FASE PRÉ-ANALÍTICA DO HEMOGRAMA

A análise do sangue periférico durante as últimas décadas tem sido realizada por sistemas automatizados que apresentam maior precisão nos resultados e em um menor intervalo de tempo que as técnicas manuais.

Entretanto, com todo o avanço tecnológico, a análise microscópica dos elementos sangüíneos é necessária e imprescindível. A excelência tecnológica dos contadores muitas vezes apontam dúvidas (flags) na identificação de células tornando a microscopia necessária e insubstituível.

Como vários estudos demonstram que a fase pré-analítica concentra cerca de 70% dos erros e fontes de variação associados aos processos laboratoriais, tive como objetivo oferecer conceitos essenciais de nossa prática hematológica a ser usada por laboratoristas com uma visão básica sobre coleta e distensão sanguínea, coloração, métodos de avaliação e contagem em lâmina, bem como dicas importantes capazes de proporcionarem uma microscopia mais segura e de melhor qualidade para a realização de um hemograma satisfatório.

Adriano Machado de Sousa

FASE PRÉ-ANALÍTICA DO HEMOGRAMA

I-INTRODUÇÃO:

A fase pré-analítica de um exame laboratorial corresponde a todos os eventos necessários que antecedem a sua execução propriamente dita. Ela envolve basicamente a história clínica do paciente, os procedimentos de coleta e preparo da amostra. Erros ou maus procedimentos nessa fase podem inviabilizar a exatidão de um resultado.

CONDIÇÕES PRÉ-ANALÍTICAS:

1-Idade:

Alguns parâmetros hematológicos possuem concentração dependente da idade do indivíduo. Esta dependência é resultante de diversos fatores, como: maturidade funcional dos órgãos e sistemas, conteúdo hídrico e massa corporal.

2-Origem étnica:

Os parâmetros hematológicos são afetados não apenas pela idade, altitude, sexo, fatores biológicos e influências externas, mas também por origem étnica. A contagem leucocitária e a contagem de neutrófilos são mais baixa nos negros que nos brancos. Como no Brasil há uma valorosa mistura racial, torna-se difícil estabelecer valores limites para indivíduos pardos ou miscigenados.

3-Ocupação:

O hemograma constitui um dos exames básicos mais solicitados pelo médico como periódico de características importantes para o trabalhador e a empresa, relacionando seu ambiente de trabalho com doenças profissionais que podem ser provocadas pelo mau uso ou mesmo falhas nas medidas de proteção.

4-Gestante:

As contagens leucocitárias e a contagem de neutrófilos e monócitos aumentam durante a gravidez; ocorre desvio à esquerda e a contagem de linfócitos, eosinófilos diminuem. Pode ocorrer aparecimento de granulações tóxicas e corpos de Döhle devido ao encurtamento de maturação entre promielócitos e granulócitos maduros na medula óssea; tudo isso sem significado patológico. A contagem de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito baixam proporcionalmente pela hemodiluição (aumento plasmático). Essa pseudo-anemia na maioria das vezes é fisiológica.

5-Uso de medicamento, controle de tratamento e Drogas de Abuso:

Este é um item amplo e inclui tanto a administração de substâncias com finalidades terapêuticas. Ambos podem causar variações nos resultados de exames laboratoriais, seja pelo próprio efeito fisiológico in vivo ou por interferência analítica, in vitro.

6-Postura:

A variação do volume plasmático ao passar-se do repouso (horizontal) à posição vertical ocorre devido ao acúmulo gravitacional e transudação nos membros inferiores, o que pode aumentar as cifras hematimétricas em 2 a 5%.

7-Atividade Física:

O efeito da atividade física sobre alguns componentes sangüíneos, em geral, é transitório e decorre da mobilização de água, da mobilização do pool marginal dos leucócitos para o pool circulante, da mobilização de outras substâncias entre os diferentes compartimentos corporais e das variações nas necessidades energéticas do metabolismo o que pode provocar uma significativa leucocitose.

8-Horário de coleta:

Hemogramas de um mesmo paciente colhido em diferentes horas do dia podem apresentar resultados diferentes de acordo com suas variações hidrícas, variações cíclicas dos diferentes tipos de leucócitos e também das plaquetas nas diferentes horas do dia.

9-Condições físicas do paciente:

É interessante que todos saibam suas contagens basais normais. Tabagistas possuem contagens de leucócitos, eritrócitos e plaquetas maiores que não fumantes.

Obesos apresentam valores leucométricos maiores que não obesos. Estresse e choro excessivo de crianças durante a coleta causam elevação da contagem global de leucócitos e diminuição relativa de eosinófilos.

Febre, frio, calor, são situações que podem gerar variações quantitativas no hemograma

10-Jejum:

O período de jejum habitual para a coleta de sangue de rotina é de

8 a 12 horas, podendo ser reduzido a 4 horas, para alguns exames

e, em situações especiais, tratando-se de crianças na primeira

infância ou lactentes, pode ser de 1 ou 2 horas apenas.

11-Dieta:

A dieta a que o indivíduo está submetido, mesmo respeitado o

período regulamentar de jejum, pode interferir na concentração

de alguns componentes, na dependência das características

orgânicas do próprio paciente.

COLETA SANGÜÍNEA PARA HEMOGRAMA

INTRODUÇÃO:

A amostra sangüínea deve ser adequadamente conservada em tubos com substâncias anticoagulantes específicas.

TIPOS DE ANTICOAGULANTES:

1. EDTA: tubo tampa roxa ou lilás. Conserva a morfologia das células

sangüíneas (específico para realização do hemograma).

2. Citrato de Sódio: tubo tampa azul. Preserva os fatores

hemostásticos.

3. Fluoreto de Sódio: tubo tampa cinza. Retarda o metabolismo

glicolítico.

4. Heparina: tubo tampa verde. Conservante multi-funcional,

principalmente para aferições gasosas.

COLETA SANGÜINEA (PADRONIZAÇÃO)

PRINCIPAIS SITIOS VENOSOS

1. Veia cubital média,

2. Veia basílica;

3. Veia cefálica;

4. Veia cefálica acessória.1

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4

COLETA SANGÜÍNEA PARA HEMOGRAMA

GARROTEAMENTO:

O tempo de garroteamento deve ser observado

e o recomendado é que não ultrapasse de um

minuto, após este tempo ocorre aumento da

pressão intravascular no local, facilitando a

saída de líquido e de moléculas pequenas para

o espaço intersticial, resultando em

hemoconcentração relativa.

SANGUE TOTAL X ANTICOAGULANTE

A relação sangue total x anticoagulante deve ser respeitado de tal modo

que todo cálcio presente na amostra seja quelado pelo anticoagulante e

todo anticoagulante neutralizado pelo cálcio. A presença de coágulos

e/ou micro coágulos pode ocorrer devido a não observação desta

relação.

A homogeneização deve ser feita suavemente por inversão conforme

ilustrado, no mínimo por cinco vezes:

CONFECÇÃO DE LÂMINA PARA HEMOGRAMA

As lâminas de vidro devem estar limpas, secas, desengorduradas e sem ranhuras para iniciar a confecção;

O distensor deve estar limpo, seco, desengordurado, sem ranhuras e mais estreito que a lâmina de microscopia para que os elementos celulares possam ser observados nas bordas sem nenhuma dificuldade;

Colocar uma gota de sangue (5 a 10 uL) aproximadamente a 1cm da extremidade da lâmina;

Caso o sangue utilizado seja obtido por punção digital, desprezar a primeira gota;

Usando um distensor colocado com uma inclinação de 45º em relação à primeira;

Deslizá-lo rapidamente e de maneira uniforme.

INTERFERENTES NOS RESULTADOS DO

HEMOGRAMA

FALTA DE MANUTENÇÃO E CALIBRAÇÃO NO EQUIPAMENTO

TURBIDEZ DA AMOSTRA: Hemólise Lipemia

Bilirrubina

Glóbulos Brancos Elevados

CRIOGLOBULINAS

CRIOAGLUTININAS

MICRÓCITOS, ESQUISÓCITOS E PLAQUETAS GIGANTES

QUIMIOTERÁPICOS / CITOTÓXICOS :

PODEM AUMENTAR A FRAGILIDADE DOS GLÓBULOS BRANCOS E/OU DAS PLAQUETAS ORIGINANDO RESULTADOS DEMASIADAMENTE BAIXOS

COLETA SANGÜÍNEA-HEMÓLISE

A hemólise provoca diminuição da hematimetria, do hematócrito, aumento da

Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM).

Os restos dos glóbulos vermelhos (estroma) destruídos podem ser contados

como plaquetas no contadores hematológicos provocando um falso aumento

na contagem das plaquetas.

COLETA SANGÜÍNEA-LIPEMIA

Provoca aumento na dosagem da hemoglobina e

interfere na contagem diferencial em alguns contadores hematológico

CORANTES HEMATOLÓGICOS

Os corantes atuais se baseiam no método de Romanowsky, onde se utiliza um corante ácido e um básico.

Eles são uma mistura de sais ácidos (eosina) e sais básicos (azul de metileno e oxidação de seus produtos- azures de metileno).

A eosina, por ser um corante ácido, tem afinidade por estruturas celulares básicas e o azul de metileno, por ser um corante básico tem afinidade por estruturas celulares ácidas.

TIPOS DE CORANTES PARA HEMOGRAMA

1. May-Grünwald - Giemsa: É a associação de duas técnicas de coloração. Onde a primeira provém do corante ácido May-Grünwald, pouco específico para o núcleo com a segunda técnica, a de Giemsa, que apresenta afinidade nuclear por ser básico.

2. Wright e Leishmann: É o corante que associa o corante ácido eosina com o básico azul de metileno ao mesmo tempo. Diminuindo o tempo de coloração.

3. Panóptica: É a mais recente, que utiliza um fixador (metanol), um corante ácido e logo após um básico. Este método é realizado em segundos.

COLORAÇÃO HEMATOLÓGICA - DICAS

1. O segredo de uma boa coloração está em descobrir o pH ideal e o tempo correto para fixação e coloração do corante.

2. Colorações excessivamente ácidas:

Macroscopicamnete os esfregaços apresentam um tom mais para róseo ou vermelho desbotado. Microscopicamente os eritrócitos são excessivamente alaranjados ou até vermelhos, os leucócitos geralmente são com tonalidade pálida sem nenhum contraste com o citoplasma. O citoplasma dos linfócitos e monócitos não se cora. Os grânulos dos eosinófilos ficam corados, mas sem brilho e os grânulos secundários dos neutrófilos pouco se coram ou não se coram.

3. Causas:

Tempo de coloração insuficiente, corante excessivamente ácido ou pH do tampão ou da água muito baixo.

COLORAÇÃO HEMATOLÓGICA-DICAS

4. Colorações excessivamente alcalinas:

Macroscopicamente os esfregaços apresentam um tom esverdeado. Microscopicamente os eritrócitos são vistos de cor esverdeada ou até verde azulada o que dificulta a visualização da policromasia. Os leucócitos apresentam uma coloração excessivamente generalizada com cromatina profundamente corada em púrpura-azulado o que dificulta o contraste com o citoplasma com intensa basofilia. Os grânulos dos eosinófilos coram-se de azul-escuro, e os grânulos dos neutrófilos normais apresentam-se excessivamente corados, simulando granulações tóxicas.

5. Causas:

Esfregaço muito grosso, pH elevado da água ou do tampão, corante excessivamente alcalino ou tempo excessivo de coloração.

AVALIAÇÃO DE UMA COLORAÇÃO SATISFATÓRIA

•Eritrócito : Salmão ou levemente rosado

•Plaquetas : Azuladas e os grânulos púrpura

•Eosinófilos : Grânulos (laranja vivo)

•Monócitos : Citoplasma cinza-azulado e grânulos

citoplasmático finos na cor vermelho púrpura suave

Eritrócitos : SALMÃO OU LEVEMENTE ROSADO

Plaquetas: azuladas e os grânulos púrpura

•Eosinófilos : Grânulos (laranja vivo)

Monócitos : Citoplasma cinza-azulado e grânulos

citoplasmáticos finos na cor vermelho púrpura suave

DISTENSÃO SATISFATÓRIA

Comentário: A distensão deverá ocupar 2/3 da lâmina de

microscopia, apresentar cabeça, corpo, cauda e bordas bem

definidas

O esfregaço bem feito é composto por três porções;

espessa, média e fina.

Na Porção Espessa ou cabeça as células se

congestionam, dificultando análise.

Na Porção Média ou área útil se concentram as

células com distribuição homogênea, perfeitas para

análises.

Na Porção Fina ou cauda a disposição de eritrócitos

e leucócitos é defeituosa, com células deformadas

artefatualmente.

DISTENSÃO SANGÜINEA E SUA AVALIAÇÃO

cabeçacauda área útil

ÁREA ÚTIL PARA AVALIAÇÃO CITOLÓGICA

ÁREA ÚTIL DA DISTENSÃO PARA AVALIAÇÃO E

CONTAGEM

Não há sobreposição eritrocitária e

nem condensação dos leucócitos

• Erros decorrentes a avaliação em local inadequado do

esfregaço (distensão):

• Local muito espesso (cabeça): Dificuldade de avaliação da

cromatina nuclear dos leucócitos, falsa linfocitose e

monocitopenia. Dificuldade de avaliação da morfologia

eritrocitária.

• Local muito fino (cauda): Aumento indevido de monócitos e

polimorfonucleados. Para análise morfológica eritrocitária

pode ocorrer possível mascaramento de hipocromia e falsos

esferócitos.

• Leitura excessiva nas bordas: Aumento excessivo de

monócitos e neutrófilos.

• Leitura excessiva no centro: Aumento indevido de linfócitos.

DISTENSÃO SANGÜINEA E SUA AVALIAÇÃO

• É o estudo dos elementos celulares do sangue espalhados

em camada única sobre a superfície de uma lâmina de

microscopia.

• A distensão ou esfregaço fornece uma distribuição irregular

dos elementos celulares.

• As células de maior densidade correspondem à série

mielóide, acumulam-se nas margens e cauda.

• As células de menor densidade correspondem à série

linfóide, que tendem a uma distribuição central.

CONTAGEM E AVALIAÇÃO EM LÂMINA

Métodos de Contagem em Lâmina

Comentário :

Células de maior densidade localizam-se nas bordas.

Compensa a distribuição entre o centro e o corpo,

mas não entre o centro e a borda.

Métodos de Contagem em Lâmina

Comentário : Células de menor densidade localizam-se ao centro.

Compensa a má distribuição entre o centro e a borda, mas não entre o corpo e extremidade.

Obrigatoriamente deve-se chegar até a outra borda; caso a contagem termine antes de se

chegar ao outro lado deve-se contar mais 100 ou 200 células até que se chegue à outra

borda.

Métodos de Contagem em Lâmina

Comentário :

Está a meio caminho entre os dois métodos.

Quanto mais células forem contadas menor o erro e mais

próximo da realidade do paciente.

• A estocagem da amostra por tempo excessivo provoca profundas

alterações morfológicas das células sangüíneas pela ação do

EDTA e pela depleção de ATP do meio.

• O esfregaço sangüíneo deve ser realizado sem anticoagulante ou o

mais rápido possível (menos de 2 horas de contato com EDTA).

• Lâminas realizadas de amostras estocadas, mesmo de 2 a 80 C

ocorrem lise celular, principalmente dos granulócitos, o que pode

levar a uma falsa leucopenia com neutropenia, falso desvio à

esquerda, pseudovacuolização citoplasmática, pseudo linfocitose

relativa com alteração da morfologia nuclear.

• Na série vermelha além da hiperidratação dos eritrócitos com

conseqüente aumento do VCM, pode ocorrer equinocitose

indevida. Na série plaquetária ocorre agregação in vitro e

conseqüentemente falsa plaquetopenia.

ERROS RELACIONADOS AO TEMPO, EXPOSIÇÃO

E ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS

Exposição excessiva ao EDTA

Comentário: Eritrócitos com crenação (equinocitose)

e degeneração neutrofílica

Comentário:

neutrófilo em degeneração (Exposição excessiva ao EDTA)

lembrando um eritroblasto

Comentário:

Degeneração neutrofílica por exposição

excessiva ao EDTA .

Comentário:

Modificação núclear devido a exposição

excessiva ao EDTA

• Devem-se examinar as distensões sangüíneas de forma

sistemática para confirmar se ela está adequada ou se há

características anormais ou de coloração.

• Macroscopicamente a alteração mais comum na coloração é o

aumento da coloração azul causada por

hipergamaglobulinemia decorrente de uma paraproteína

(mieloma múltiplo), ou também do aumento reacional das

imunoglobulinas ( na cirrose, algumas viroses e na artrite

reumatóide).

• Ocasionalmente, as alterações macroscópicas podem ser

causadas por precipitações de crioglobulinas.

Exame das Distensões - Dicas

Mieloma: mudança de coloração devido

à presença de imunoglobulinas anormais.

Análise Macroscópica

Análise Macroscópica

Precipitação macroscopicamente de Crioglobulinas

Acentuada aglutinação devido à potente crioaglutinina

que foi corrigida após aquecimento possibilitando a

avaliação e a contagem citológica

Análise Macroscópica

• Microscopicamente a avaliação deve ser feito com pequeno

aumento (10x e 40x ) para ter noção do numero de células

por campo e detectar uma leucopenia, leucocitose,

plaquetopenia ou plaquetose. Pesquisar conglomerado de

células tumorais ou presença de células anormais quando

pouco frequentes. Observar se há empilhamento

eritrocitário (rouleaux); aglutinação eritrocitária, leucocitária

e plaquetária. Nos casos de plaquetopenia procurar

satelitismo plaquetário, aglutinação plaquetária e/ou

filamentos de fibrina.

Exame das Distensões - Dicas

Comentário: As plaquetas devem estar distribuídas

uniformemente (distensão com EDTA) ou pouco agregadas

(distensão sem EDTA)

Comentário: A agregação plaquetária pode ser motivo de falsa

plaquetopenia

Satelitismo plaquetário:

Fenômeno raro “in vitro”,

ocorre em alguns pacientes

em exposição do sangue ao

EDTA.

Motivo de falsa

plaquetopenia.

Comentário: deve-se colher o

sangue com o anticoagulante

citrato para uma contagem de

plaquetas mais acurada

AGLUTINAÇÃO ERITROCITÁRIA:

Formação de aglomerados irregulares de eritrócitos.

Ocorre quando os eritrócitos estão revestidos por anticorpos.

Sugere-se titulo elevado de crioaglutininas

ROULEAUX: empilhamento eritrocitário observado na região útil da distensão

sangüinea. Ocorre quando há um aumento na concentração plasmática de proteínas

de alto peso molecular.

Principais causas: gravidez (aumento fibrinogênio), processos inflamatórios,

discrasias das células plasmáticas (mieloma múltiplo- presença de paraproteína

monoclonal).

Rouleaux: empilhamento eritrocitário observado

na região útil da distensão sangüinea

Comentário: Toda distensão sangüínea inicialmente deve-se analisar a sua

distribuição celular, se o número está aumentado ou diminuído, qual o tipo

predominante, se as formas são normais e/ou imaturas, as alterações

morfológicas e inclusões, e então realizar a contagem diferencial.

MANCHAS NUCLEARES

Algumas manchas nucleares podem ser normais devido a pressão durante

a realização da distensão sangüínea, mas o excesso delas com

predomínio de linfócitos em pacientes adultos com mais de 40 anos, pode

ser sugestivo de patologias como exemplo: doença linfoproliferativa

crônica.

Em pacientes neutropênicos febris ou com deficiência imunológica

podem ser observados fungos livres ou dentro

de neutrófilos e/ou monócitos na distensão sangüínea .

Hifas fúngica Histoplasma Candida albicans

ACADEMIA DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA - São José do Rio Preto – SP

BAIN, BJ. Células sangüineas. Ed Artes médicas. 2.ed, São Paulo.

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REFERÊNCIA