratawidjaja, 2004). Setelah injeksi vaksin sebanyak

    3 kali, suatu antibodi terhadap HbsAg akan mengalir di darah. Antibodi ini

    dikenal sebagai anti-HbsAg. Antibodi dan memori sistem imun kemudian

    menyediakan imunitas terhadap infeksi virus hepatitis B (Anonim, 2008d).

    2. Hepavax-Gene®

    Hepavax-Gene® adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen

    imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B

    (HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan Crucell’s propietary

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 12

    Hansenula polymorpha expression system. 1 ml vaksin mengandung 20 mcg

    HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax-Gene®

    adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif

    melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008e). Vaksin ini diproduksi oleh Berna

    Biotech Korea Corporation.

    F. Ekstraksi

    Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut

    supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia

    yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang

    tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).

    Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran

    etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan maserasi,

    perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian campuran etanol dan

    air dilakukan dengan cara maserasi dan perkolasi (Anonim, 1979).

    Maserasi adalah salah satu cara penyarian yang sederhana yang

    dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam cairan penyari. Cairan penyari

    akan menembus dinding rongga sel sehingga masuk dalam sel yang mengandung

    zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara

    larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat

    didesak keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang sehingga terjadi keseimbangan

    antara di dalam dan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia

    yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 13

    penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain

    (Anonim, 1986).

    Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit

    ditumbuhi kapang dan kuman dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,

    absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,

    dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

    Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida,

    kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,

    malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut, dengan demikian zat pengganggu

    yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

    G. MTT

    Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada

    uji proliferasi adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT,

    garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium

    bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di

    mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel

    karena tidak dapat menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO,

    isopropanol, atau pelarut yang tepat, maka produk formazan larut dan dibebaskan

    sehingga dapat diukur secara kolorimetri. Kemampuan enzim dehidrogenase

    mitokondria untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas

    mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel hidup. Pembacaan absorbansi

    dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate

    reader (Castell, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur

    sampel dalam jumlah banyak (Doyle, 2000).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 14

    H. Kerangka Pemikiran

    Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap segala macam

    antigen yang masuk dalam tubuh. Peranannya sangat penting untuk mencegah

    seseorang terserang penyakit. Karena fungsinya yang sangat penting inilah,

    dibutuhkan sistem imun yang kuat. Peningkatan sistem imun dapat dilakukan

    dengan cara pemberian suplemen makanan.

    Daun mimba merupakan salah satu tanaman obat yang diduga dapat

    digunakan sebagai imunostimulan. Daun mimba mempunyai kandungan rutin,

    quercetin, polisakarida, phosphorus yang mempunyai aktivitas sebagai

    imunomodulator. Berbagai penelitian efek imunomodulator daun mimba telah

    dipublikasikan, antara lain penelitian Ekstrak air kulit batang mimba telah terbukti

    mempunyai efek sebagai imunomodulator (Biswas, 2002); Ekstrak air daun

    mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral menyebabkan

    peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada

    mencit (Ray, 1996). Pemberian 120 mg/kgBB NIM-76, suatu fraksi menguap dari

    minyak mimba menunjukkan peningkatan aktivitas imunostimulan dengan

    mengaktifkan mekanisme imun yang diperantarai sel pada tikus (Sairam, 1997).

    Penelitian ini adalah penelitian awal penemuan senyawa dari tanaman

    yang berefek sebagai imunostimulan dengan cara peningkatan proliferasi sel

    limfosit.

    I. Hipotesis

    Ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) mempunyai

    efek sebagai imunostimulan dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 15

    BAB III

    METODE PENELITIAN

    A. Jenis dan Rancangan Penelitian

    Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta indica A.

    Juss) terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar

    ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola

    satu arah.

    B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

    1. Variabel bebas

    Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu: 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB

    tikus, 140 mg/kg BB tikus.

    2. Variabel tergantung

    Besar kenaikan proliferasi sel limfosit

    3. Variabel pengacau terkendali

    a. Suhu pembuatan ekstrak etanolik, dikendalikan pada suhu ruangan 25oC–

    30oC.

    b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berumur 3

    bulan, berat badan 150-250 g

    c. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

    1640.

    d. Inkubasi sel limfosit dikendalikan dengan disimpan di inkubator dengan

    aliran 5% CO2 dan suhu 37oC.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 16

    e. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

    memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

    4. Variabel pengacau tak terkendali

    Kondisi fisiologis dan patologis hewan uji

    5. Definisi operasional

    a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang

    diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM

    berumur 3 bulan.

    b. Ekstrak etanolik daun mimba adalah hasil penyarian daun mimba dengan

    metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 70%.

    c. Imunostimulan ialah senyawa atau yang menyebabkan peningkatan

    sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan proliferasi sel imun.

    d. Peningkatan proliferasi sel limfosit adalah peningkatan pertumbuhan sel

    yang ditandai dengan peningkatan jumlah sel kelompok perlakuan

    dibandingkan dengan kontrol.

    C. Alat dan Bahan Penelitian

    1. Alat

    Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

    timbangan analitik (Sartorius), alumunium foil, alat bedah, alat injeksi (Terumo),

    magnetic stirrer, tabung sentrifuge (Nunc), autoklaf, swing rotor sentrifuge,

    inkubator (Memmett), mikropipet, autoklaf, lemari pendingin, cell counter, 96-

    well plate (Nunc), laminar air flow (Labquib), mikroskop (Olympus), ELISA

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 17

    reader (SLT 340 ATC), haemocytometer (Nebaueur), tissue (Nice), sarung

    tangan, masker.

    2. Bahan

    Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

    a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman,

    Yogyakarta

    b. Hewan uji tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan dengan berat badan

    150-250 g

    c. Etanol teknis 70%

    d. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac-gene®)

    e. Bahan untuk kulturisasi sel limfosit

    1) Media pencuci

    Media RPMI : RPMI 1640 (Sigma), NaHCO3 (Sigma), HEPES

    (Sigma), Aquabides steril

    2) Buffer lisis eritrosit :

    tris buffer ammonium klorida : tris base 0,17 M, NH4Cl 0,16 M

    3) Media penumbuh: Medium komplit

    a) Medium RPMI (Sigma)

    b) Fetal bovine serum (FBS) 10 % (Gibco)

    c) penisilin-streptomisin 1% v/v (Gibco)

    d) fungison 0,5%

    f. Bahan untuk uji proliferasi sel limfosit

    MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 18

    Buffer pelarut MTT : Phosphat buffered saline steril

    Reagen Stopper: Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N

    D. Tata Cara Penelitian

    1. Determinasi tanaman

    Determinasi daum mimba dilakukan di laboratorium Farmakognosi

    Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan

    dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen

    van den Brink, Jr., 1965).

    2. Pengumpulan daun mimba

    Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

    Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008.

    3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba

    Sepuluh bagian serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol teknis

    sebanyak 70 bagian (Anonim, 1986). Maserasi dilakukan selama 24-48 jam

    dengan pengadukan terus-menerus menggunakan shaker. Filtrat yang didapat

    kemudian disaring dan kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

    sampai sebagian besar etanol menguap dan terpisah dari filtrat. Filtrat yang

    didapat dikeringkan dengan oven. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan

    selanjutnya digunakan sebagai senyawa uji.

    4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji

    Tiga kelompok hewan uji, masing-masing kelompok hewan uji diberi

    perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35 mg/Kg BB, 70 mg/kg

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 19

    BB, 140 mg/kg BB secara peroral setiap hari selama 48 hari. Kelompok keempat

    diberi perlakuan aquades sebagai kontrol negatif.

    5. Induksi antigen

    Selama proses pemberian ekstrak mimba, hewan uji divaksinasi dengan

    antigen untuk memicu respon imun. Proses vaksinasi dilakukan setelah proses

    perlakuan dengan ekstrak etanolik selama 7 hari, masing-masing kelompok uji

    diinduksi dengan antigen sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke 7, 21, dan 35.

    6. Kulturisasi sel limfosit

    Setelah proses induksi antigen selesai, hewan uji dikorbankan dan

    diambil sel limfositnya dari organ limpa. Tikus diletakkan dalam posisi telentang,

    kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan

    alkohol 70%. Limpa diangkat dan diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm

    yang berisi 5 ml medium RPMI. Limpa dibersihkan dengan pinset steril dari

    organ dan jaringan yang mengikat. Limpa dicuci dibawah Laminar Air Flow

    (LAF) dengan jalan memindahkan Limpa dari satu cawan petri ke cawan petri

    berikutnya yang telah disiapkan (4-5 cawan petri berisi 10 ml medium tanpa

    serum pada masing-masing petri).

    Pada organ limpa dilakukan penyemprotan medium ke dalam organ

    dengan alat suntik 5 ml atau 10 ml dari berbagai posisi sampai organ tampak

    transparan dan didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung

    sentrifus 10 ml. sel disentrifus pada 1200 rpm 4oC selama 10 menit. Pellet yang

    didapat disuspensikan dalam 2 ml tris buffer ammonium klorida. Sel dicampur

    menggunakan pipet. Suspensi tersebut kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4o C

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 20

    selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dengan RPMI 2 kali

    dengan dara dipipet berulang-ulang dan disentrifus 1200 rpm 4oC selama 5 menit.

    Supernatan dibuang dan sel limfosit disuspensikan dengan medium komplit. Sel

    dihitung dengan hemositometer.

    7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit

    Dalam 96 well plate dimasukkan 100 µl suspensi sel dalam media

    RPMI yang sudah disterilkan dengan filter 0.22µl + 100µl senyawa antigen,

    inkubasi 3 x 24 jam, 10µl media kemudian diambil dari tiap-tiap sumuran lalu

    tambahkan 10 µl larutan 5 mg/ml MTT dalam PBS steril, inkubasi 4 jam.

    Tambahkan 100µl larutan stop (10 % SDS + HCl 0,01N dalam akuades). Inkubasi

    dilanjutkan 18-20 jam dan selanjutnya dibaca absorbansinya dengan

    menggunakan ELISA reader pada λ 550 nm.

    E. Analisis Hasil

    Untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan

    pengolahan data secara statistik. Data diuji normalitasnya, apabila distribusi data

    normal, uji statistik yang dilakukan adalah uji parametrik dengan ANOVA satu

    arah. Apabila distribusi data tidak normal, dilakukan uji non parametrik dengan

    Kruskal-Wallis.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 21

    Skema Penelitian

    Gambar 2. Skema Kerja Penelitian

    Proses Ekstraksi daun mimba

    Kontrol

    Aquades

    Isolasi Limfosit dari Organ Limpa Hewan Uji

    Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT

    Persiapan Penelitian

    Pengumpulan Daun Mimba

    Induksi Antigen

    Kelompok

    Perlakuan

    35mg/kgBB

    Kelompok

    Perlakuan

    70mg/kgBB

    Kelompok

    Perlakuan

    140mg/kgBB

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 22

    BAB IV

    HASIL DAN PEMBAHASAN

    A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia

    Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman

    Azadirachta indica A. Juss (Mimba) yang diambil dari Desa Gayamharjo,

    Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang dikumpulkan

    berasal dari satu pohon dan dalam sekali pemanenan. Hal ini bertujuan untuk

    menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun yang

    diambil. Umur daun yang dipilih tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda sehingga

    diperoleh kandungan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya dilakukan

    pemisahan daun dari tangkai daun, bagian tumbuhan yang lain, atau dari bahan

    asing yang ikut terbawa saat pemanenan daun mimba. Daun dicuci dengan air

    mengalir untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel.

    Daun yang sudah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari

    dengan ditutup kain hitam untuk mencegah kerusakan senyawa kemudian setelah

    daun cukup kering, daun dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 60o C selama

    24 jam sampai daun mudah dihancurkan. Daun kemudian diblender, diayak

    dengan ayakan yang mempunyai 154 lubang per 1 cm2 dan disimpan sebagai

    serbuk simplisia kering.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 23

    B. Hasil Ekstraksi

    Serbuk simplisia kering diekstraksi dengan pelarut etanol teknis 70%

    dengan metode maserasi untuk mendapatkan ekstrak etanolik daun mimba yang

    akan digunakan sebagai ekstrak uji. Penyari akan menembus dinding sel dan

    melarutkan zat aktif yang sesuai dengan kepolaran penyari. Karena adanya

    perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel yang lebih tinggi, maka

    zat aktif dalam sel tersebut akan terdesak keluar sampai terjadi kesetimbangan

    konsentrasi. Etanol dipilih sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit

    ditumbuhi kapang dan khamir dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,

    absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,

    dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

    Selain itu etanol juga melarutkan flavonoid, rutin, phosphorus yang merupakan

    senyawa-senyawa yang mempunyai efek sebagai imunomodulator. Metode

    penyarian yang dipilih adalah metode maserasi dengan pengadukan terus-menerus

    karena metode ini sederhana, mudah untuk dilakukan, tidak memerlukan panas

    tinggi dan dapat menyari secara efektif.

    Penyarian dilakukan dengan perbandingan 10 bagian serbuk disari dalam

    70 bagian cairan penyari (Anonim, 1986). Pengadukan secara terus-menerus

    dilakukan dengan shaker dan lama penyarian antara 24- 48 jam. Ekstrak yang

    didapat disaring dan diambil filtratnya kemudian dipekatkan dengan vaccum

    rotary evaporator sampai menjadi ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan

    oven pada suhu 40o – 60

    o C sampai didapat ekstrak kering. Pada pembuatan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 24

    ekstrak etanolik digunakan 1100 g serbuk dan kemudian didapat 72,36 g ekstrak

    etanolik kering. Ekstrak etanolik kering yang dihasilkan berwarna hitam.

    C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji

    Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang

    berusia ±12 minggu karena tikus pada usia ini telah dewasa sehingga sistem organ

    telah terbentuk dengan baik. Pemilihan hewan uji ini berdasarkan kemiripan

    dengan manusia dalam hal absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi

    (ADME) karena diharapkan penelitian ini dapat diaplikasikan pada manusia.

    Tikus dipilih sebagai hewan uji karena mempunyai ADME yang mirip manusia,

    mudah didapat, mudah ditangani selama masa perlakuan. Tikus yang digunakan

    adalah galur Wistar. Jenis kelamin tikus dipilih jantan karena lebih sedikit

    dipengaruhi hormon reproduksi sehingga variasi lebih sedikit dibanding tikus

    betina.

    Dalam penelitian menggunakan hewan uji, penting untuk memperhatikan

    perlakuan dan pemeliharaan hewan uji yang meliputi kebersihan kandang,

    kecukupan makanan dan minuman, lingkungan yang tenang dan nyaman (cahaya

    dan sirkulasi udara yang cukup) karena akan mempengaruhi kesahihan penelitian.

    Proliferasi sel limfosit diinduksi oleh antigen yang dipejankan, yaitu vaksin

    Hepatitis B sehingga faktor penginduksi yang lain perlu diminimalisir agar hasil

    tidak menjadi bias. Selama 48 hari hewan uji dipejani dengan ekstrak etanolik

    daun mimba. Dosis yang digunakan adalah 35 mg/kg BB, 70 mg/kgBB dan 140

    mg/kg BB tikus. Pemilihan dosis ini mengacu pada penelitian yang pernah

    dilakukan yaitu ekstrak air daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 25

    mempunyai efek peningkatan titer antibodi (Ray, 1996). Selain itu ada kelompok

    kontrol negatif yang mendapat perlakuan aquades. Rute pemberian yang dipilih

    adalah rute oral karena sama dengan rute yang digunakan pada manusia.

    Dalam penelitian ini pemantauan kesehatan dilihat dari penambahan

    berat badan tikus yang diukur setiap hari (Gambar 3). Tikus dengan kondisi

    patologis buruk cenderung mengalami penurunan berat badan secara drastis

    sehingga dapat menjadi tanda peringatan untuk melakukan perlakuan khusus.

    Selain untuk pemantauan kesehatan, pengukuran berat badan ini digunakan untuk

    penyesuaian volume pemberian ekstrak mimba pada setiap tikus sehingga

    pemberian ekstrak mimba sesuai dengan berat badan masing-masing tikus.

    Gambar 3. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan

    Pemberian ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertinggi

    menyebabkan perubahan warna dan konsistensi feses tikus. Setelah 3 minggu

    perlakuan warna feses tikus kehitaman dan konsistensinya menjadi lebih keras.

    Gejala ini mengindikasikan adanya kerusakan hepar karena pemejanan mimba

    dalam jangka waktu yang lama. Dari penelitian toksisitas akut ekstrak etanolik

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 26

    daun mimba diperoleh informasi bahwa potensi ketoksikan akut ekstrak etanolik

    daun mimba termasuk dalam kategori praktis tidak toksik (5-15 g/kgBB manusia)

    namun terjadi perubahan histopatologi pada hepar dengan pemejanan ekstrak

    etanolik daun mimba dosis 182 mg/kgBB mencit (Apriyanto, 2002). Berdasarkan

    informasi tersebut, penting untuk menyelidiki perubahan histopatologi hepar tikus

    terkait dengan perubahan warna dan konsistensi feses pada masa perlakuan. Hasil

    gambaran histologi hepar tikus kelompok dosis tertinggi (140 mg/kgBB tikus)

    antara lain terjadi penebalan dan muncul vakuola pada kapsula Glissoni (selaput

    pembungkus hepar), inflamasi, pelebaran sinusoid, hemorraghi pada daerah di

    sekitar kapsula Glissoni, hepatosit normal (Gambar 4). Perubahan histo hepar

    yang terjadi hampir sama dengan penelitian Apriyanto pada mencit yang dipejani

    ekstrak 182 mg/kgBB mencit, yaitu terjadi hemorraghi, inflamasi, serta pelebaran

    sinusoid. Pada penelitian Apriyanto terjadi degenerasi melemak yang tidak terjadi

    pada penelitian ini. Hal ini mungkin karena perubahan yang terjadi belum sampai

    mempengaruhi metabolisme lemak dalam hepar. Perubahan-perubahan yang

    terjadi pada hepar ini bersifat reversibel, yaitu dapat kembali seperti semula

    karena sel hepatosit hepar normal. Namun demikian, perlu berhati-hati untuk

    pemakaian ekstrak etanolik daun mimba dalam jangka waktu lama. Mimba juga

    dikenal mempunyai efek antifertilitas (Biswas, 2002) sehingga dianjurkan untuk

    tidak digunakan oleh wanita hamil.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 27

    (a) (b)

    Gambar 4. Histologi Hepar Tanpa Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Perbesaran

    400x) (a) Histologi Hepar dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba

    Dosis 140mg/kgBB (perbesaran 400x) (b) (i) hepatosit (ii) sinusoid (iii) kapsula

    glissoni (iv) vakuola (v) sel radang

    D. Hasil Isolasi Sel Limfosit

    Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa. Tujuan kultur

    sel ini adalah untuk mengetahui proliferasi sel limfosit yang ada di dalam limpa.

    Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa karena organ ini

    merupakan organ limfoid sekunder yang menghasilkan sel B dan sel T limfosit,

    tempat utama produksi antibodi dan sensitisasi sel T antigen spesifik, serta

    merupakan tempat terjadinya respon imun terhadap antigen yang masuk dalam

    sirkulasi darah.

    Pengambilan sel limfosit dilakukan dengan metode ekstruksi limpa untuk

    dapat meminimalisir kerusakan sel limfosit selama proses isolasi. Metode

    ekstruksi dilakukan dengan cara menyuntikkan medium RPMI tanpa serum dalam

    organ berulang-ulang dari berbagai sisi sampai terjadi suspensi sel yang mengalir

    keluar dari organ.

    Selanjutnya suspensi sel ditambahkan buffer tris ammonium chlorida

    untuk melisiskan sel darah merah dan pellet dipisahkan dengan sentrifugasi.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 28

    Pemberian Fetal Bovine Serum (FBS) bertujuan untuk memacu pertumbuhan sel

    limfosit (growth factor), sebagai nutrisi dan membuat sel bertahan hidup lebih

    lama. Suspensi sel selanjutnya dihitung dengan hemocytometer untuk mengetahui

    kepadatan sel dari suspensi yang diperoleh dari isolasi. Perhitungan ini perlu

    dilakukan karena untuk melihat respon imun tidak dapat dilihat dari jumlah sel

    dalam suspensi karena jumlah sel ini sangat tergantung dari proses pengeluaran

    sel dari organ limpa. Setelah diketahui kepadatan suspensi, sejumlah volume

    suspensi tertentu diambil kemudian dikultur. Kepadatan yang diperlukan dalam

    medium 2,0 x 105 sel limfosit (Gambar 5).

    Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup ( Perbesaran 400x)

    E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit

    Metode uji peningkatan proliferasi limfosit yang digunakan dalam

    penelitian ini adalah metode MTT. Metode MTT dipilih karena pengukuran relatif

    cepat dengan pembacaan absorbansi yang dilakukan secara spektrofotometri

    dengan menggunakan multiwell ELISA reader. Selain itu metode ini aman karena

    tidak menggunakan bahan radioaktif. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

    diphenyltetrazolium bromide) merupakan suatu garam yang larut air. Metode

    MTT merupakan salah satu metode kolorimetri. Prinsip dari metode MTT yaitu

    terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 29

    NN

    NN

    S

    N

    CH3

    CH3NH

    N

    NN

    S

    N

    CH3

    CH3

    NADH

    NAD+

    MTT

    Br

    Formazan

    dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk kristal

    formazan yang berwarna ungu (Gambar 6).

    Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan

    Kristal formazan ini bersifat tidak larut air. Penambahan detergen

    (sodium dodesil sulfat 10%) yang terdapat dalam stopper reagent, akan

    melarutkan kristal formazan. Intensitas warna ungu yang terbentuk dapat dibaca

    dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Jumlah sel hidup

    berbanding lurus dengan intensitas warna dari formazan yang terbentuk.

    Data yang diperoleh dari pengukuran ini berupa absorbansi atau optical

    density (OD) suspensi sel (Tabel I) yang kemudian diolah secara statistik untuk

    mengetahui apakah ada perbedaan karena perlakuan dengan ekstrak etanolik daun

    mimba (Gambar 7).

    Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar Deviasi Setelah Inkubasi

    selama 72 jam

    Rata-rata Absorbansi Hasil Pengukuran Kultur Sel Limfosit

    Kelompok Rata-rata Absorbansi ± SD 1 Kontrol aquades 0,512 ± 0,079 2 Dosis 1 (35 mg/kg) 0,803 ± 0,133 3 Dosis 2 (70 mg/kg) 0,831 ± 0,062 4 Dosis 3 (140 mg/kg) 0,815 ± 0,049

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 30

    Gambar 7. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan

    Untuk melihat apakah ada perbedaan yang bermakna antar kelompok

    perlakuan dilakukan uji statistik dengan taraf kepercayaan sebesar 95%. Uji

    Statistik yang digunakan adalah uji Kruskal Wallis menggunakan program SPSS

    12,0. Uji Kruskal Wallis dipilih karena distribusi data tidak normal dan data tidak

    homogen. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan ada perbedaan yang signifikan

    antar kelompok perlakuan (P

  • 31

    dan interleukin 2 (IL-2) yang dapat memacu proliferasi sel limfosit. Pada ekstrak

    etanolik daun mimba terdapat flavonoid yang dapat meningkatkan produksi sel

    Th1 dan produksi IFN-γ namun dapat menurunkan sitokin Th2 (IL-4) sehingga

    dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit (Nair et al, 2002). Pengukuran yang

    dilakukan terhadap titer antibodi menunjukkan adanya penurunan IgG tikus

    karena pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dosis 70 mg/kgBB (Penelitian

    belum dipublikasi). Dari perbandingan hasil ini dapat diketahui bahwa ekstrak

    etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit namun juga

    dapat menurunkan produksi antibodi pada tikus. Hal ini mungkin karena

    flavonoid pada ekstrak etanolik daun mimba menurunkan produksi IL-4 yang

    merupakan salah satu sitokin yang membantu diferensiasi sel B menjadi sel

    plasma yang mampu memproduksi antibodi (Nair et al., 2002).

    Selain melihat adanya perbedaan antara kelompok kontrol dan kelompok

    perlakuan, dilihat juga persentase kenaikan proliferasi sel limfosit kelompok

    perlakuan terhadap kelompok kontrol (Tabel II).

    Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit Kelompok Perlakuan

    Dibandingkan Kelompok Kontrol

    Kontrol

    Aquades

    Perlakuan

    35mg/kgBB

    Perlakuan

    70mg/kgBB

    Perlakuan

    140mg/kgBB

    Kontrol

    Aquades - 56,83% 62,30% 59,18%

    Dilihat dari besarnya persentase kenaikan proliferasi sel limfosit, maka

    dosis yang memberikan peningkatan terbesar adalah perlakuan ekstrak etanolik

    daun mimba dengan dosis 70 mg/kgBB. Namun demikian tidak ada perbedaan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 32

    yang signifikan antara pemberian ekstrak etanolik dosis 35mg/kgBB dan dosis

    70mg/kgBB sehingga untuk pemilihan dosis lebih baik tetap menggunakan dosis

    yang rendah.

    Dari persentase kenaikan ini dapat dilihat bahwa peningkatan dosis tidak

    selalu diikuti dengan peningkatan efek. Pada perlakuan ekstrak mimba dosis 140

    mg/kgBB proliferasi lebih rendah dibanding pada dosis 70 mg/kgBB. Hal ini

    mungkin disebabkan karena ada efek maksimum peningkatan proliferasi sel

    limfosit dengan pemejanan ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertentu.

    Kemungkinan yang lain adalah efek toksisitas ekstrak etanol daun mimba

    menghambat proliferasi sel limfosit. Hal ini dapat diketahui lebih baik apabila

    dilakukan penelitian dengan seri dosis yang lebih banyak untuk mengetahui

    berapa dosis maksimum ekstrak etanolik daun mimba yang meningkatkan

    proliferasi sel limfosit.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 33

    BAB V

    KESIMPULAN DAN SARAN

    A. Kesimpulan

    1. Ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit pada

    dosis 35 mg/kgBB, 70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB.

    2. Peningkatan proliferasi sel limfosit kelompok perlakuan 35 mg/kgBB,

    70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba berturut-turut

    adalah sebesar 56,83%, 62,30%, dan 59,18%

    3. Hasil histologi hepar menunjukkan adanya perubahan pada organ hepar

    setelah pemejanan 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba, yaitu terjadi

    hemorraghi, inflamasi, pelebaran sinusoid dan penebalan kapsula glissoni.

    Perubahan ini masih reversibel selama sel hepatosit masih normal.

    B. Saran

    1. Perlu dilakukan penelitian ulang dengan seri dosis yang rendah dan lebih

    banyak untuk mengetahui profil efek imunostimulan yang dipengaruhi ekstrak

    etanolik daun mimba dan dosis yang optimum dari ekstrak etanolik daun

    mimba.

    2. Perlu dilakukan penelitian lanjut untuk mengetahui senyawa apa yang

    bertanggung jawab terhadap efek imunostimulan daun mimba. Penelitian

    dapat dilakukan dengan cara memfraksinasi dan mengisolasi senyawa-

    33

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 34

    senyawa dalam ekstrak etanolik daun mimba kemudian dilakukan uji

    peningkatan proliferasi sel limfosit.

    3. Perlu dilakukan penelitian lain untuk mengetahui mekanisme imunostimulan

    dari ekstrak etanolik daun mimba. Penelitian dapat dilakukan dengan melihat

    pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap respon imun nonspesifik,

    termasuk respon seluler dan humoral.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 35

    DAFTAR PUSTAKA

    Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 49-52, Departemen Kesehatan

    Republik Indonesia, Jakarta.

    Anonim, 1986, Sediaan Galenika, 10-16, Departemen Kesehatan Republik

    Indonesia, Jakarta

    Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Edisi V, 67-71, Departemen

    Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

    Anonim, 1998, Kamus Saku Kedokteran Dorland, Penerbit Buku Kedokteran

    EGC, Jakarta

    Anonim, 2000, Parameter standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan 1, 1-

    6, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

    Anonim, 2008a, Backgrounder: Understanding the Body’s Immune System,

    Center for Immune Research, http://www.immunereseach.com , diakses

    tanggal 29 Maret 2008

    Anonim, 2008b, immune respons, http://www.biol.sc.edu/courses/bio102/f97-

    39.html, diakses tanggal 3 November 2008

    Anonim, 2008c, Antigen, http://en.wikipedia.org/wiki/Antigen, diakses tanggal 1

    Oktober 2008

    Anonim, 2008d, Hepatitis B vaccine, http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_B

    _vaccine, diakses tanggal 1 Oktober 2008

    Anonim, 2008e, Product-Hepavax-Gene, http://www.crucell.com/Products-

    Hepavax-Gene, diakses tanggal 16 Oktober 2008

    Apriyanto, A., 2002, Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Mimba, Skripsi, 42-43,

    Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

    Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1963, Flora of Java, Volume

    I, 3-12, N. V. Noordhoff, Graningen

    Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume

    II, 116, 117, 121, N. V. Noordhoff, Graningen

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 36

    Baral, R., Chattopadhyay, U., 2004, Neem (Azadirachta indica) Leaf Mediated

    Immune Activation Causes Prophylactic Growth Inhibition of Murine

    Erlich Carcinoma and B16 Melanoma, Int. Immunopharmacol

    Mar;4(3):355-66, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYS

    TEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008

    Baratawidjaja, K.G., 2004, Imunologi Dasar ed ke-6, 413-414, Balai Penerbit

    FKUI, Jakarta

    Biswas, K., Ishita C., Ranajit K. B. and Uday B., 2002, Biological Activities and

    Medicinal Properties of Neem (Azadirachta indica), Current Science, vol.

    82, no. 11, 10 june 2002, www.ias.ac.in/currsci/jun102002/1336.pdf,

    diakses tanggal 25 April 2008

    Castell, J. V., and Gomez-Lechon, M. J., 1997, In Vitro Methods in

    Pharmaceutical Research, 3-6, Academic Press, California

    Cook, E.F., Martin, E.W., 1961, Remington’s Practice of Pharmacy, 120-127,

    The Mack Publishing Company, PA.

    Dhote, B. W., Singh G. K., dan Chauhan R.S., 2005, Effect of Immuplus (A

    Herbal Immunomodulator) on Paraspecific Immune Respones in Chicks,

    61, ISAH vol 2, Warsaw, Poland, www.isah-soc.org/documents/

    2005/sections/12_vol_2.pdf, diakses tanggal 21 April 2008

    Doyle, A., Griffiths J. B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

    12-15, 47, John Wiley and Sons, Ltd., England

    Duke, J., 1996, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases,

    Azadiractha indica A. Juss Activities, http://sun.ars-

    grin.gov:8080/npgspub/xsql/duke/plantdisp.xsql?taxon=146, diakses

    tanggal 13 Mei 2008

    Gan, V.H.S., dan Handoko, T., 1991, Farmakologi dan Terapi ed 3, 639 – 641,

    Gaya Baru, Jakarta

    Hutapea, J. R., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan LitBang

    kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

    Jain, S., Hariom Y., 2007, Cell Proliferation Assay, http://www.protocol-

    online.org/prot/, diakses tanggal 3 April 2008

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 37

    Juyal, P.D., Singla L.D., 2008, Herbal Immunomodulatory and Therapeutics

    Approaches to Control Parasitic Infection in Lifestock,

    http://hillagric.ernet.in/education/covas/vpharma/winter%20school/lecture

    s/24%20Herbal%20immunomodulatory%20approaches%20parasitic.pdf,

    diakses tanggal 25 April 2008

    Mandal, I., Chattopadhyay, U., and Baral R., 2007, Neem Preparation Enhances

    Th1 Type Immune Response and Anti-tumor Immunity Against Breast

    Tumor Associated Antigen, Cancer Immunity vol 7, p.8,

    http://www.cancerimmunity.org/v7p8/070308.htm, diakses tanggal 10 Mei

    2008

    Nair N, Mahajan S, Chawda R, Kandaswami C, Shanahan TC, Schwartz SA,

    2002, Grape seed extract activates Th1 cells in vitro, Clin Diagn Lab

    Immunol; 9: 470-476, http://www.pubmedcentral.com, diakses tanggal 13

    Desembar 2008

    Ray, A., Banerjee B.D., Sen P., 1996, Modulation of humoral and cell-mediated

    immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice, Indian J Exp

    Biol. 1996 Jul ;34 (7):698-701 8979510,

    http://lib.bioinfo.pl/pmid:8979510 biobank, diakses tanggal 10 Mei 2008

    Roitt, I.M., 1994, Essential Immunology 8th ed., diterjemahkan oleh Harahap,

    Alida, 76, 137, Penerbit Widya Medika, Jakarta

    Sagrawat, H., Khan Y., 2007, Immunomodulatory Plants: A

    Phytopharmacological Review, Pharmacognosy Reviews Vol 1, Issue 2,

    Jul-Dec, 2007, http://www.phcog.net/reviews/issue2/9.pdf, diakses tanggal

    10 Mei 2008

    Sairam M, Sharma S.K., Ilavazhagan G., Kumar D., Selvamurthy W., 1997,

    Immunomodulatory Effect of NIM-76, A Volatile Fraction from Neem

    Oil, J Ethnopharmacol, Jan; 55(2) :133-9,

    http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYSTEM.pdf, diakses

    tanggal 10 Mei 2008

    Upadhyay SN, Dhawan S, Garg S, and Talwar GP, 1992, Immunomodulatory

    effects of neem (Azadirachta indica) oil, Int J Immunopharmacol Oct;14(7) : 1187-93, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8979510?Dopt

    =Abstract, diakses tanggal 10 Mei 2008

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 38

    LAMPIRAN

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 39

    Lampiran 1. Perhitungan Dosis

    Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan Ray (1996), ekstrak air

    daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit mempunyai efek peningkatan titer

    antibodi. Dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah ½ x, 1x, dan 2x dosis

    acuan.

    Konversi dosis dari mencit 20 g ke tikus 200 g = 7,0

    Dosis I : ½ x 100 mg/kgBB mencit = 50 mg/kgBB

    Dosis pada mencit 20 g = x 50 mg/kgBB = 1 mg/20 g

    Dosis pada tikus 200 g = 1 mg/20 g x 7,0 = 7 mg/200 g

    Dosis per kgBB tikus = 7mg/200g x = 35 mg/kgBB

    Dosis II : 100 mg/kgBB mencit = 100 mg/kgBB

    Dosis pada mencit 20 g = x 100 mg/kgBB = 2 mg/20 g

    Dosis pada tikus 200 g = 2 mg/20 g x 7,0 = 14 mg/200 g

    Dosis per kgBB tikus = 14 mg/200g x = 70 mg/kgBB

    Dosis III : 2 x 100 mg/kgBB mencit = 200 mg/kgBB

    Dosis pada mencit 20 g = x 200 mg/kgBB = 4 mg/20 g

    Dosis pada tikus 200 g = 4 mg/20 g x 7,0 = 28 mg/200 g

    Dosis per kgBB tikus = 28 mg/200g x = 140 mg/kgBB

    Kelompok kontrol aquades :

    Volume pemberian per oral untuk tikus 200 g = 0,5 ml

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 40

    Perhitungan dosis antigen

    Antigen yang digunakan adalah Hepavax-Gene® dengan dosis 20 µg

    digunakan oleh masyarakat Indonesia dengan asumsi berat badan 50 kg.

    Konsentrasi antigen adalah 20 µg/ml

    Konversi dosis dari manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018

    Dosis untuk manusia 70 kg = x 20 µg = 28 µg

    Dosis antigen untuk tikus 200g = 0,018 x 28 µg = 0,504 µg/200 g

    Volume pemberian intraperitoneal = 2,5 ml

    Konsentrasi yang dibuat = = 0,202 µg/ml ~ 0,2 µg/ml

    Pengenceran dilakukan 100 x

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 41

    Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu

    Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan Selama Masa Perlakuan

    Profil Berat Badan Tikus Selama Masa Perlakuan

    Minggu

    I

    Minggu

    II

    Minggu

    III

    Minggu

    IV

    Minggu

    V

    Minggu

    VI

    Minggu

    VII

    191,8 215,5 230,4 262,8 276,0 289,3 281,3

    171,4 200,2 211,7 243,6 255,1 265,7 259,1

    195,8 224,8 236,0 271,6 281,7 299,3 284,1

    168,9 202,5 215,5 256,5 278,2 292,0 286,8

    186,6 197,1 210,1 229,9 245,2 255,8 262,1

    164,0 184,8 198,1 230,8 240,1 249,0 237,4

    Kontrol

    Aquades

    183,5 208,1 215,0 242,1 254,9 263,5 262,0

    Rata rata 180,3 204,7 216,7 248,2 261,6 273,5 267,5

    150,2 170,3 183,3 207,7 219,3 228,7 219,7

    174,8 188,6 202,5 216,6 227,1 246,9 247,4

    191,9 216,4 238,3 262,2 264,7 274,6 270,3

    158,9 181,2 199,0 213,0 220,8 223,2 213,0

    153,0 165,0 181,5 207,7 220,3 232,7 229,7

    180,1 199,4 210,4 221,0 231,1 243,2 240,8

    Perlakuan

    Dosis 1

    (35

    mg/kgBB)

    161,3 180,2 199,8 226,1 236,5 243,4 241,3

    Rata rata 167,2 185,9 202,1 222,0 231,4 241,8 237,5

    211,5 242,8 266,7 306,3 328,4 343,8 341,1

    189,2 211,1 227,9 249,2 256,4 257,8 252,2

    164,9 178,0 191,6 224,4 243,0 250,3 241,0

    164,8 186,5 207,2 220,0 228,8 239,2 233,3

    155,0 169,4 190,5 211,4 222,3 231,2 237,4

    167,9 184,0 206,3 232,6 248,5 256,8 254,7

    Perlakuan

    Dosis 2

    (70

    mg/kgBB)

    179,1 212,3 239,5 276,5 302,7 318,2 311,1

    Rata rata 176,1 197,7 218,5 245,8 261,4 271,0 267,3

    153,8 193,3 209,7 233,0 248,7 257,5 256,4

    184,5 211,9 214,5 234,4 246,3 253,3 246,8

    155,7 187,6 211,4 243,4 251,3 259,4 256,3

    140,9 158,9 164,2 186,6 211,7 223,1 233,4

    164,8 183,9 197,2 224,8 246,9 244,7 239,7

    187,7 175,5 195,0 225,7 247,9 249,5 240,6

    Perlakuan

    Dosis 3

    (140

    mg/kgBB)

    157,0 213,1 231,7 258,8 264,3 289,2 281,6

    Rata rata 163,5 189,2 203,4 229,5 245,3 253,8 250,7

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 42

    Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit

    Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik

    Daun Mimba

    Absorbansi

    Hewan

    Uji

    Kelompok

    Kontrol

    Aquades

    Kelompok

    Dosis 1

    (35mg/kgBB)

    Kelompok

    Dosis 2

    (70 mg/kgBB)

    Kelompok

    Dosis 3

    (140 mg/kgBB)

    1 0,410 0,917 0,876 0,729

    2 0,570 0,745 0,700 0,826

    3 0,431 0,661 0,834 0,805

    4 0,455 0,616 0,813 0,834

    5 0,603 0,825 0,872 0,781

    6 0,536 0,894 0,863 0,856

    7 0,582 0,962 0,856 0,877

    Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif Case Processing Summary

    Cases

    Valid Missing Total

    Dosis N Percent N Percent N Percent

    Absorbance kontrol 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

    D1 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

    D2 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

    D3 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 43

    Descriptives

    Dosis Statistic Std. Error

    Absorbance Kontrol Mean .51243 .029814

    95% Confidence Interval for Mean

    Lower Bound

    .43948

    Upper Bound .58538

    5% Trimmed Mean .51309

    Median .53600

    Variance .006

    Std. Deviation .078881

    Minimum .410

    Maximum .603

    Range .193

    Interquartile Range .151

    Skewness -.247 .794

    Kurtosis -2.183 1.587

    D1

    Mean

    .80286

    .050128

    95% Confidence Interval for Mean

    Lower Bound

    .68020

    Upper Bound .92552

    5% Trimmed Mean .80440

    Median .82500

    Variance .018

    Std. Deviation .132627

    Minimum .616

    Maximum .962

    Range .346

    Interquartile Range .256

    Skewness -.329 .794

    Kurtosis -1.606 1.587

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 44

    D2 Mean .8305 .023324 95%

    Confidence Interval for Mean

    Lower Bound

    .77350

    Upper Bound .88764

    5% Trimmed Mean .83530

    Median .85600

    Variance .004

    Std. Deviation .061709

    Minimum .700

    Maximum .876

    Range .176

    Interquartile Range .059

    Skewness -2.002 .794

    Kurtosis 4.238 1.587

    D3

    Mean

    .81543

    .018681

    95% Confidence Interval for Mean

    Lower Bound

    .76972

    Upper Bound .86114

    5% Trimmed Mean .81681

    Median .82600

    Variance .002

    Std. Deviation .049426

    Minimum .729

    Maximum .877

    Range .148

    Interquartile Range .075

    Skewness -.734 .794

    Kurtosis .420 1.587

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 45

    Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji

    Homogenitas Data Tests of Normality

    Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk

    Statistic Df Sig. Statistic df Sig.

    Absorbance .195 28 .008 .902 28 .012

    a Lilliefors Significance Correction

    Hasil uji normalitas data dengan uji Shapiro Wilk menunjukkan bahwa

    data tidak terdistribusi normal (P

  • 46

    Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis

    Kruskal-Wallis Test Ranks

    Dosis N Mean Rank

    Absorbance Kontrol 7 4.00

    D1 7 18.00

    D2 7 19.00

    D3 7 17.00

    Total 28

    Test Statistics(a,b)

    Absorbance

    Chi-Square 15.422

    Df 3

    Asymp. Sig. .001

    a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: Dosis

    Hasil Uji Kruskal Wallis: ada perbedaan signifikan antar kelompok (p0,05)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 47

    Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit

    Persentase kenaikan dihitung dari perbandingan absorbansi kelompok

    perlakuan dibanding kelompok kontrol.

    Persentase kenaikan = x 100%

    Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 35 mg/kgBB

    Persentase kenaikan = x 100 % = 56,83%

    Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 70 mg/kgBB

    Persentase kenaikan = x 100% = 62,30%

    Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 140 mg/kgBB

    Persentase kenaikan = x 100% = 59,18%

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 48

    Lampiran 9. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 49

    Lampiran 10. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss)

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 50

    Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba

    Lampiran 12. Ekstrak Etanol