PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Anna Karina Algustie

NIM : 058114012

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Anna Karina Algustie

NIM : 058114012

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PERSETUJUAN PEMBIMBING

PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

Yang diajukan oleh :

Anna Karina Algustie

NIM : 058114012

Skripsi ini telah disetujui oleh:

Pembimbing

(Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)

Tanggal: 5 Desember 2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iv

Pengesahan Skripsi

Berjudul

PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

Oleh :

Anna Karina Algustie

NIM : 058114012

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal : 10 Januari 2009

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

(Rita Suhadi, M.Si.,Apt.)

Pembimbing

(Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji:

1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt. 1……………………

2. Rm. Drs. P. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J. 2……………………

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. 3……………………

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

v

Dalam hidup ini meminta sesuatu adalah suatu hal biasa

namun memberi dan mensyukuri segala sesuatu adalah

suatu hal lain yang luar biasa

Legenda Pribadi datang menghampiri semua

orang, namun hanya beberapa saja yang berani

menjawab panggilannya…

Aku ingin bermimpi, kemudian...berlayar!!!

Karya ini kupersembahkan untuk

Tuhan Yesus yang selalu menemani setiap lamgkah hidupku

Mami, Papi, De’Donny, De’Puput, De’Sasa Hikoza-ku, I love you

Almamaterku

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Anna Karina Algustie

Nomor Mahasiswa : 058114012

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Pengaruh Ekstrak

Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss) terhadap Proliferasi Sel

Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar beserta perangkat yang diperlukan

(bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas

Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain,

mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan

mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis

tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya

selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal: 11 Januari 2009

Yang menyatakan,

(Anna Karina Algustie)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vi

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan

berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh

Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap Proliferasi

Sel Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi

salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi

Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bimbingan,

bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing, yang

selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama

penyusunan skripsi.

2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah

berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan

yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan

menguji dan memberikan masukan dan saran.

4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam

identifikasi dan determinasi tumbuhan.

5. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata

Dharma.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vii

6. Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Kayat, Mas Yuwono, Mas

Andri, Mas Sigit, Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan

bantuan.

7. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Mbak Istini, dan segenap karyawan LPPT UGM

yang telah banyak membantu dan menemani dalam penelitian skripsi ini.

8. Mami, Papi, dan adik-adikku yang selalu menyemangatiku dan

mendoakanku. Untuk kasih sayang yang luar biasa.

9. Agustinus Titis Iswara atas cinta yang luar biasa dan motivasi untuk tidak

pernah menyerah.

10. Illon, Rias, Yesika, Anni atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh

kesah selama penyusunan skripsi ini.

11. Sekar, Nolen, Lina “boy”, Tami, Anni, Imelda, Mitha, teman-teman UKK

“A”, teman-teman FKK ‘05 dan teman-teman kost atas dukungan,

kebersamaan, dan kesediannya untuk berbagi suka dan duka selama ini.

12. Nur’aniyah, Ratna, Cawas, Cicil atas masukan yang sangat berguna dalam

penyelesaian skripsi ini.

13. Teman-teman angkatan 2005 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

atas kebersamaannya.

14. Semua pihak yang telah banyak memberikan dukungan dalam

penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

viii

Penulis menyadari tulisan ini masih banyak kekurangan dan kesalahan.

Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atas tulisan ini. Penulis

berharap tulisan ini berguna untuk perkembangan ilmu kefarmasian.

Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan bahwa sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 6 November 2008

Penulis,

Anna Karina Algustie

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

x

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

mg : miligram

ml : mililiter

rpm : rotasi per menit

FBS : Fetal Bovine Serum

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat

menanam sel pada uji sitotoksisitas

ADCC : Antibody Dependent Cytotoxic Cell

CTL : Cell T Lymphocyte

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xi

INTISARI

Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap suatu penyakit.

Tanaman mimba adalah salah satu tanaman yang diduga dapat meningkatkan

sistem imun tubuh. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa

eksrak air daun dan kulit batang mimba berkhasiat meningkatkan sistem imun.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik daun mimba

terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit dan berapa besar persentase

peningkatan proliferasi sel limfosit.

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan

acak lengkap pola satu arah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak

etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B.

Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menghitung

kultur sel limfosit yang diambil dari limpa tikus jantan dengan metode MTT (3-

(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh

kemudian diolah secara statistik dengan uji Kruskal Wallis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba

mempunyai aktifitas imunostimulan dengan meningkatkan proliferasi sel limfosit.

Peningkatan proliferasi sel limfosit terjadi pada kelompok perlakuan dosis 35

mg/kgBB, 70 mg/kgBB dan 140 mg/kgBB dengan peningkatan proliferasi sel

limfosit sebesar 56,83%; 62,30 % dan 59,18% terhadap kontrol negatif.

Kata kunci : proliferasi sel limfosit, tikus jantan, ekstrak etanolik, daun mimba

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xii

ABSTRACT

Immune system protects the body from many diseases. Neem is plant

which is expected to increase immune system. Various researches had been done

previously show that water extract of neem’s bark increased immune system. The

purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf

on lymphocyte proliferation and to determine the percentage of the increasing of

lymphocyte proliferation.

This research is a pure experimental research with the complete random

design one way pattern. Wistar male rats were given ethanolic extract of neem’s

leaf and induced by hepatitis B vaccine. Lymphocyte proliferation was measured

by using MTT method (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide). The result was analysed statistically by using Kruskal-Wallis test.

The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf shows

immunostimulant activity to lymphocyte proliferation. Immunostimulant effect is

achieved at the dose of 35;70;140 mg/kgBB with the percentage of proliferation

increase are 56,83%; 62,30% and 59,18%, respectively.

Key words: lymphocyte proliferation, male rat, ethanolic extract, neem’s leaf

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xiii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v

PRAKATA.................................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ............................................. x

INTISARI ..................................................................................................... xi

ABSTRACT.................................................................................................... xii

DAFTAR ISI................................................................................................. xiii

DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi

DAFTAR GAMBAR.................................................................................... xvii

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii

BAB I PENGANTAR.................................................................................. 1

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

1. Rumusan masalah ....................................................................... 2

2. Keaslian penelitian...................................................................... 3

3. Manfaat penelitian ...................................................................... 3

B. Tujuan .................................................................................................. 4

1. Tujuan umum……...................................................................... 4

2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xiv

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 5

A. Azadirachta indica A. Juss .................................................................. 5

B. Sistem Imun.......................................................................................... 7

C. Imunomodulator……………............................................................... 9

D. Limfosit……….................................................................................... 9

E. Antigen................................................................................................. 10

1. Vaksin Hepatitis.......................................................................... 11

2. Hepavax-Gene®........................................................................... 11

F. Ekstraksi............................................................................................... 12

G. MTT ..................................................................................................... 13

H. Kerangka Pemikiran............................................................................. 14

I. Hipotesis .............................................................................................. 14

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 15

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 15

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional................................... 15

1. Variabel bebas............................................................................. 15

2. Variabel tergantung..................................................................... 15

3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 15

4. Variabel pengacau tak terkendali................................................ 16

5. Definisi operasional .................................................................... 16

C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 16

1. Alat ............................................................................................ 16

2. Bahan .......................................................................................... 17

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xv

D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 18

1. Determinasi tanaman................................................................... 18

2. Pengumpulan daun mimba.......................................................... 18

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba .................................. 18

4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji...... 18

5. Induksi antigen............................................................................ 19

6. Kulturisasi sel limfosit ................................................................ 19

7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit......................... 20

E. Analisis Hasil....................................................................................... 20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22

A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia........................ 22

B. Hasil Ekstraksi ..................................................................................... 23

C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji ................................................... 24

D. Hasil Isolasi Sel Limfosit..................................................................... 27

E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit.............. ..................... 28

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 33

A. Kesimpulan .......................................................................................... 33

B. Saran .................................................................................................... 33

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 35

LAMPIRAN.................................................................................................. 38

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 55

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar

Deviasi Setelah Inkubasi selama 72 jam..................................... 29

Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit

Kelompok Perlakuan Dibandingkan Kelompok Kontrol............ 31

Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan

Selama Masa Perlakuan .............................................................. 41

Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan

Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba................................... 42

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xvii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh......................... 8

Gambar 2. Skema Kerja Penelitian............................................................ 21

Gambar 3. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama

Masa Perlakuan....................................................................... 25

Gambar 4. Foto Histologi Hepar................................................................ 27

Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup ....................................................... 28

Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan ................................... 29

Gambar 7. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan

Perlakuan.................................................................................. 30

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Perhitungan Dosis ................................................................. 39

Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu ............................. 41

Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit ............................................... 42

Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif…………………....……. 42

Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Shapiro Wilk dan Uji

Homogenitas Data................................................................. 45

Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis ... 46

Lampiran 7. Uji Kruskal Wallis Kelompok Perlakuan Daun Mimba ....... 46

Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit…. 47

Lampiran 9. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)……………… 48

Lampiran 10. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss) ……………........ 49

Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba……………………….….…………… 50

Lampiran 12. Ekstrak Etanolik Daun Mimba.............................................. 50

Lampiran 13. 96-Well Plate ........................................................................ 51

Lampiran 14. ELISA reader SLT 340 ATC............................................... 51

Lampiran 15. Surat Pengesahan Determinasi.............................................. 52

Lampiran 16. Hasil Histologi Hepar ............................................................. 53

Lampiran 17. Surat Keterangan Penelitian ................................................... 54

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Dewasa ini banyak penyakit baru yang berkembang dan tingkat kematian

karena berbagai penyakit tersebut terus meningkat. Hal ini dapat dicegah apabila

tubuh mempunyai imunitas yang baik. Imunitas merupakan resistensi

(pertahanan) tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas ini

bersifat alami (bawaan) atau diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas

yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non

spesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh setelah

pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat

diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Oleh karena pentingnya imunitas

tubuh, menurut pusat penelitian imun (Center for Immune Research) maka perlu

adanya pemeliharaan sistem imun untuk mengurangi resiko melemahnya sistem

imun tubuh, antara lain dengan: mengurangi stress, banyak berolahraga, asupan

gizi yang cukup (buah, sayur, produk rendah lemak, suplemen makanan), dan

istirahat yang cukup (Anonim, 2008a). Sistem imun tubuh yang baik akan

meningkatkan respon imun terhadap antigen atau agen penyebab infeksi sehingga

mencegah terjadinya gejala penyakit atau dapat juga mempercepat penyembuhan

penyakit, dan dengan imunitas tubuh yang baik, secara umum diharapkan adanya

peningkatan kesehatan masyarakat.

Salah satu cara peningkatan sistem imun tubuh dengan suplemen

makanan. Senyawa-senyawa yang diketahui dapat meningkatkan sistem imun

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2

disebut sebagai imunostimulan. Kebutuhan imunostimulan di masyarakat

mulai meningkat dan untuk memenuhi kebutuhan tersebut telah dikembangkan

beberapa produk herbal. Adanya peningkatan kebutuhan ini mendorong pencarian

tanaman obat yang mempunyai efek imunostimulan. Salah satu tanaman yang

telah dikenal mempunyai banyak manfaat kesehatan adalah tanaman mimba

(Azadirachta indica A. Juss). Hampir semua bagian dari tanaman ini mempunyai

manfaat bagi keseimbangan kehidupan, antara lain: pengusir serangga,

antidiabetes, antimikroba, antifertilitas, antikanker dan diduga dapat pula

meningkatkan sistem imun tubuh (Biswas, 2002). Sebelumnya telah diketahui

bahwa kulit batang tanaman mimba mempunyai efek sebagai imunostimulan

(Biswas, 2002). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba

dapat meningkatkan antibodi (Ray, 1996).

Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak

etanolik daun mimba dalam peningkatan proliferasi sel limfosit yang berperan

sebagai sel imunitas tubuh. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji

dan in vitro dengan pengkulturan sel limfosit kemudian diukur perbedaan

proliferasi sel limfosit dengan metode MTT.

Dari penelitian ini diharapkan adanya pengembangan sediaan herbal

yang mampu meningkatkan sistem imun sehingga imunitas tubuh meningkat dan

tubuh dalam kondisi siap dalam menghadapi penyakit.

1. Rumusan masalah

a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel

limfosit tikus jantan galur wistar?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3

b. Berapa besar peningkatan proliferasi sel limfosit hewan uji dengan

pemberian ekstrak etanolik daun mimba?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian

tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam meningkatkan proliferasi

sel limfosit tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait

dengan efek imunostimulan tanaman mimba antara lain: Efek Imunomodulator

dari Minyak Mimba (Azadirachta indica A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi

respon imun humoral dan seluler oleh Azadirachta indica (Mimba) pada mencit

(Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM-76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak

Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang

Menghambat Perkembangan Murine Erlich Carcinoma dan B16 Melanoma

(Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas

anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).

3. Manfaat Penelitian

Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel

limfosit ini diharapkan bermanfaat antara lain:

a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu

pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem

imun tubuh dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

b. manfaat praktis penelitian ini adalah pemanfaatan daun mimba sebagai

peningkat sistem imun atau dapat dikembangkan menjadi sediaan herbal

suplemen imunostimulan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

4

B. Tujuan

1. Tujuan umum

Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta

indica A. Juss.) mempunyai efek imunostimulan.

2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat

meningkatkan proliferasi sel limfosit

b. Untuk mengetahui berapa besar peningkatan proliferasi sel dengan

pemberian ekstrak etanolik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Mimba

1. Keterangan botani

Pohon mimba dideskripsikan dengan nama A.indica pada awal 1830 oleh

De Jussieus (Biswas, 2002). Posisi taksonomik mimba sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Class : Dicotyledonae

Ordo : Rutales

Family : Meliaceae (keluarga mahogany)

Genus : Azadirachta

Species : Azadirachta indica A. Juss (Hutapea, 1993)

Nama daerah : imba, mimba, membha, mempheuh (Anonim, 1989).

Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10-15 m; Batang tegak, berkayu,

bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong,

melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan

menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris;

Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang,

coklat (Hutapea, 1993).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

6

2. Khasiat Mimba

Selama ini, mimba digunakan sebagai pupuk tanah, repelan, insektisida,

lubrikan, sabun, produk hygiene mulut, dan pengobatan tradisional. Bagian yang

paling banyak diteliti dari mimba adalah digunakan dalam agrikultur sebagai

biopestisida. Fraksi kasar dari berbagai bagian tanaman mimba yang terisolasi

telah diketahui mempunyai efek sebagai antiinflamasi, antirematik, antiartitis,

antipiretik, antimalaria, antimikroba, depresi sistem saraf pusat (SSP), antiulcer,

antidiabetes, antitumor, antifertilitas, imunostimulan dan efek kardiovaskuler.

Kandungan mimba dapat dibagi menjadi dua kelas mayor : isoprenoid dan

lainnya. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid termasuk protomeliacin,

limonoid, azadirone dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, tipe kandungan

vilasinin dan C secomeliacins seperti nimbin, salanin dan azadirachtin.

Kandungan nonisoprenoid meliputi protein (asam amino) dan karbohidrat

(polisakarida), konponen sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya,

dihidrocalcone, kumarin dan tannin, komponen alifatik, dan lainnya. Pada kulit

batang mimba mengandung catechin dan NB II Peptidoglycan yang diduga

mempunyai aktivitas imunomodulator (Biswas, 2002). Kandungan senyawa pada

daun mimba antara lain: karbohidrat, β- sitosterol, calsium, fiber, magnesium,

nimbaflavon, nimbolide, phosphorus, protein, quercetin, rutin (Duke, 1996).

Penelitian tanaman mimba sebagai imunomodulator sudah banyak

dilakukan, antara lain: Efek imunomodulator minyak mimba pada mencit

menunjukkan adanya peningkatan proliferasi limfosit (Upadhyay, 1992); Ekstrak

air daun mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7

menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody

antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator dari NIM-76,

suatu fraksi volatile dari biji mimba pada tikus. Pada pemberian NIM-76 dengan

dosis 120 mg/kgBB terdapat peningkatan aktivitas makrofag dan respon

proliferasi limfosit tikus (Sairam, 1997); Ekstrak air dari daun mimba

meningkatkan sistem imun tubuh baik dengan peningkatan humoral (antibodi) dan

sistem imun tergantung sel (Biswas, 2002) ; Preparat daun mimba dapat

meningkatkan aktivasi imun yang menghambat perkembangan murine erlich

carcinoma dan B16 melanoma dengan induksi proliferasi limfosit pada mencit

galur swiss dan C57BL/6 (Baral, 2004). Preparat daun mimba meningkatkan

respon imun Th 1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara

dengan hasil peningkatan antibodi tergantung sel sitotoksik (ADCC) dan sel T

sitotoksik (CTL) (Mandal, 2007).

B. Sistem Imun

Imunitas adalah suatu keadaan dimana tubuh resisten terhadap penyakit

terutama penyakit infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan

dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun sedangkan reaksi yang

dikoordinasi sel-sel dan molekul-molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya

disebut respon imun (Baratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan

didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh

melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan

imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap

suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

8

sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam

reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991).

Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau

monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari

sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan

merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri

dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh

antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang

menghasilkan antibodi, sedangkan sel T (thymus derived) akan tersensitisasi

menjadi sensitized T cells menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping

itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada

kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel

plasma dan sensitized T cells (gambar 1). Memori imunologik dapat berada dalam

bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan,

1991).

Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh (Anonim, 2008b)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9

C. Imunomodulator

Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau

sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen-

komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi

individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini

menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit

(Juyal, 2003).

Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu

imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah

pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai

komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).

Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan

resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah

suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).

Senyawa-senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain:

rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat,

asam oleanolik, asam ursolic. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan

antara lain: phosphorus (Duke, 1996).

D. Limfosit

Limfosit adalah leukosit mononukleus dan tidak bergranula yang

mempunyai inti berwarna gelap yang mengandung kromatin tebal dan sitoplasma

yang berwarna biru pucat, suatu sel berinti satu berdiameter 7-12 µm yang

mengandung inti dengan kromatin padat dan lingkaran kecil sitoplasma

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

10

(Anonim,1998). Limfosit mencakup sel T dan sel B, yang mempunyai peran

utama dalam imunitas (Brooks, 1995). Peningkatan dan penurunan konsentrasi sel

ini mempengaruhi kesehatan (imunitas) tubuh untuk mengenali antigen asing dan

penurunan respon imun (Dhote, 2005). Untuk terjadinya respons imun efektif

harus terjadi peristiwa seluler yang rumit yang berurutan. Antigen harus terikat

dan bila perlu diproses oleh sel penyaji antigen yang kemudian berhubungan dan

mengaktifkan sel B dan sel T. Sel T helper harus membantu sel B dan prekursor

sel T sitotoksik tertentu dan diperlukan mekanisme yang mampu melipatgandakan

jumlah sel efektor berpotensi dengan cara proliferasi dan berdiferensiasi, untuk

menghasilkan mediator imunitas humoral dan seluler. Integrasi dari interaksi

seluler yang rumit yang terjadi in vivo, yang merupakan dasar respons imun,

terjadi pada jaringan limfoid perifer atau sekunder, yang arsitekturnya teratur;

yaitu kelenjar getah bening, limpa (Roitt, 1994)..

E. Antigen

Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat

merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang

sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi

antibodi (Baratawidjaja, 2004). Secara fungsional antigen dibagi menjadi

imunogen dan hapten. Hapten adalah molekul kecil yang dapat merangsang

respon imun apabila diika oleh molekul besar. Kompleks antara hapten dan

molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai

imunogen (Baratawidjaja, 2004). Tidak semua antigen menimbulkan respon

imunogenik, namun semua imunogen adalah antigen (Janeway, 1994). Bagian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

11

daerah hipervariabel antibodi yang berkontak dengan antigen diberi istilah paratop

dan bagian antigen yang berkontak dengan paratop disebut epitop (Roitt, 1994).

Antigen eksogen adalah antigen yang masuk dari luar tubuh, misalnya

dengan inhalasi, ingesti atau injeksi. Oleh endositosis atau fagositosis, antigen ini

kemudian dipresentasikan pada antigen presenting cells (APCs) dan diproses

menjadi fragmen-fragmen. APCs kemudian mempresentasikan fragmen-fragmen

tersebut pada sel T helper (CD4+) dengan menggunakan molekul

histocompatibility kelas II pada permukaannya. Beberapa sel T spesifik terhadap

peptida: komplek MHC. Mereka kemudian diaktifkan dan mulai menghasilkan

sitokin. Sitokin adalah substansi yang dapat mengaktifkan limfosit T sitotoksik

(CTL), antibodi dari sel B, makrofag, dan partikel lain (Anonim, 2008c).

1. Vaksin Hepatitis B

Vaksin hepatitis B adalah vaksin yang dikembangkan untuk mencegah

infeksi virus hepatitis B. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan

rekayasa genetik galur Saccharomyces cereviceae yang mengandung plasmid atau

gen untuk antigen HbsAg (Baratawidjaja, 2004). Setelah injeksi vaksin sebanyak

3 kali, suatu antibodi terhadap HbsAg akan mengalir di darah. Antibodi ini

dikenal sebagai anti-HbsAg. Antibodi dan memori sistem imun kemudian

menyediakan imunitas terhadap infeksi virus hepatitis B (Anonim, 2008d).

2. Hepavax-Gene®

Hepavax-Gene® adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen

imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B

(HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan Crucell’s propietary

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

12

Hansenula polymorpha expression system. 1 ml vaksin mengandung 20 mcg

HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax-Gene®

adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif

melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008e). Vaksin ini diproduksi oleh Berna

Biotech Korea Corporation.

F. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut

supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia

yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang

tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).

Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran

etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan maserasi,

perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian campuran etanol dan

air dilakukan dengan cara maserasi dan perkolasi (Anonim, 1979).

Maserasi adalah salah satu cara penyarian yang sederhana yang

dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam cairan penyari. Cairan penyari

akan menembus dinding rongga sel sehingga masuk dalam sel yang mengandung

zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara

larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat

didesak keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang sehingga terjadi keseimbangan

antara di dalam dan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia

yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

13

penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain

(Anonim, 1986).

Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit

ditumbuhi kapang dan kuman dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,

absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,

dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida,

kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,

malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut, dengan demikian zat pengganggu

yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

G. MTT

Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada

uji proliferasi adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT,

garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium

bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di

mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel

karena tidak dapat menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO,

isopropanol, atau pelarut yang tepat, maka produk formazan larut dan dibebaskan

sehingga dapat diukur secara kolorimetri. Kemampuan enzim dehidrogenase

mitokondria untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas

mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel hidup. Pembacaan absorbansi

dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate

reader (Castell, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur

sampel dalam jumlah banyak (Doyle, 2000).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

14

H. Kerangka Pemikiran

Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap segala macam

antigen yang masuk dalam tubuh. Peranannya sangat penting untuk mencegah

seseorang terserang penyakit. Karena fungsinya yang sangat penting inilah,

dibutuhkan sistem imun yang kuat. Peningkatan sistem imun dapat dilakukan

dengan cara pemberian suplemen makanan.

Daun mimba merupakan salah satu tanaman obat yang diduga dapat

digunakan sebagai imunostimulan. Daun mimba mempunyai kandungan rutin,

quercetin, polisakarida, phosphorus yang mempunyai aktivitas sebagai

imunomodulator. Berbagai penelitian efek imunomodulator daun mimba telah

dipublikasikan, antara lain penelitian Ekstrak air kulit batang mimba telah terbukti

mempunyai efek sebagai imunomodulator (Biswas, 2002); Ekstrak air daun

mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral menyebabkan

peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada

mencit (Ray, 1996). Pemberian 120 mg/kgBB NIM-76, suatu fraksi menguap dari

minyak mimba menunjukkan peningkatan aktivitas imunostimulan dengan

mengaktifkan mekanisme imun yang diperantarai sel pada tikus (Sairam, 1997).

Penelitian ini adalah penelitian awal penemuan senyawa dari tanaman

yang berefek sebagai imunostimulan dengan cara peningkatan proliferasi sel

limfosit.

I. Hipotesis

Ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) mempunyai

efek sebagai imunostimulan dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

15

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta indica A.

Juss) terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar

ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola

satu arah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel bebas

Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu: 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB

tikus, 140 mg/kg BB tikus.

2. Variabel tergantung

Besar kenaikan proliferasi sel limfosit

3. Variabel pengacau terkendali

a. Suhu pembuatan ekstrak etanolik, dikendalikan pada suhu ruangan 25oC–

30oC.

b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berumur 3

bulan, berat badan 150-250 g

c. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640.

d. Inkubasi sel limfosit dikendalikan dengan disimpan di inkubator dengan

aliran 5% CO2 dan suhu 37oC.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

16

e. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kondisi fisiologis dan patologis hewan uji

5. Definisi operasional

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang

diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM

berumur 3 bulan.

b. Ekstrak etanolik daun mimba adalah hasil penyarian daun mimba dengan

metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 70%.

c. Imunostimulan ialah senyawa atau yang menyebabkan peningkatan

sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan proliferasi sel imun.

d. Peningkatan proliferasi sel limfosit adalah peningkatan pertumbuhan sel

yang ditandai dengan peningkatan jumlah sel kelompok perlakuan

dibandingkan dengan kontrol.

C. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

timbangan analitik (Sartorius), alumunium foil, alat bedah, alat injeksi (Terumo),

magnetic stirrer, tabung sentrifuge (Nunc), autoklaf, swing rotor sentrifuge,

inkubator (Memmett), mikropipet, autoklaf, lemari pendingin, cell counter, 96-

well plate (Nunc), laminar air flow (Labquib), mikroskop (Olympus), ELISA

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

17

reader (SLT 340 ATC), haemocytometer (Nebaueur), tissue (Nice), sarung

tangan, masker.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman,

Yogyakarta

b. Hewan uji tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan dengan berat badan

150-250 g

c. Etanol teknis 70%

d. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac-gene®)

e. Bahan untuk kulturisasi sel limfosit

1) Media pencuci

Media RPMI : RPMI 1640 (Sigma), NaHCO3 (Sigma), HEPES

(Sigma), Aquabides steril

2) Buffer lisis eritrosit :

tris buffer ammonium klorida : tris base 0,17 M, NH4Cl 0,16 M

3) Media penumbuh: Medium komplit

a) Medium RPMI (Sigma)

b) Fetal bovine serum (FBS) 10 % (Gibco)

c) penisilin-streptomisin 1% v/v (Gibco)

d) fungison 0,5%

f. Bahan untuk uji proliferasi sel limfosit

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

18

Buffer pelarut MTT : Phosphat buffered saline steril

Reagen Stopper: Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi daum mimba dilakukan di laboratorium Farmakognosi

Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan

dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen

van den Brink, Jr., 1965).

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008.

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba

Sepuluh bagian serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol teknis

sebanyak 70 bagian (Anonim, 1986). Maserasi dilakukan selama 24-48 jam

dengan pengadukan terus-menerus menggunakan shaker. Filtrat yang didapat

kemudian disaring dan kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

sampai sebagian besar etanol menguap dan terpisah dari filtrat. Filtrat yang

didapat dikeringkan dengan oven. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan

selanjutnya digunakan sebagai senyawa uji.

4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji

Tiga kelompok hewan uji, masing-masing kelompok hewan uji diberi

perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35 mg/Kg BB, 70 mg/kg

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

19

BB, 140 mg/kg BB secara peroral setiap hari selama 48 hari. Kelompok keempat

diberi perlakuan aquades sebagai kontrol negatif.

5. Induksi antigen

Selama proses pemberian ekstrak mimba, hewan uji divaksinasi dengan

antigen untuk memicu respon imun. Proses vaksinasi dilakukan setelah proses

perlakuan dengan ekstrak etanolik selama 7 hari, masing-masing kelompok uji

diinduksi dengan antigen sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke 7, 21, dan 35.

6. Kulturisasi sel limfosit

Setelah proses induksi antigen selesai, hewan uji dikorbankan dan

diambil sel limfositnya dari organ limpa. Tikus diletakkan dalam posisi telentang,

kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan

alkohol 70%. Limpa diangkat dan diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm

yang berisi 5 ml medium RPMI. Limpa dibersihkan dengan pinset steril dari

organ dan jaringan yang mengikat. Limpa dicuci dibawah Laminar Air Flow

(LAF) dengan jalan memindahkan Limpa dari satu cawan petri ke cawan petri

berikutnya yang telah disiapkan (4-5 cawan petri berisi 10 ml medium tanpa

serum pada masing-masing petri).

Pada organ limpa dilakukan penyemprotan medium ke dalam organ

dengan alat suntik 5 ml atau 10 ml dari berbagai posisi sampai organ tampak

transparan dan didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung

sentrifus 10 ml. sel disentrifus pada 1200 rpm 4oC selama 10 menit. Pellet yang

didapat disuspensikan dalam 2 ml tris buffer ammonium klorida. Sel dicampur

menggunakan pipet. Suspensi tersebut kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4o C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

20

selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dengan RPMI 2 kali

dengan dara dipipet berulang-ulang dan disentrifus 1200 rpm 4oC selama 5 menit.

Supernatan dibuang dan sel limfosit disuspensikan dengan medium komplit. Sel

dihitung dengan hemositometer.

7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit

Dalam 96 well plate dimasukkan 100 µl suspensi sel dalam media

RPMI yang sudah disterilkan dengan filter 0.22µl + 100µl senyawa antigen,

inkubasi 3 x 24 jam, 10µl media kemudian diambil dari tiap-tiap sumuran lalu

tambahkan 10 µl larutan 5 mg/ml MTT dalam PBS steril, inkubasi 4 jam.

Tambahkan 100µl larutan stop (10 % SDS + HCl 0,01N dalam akuades). Inkubasi

dilanjutkan 18-20 jam dan selanjutnya dibaca absorbansinya dengan

menggunakan ELISA reader pada λ 550 nm.

E. Analisis Hasil

Untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan

pengolahan data secara statistik. Data diuji normalitasnya, apabila distribusi data

normal, uji statistik yang dilakukan adalah uji parametrik dengan ANOVA satu

arah. Apabila distribusi data tidak normal, dilakukan uji non parametrik dengan

Kruskal-Wallis.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

21

Skema Penelitian

Gambar 2. Skema Kerja Penelitian

Proses Ekstraksi daun mimba

Kontrol

Aquades

Isolasi Limfosit dari Organ Limpa Hewan Uji

Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT

Persiapan Penelitian

Pengumpulan Daun Mimba

Induksi Antigen

Kelompok

Perlakuan

35mg/kgBB

Kelompok

Perlakuan

70mg/kgBB

Kelompok

Perlakuan

140mg/kgBB

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

22

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia

Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman

Azadirachta indica A. Juss (Mimba) yang diambil dari Desa Gayamharjo,

Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang dikumpulkan

berasal dari satu pohon dan dalam sekali pemanenan. Hal ini bertujuan untuk

menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun yang

diambil. Umur daun yang dipilih tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda sehingga

diperoleh kandungan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya dilakukan

pemisahan daun dari tangkai daun, bagian tumbuhan yang lain, atau dari bahan

asing yang ikut terbawa saat pemanenan daun mimba. Daun dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel.

Daun yang sudah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari

dengan ditutup kain hitam untuk mencegah kerusakan senyawa kemudian setelah

daun cukup kering, daun dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 60o C selama

24 jam sampai daun mudah dihancurkan. Daun kemudian diblender, diayak

dengan ayakan yang mempunyai 154 lubang per 1 cm2 dan disimpan sebagai

serbuk simplisia kering.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

23

B. Hasil Ekstraksi

Serbuk simplisia kering diekstraksi dengan pelarut etanol teknis 70%

dengan metode maserasi untuk mendapatkan ekstrak etanolik daun mimba yang

akan digunakan sebagai ekstrak uji. Penyari akan menembus dinding sel dan

melarutkan zat aktif yang sesuai dengan kepolaran penyari. Karena adanya

perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel yang lebih tinggi, maka

zat aktif dalam sel tersebut akan terdesak keluar sampai terjadi kesetimbangan

konsentrasi. Etanol dipilih sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit

ditumbuhi kapang dan khamir dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,

absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,

dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

Selain itu etanol juga melarutkan flavonoid, rutin, phosphorus yang merupakan

senyawa-senyawa yang mempunyai efek sebagai imunomodulator. Metode

penyarian yang dipilih adalah metode maserasi dengan pengadukan terus-menerus

karena metode ini sederhana, mudah untuk dilakukan, tidak memerlukan panas

tinggi dan dapat menyari secara efektif.

Penyarian dilakukan dengan perbandingan 10 bagian serbuk disari dalam

70 bagian cairan penyari (Anonim, 1986). Pengadukan secara terus-menerus

dilakukan dengan shaker dan lama penyarian antara 24- 48 jam. Ekstrak yang

didapat disaring dan diambil filtratnya kemudian dipekatkan dengan vaccum

rotary evaporator sampai menjadi ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan

oven pada suhu 40o – 60

o C sampai didapat ekstrak kering. Pada pembuatan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

24

ekstrak etanolik digunakan 1100 g serbuk dan kemudian didapat 72,36 g ekstrak

etanolik kering. Ekstrak etanolik kering yang dihasilkan berwarna hitam.

C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji

Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang

berusia ±12 minggu karena tikus pada usia ini telah dewasa sehingga sistem organ

telah terbentuk dengan baik. Pemilihan hewan uji ini berdasarkan kemiripan

dengan manusia dalam hal absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi

(ADME) karena diharapkan penelitian ini dapat diaplikasikan pada manusia.

Tikus dipilih sebagai hewan uji karena mempunyai ADME yang mirip manusia,

mudah didapat, mudah ditangani selama masa perlakuan. Tikus yang digunakan

adalah galur Wistar. Jenis kelamin tikus dipilih jantan karena lebih sedikit

dipengaruhi hormon reproduksi sehingga variasi lebih sedikit dibanding tikus

betina.

Dalam penelitian menggunakan hewan uji, penting untuk memperhatikan

perlakuan dan pemeliharaan hewan uji yang meliputi kebersihan kandang,

kecukupan makanan dan minuman, lingkungan yang tenang dan nyaman (cahaya

dan sirkulasi udara yang cukup) karena akan mempengaruhi kesahihan penelitian.

Proliferasi sel limfosit diinduksi oleh antigen yang dipejankan, yaitu vaksin

Hepatitis B sehingga faktor penginduksi yang lain perlu diminimalisir agar hasil

tidak menjadi bias. Selama 48 hari hewan uji dipejani dengan ekstrak etanolik

daun mimba. Dosis yang digunakan adalah 35 mg/kg BB, 70 mg/kgBB dan 140

mg/kg BB tikus. Pemilihan dosis ini mengacu pada penelitian yang pernah

dilakukan yaitu ekstrak air daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

25

mempunyai efek peningkatan titer antibodi (Ray, 1996). Selain itu ada kelompok

kontrol negatif yang mendapat perlakuan aquades. Rute pemberian yang dipilih

adalah rute oral karena sama dengan rute yang digunakan pada manusia.

Dalam penelitian ini pemantauan kesehatan dilihat dari penambahan

berat badan tikus yang diukur setiap hari (Gambar 3). Tikus dengan kondisi

patologis buruk cenderung mengalami penurunan berat badan secara drastis

sehingga dapat menjadi tanda peringatan untuk melakukan perlakuan khusus.

Selain untuk pemantauan kesehatan, pengukuran berat badan ini digunakan untuk

penyesuaian volume pemberian ekstrak mimba pada setiap tikus sehingga

pemberian ekstrak mimba sesuai dengan berat badan masing-masing tikus.

Gambar 3. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan

Pemberian ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertinggi

menyebabkan perubahan warna dan konsistensi feses tikus. Setelah 3 minggu

perlakuan warna feses tikus kehitaman dan konsistensinya menjadi lebih keras.

Gejala ini mengindikasikan adanya kerusakan hepar karena pemejanan mimba

dalam jangka waktu yang lama. Dari penelitian toksisitas akut ekstrak etanolik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

26

daun mimba diperoleh informasi bahwa potensi ketoksikan akut ekstrak etanolik

daun mimba termasuk dalam kategori praktis tidak toksik (5-15 g/kgBB manusia)

namun terjadi perubahan histopatologi pada hepar dengan pemejanan ekstrak

etanolik daun mimba dosis 182 mg/kgBB mencit (Apriyanto, 2002). Berdasarkan

informasi tersebut, penting untuk menyelidiki perubahan histopatologi hepar tikus

terkait dengan perubahan warna dan konsistensi feses pada masa perlakuan. Hasil

gambaran histologi hepar tikus kelompok dosis tertinggi (140 mg/kgBB tikus)

antara lain terjadi penebalan dan muncul vakuola pada kapsula Glissoni (selaput

pembungkus hepar), inflamasi, pelebaran sinusoid, hemorraghi pada daerah di

sekitar kapsula Glissoni, hepatosit normal (Gambar 4). Perubahan histo hepar

yang terjadi hampir sama dengan penelitian Apriyanto pada mencit yang dipejani

ekstrak 182 mg/kgBB mencit, yaitu terjadi hemorraghi, inflamasi, serta pelebaran

sinusoid. Pada penelitian Apriyanto terjadi degenerasi melemak yang tidak terjadi

pada penelitian ini. Hal ini mungkin karena perubahan yang terjadi belum sampai

mempengaruhi metabolisme lemak dalam hepar. Perubahan-perubahan yang

terjadi pada hepar ini bersifat reversibel, yaitu dapat kembali seperti semula

karena sel hepatosit hepar normal. Namun demikian, perlu berhati-hati untuk

pemakaian ekstrak etanolik daun mimba dalam jangka waktu lama. Mimba juga

dikenal mempunyai efek antifertilitas (Biswas, 2002) sehingga dianjurkan untuk

tidak digunakan oleh wanita hamil.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

27

(a) (b)

Gambar 4. Histologi Hepar Tanpa Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Perbesaran

400x) (a) Histologi Hepar dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba

Dosis 140mg/kgBB (perbesaran 400x) (b) (i) hepatosit (ii) sinusoid (iii) kapsula

glissoni (iv) vakuola (v) sel radang

D. Hasil Isolasi Sel Limfosit

Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa. Tujuan kultur

sel ini adalah untuk mengetahui proliferasi sel limfosit yang ada di dalam limpa.

Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa karena organ ini

merupakan organ limfoid sekunder yang menghasilkan sel B dan sel T limfosit,

tempat utama produksi antibodi dan sensitisasi sel T antigen spesifik, serta

merupakan tempat terjadinya respon imun terhadap antigen yang masuk dalam

sirkulasi darah.

Pengambilan sel limfosit dilakukan dengan metode ekstruksi limpa untuk

dapat meminimalisir kerusakan sel limfosit selama proses isolasi. Metode

ekstruksi dilakukan dengan cara menyuntikkan medium RPMI tanpa serum dalam

organ berulang-ulang dari berbagai sisi sampai terjadi suspensi sel yang mengalir

keluar dari organ.

Selanjutnya suspensi sel ditambahkan buffer tris ammonium chlorida

untuk melisiskan sel darah merah dan pellet dipisahkan dengan sentrifugasi.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

28

Pemberian Fetal Bovine Serum (FBS) bertujuan untuk memacu pertumbuhan sel

limfosit (growth factor), sebagai nutrisi dan membuat sel bertahan hidup lebih

lama. Suspensi sel selanjutnya dihitung dengan hemocytometer untuk mengetahui

kepadatan sel dari suspensi yang diperoleh dari isolasi. Perhitungan ini perlu

dilakukan karena untuk melihat respon imun tidak dapat dilihat dari jumlah sel

dalam suspensi karena jumlah sel ini sangat tergantung dari proses pengeluaran

sel dari organ limpa. Setelah diketahui kepadatan suspensi, sejumlah volume

suspensi tertentu diambil kemudian dikultur. Kepadatan yang diperlukan dalam

medium 2,0 x 105 sel limfosit (Gambar 5).

Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup ( Perbesaran 400x)

E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit

Metode uji peningkatan proliferasi limfosit yang digunakan dalam

penelitian ini adalah metode MTT. Metode MTT dipilih karena pengukuran relatif

cepat dengan pembacaan absorbansi yang dilakukan secara spektrofotometri

dengan menggunakan multiwell ELISA reader. Selain itu metode ini aman karena

tidak menggunakan bahan radioaktif. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide) merupakan suatu garam yang larut air. Metode

MTT merupakan salah satu metode kolorimetri. Prinsip dari metode MTT yaitu

terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

29

NN

NN

S

N

CH3

CH3NH

N

NN

S

N

CH3

CH3

NADH

NAD+

MTT

Br

Formazan

dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk kristal

formazan yang berwarna ungu (Gambar 6).

Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan

Kristal formazan ini bersifat tidak larut air. Penambahan detergen

(sodium dodesil sulfat 10%) yang terdapat dalam stopper reagent, akan

melarutkan kristal formazan. Intensitas warna ungu yang terbentuk dapat dibaca

dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Jumlah sel hidup

berbanding lurus dengan intensitas warna dari formazan yang terbentuk.

Data yang diperoleh dari pengukuran ini berupa absorbansi atau optical

density (OD) suspensi sel (Tabel I) yang kemudian diolah secara statistik untuk

mengetahui apakah ada perbedaan karena perlakuan dengan ekstrak etanolik daun

mimba (Gambar 7).

Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar Deviasi Setelah Inkubasi

selama 72 jam

Rata-rata Absorbansi Hasil Pengukuran Kultur Sel Limfosit

Kelompok Rata-rata Absorbansi ± SD 1 Kontrol aquades 0,512 ± 0,079 2 Dosis 1 (35 mg/kg) 0,803 ± 0,133 3 Dosis 2 (70 mg/kg) 0,831 ± 0,062 4 Dosis 3 (140 mg/kg) 0,815 ± 0,049

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

30

Gambar 7. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan

Untuk melihat apakah ada perbedaan yang bermakna antar kelompok

perlakuan dilakukan uji statistik dengan taraf kepercayaan sebesar 95%. Uji

Statistik yang digunakan adalah uji Kruskal Wallis menggunakan program SPSS

12,0. Uji Kruskal Wallis dipilih karena distribusi data tidak normal dan data tidak

homogen. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan ada perbedaan yang signifikan

antar kelompok perlakuan (P

31

dan interleukin 2 (IL-2) yang dapat memacu proliferasi sel limfosit. Pada ekstrak

etanolik daun mimba terdapat flavonoid yang dapat meningkatkan produksi sel

Th1 dan produksi IFN-γ namun dapat menurunkan sitokin Th2 (IL-4) sehingga

dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit (Nair et al, 2002). Pengukuran yang

dilakukan terhadap titer antibodi menunjukkan adanya penurunan IgG tikus

karena pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dosis 70 mg/kgBB (Penelitian

belum dipublikasi). Dari perbandingan hasil ini dapat diketahui bahwa ekstrak

etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit namun juga

dapat menurunkan produksi antibodi pada tikus. Hal ini mungkin karena

flavonoid pada ekstrak etanolik daun mimba menurunkan produksi IL-4 yang

merupakan salah satu sitokin yang membantu diferensiasi sel B menjadi sel

plasma yang mampu memproduksi antibodi (Nair et al., 2002).

Selain melihat adanya perbedaan antara kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan, dilihat juga persentase kenaikan proliferasi sel limfosit kelompok

perlakuan terhadap kelompok kontrol (Tabel II).

Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit Kelompok Perlakuan

Dibandingkan Kelompok Kontrol

Kontrol

Aquades

Perlakuan

35mg/kgBB

Perlakuan

70mg/kgBB

Perlakuan

140mg/kgBB

Kontrol

Aquades - 56,83% 62,30% 59,18%

Dilihat dari besarnya persentase kenaikan proliferasi sel limfosit, maka

dosis yang memberikan peningkatan terbesar adalah perlakuan ekstrak etanolik

daun mimba dengan dosis 70 mg/kgBB. Namun demikian tidak ada perbedaan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

32

yang signifikan antara pemberian ekstrak etanolik dosis 35mg/kgBB dan dosis

70mg/kgBB sehingga untuk pemilihan dosis lebih baik tetap menggunakan dosis

yang rendah.

Dari persentase kenaikan ini dapat dilihat bahwa peningkatan dosis tidak

selalu diikuti dengan peningkatan efek. Pada perlakuan ekstrak mimba dosis 140

mg/kgBB proliferasi lebih rendah dibanding pada dosis 70 mg/kgBB. Hal ini

mungkin disebabkan karena ada efek maksimum peningkatan proliferasi sel

limfosit dengan pemejanan ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertentu.

Kemungkinan yang lain adalah efek toksisitas ekstrak etanol daun mimba

menghambat proliferasi sel limfosit. Hal ini dapat diketahui lebih baik apabila

dilakukan penelitian dengan seri dosis yang lebih banyak untuk mengetahui

berapa dosis maksimum ekstrak etanolik daun mimba yang meningkatkan

proliferasi sel limfosit.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

33

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit pada

dosis 35 mg/kgBB, 70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB.

2. Peningkatan proliferasi sel limfosit kelompok perlakuan 35 mg/kgBB,

70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba berturut-turut

adalah sebesar 56,83%, 62,30%, dan 59,18%

3. Hasil histologi hepar menunjukkan adanya perubahan pada organ hepar

setelah pemejanan 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba, yaitu terjadi

hemorraghi, inflamasi, pelebaran sinusoid dan penebalan kapsula glissoni.

Perubahan ini masih reversibel selama sel hepatosit masih normal.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian ulang dengan seri dosis yang rendah dan lebih

banyak untuk mengetahui profil efek imunostimulan yang dipengaruhi ekstrak

etanolik daun mimba dan dosis yang optimum dari ekstrak etanolik daun

mimba.

2. Perlu dilakukan penelitian lanjut untuk mengetahui senyawa apa yang

bertanggung jawab terhadap efek imunostimulan daun mimba. Penelitian

dapat dilakukan dengan cara memfraksinasi dan mengisolasi senyawa-

33

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

34

senyawa dalam ekstrak etanolik daun mimba kemudian dilakukan uji

peningkatan proliferasi sel limfosit.

3. Perlu dilakukan penelitian lain untuk mengetahui mekanisme imunostimulan

dari ekstrak etanolik daun mimba. Penelitian dapat dilakukan dengan melihat

pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap respon imun nonspesifik,

termasuk respon seluler dan humoral.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

35

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 49-52, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta.

Anonim, 1986, Sediaan Galenika, 10-16, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta

Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Edisi V, 67-71, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Anonim, 1998, Kamus Saku Kedokteran Dorland, Penerbit Buku Kedokteran

EGC, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan 1, 1-

6, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Anonim, 2008a, Backgrounder: Understanding the Body’s Immune System,

Center for Immune Research, http://www.immunereseach.com , diakses

tanggal 29 Maret 2008

Anonim, 2008b, immune respons, http://www.biol.sc.edu/courses/bio102/f97-

39.html, diakses tanggal 3 November 2008

Anonim, 2008c, Antigen, http://en.wikipedia.org/wiki/Antigen, diakses tanggal 1

Oktober 2008

Anonim, 2008d, Hepatitis B vaccine, http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_B

_vaccine, diakses tanggal 1 Oktober 2008

Anonim, 2008e, Product-Hepavax-Gene, http://www.crucell.com/Products-

Hepavax-Gene, diakses tanggal 16 Oktober 2008

Apriyanto, A., 2002, Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Mimba, Skripsi, 42-43,

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1963, Flora of Java, Volume

I, 3-12, N. V. Noordhoff, Graningen

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume

II, 116, 117, 121, N. V. Noordhoff, Graningen

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

36

Baral, R., Chattopadhyay, U., 2004, Neem (Azadirachta indica) Leaf Mediated

Immune Activation Causes Prophylactic Growth Inhibition of Murine

Erlich Carcinoma and B16 Melanoma, Int. Immunopharmacol

Mar;4(3):355-66, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYS

TEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008

Baratawidjaja, K.G., 2004, Imunologi Dasar ed ke-6, 413-414, Balai Penerbit

FKUI, Jakarta

Biswas, K., Ishita C., Ranajit K. B. and Uday B., 2002, Biological Activities and

Medicinal Properties of Neem (Azadirachta indica), Current Science, vol.

82, no. 11, 10 june 2002, www.ias.ac.in/currsci/jun102002/1336.pdf,

diakses tanggal 25 April 2008

Castell, J. V., and Gomez-Lechon, M. J., 1997, In Vitro Methods in

Pharmaceutical Research, 3-6, Academic Press, California

Cook, E.F., Martin, E.W., 1961, Remington’s Practice of Pharmacy, 120-127,

The Mack Publishing Company, PA.

Dhote, B. W., Singh G. K., dan Chauhan R.S., 2005, Effect of Immuplus (A

Herbal Immunomodulator) on Paraspecific Immune Respones in Chicks,

61, ISAH vol 2, Warsaw, Poland, www.isah-soc.org/documents/

2005/sections/12_vol_2.pdf, diakses tanggal 21 April 2008

Doyle, A., Griffiths J. B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

12-15, 47, John Wiley and Sons, Ltd., England

Duke, J., 1996, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases,

Azadiractha indica A. Juss Activities, http://sun.ars-

grin.gov:8080/npgspub/xsql/duke/plantdisp.xsql?taxon=146, diakses

tanggal 13 Mei 2008

Gan, V.H.S., dan Handoko, T., 1991, Farmakologi dan Terapi ed 3, 639 – 641,

Gaya Baru, Jakarta

Hutapea, J. R., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan LitBang

kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Jain, S., Hariom Y., 2007, Cell Proliferation Assay, http://www.protocol-

online.org/prot/, diakses tanggal 3 April 2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

37

Juyal, P.D., Singla L.D., 2008, Herbal Immunomodulatory and Therapeutics

Approaches to Control Parasitic Infection in Lifestock,

http://hillagric.ernet.in/education/covas/vpharma/winter%20school/lecture

s/24%20Herbal%20immunomodulatory%20approaches%20parasitic.pdf,

diakses tanggal 25 April 2008

Mandal, I., Chattopadhyay, U., and Baral R., 2007, Neem Preparation Enhances

Th1 Type Immune Response and Anti-tumor Immunity Against Breast

Tumor Associated Antigen, Cancer Immunity vol 7, p.8,

http://www.cancerimmunity.org/v7p8/070308.htm, diakses tanggal 10 Mei

2008

Nair N, Mahajan S, Chawda R, Kandaswami C, Shanahan TC, Schwartz SA,

2002, Grape seed extract activates Th1 cells in vitro, Clin Diagn Lab

Immunol; 9: 470-476, http://www.pubmedcentral.com, diakses tanggal 13

Desembar 2008

Ray, A., Banerjee B.D., Sen P., 1996, Modulation of humoral and cell-mediated

immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice, Indian J Exp

Biol. 1996 Jul ;34 (7):698-701 8979510,

http://lib.bioinfo.pl/pmid:8979510 biobank, diakses tanggal 10 Mei 2008

Roitt, I.M., 1994, Essential Immunology 8th ed., diterjemahkan oleh Harahap,

Alida, 76, 137, Penerbit Widya Medika, Jakarta

Sagrawat, H., Khan Y., 2007, Immunomodulatory Plants: A

Phytopharmacological Review, Pharmacognosy Reviews Vol 1, Issue 2,

Jul-Dec, 2007, http://www.phcog.net/reviews/issue2/9.pdf, diakses tanggal

10 Mei 2008

Sairam M, Sharma S.K., Ilavazhagan G., Kumar D., Selvamurthy W., 1997,

Immunomodulatory Effect of NIM-76, A Volatile Fraction from Neem

Oil, J Ethnopharmacol, Jan; 55(2) :133-9,

http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYSTEM.pdf, diakses

tanggal 10 Mei 2008

Upadhyay SN, Dhawan S, Garg S, and Talwar GP, 1992, Immunomodulatory

effects of neem (Azadirachta indica) oil, Int J Immunopharmacol Oct;14(7) : 1187-93, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8979510?Dopt

=Abstract, diakses tanggal 10 Mei 2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

38

LAMPIRAN

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

39

Lampiran 1. Perhitungan Dosis

Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan Ray (1996), ekstrak air

daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit mempunyai efek peningkatan titer

antibodi. Dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah ½ x, 1x, dan 2x dosis

acuan.

Konversi dosis dari mencit 20 g ke tikus 200 g = 7,0

Dosis I : ½ x 100 mg/kgBB mencit = 50 mg/kgBB

Dosis pada mencit 20 g = x 50 mg/kgBB = 1 mg/20 g

Dosis pada tikus 200 g = 1 mg/20 g x 7,0 = 7 mg/200 g

Dosis per kgBB tikus = 7mg/200g x = 35 mg/kgBB

Dosis II : 100 mg/kgBB mencit = 100 mg/kgBB

Dosis pada mencit 20 g = x 100 mg/kgBB = 2 mg/20 g

Dosis pada tikus 200 g = 2 mg/20 g x 7,0 = 14 mg/200 g

Dosis per kgBB tikus = 14 mg/200g x = 70 mg/kgBB

Dosis III : 2 x 100 mg/kgBB mencit = 200 mg/kgBB

Dosis pada mencit 20 g = x 200 mg/kgBB = 4 mg/20 g

Dosis pada tikus 200 g = 4 mg/20 g x 7,0 = 28 mg/200 g

Dosis per kgBB tikus = 28 mg/200g x = 140 mg/kgBB

Kelompok kontrol aquades :

Volume pemberian per oral untuk tikus 200 g = 0,5 ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

40

Perhitungan dosis antigen

Antigen yang digunakan adalah Hepavax-Gene® dengan dosis 20 µg

digunakan oleh masyarakat Indonesia dengan asumsi berat badan 50 kg.

Konsentrasi antigen adalah 20 µg/ml

Konversi dosis dari manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018

Dosis untuk manusia 70 kg = x 20 µg = 28 µg

Dosis antigen untuk tikus 200g = 0,018 x 28 µg = 0,504 µg/200 g

Volume pemberian intraperitoneal = 2,5 ml

Konsentrasi yang dibuat = = 0,202 µg/ml ~ 0,2 µg/ml

Pengenceran dilakukan 100 x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

41

Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu

Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan Selama Masa Perlakuan

Profil Berat Badan Tikus Selama Masa Perlakuan

Minggu

I

Minggu

II

Minggu

III

Minggu

IV

Minggu

V

Minggu

VI

Minggu

VII

191,8 215,5 230,4 262,8 276,0 289,3 281,3

171,4 200,2 211,7 243,6 255,1 265,7 259,1

195,8 224,8 236,0 271,6 281,7 299,3 284,1

168,9 202,5 215,5 256,5 278,2 292,0 286,8

186,6 197,1 210,1 229,9 245,2 255,8 262,1

164,0 184,8 198,1 230,8 240,1 249,0 237,4

Kontrol

Aquades

183,5 208,1 215,0 242,1 254,9 263,5 262,0

Rata rata 180,3 204,7 216,7 248,2 261,6 273,5 267,5

150,2 170,3 183,3 207,7 219,3 228,7 219,7

174,8 188,6 202,5 216,6 227,1 246,9 247,4

191,9 216,4 238,3 262,2 264,7 274,6 270,3

158,9 181,2 199,0 213,0 220,8 223,2 213,0

153,0 165,0 181,5 207,7 220,3 232,7 229,7

180,1 199,4 210,4 221,0 231,1 243,2 240,8

Perlakuan

Dosis 1

(35

mg/kgBB)

161,3 180,2 199,8 226,1 236,5 243,4 241,3

Rata rata 167,2 185,9 202,1 222,0 231,4 241,8 237,5

211,5 242,8 266,7 306,3 328,4 343,8 341,1

189,2 211,1 227,9 249,2 256,4 257,8 252,2

164,9 178,0 191,6 224,4 243,0 250,3 241,0

164,8 186,5 207,2 220,0 228,8 239,2 233,3

155,0 169,4 190,5 211,4 222,3 231,2 237,4

167,9 184,0 206,3 232,6 248,5 256,8 254,7

Perlakuan

Dosis 2

(70

mg/kgBB)

179,1 212,3 239,5 276,5 302,7 318,2 311,1

Rata rata 176,1 197,7 218,5 245,8 261,4 271,0 267,3

153,8 193,3 209,7 233,0 248,7 257,5 256,4

184,5 211,9 214,5 234,4 246,3 253,3 246,8

155,7 187,6 211,4 243,4 251,3 259,4 256,3

140,9 158,9 164,2 186,6 211,7 223,1 233,4

164,8 183,9 197,2 224,8 246,9 244,7 239,7

187,7 175,5 195,0 225,7 247,9 249,5 240,6

Perlakuan

Dosis 3

(140

mg/kgBB)

157,0 213,1 231,7 258,8 264,3 289,2 281,6

Rata rata 163,5 189,2 203,4 229,5 245,3 253,8 250,7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

42

Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit

Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik

Daun Mimba

Absorbansi

Hewan

Uji

Kelompok

Kontrol

Aquades

Kelompok

Dosis 1

(35mg/kgBB)

Kelompok

Dosis 2

(70 mg/kgBB)

Kelompok

Dosis 3

(140 mg/kgBB)

1 0,410 0,917 0,876 0,729

2 0,570 0,745 0,700 0,826

3 0,431 0,661 0,834 0,805

4 0,455 0,616 0,813 0,834

5 0,603 0,825 0,872 0,781

6 0,536 0,894 0,863 0,856

7 0,582 0,962 0,856 0,877

Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

Dosis N Percent N Percent N Percent

Absorbance kontrol 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

D1 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

D2 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

D3 7 100.0% 0 .0% 7 100.0%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

43

Descriptives

Dosis Statistic Std. Error

Absorbance Kontrol Mean .51243 .029814

95% Confidence Interval for Mean

Lower Bound

.43948

Upper Bound .58538

5% Trimmed Mean .51309

Median .53600

Variance .006

Std. Deviation .078881

Minimum .410

Maximum .603

Range .193

Interquartile Range .151

Skewness -.247 .794

Kurtosis -2.183 1.587

D1

Mean

.80286

.050128

95% Confidence Interval for Mean

Lower Bound

.68020

Upper Bound .92552

5% Trimmed Mean .80440

Median .82500

Variance .018

Std. Deviation .132627

Minimum .616

Maximum .962

Range .346

Interquartile Range .256

Skewness -.329 .794

Kurtosis -1.606 1.587

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

44

D2 Mean .8305 .023324 95%

Confidence Interval for Mean

Lower Bound

.77350

Upper Bound .88764

5% Trimmed Mean .83530

Median .85600

Variance .004

Std. Deviation .061709

Minimum .700

Maximum .876

Range .176

Interquartile Range .059

Skewness -2.002 .794

Kurtosis 4.238 1.587

D3

Mean

.81543

.018681

95% Confidence Interval for Mean

Lower Bound

.76972

Upper Bound .86114

5% Trimmed Mean .81681

Median .82600

Variance .002

Std. Deviation .049426

Minimum .729

Maximum .877

Range .148

Interquartile Range .075

Skewness -.734 .794

Kurtosis .420 1.587

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

45

Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji

Homogenitas Data Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk

Statistic Df Sig. Statistic df Sig.

Absorbance .195 28 .008 .902 28 .012

a Lilliefors Significance Correction

Hasil uji normalitas data dengan uji Shapiro Wilk menunjukkan bahwa

data tidak terdistribusi normal (P

46

Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis

Kruskal-Wallis Test Ranks

Dosis N Mean Rank

Absorbance Kontrol 7 4.00

D1 7 18.00

D2 7 19.00

D3 7 17.00

Total 28

Test Statistics(a,b)

Absorbance

Chi-Square 15.422

Df 3

Asymp. Sig. .001

a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: Dosis

Hasil Uji Kruskal Wallis: ada perbedaan signifikan antar kelompok (p0,05)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

47

Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit

Persentase kenaikan dihitung dari perbandingan absorbansi kelompok

perlakuan dibanding kelompok kontrol.

Persentase kenaikan = x 100%

Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 35 mg/kgBB

Persentase kenaikan = x 100 % = 56,83%

Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 70 mg/kgBB

Persentase kenaikan = x 100% = 62,30%

Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 140 mg/kgBB

Persentase kenaikan = x 100% = 59,18%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

48

Lampiran 9. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

49

Lampiran 10. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

50

Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba

Lampiran 12. Ekstrak Etanol