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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
CURSO DE DOUTORADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA
LEANDRO GONÇALVES
EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO NO
REMODELAMENTO CARDÍACO DE RATOS INFARTADOS.
ASPECTOS MORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
São Paulo
2017
UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
CURSO DE DOUTORADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA
EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO NO
REMODELAMENTO CARDÍACO DE RATOS INFARTADOS.
ASPECTOS MORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
LEANDRO GONÇALVES
Tese apresentada ao Programa de
Doutorado em Educação Física da
Universidade São Judas Tadeu como
requisito à obtenção do título de Doutor em
Educação Física.
Área de Concentração: Escola, Esporte,
Atividade Física e Saúde.
Linha de Pesquisa: Atividade Física e
Disfunções Orgânicas
Orientador: Prof. Dr. Erico Chagas
Caperuto
São Paulo
2017
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca
da Universidade São Judas Tadeu
Bibliotecária: Cláudia Silva Salviano Moreira - CRB 8/9237
Gonçalves, Leandro
G635e Efeitos do treinamento resistido no remodelamento cardíaco
de ratos infartados. Aspectos morfológicos e
imunohistoquímicos / Leandro Gonçalves. - São Paulo, 2017.
f.77: il.; 30 cm.
Orientador: Erico Chagas Caperuto.
Tese (doutorado) – Universidade São Judas Tadeu, São
Paulo, 2017.
1. Coração. 2. Infarto. 3. Exercícios. 4. Histologia. 5. Imunohistoquímica. 6.
Ratos. I. Caperuto, Erico Chagas. II. Universidade São Judas Tadeu,
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Educação Física. III. Título
CDD 22 – 796.077
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus pais, Wandir Gonçalves (que infelizmente nos deixou no
início do curso) e Maria Aparecida Burgos Gonçalves por sempre me incentivar em minha
carreira;
Ao meu filho Kayan, pelo carinho e paciência em todos os momentos e por ser minha maior
inspiração.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Erico Chagas Caperuto, por quem tenho profunda admiração e
respeito, agradeço aos ensinamentos, a compreensão, ao empenho e a dedicação
que estiveram presentes durante toda a orientação e desenvolvimento desse
trabalho. Obrigada pela amizade e confiança demonstrada e pela oportunidade de
crescimento intelectual e pessoal que me concedeu;
À Profª Alzira Altenfelder Silva Mesquita fundadora da USJT, por acreditar e
me ajudar em muitos momentos da minha carreira.
Aos professores da Universidade São Judas Tadeu: Eliane Florencio Gama,
Jurema Carmona Sattin Cury, Laura Beatriz Maifrino, Romeu Rodrigues de Souza,
Iris Callado, pela troca de conhecimentos, empenho e dedicação expressados na
conclusão dessa tese.
Ao supervisor dos laboratórios da área de saúde André Hanne, pela amizade,
pelo incentivo, sempre disposto a me ajudar nos momentos mais difíceis para a
conclusão do trabalho.
Aos Funcionários Ricardo (biotério), Lúcia e Cláudia (biblioteca), Toninho,
Júnior, Jamile e Zé Queiroz (lab. de Biologia), Gilson (clínica de fisioterapia) por toda
ajuda e por todo apoio na realização desse trabalho.
A todos os alunos e amigos do GEPAME pelo auxílio e troca de informações
durante o curso, em especial ao aluno de doutorado Elias de França pelo auxílio em
todos os momentos que foram necessários.
Aos funcionários da secretaria de pós-graduação pelo respeito e assistência
com os alunos.
Às alunos(as) Nathália Edwiges Alves de Lima, Lueni Gomes do Carmo,
Ismael Barbosa Monteiro, Sheila Pereira da Silva pela extrema contribuição nas
análises histológicas.
Aos alunos de iniciação científica: Letícia, Vanessa e Thayná que
participaram da etapa de cuidados com os animais e das fotografias de microscopia
óptica, meus agradecimentos pelo cuidado e carinho dispensados a esse estudo.
Aos membros das bancas do Exame de qualificação e da Defesa desse
trabalho: Prof. Dr. Bruno Rodrigues, Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza, Profª Drª
Iris Callado, Profª Drª Márcia Sanae Mizuno, por todo o cuidado, carinho e atenção
dispensados na leitura do mesmo e pelas valiosas contribuições que agregaram a
ele.
A todos os meus amigos pessoais: Luciano, Ricardo, Andréa, Patrícia, Tina,
Del e Bete que me apoiaram e incentivaram, trazendo força e coragem nessa etapa.
GONÇALVES,L. EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO NO
REMODELAMENTO CARDÍACO DE RATOS INFARTADOS. ASPECTOS
MORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS [tese]. Curso de Doutorado da
Universidade São Judas Tadeu. São Paulo. 77 pág, 2017.
RESUMO
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma das principais causas de morte, morbidade e incapacitação. O IAM promove o remodelamento cardíaco, onde ocorrem alterações na geometria, massa, volume e constituição do coração com finalidade compensatória. Programas de reabilitação cardíaca geralmente são idealizados com exercícios aeróbicos, no entanto, o treinamento resistido já demonstrou ser uma conduta não farmacológica útil, segura e capaz de melhorar a capacidade funcional desses pacientes. O objetivo do presente estudo foi analisar em ratos Wistar os efeitos de 7 dias de treinamento resistido nos parâmetros biométricos, histomorfométricos e Imunohistoquímicos do coração de animais infartados. Foram utilizados 40 Ratos Wistar machos provenientes do Biotério da Universidade São Judas Tadeu (USJT) com peso aproximado de 300g divididos em 4 grupos experimentais: Grupo SI - animais sedentários infartados. Sacrificados 7 dias após o infarto (n=5). Grupo TI - animais treinados infartados. Treinados e Sacrificados 7 dias após o infarto (n=5). Grupo SS – animais sedentários SHAM. Sacrificados 7 dias após a cirurgia fictícia (n=5). Grupo ST – animais treinados SHAM. Treinados e Sacrificados 7 dias após a cirurgia fictícia (n=5). Ao término desse período, os animais foram eutanasiados, e amostras do ventrículo esquerdo foram retiradas e preparadas para análises histomorfométricas e imunohistoquímicas. Os dados foram analisados através do teste de análise de variância (ANOVA) de duas vias com o post teste de Tukey, com significância determinada a p<0,05. Os animais treinados apresentaram menor peso corporal em relação aos animais sedentários, porém os grupos infartados apresentaram maior peso cardíaco causado pelo processo inflamatório. Em relação aos parâmetros estereológicos a (Vv[col I]) e (Vv[col III]) diminuiram nos animais dos grupos infartados treinados diminuindo a rigidez do VE, a quantidade (Vv[cap]) aumentou na região necrosada como tentativa de atenuar os danos em decorrência do infarto sendo mais evidente nos animais do grupo IS. A (Vv[mio]) não mostrou diferenças apesar de que o grupo IT apresentou uma maior (Vv[mio]) em relação ao grupo IS. Em relação aos aspectos morfométricos, o grupo IS apresentou menor ASTm quando comparado ao grupo SS, indicando assim uma melhor condição do tecido cardíaco. Em relação ao ASTn ocorreu um aumento nos grupos infartados em relação aos grupos SHAM. Esse maior volume nuclear dos animais treinados está relacionado à maior demanda/expressão gênica no sentido de recuperar o tecido ou solucionar a lesão e a inflamação. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa dos valores de MMP2 no grupo IS com recuperação no grupo IT, com valores se aproximando dos animais do grupo SHAM, isso pode ser considerado um prognóstico de remodelamento que está sendo afetado pelo exercício físico. Nossos dados revelaram que o treinamento resistido mostrou-se eficiente em relação às respostas morfométricas, estereológicas e imunohistoquímicas apresentadas pelos
ratos infartados e treinados durante 7 dias. A adoção dessa estratégia de intervenção não farmacológica no tratamento de indivíduos infartados a curto prazo, promove melhoras na condição cardíaca.
PALAVRAS-CHAVE: Infarto agudo do miocárdio, Remodelamento cardíaco, Ventrículo esquerdo, Treinamento resistido.
ABSTRACT
Acute myocardial infarction (AMI) is one of the main causes of death, morbidity and
incapacitation. AMI causes cardiac remodeling with changes in the heart geometry,
mass, volume and structure because of the compensatory response. Rehabilitation
programs usually are carried out with aerobic exercises, however, resistance training
has been demonstrated to be a useful and safe non-pharmacological conduct that is
able to improve the patients functional capacities. The aim of this study was to
analyze the effects of 7 days of resistance training in the biometric,
histomorphometric and immunohistochemical parameters of infarcted Wistar rats. We
used 40 Wistar rats from the USJT vivarium, with average weight of 300g divided in 4
groups. SI group – infarcted and sedentary animals, (n=5); TI group – infarcted and
trained animals (n=5); SS group – sedentary SHAM animals (n=5) and ST group –
trained SHAM animals (n=5). After this period, all animals were sacrificed and
samples of the left ventricle were prepared for histological and immunohistochemical
analysis. Data were analyzed through the ANOVA test with the Tukey post test with
significance determined to be p<0.05. Trained animals had a lower body weight when
compared to the sedentary, however the infarcted groups showed larger heart weight
values probably caused by the inflammatory process. Regarding the stereologic
parameters (Vv[col I]) and (Vv[col III]) decreased in the infarcted and trained animals
reducing the LV stiffness, the amount of capillaries (Vv[cap]) increased in the necrotic
area as an attempt to reduce the damage due to the infarction with larger values for
the IS group. The amount of myocytes (Vv[mio]) showed no differences although the
IT group presented a larger (Vv[mio]) when compared to IS group. Regarding the
morphometric aspects the IS group presented smaller ASTm when compared to the
SS group, indicating a better condition of the cardiac tissue. Infarcted rats had a
bigger ASTn when compared to the SHAM groups. This bigger nuclear volume in the
trained animals is related to a higher demand on genes expression towards the
recovery of the tissue or to the inflammation end. Our results showed a significative
decrease in the MMP2 values in the IS group with recovering values to the IT group
(values got close to the SHAM groups values) and that can be considered a positive
remodeling prognostic due to the physical activity. Our data revealed that resistance
training was efficient to promote positive morphometric, stereologic and
immunohistochemical responses on infarcted rats trained for only 7 days. The
adoption of this non-pharmacological short term intervention in the treatment of
infarcted individuals is able to improve the cardiac condition.
KEY WORDS: Acute Myocardial infarction, Cardiac remodeling, Left ventricle,
Resistance exercise.
Índice
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 16
2.1 Remodelamento Cardíaco .......................................................................................... 19
2.2 Reabilitação Cardíaca ................................................................................................ 20
2.3 Treinamento Físico ..................................................................................................... 21
2.4 Exercício Físico e Coração ......................................................................................... 21
2.5 Exercício Resistido ..................................................................................................... 23
2.6 Hipertrofia Ventricular Esquerda (HVE) e Exercício Físico (EF) ................................. 25
3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 27
4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 28
4.1 Objetivos Gerais ......................................................................................................... 28
4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................. 28
5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 29
5.1 Animais e Grupos ....................................................................................................... 29
5.2 Cirurgia de Infarto do miocárdio e cirurgia fictícia (SHAM) ........................................ 30
5.2.1 Delineamento do estudo ...................................................................................... 31
5.3 Protocolos .................................................................................................................. 31
5.3.1 Treinamento resistido .......................................................................................... 31
5.3.2 Processo de Adaptação ....................................................................................... 35
5.3.3 Protocolo de treinamento resistido ....................................................................... 35
5.4 Eutanásia dos Animais ............................................................................................... 36
5.4.1 Coleta e preparação do material para as análises ............................................... 36
5.4.2 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia de Luz ....................... 37
5.4.3 Processamento para Imunohistoquìmica ............................................................. 38
5.5 Análises Morfométricas e Estereológicas ................................................................... 38
5.5.1 Área da secção transversa do cardiomiócito e nuclear (AST) .............................. 39
5.5.2 Densidade de volume das fibras colágenas tipo I (Vv[col I]) e tipo III (Vv[col III]) 40
5.5.3. Densidade de volume nuclear (Vv[nuc]), dos miócitos (Vv[mio]), do interstício
(Vv[int]) e dos capilares (Vv[cap]) ................................................................................. 41
5.6 Análise Imunohistoquímica para Metaloproteinases 2 e 9 .......................................... 42
6. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................. 44
7. RESULTADOS ................................................................................................................ 45
7.1 Massa corporal e relação dos componentes cardíacos .............................................. 45
7.2 Análise Estereológica ................................................................................................. 48
7.3 Análise Morfométrica .................................................................................................. 57
7.4 Expressão das Metaloproteinases 2 e 9 ( MMP2 e MMP9) ........................................ 57
8. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 63
8.1 Parâmetros biométricos .............................................................................................. 63
8.2 Parâmetros estereológicos ......................................................................................... 64
8.2.1 Miócitos cardíacos ............................................................................................... 64
8.2.2 Capilares ............................................................................................................. 65
8.2.3 Colágeno ............................................................................................................. 66
8.2.4 Espaço intersticial ................................................................................................ 67
8.3 Parâmetros morfométricos ......................................................................................... 67
8.3.1 Área de secção transversa dos miócitos (ASTm) ................................................. 67
8.3.2 Área de secção transversa nuclear (ASTn) .......................................................... 68
8.4 Parâmetros imunohistoquímicos ................................................................................ 69
9. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 70
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 71
LISTA DE FIGURAS
Fig.1 - Delineamento do estudo, modelo de formação dos grupos experimentais apresentados na tese............................................................. 31 Fig.2 – Escada utilizada para realização do treinamento resistido…........... 32 Fig.3 - Modelo de carga utilizada durante o treinamento resistido............... 33 Fig.4 - Foto de um dos animais realizando o treinamento de força. Peso preso à cauda do animal................................................................................ 34
Fig.5 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400, onde foi medida a área da secção transversa do miócito (µm2), submetida ao software Axion Vision 3.8, Zeiss.............................................................................................................. 39 Fig.6 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus em aumento de x 400 em microscópio de luz polarizada, aplicado o software Image Pró- Plus e sobre ele o software Image J. Barra com 50 µm..................................................................................................... 40 Fig.7 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400 submetida ao software Image J..................... 42 Fig.8 – Análise do peso dos grupos de animais em 3 momentos................. 46
Fig.9 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corados em H/E em aumento de x400 dos vários grupos, evidenciando cardiomiócitos (cabeça de seta vermelha), interstício (cabeça de seta verde) e capilares sanguíneos (cabeça de seta amarela). Barra: 20 µm.................................................................................................................. 49 Fig.10 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em Picrosiruss em aumento de x400 dos animais dos vários grupos, evidenciando em vermelho e alaranjado as fibras colágenas do tipo I e em verde as fibras colágenas do tipo III, presentes no miocárdio. Barra: 20 µm..................................................................................................
51 Fig.11 – Variação (%) da densidade de volume de capilares (Vv[cap]) no
ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. Valores
representam média ± EPM. **p <0,01 vs. SS e ST. #p = 0,08. Letras
semelhantes representam semelhanças estatísticas; letras diferentes
representam que os valores dentro do mesmo grupo são diferentes........... 52
Fig.12 – Variação (%) da densidade de volume de miócitos (Vv[mio]) no
ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. Valores
representam média ± DP............................................................................... 53 Fig.13 - Variação (%) da densidade de volume do Espaço Intersticial
(Vv[int]) no ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais.... 54 Fig.14 - Variação (%) da densidade de volume nuclear (Vv[nuc]) no
ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. **, p <0,01
vs. IS e IT. #, p= 0,19 vs. IT. Letras semelhantes representam
semelhanças estatísticas; letras diferentes representam que os valores
dentro do mesmo grupo são diferentes.........................................................
55
Fig.15 - Variação (%) da densidade de volume de colágeno tipo I e tipo III
(Vv[col I]) - (Vv[col III]), no ventrículo esquerdo após o sacrifício dos
grupos de animais. #, p <0,19 vs. IT. Letras semelhantes representam
semelhanças estatísticas para o mesmo tipo de colágeno; letras diferentes
representam que os valores dentro do mesmo tipo de colágeno são
diferentes. No colágeno tipo III a diferença foi p < 0,001............................... 56
Fig.16 - Variação da área de secção transversa dos miócitos (ASTm) e da
Área de secção transversa nuclear (ASTn) no ventrículo esquerdo após o
sacrifício dos grupos de animais. *p <0,05 vs. SS. #p <0,05 vs. ST. Letras
semelhantes representam semelhanças estatísticas; letras diferentes
representam que os valores dentro do mesmo grupo são diferentes............ 57
Fig.17 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento
de x400 evidenciando a expressão da MMP2 nos vários grupos
estudados. Barra de 20µm............................................................................. 59
Fig.18 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento
de x400 evidenciando a expressão da MMP9 nos vários grupos
estudados. Barra de 20µm............................................................................. 61
Fig.19-Variação de imunodetecção da expressão gênica
(semiquantitativa) da MMP2 e 9 no ventrículo esquerdo após o sacrifício
dos grupos de animais. *p <0,05 vs. SS. #p <0,05 vs. ST. Letras diferentes
representam que os valores dentro do mesmo grupo são diferentes. *, p<
0,05 vs. MMP2 dos grupos SS e ST.............................................................. 62
LISTA DE TABELAS
Tab. 1: Valores das médias ± desvio padrão, n = nº de ratos, PC = peso
corporal, PCd = peso cardíaco, PVE = peso do ventrículo esquerdo,
PCd/PC = relação peso cardíaco/pesocorporal, PVE/PCd = relação peso
do ventrículo esquerdo/peso cardíaco..........................................................
47
LISTA DE SIGLAS
ACSM American College of Sports Medicine
ASTm Área de secção transversa do miócito
ASTn Área de secção transversa nuclear
AHA American Heart Association
AMPc Adenosina Trifosfato
ANOVA Análise de variância
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DCV Doença Cardiovascular
EF Exercício Físico
ER Exercício Resistido
FA Fibrilação Atrial
HE Hematoxilina Eosina
HVE Hipertrofia Ventricular Esquerda
IAM Infarto Agudo do Miocárdio
IC Insuficiência Cardíaca
IS Infartado Sedentário
IT Infartado Treinado
PC Peso Corporal
PCd Peso cardíaco
PVE Peso do Ventrículo Esquerdo
SPSS Statistical Package for Social Sciences
SS Sham Sedentário
ST Sham Treinado
TF Treinamento Físico
UIR Cortes Aleatórios e Uniformemente Isotrópicos
VE Ventrículo Esquerdo
Vv Densidade de Volume
Vv [col I] Densidade de volume das fibras colágenas do tipo I
Vv [col III] Densidade de volume das fibras colágenas do tipo III
Vv[cap] Densidade de volume dos capilares
Vv[int] Densidade de volume do interstício
Vv[mio] Densidade de volume dos miócitos cardíacos
Vv[nuc] Densidade de volume nuclear
16
1. INTRODUÇÃO
A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade, morte e
incapacitação entre os países desenvolvidos e é a principal causa de óbitos em todo
o mundo. A aterosclerose constitui-se, nesses países, em sério problema de saúde
pública, assumindo contornos de verdadeira epidemia e está se tornando um desafio
de importância progressiva para os países em desenvolvimento. Excluídos os óbitos
por causas não definidas entre os indivíduos com mais de 30 anos de idade no
Brasil em 1988, as doenças cardiovasculares (DCVs) representaram a totalidade de
50% de óbitos femininos e 40% dos óbitos masculinos (LOPEZ & MURRAY, 1998).
Dentre as doenças cardiovasculares, a doença isquêmica do coração,
incluindo o infarto agudo do miocárdio (IAM), é o componente principal dessa
mortalidade (SILVA et al, 1997).
O IAM, em sua grande maioria é resultante de placas de aterosclerose nas
artérias coronárias que podem ocorrer por diversos fatores (sedentarismo,
dislipidemia, hipertensão arterial sistêmica, tabagismo, stress, obesidade, diabetes
mellitus, etc). Essas placas são formadas pela agregação plaquetária e depósito de
fibrina, posteriormente evoluindo para a formação de trombo agudo que acarretam
no estreitamento da luz da árvore coronariana provocando insuficiência na irrigação
e eventualmente levando ao infarto da região subsequente (GOTTLIEB, 2005).
O IAM ocorre quando o suprimento sanguíneo para uma parte do miocárdio é
severamente reduzido ou bloqueado, ocorrendo consequências desastrosas e
comprometimentos graves da função cardíaca reduzindo a expectativa de vida e
causando até mesmo morte súbita do indivíduo. Uma das consequências do IAM é a
isquemia do miocárdio onde há um aumento exagerado do consumo de sangue
arterial em determinada área do miocárdio. Se esta isquemia for severa e
prolongada pode ocorrer necrose resultante de baixa perfusão tecidual, com sinais e
sintomas consequentes da morte celular cardíaca (NESRALLA, 1994; SHIH ET AL.,
2011).
O IAM produz extensa resposta inflamatória sistêmica e miocárdica. Como
consequência a resposta inflamatória ao IAM pode causar o desenvolvimento de
17
fibrilação atrial (FA), insuficiência cardíaca (IC) e morte súbita (ARONSON ET AL,
2007; BURSI ET et al, 2007).
As arritmias ventriculares são responsáveis pela maior parte das mortes
súbitas, sendo que a degeneração em fibrilação ventricular está associada com
baixa sobrevida nos primeiros trinta dias após o IAM. As arritmias ventriculares estão
associadas à morte súbita nos seis primeiros meses que se seguem ao IAM
(MAGGIONI, et al. 1993; ZHENG, et al., 2001; AL-KHATIB, et al.,2003; HENKEL, et
al., 2006;)
O IAM gerado pela oclusão aguda de uma artéria coronária, apresenta
alterações genéticas, estruturais e bioquímicas resultando em deterioração da
funcionalidade do coração. Essas alterações se estabelecem imediatamente após a
oclusão arterial, evoluindo por várias semanas após o dano isquêmico inicial. Os
primeiros eventos do remodelamento cardíaco apresentam um processo adaptativo
para manter a função cardíaca. Já em longo prazo pode afetar significativamente a
função ventricular patologicamente resultando em IC, arritmias e como conseqüência
morte súbita. O remodelamento cardíaco, portanto, está associado a um negativo
prognóstico pós-infarto. Desse modo, o entendimento desse processo é crítico, pois
a evolução do remodelamento pode ser alterada por meio de diversas intervenções
terapêuticas farmacológicas e não farmacológicas (ZORNOFF, et al, 2008) .
O exercício físico vem sendo utilizado como uma ferramenta terapêutica não
farmacológica para vários tipos de patologias inclusive em pacientes com IC pós-
infarto e tem apresentado efeitos positivos comprovados. Pesquisas sugerem que
níveis regulares de atividade física causam benefícios cardiovasculares diminuindo à
mortalidade. Estudos experimentais apontam para um efeito cardioprotetor do
exercício físico após IM (XU et al., 2008; YENGO et al., 2012).
Os exercícios físicos podem trazer diversos benefícios em indivíduos com
patologias cardiovasculares, dentre eles, efeitos sistêmicos e na musculatura
esquelética, vasculatura periférica, metabolismo geral, melhora do débito cardíaco,
da capacidade e pulmonar, elevação do VO2max e extração de oxigênio pelos
tecidos. Essas alterações positivas são responsáveis por ampliar a tolerância ao
esforço, que é reduzida em consequência do IAM e melhorar a qualidade de vida,
18
além de reduzir a morbidade e mortalidade desses pacientes (MANN &
ROSENZWEIG, 2012; GHORAYEB et al., 2013).
Sabendo que o IAM causa um processo de remodelamento cardíaco
evoluindo com o tempo para um quadro de IC. Consequentemente esse evento se
torna patológico podendo levar o indivíduo a morte súbita. O exercício físico vem
sendo considerado uma importante ferramenta não farmacológica na diminuição dos
riscos das DCV, a importância deste trabalho está em analisar as alterações
estruturais dos componentes do VE frente a estes fatores, no intuito de podermos
contribuir para o estabelecimento de estratégias que possam minimizar estas
alterações, visando interferir positivamente na melhora da qualidade de vida desses
pacientes.
Para tanto, a proposta desse trabalho é avaliar os efeitos do exercício
resistido nos componentes do ventrículo esquerdo de ratos infartados por meio de
análises histomorfométrica, estereológica e imunohistoquímica.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Remodelamento Cardíaco
Nas últimas décadas, um fator que vem ganhando destaque na literatura
como preditor de má evolução após o IAM é a ocorrência de remodelamento
cardíaco. O remodelamento cardíaco produz alterações na geometria, massa,
volume e constituição do coração em resposta a determinada agressão, onde
ocorrem diversas alterações estruturais, bioquímicas e eletrofísicas que geram
ações endócrinas, parácrinas e autócrinas. Esses fatores, atuando em receptores
específicos ativam sinalizadores que promovem alteração na expressão gênica e
aumento da síntese protéica local (GONÇALVES, et al, 2005). Essas alterações
ocorrem em áreas infartadas e não infartadas do miocárdio e já se inicia nas
primeiras horas após o infarto, continuando progressivamente tendo finalidade
compensatória (WHITE, et al., 1997; MILL, et al., 1990; GONÇALVES, G et al,
2005).
A hipertrofia miocárdica patológica é importante componente do
remodelamento cardíaco e, usualmente, ocorre em resposta à sobrecarga
hemodinâmica crônica. Esse mecanismo adaptativo permite ao coração manter suas
funções básicas vitais de aumento das condições de carga, entretanto, é incapaz de
restaurar totalmente a função ventricular. Em longo prazo, levam a deterioração da
função mecânica da bomba cardíaca e facilitam o desenvolvimento da IC, podendo
assim a hipertrofia cardíaca patológica representar fator de risco independente para
morbidade e mortalidade cardíacas (WHITE, et al., 1997; MILL, et al., 1990;
GONÇALVES, G et al, 2005).
A IC é uma síndrome clínica de fisiopatologia complexa que pode ser
resultante de qualquer disfunção funcional ou estrutural que atinja o coração e,
consequentemente, comprometa a capacidade dos ventrículos de encherem e
bombearem sangue satisfatoriamente. As doenças das artérias coronárias,
hipertensão, cardiomiopatias dilatadas e doenças das valvas cardíacas são as
principais causas da IC. As manifestações da IC são dispnéia e fadiga, as quais
podem limitar a capacidade de realização de esforço físico (intolerância ao exercício
20
físico) e culminar em processos que levem à congestão pulmonar e sistêmica e ao
aumento da resistência vascular periférica. Estudo realizado por Gaudron e
colaboradores (2001), em pacientes infartados, mostrou que aqueles com
remodelamento ventricular mais acentuado têm maior propensão a morte súbita.
Outro componente que se destaca nesse processo de remodelamento é o
tecido conjuntivo. O miocárdio é composto de miócitos, células musculares lisas dos
vasos, células endoteliais, fibroblastos e o colágeno que forma uma complexa rede
que circunda e interligam todas essas estruturas em uma complexa e organizada
rede. Essa rede tem como principal função regular a apoptose, resistir às
deformações patológicas, manter o alinhamento das estruturas e regular a
transmissão de força durante o encurtamento da fibra cardíaca (BURSI, 2007).
O colágeno é importante modulador da arquitetura e da função cardíaca
quando se encontra em níveis normais. Dependendo do estímulo pode ocorrer
acúmulo de colágeno resultando em fibrose miocárdica interferindo com a
manutenção da geometria normal cardíaca, assim comprometendo a função
ventricular (BURSI, 2007).
2.2 Reabilitação Cardíaca
Os programas de reabilitação cardíaca foram desenvolvidos com o propósito
de trazer pacientes cardiopatas de volta às suas atividades diárias habituais, com
ênfase na prática do exercício físico, acompanhada por ações educacionais voltadas
para mudanças no estilo de vida (ARAÚJO et al, 2004).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (1964), reabilitação cardíaca é o
somatório das atividades necessárias para garantir aos pacientes portadores de
cardiopatia as melhores condições física, mental e social, de forma que eles
consigam, pelo seu próprio esforço, reconquistar uma posição normal na
comunidade e levar uma vida ativa e produtiva.
Um elemento fundamental nos programas de reabilitação é o treinamento
resistido. Este tipo de treinamento demonstrou ser uma conduta não farmacológica
útil, segura e capaz de melhorar a capacidade funcional de pacientes, após IAM
promovendo melhoras na qualidade de vida. Até meados da década de 80 era
21
aconselhado o repouso absoluto em pacientes pós-infarto, para reduzir o estresse
sobre o sistema cardiovascular já comprometido (DE MORAES, 2011).
2.3 Treinamento Físico
O treinamento físico (TF) tem sido utilizado como intervenção não
medicamentosa para prevenção e tratamento de diversas doenças como
insuficiência cardíaca (ROVEDA et. al., 2003; RONDON et. al., 2006; MEDEIROS et.
al., 2008a e 2008b), diabetes (HARTHMANN et al., 2007; MOSTARDA et al., 2009),
hipertensão arterial (SILVA et al., 1997; BERTAGNOLLI et al., 2008; MORAES-
SILVA et al., 2010) e infarto do miocárdio (FLORES et al., 2010; JORGE et al.,
2011), uma vez que o exercício físico é capaz de proporcionar modificações
favoráveis em diferentes sistemas corporais de diferentes espécies animais com
doenças cardiovasculares.
No sistema cardiovascular, por exemplo, são observadas diminuição das
frequências cardíacas de repouso e submáxima e aumento do consumo máximo de
oxigênio, do limiar anaeróbio e da tolerância ao esforço (SULLIVAN,
HIGGINBOTHAM e COBB 1988 e 1989); melhora na contratilidade e remodelamento
cardíaco (MEDEIROS et al., 2008b; ROLIM, 2007; PORTES e TUCCI, 2005)
também melhora no sistema renina-angiotensina e na função ventricular (PEREIRA
et al. 2008; LEOSCO et al., 2008) e na função endotelial (HUSAIN 2004; ZHENG et
al., 2005; NUNES et al., 2008).
Porém, apesar de os achados na literatura não deixarem dúvida de que o TF
mostra-se favorável em diferentes situações de acometimento do sistema
cardiovascular, sua prescrição ainda é assunto de muita discussão. Ainda não há
consenso sobre a combinação ideal dos diferentes tipos e protocolos de exercício
para uma prescrição mais individualizada quanto à doença que acomete o indivíduo.
2.4 Exercício Físico e Coração
O exercício físico tem um efeito significante sobre o tamanho, aspecto e
função do coração. A hipertrofia miocárdica é um mecanismo adaptativo em
resposta ao excesso de pós-carga imposto ao coração que pode ser fisiológico ou
22
patológico. Um fator que pode agir negativamente sobre as características do
miocárdio é o sedentarismo. O sedentarismo tem resultados muito diferentes, em
geral negativos, no músculo cardíaco quando comparados aos do exercício físico.
Apesar de comprovados os benefícios do exercício físico, o sedentarismo continua
presente em 60% da população. Assim sendo, exercícios físicos podem influenciar
positivamente na diminuição dos fatores de risco cardíaco (SAFI, 1998; FOSS, 2000;
WEINECK, 2005; ZAZYCKI, 2009).
O exercício aeróbio (baixa intensidade e elevada frequência) promove
hipertrofia dos miócitos cardíacos no sentido longitudinal e como consequência disso
a luz ventricular aumenta e a parede diminui de espessura. Este processo é
conhecido como hipertrofia excêntrica. Já os exercícios anaeróbios ou exercícios
resistidos (em geral, realizados em alta intensidade e com menor volume) promovem
o aumento da parede ventricular com diminuição de sua luz. Este processo é
conhecido como hipertrofia concêntrica (LAKATTA, 2003; DORNAS, 2008).
Indivíduos que mantêm uma rotina regular de exercícios físicos apresentam
atenuação das alterações fisiológicas, além de apresentarem melhora na condição
de vida, com diminuição do risco de doenças cardiovasculares. Segundo Pereira et
al (2002) homens treinados de 50 anos apresentam débito cardíaco 30% maior do
que sedentários da mesma idade, no entanto, 16% menos em relação a homens
treinados com 25 anos. Sem dúvida, a manutenção dos exercícios físicos atenua os
efeitos degenerativos deste no sistema cardiovascular.
As diversas modalidades esportivas têm sido classificadas, em dois grandes
grupos: esportes de resistência ou aeróbios, onde predominam as formas isotônicas
ou dinâmicos de exercício, e esportes de força ou resistidos, onde predominam as
formas isométricas ou estáticas de exercício (GHORAYEB et al, 2005). Cada uma
dessas atividades interfere no funcionamento corporal de formas diversas.
23
2.5 Exercício Resistido
O exercício resistido (ER) consiste em uma atividade voltada para o
desenvolvimento das funções musculares esqueléticas através da aplicação de
sobrecarga podendo ser imposta através de pesos livres (halteres, barras e anilas),
máquinas específicas, elásticos ou a própria massa corporal (FRONTERA et al,
1988).
Os ERs são regidos pelos princípios do treinamento e, portanto, são
prescritos em volume e intensidade apropriados aos objetivos pretendidos. O volume
é geralmente expresso em número de séries e repetições enquanto que a
intensidade é representada por um determinado percentual da maior carga possível
de ser vencida em uma única repetição (1-RM). Muito já se especulou a respeito do
exercício resistido, mas só nas duas últimas décadas a comunidade científica
passou a demonstrar maior interesse por esse tipo de treinamento. Embora o
exercício resistido seja aceito como eficaz no desenvolvimento ou na manutenção da
força, da potência e da massa muscular, que são benefícios relacionados a
indicadores de saúde e a doenças crônicas, só recentemente foram reconhecidos
(POLLOCK et al., 2000).
Por muitos anos o exercício resistido foi considerado de pouca importância
para o tratamento de doenças cardíacas, pois eram considerados pouco eficientes
em diminuir os riscos de doenças cardiovasculares e também eram considerados
perigosos, pois se imaginava que poderiam elevar a pressão arterial e também
promover hipertrofia patológica do miocárdio. Acreditava-se também que eram
pouco eficientes para aprimorar a função de bomba do coração e para aumentar a
oxigenação dos tecidos. Com o passar do tempo, foram esclarecidos muitos
aspectos relevantes sobre os exercícios resistidos. Por exemplo, já se sabe que
hipertrofia cardíaca induzida pelo exercício resistido é considerada fisiológica e que
é um fator importante para as capacidades funcionais (FLECK, 1999; SANTARÉM,
2000).
24
Essas alterações estruturais não alteram a diástole do VE em comparação
com indivíduos sedentários. Na fase pós-sobrecarga o coração treinado alcança
rapidamente seus valores iniciais de repouso. No coração de indivíduos sedentários
o mesmo processo ocorre de forma significativamente mais lenta (WEINECK, 2005).
O aumento da força do músculo esquelético e cardíaco permitem realizar as
atividades do trabalho e da vida diária com menor esforço, diminuindo assim as
alterações de frequência cardíaca e de pressão arterial durante as atividades. Todos
esses efeitos observados chamaram a atenção para sua aplicação em reabilitação
cardíaca, não com o objetivo de fortalecer o coração, mas de protegê-lo nos
esforços da vida diária.
O ER, ao contrário do apontado pela literatura, alcançou os efeitos
terapêuticos desejados com complicações muito menos frequentes. Verificou-se que
os exercícios resistidos com cargas pesadas, mas sem chegar à falência muscular
são realizados com baixa frequência cardíaca, e isto por si já é um fator de
segurança. Mais ainda, verificou-se que a pressão arterial diastólica mais elevada
nos exercícios resistidos em relação aos aeróbios é um importante fator para o
aumento da oferta de sangue para o miocárdio (SANTARÉM, 2000).
Santarém (2000) afirma que dentre as possibilidades de prática de exercícios,
os resistidos (anaeróbios) se destacam por melhorar a independência motora para
as atividades da vida diária. Não se encontrou associação causal entre hipertensão
arterial e treinamento com pesos. O aumento da pressão arterial durante os
exercícios com cargas sub-máximas foi considerada discreta. Mais recentemente,
novos dados aumentaram o interesse pelos ERs.
Antes de 1990, o exercício resistido não fazia parte da recomendação em
programas de exercício físico e reabilitação nem pelo American Heart Association
(AHA) nem pelo American College of Sports Medicine (ACSM). Em 1990 o ACSM
reconheceu pela primeira vez o exercício resistido como importante componente em
programas de exercícios físicos voltados para adultos de todas as idades e
atualmente já se tem um melhor entendimento dos seus benefícios relacionados à
saúde, sendo este recomendado por organizações internacionais de saúde para
25
grande parte da população, inclusive adolescentes, adultos, idosos, e indivíduos
portadores de doenças cardiovasculares e neuromusculares (KRAEMER &
RATAMESS, 2004).
2.6 Hipertrofia Ventricular Esquerda (HVE) e Exercício Físico (EF)
A capacidade de divisão das células cardíacas vai diminuindo
progressivamente após o nascimento, podendo desaparecer por completo por volta
do terceiro ao sexto mês de vida. Após esse período os miócitos sofrem processo
não mais de divisão, e sim de crescimento, fazendo com que o coração aumente de
tamanho, podendo chegar a um tamanho até 20 vezes maior na idade adulta. Na
faixa etária de 49 a 54 anos, a prevalência de HVE é de aproximadamente 2%, este
número aumenta em até 10% nos indivíduos na faixa etária de 75 a 82 anos
(SAMESINA, 2001).
A HVE desenvolve-se como processo compensatório ou adaptativo a um
estímulo hemodinâmico, e representa a sobrecarga de pressão ou volume. A teoria
que melhor explica os padrões de hipertrofia sugere que a resposta ventricular se
processa no sentido de manter o estresse parietal ventricular relativamente
constante e o volume sistólico adequado (GHORAYEB et al, 2005).
Na hipertrofia ventricular esquerda do praticante de exercício físico, a
amplitude do ecocardiograma ou a refletividade miocárdica ultra-sônica situam-se
dentro dos limites normais, sugerindo que a hipertrofia fisiológica não é
acompanhada de fibrose e outras alterações estruturais, observadas em condições
patológicas, como no IAM. Esses dados indicam que a hipertrofia ventricular
esquerda do “atleta” não induz à desproporção entre oferta e consumo de oxigênio,
mesmo em condições de esforço máximo (GHORAYEB et al, 2005).
O aumento do número de mitocôndrias, a neoformação capilar, a atividade
normal da ATPase da miosina observados no miocárdio hipertrofiado pelo
treinamento físico, impedem a desproporção entre oferta e consumo de oxigênio e a
ocorrência de isquemia, ao contrário do observado nas hipertrofias patológicas
(GHORAYEB et al, 2005).
26
As razões pelas quais a HVE dos atletas tem características nitidamente
diferentes da hipertrofia associada à hipertensão, miocardiopatia hipertrófica e outras
condições patológicas, não estão estabelecidas, porém existem algumas,
embasadas em achados clínicos e experimentais. A primeira e, provavelmente, mais
importante é que a sobrecarga de pressão e de volume resultantes do treinamento
físico intenso representa apenas um estímulo hemodinâmico para o
desenvolvimento da HVE, sem necessariamente acompanhar-se de alterações
neuro-humorais, como ocorre nas hipertrofias patológicas. A hipertrofia fisiológica do
atleta parece restringir-se aos miócitos, sem alterar a matriz extracelular e sem
provocar fibrose intersticial (GHORAYEB et al, 2005). As alterações neuro-humorais
determinam um aumento do influxo dos íons sódio, cálcio e hidrogênio para o interior
da célula. Também ocorre uma ativação da síntese de proteínas G, AMPc, e
desencadeamento de alguns eventos bioquímicos que, através de modificações nos
mecanismos de transdução celular, determinam uma mensagem errada na formação
de novas proteínas que determinarão a formação de um tecido miocárdico com
proporcionalidade de fibras diferenciadas do tecido normal no que concerne a fibras
elásticas, colágenos e miócitos (SAMESINA, 2001).
O coração do atleta apresenta uma variedade de alterações morfológicas e
funcionais, resultantes do treinamento físico rigoroso e sistemático para melhorar a
função do coração como bomba e a capacidade do sistema cardiovascular fornecer
oxigênio aos músculos que se exercitam. As adaptações predominantes incluem:
aumento da dimensão diastólica final da cavidade ventricular esquerda, da
espessura parietal e da massa ventricular esquerda, melhora do enchimento
diastólico e redução da frequência cardíaca (GHORAYEB et al, 2005).
De forma geral, esse tipo de atividade, quando orientado por profissionais
capacitados, reveste-se de níveis adequados de segurança (POLLOCK et al., 2000),
sendo inclusive compatível e aconselhável mesmo para idosos com mais de noventa
anos de idade (FIATARONE et al., 1990).
27
3. JUSTIFICATIVA
Diversos fatores como o sedentarismo, a dislipidemia, a hipertensão arterial
sistêmica, o tabagismo, o stress, a obesidade e o diabetes mellitus podem ocasionar
o IAM. A IC pós-infarto é uma condição crônica que continua aumentando em quase
todos os países do mundo.
Estudos demonstram que o TF é capaz de proporcionar modificações
favoráveis em diferentes sistemas corporais de diferentes espécies animais, e tem
sido utilizado como intervenção não medicamentosa para prevenção e tratamento de
diversas doenças dentre elas as cardiovasculares. O tipo de treinamento, a
quantidade de estímulos e os efeitos que essa estratégia gera no músculo cardíaco
ao longo do tempo na situação pós-infarto no remodelamento cardíaco, são
perguntas que permanecem sem respostas.
Assim, justifica-se a realização desse trabalho que visa observar as
modificações ocorridas no miocárdio em quatro momentos da progressão de um
protocolo de treinamento resistido e do remodelamento cardíaco.
28
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivos Gerais
O objetivo do presente estudo foi analisar, em ratos Wistar, os efeitos do
exercício resistido após o infarto.
4.2 Objetivos Específicos
Avaliar com maior profundidade o efeito do treinamento resistido e a
organização dos componentes do ventrículo esquerdo de ratos Wistar machos após
o infarto por meio das análises biométricas, histomorfométrica, estereológica e
imunohistoquímica nos seguintes parâmetros:
Biométrico:
Massa: corporal, cardíaca e ventricular esquerda
Morfométricos e estereológicos
área da secção transversa do cardiomiócito.
área da secção transversa nuclear dos cardiomiócitos.
densidade de volume dos cardiomiócitos.
densidade de volume nuclear dos cardiomiócitos.
densidade de volume do interstício celular cardíaco.
densidade de volume das fibras colágenas tipo I e tipo III
Imunohistoquímicos
expressão das Metaloproteinases 2 e 9 no tecido cardíaco
29
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Animais e Grupos
No biotério da Universidade São Judas Tadeu, os animais foram alojados em
caixas de polipropileno próprias para criação de animais, vedadas, que possuíam
entrada de ar filtrado controlada para adequada manutenção de temperatura,
providas de bebedouro e comedouro próprios, forradas de serragem estéril. Em cada
caixa foram alojados 5 animais, distribuídos de forma aleatória que foram mantidos
até os 3 meses de idade. Foram utilizados 100 Ratos Wistar machos provenientes
do Biotério da Universidade São Judas Tadeu (USJT) com peso inicial aproximado
de 300g. Os animais foram mantidos agrupados, em ambiente com temperatura (22
– 24ºC) e luz controladas em ciclo de 12 horas (claro/escuro). Água e comida foram
oferecidas de modo irrestrito, sendo a dieta normoprotéica. O manejo dos animais
obedeceu às normas estabelecidas pelos procedimentos operacionais padrão
(POPs) do biotério da USJT e pelos princípios éticos da experimentação animal do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Os procedimentos
experimentais realizados foram aprovados pelo comitê de Ética em utilização de
animais para experimentação científica da USJT conforme relatado no protocolo
No017/2015.
Os animais foram randomicamente divididos em quatro grupos experimentais:
Grupo SS – animais sedentário SHAM (cirurgia fictícia) Adaptados 3 dias em escada
antes da cirurgia (uma subida). Sacrificados 7 dias após a cirurgia (n=05).
Grupo ST - animais treinados SHAM (cirurgia fictícia) Adaptados 5 dias em escada
antes da cirurgia (cinco subidas). Sacrificados 7 dias após a cirurgia (n=05).
Grupo SI - animais sedentários infartados. Adaptados 3 dias em escada antes do
infarto (uma subida). Sacrificados 7 dias após o infarto (n=05).
Grupo TI - animais treinados infartados. Adaptados 5 dias em escada antes do
infarto (cinco subidas). Treinados e Sacrificados 7 dias após o infarto (n=05).
30
5.2 Cirurgia de Infarto do miocárdio e cirurgia fictícia (SHAM)
Os animais foram pesados e anestesiados com uma mistura de Cloridrato de
Dextrocetamina (80 mg/Kg) (Ketamin NP 50mg/ml) e Xilazina (12 mg/Kg) (Anasedan
23mg/ml) por via intra-peritoneal. Foram colocados em decúbito dorsal e entubados
(Gelko-14G). Um pequeno corte foi realizado na pele e os músculos peitorais
afastados. Os animais foram submetidos à respiração artificial (Harvard Aparattus©,
Boston, EUA) e foi realizada uma toracotomia esquerda no quarto espaço
intercostal, sendo colocado um afastador entre as costelas para permitir a melhor
visualização. O pericárdio foi seccionado e o átrio esquerdo afastado para
visualização da artéria coronária esquerda. Esta foi ligada (fio mononylon 6.0)
provocando a isquemia miocárdica. Após a ligadura, a incisão torácica foi fechada
(fio mononylon 5.0) e o pneumotórax retirado mediante a sucção do ar com uma
agulha (5x7) conectada a uma seringa de 10ml. Logo após, os animais foram
retirados da ventilação artificial e a respiração natural foi estimulada. Os animais
receberam 30000 UI de Benzilpenicilina Benzatina (Penretard, Cibran, Tanquá, RJ,
Brasil, i.m.) e colocados em ambiente aquecido para recuperação (RODRIGUES et
al., 2011; MALFITANO et al., 2011; JORGE et al., 2011). O procedimento de cirurgia
fictícia (SHAM) foi o mesmo realizado nos animais infartados, só não foi realizada a
ligadura da artéria coronária assim não provocando a isquemia miocárdica.
31
5.2.1 Delineamento do estudo
Fig.1 - Delineamento do estudo, modelo de formação dos grupos experimentais
apresentados na tese.
5.3 Protocolos
5.3.1 Treinamento resistido
O equipamento utilizado para a realização do programa de treinamento de
força com os animais foi uma escada vertical confeccionada em madeira com
degraus de ferro (Figura 2). A altura do equipamento (escada) é de 110 cm com
inclinação de 80° (DUNCAN et al 1998).
O topo do equipamento contém uma caixa de plástico para a acomodação
dos animais no intervalo entre as séries (HOMBERGER e FARRAR, 2004).
O programa de treinamento foi baseado no princípio da sobrecarga com
números de repetições e descanso que mais se aproxima do treinamento em seres
humanos. Portanto a cada semana foi adicionada uma sobrecarga na porção
proximal da cauda do animal com pesos de chumbo (Figuras 3 e 4). (HOMBERGER
e FARRAR, 2004).
32
Fig.2 - Escada utilizada para realização do
treinamento resistido
33
Fig.3 - Modelo de carga utilizada durante o
treinamento resistido
34
Fig. 4 - Foto de um dos animais realizando o treinamento de força.
Observar peso preso à cauda do animal.
35
5.3.2 Processo de Adaptação
O programa de treinamento de força foi realizado com a escada construída
conforme descrito por Homberger e Farrar (2004). Todos os grupos foram
submetidos ao processo de adaptação prévia ao protocolo de treinamento com
duração de uma semana. Nessa etapa, os ratos escalaram o equipamento sem
adição de carga com o objetivo de alcançar a área de descanso no topo da escada.
O procedimento foi repetido 6 vezes por sessão, tendo sido realizadas 5 sessões na
semana para os grupos treinados e 3 sessões na semana em dias alternados para
os grupos sedentários (Adaptado de LEE et al., 2004).
5.3.3 Protocolo de treinamento resistido
A sobrecarga atribuída ao esforço durante o treinamento foi promovida por
meio de pesos de chumbo fixados na porção proximal da cauda do animal com fita
adesiva (Figura 4). Quando os animais atingiram três meses de idade, tendo
passado um período de dois dias após a cirurgia, foram iniciados os protocolos
experimentais de treinamento resistido.
Os animais dos grupos SS e SI, realizaram os exercícios uma vez na semana
sem sobrecarga até sua eutanásia, com o objetivo de provocar um estresse
semelhante ao dos grupos treinados.
O programa de treinamento dos grupos ST e TI, foram baseados no princípio
da sobrecarga com números de repetições e descanso que mais se aproximam do
treinamento em seres humanos.
A sobrecarga inicial foi estabelecida a partir de um percentual (75%) do peso
corporal de cada animal. Semanalmente, os animais foram pesados (balança Oasus)
para correção da carga inicial caso houvesse alteração no peso do mesmo.
Os ratos foram treinados, durante 7 dias. Cada animal escalou a escada até
atingir o topo, 6 vezes por sessão por cada dia de treinamento, com intervalo
36
aproximado de 45 segundos entre uma subida e outra. A característica do
treinamento resistido foi de intensidade moderada (Adaptado de Lee et al., 2004).
5.4 Eutanásia dos Animais
A eutanásia dos animais foi realizada após o término do protocolo de
treinamento.
A decapitação foi escolhida como método de eutanásia visando à isenção de
qualquer interação medicamentosa ou farmacológica nos parâmetros estudados.
O procedimento ocorreu nas instalações do biotério da Universidade São Judas
Tadeu, seguindo normas de higiene e cuidados com os animais conforme
estabelecido pelo biotério, em sala separada do local onde os animais ficaram
alojados ao longo do experimento. Foi realizado o procedimento com um animal de
cada vez, sendo feita total higienização e lavagem das bancadas e equipamentos no
intervalo entre cada animal, evitando assim contato dos mesmos com qualquer odor
de sangue para evitar o estresse dos animais.
Os animais foram pesados e em seguida decapitados por meio de guilhotina.
5.4.1 Coleta e preparação do material para as análises
Ao final do protocolo de treinamento os animais foram sacrificados. Em seguida
os animais foram colocados em decúbito dorsal, realizada a toracotomia, onde os
corações foram evidenciados e retirados. Após lavagem dos corações com solução
fisiológica, estes foram pesados em balança analítica digital com acurácia de 0,001g.
Os átrios foram seccionados transversalmente ao nível do sulco coronário. Em
seguida os ventrículos foram separados e o VE novamente pesado. Logo após,
partes das amostras do VE foram processadas para as análises morfométricas e
estereológicas em microscopia de luz e parte para análise da expressão enzimática
por imunohistoquímica.
Para tal utilizamos à técnica do ortotrip (WEIBEL, 1979). Assim, foram obtidos
cortes aleatórios e uniformemente isotrópicos (UIR). Isotrópico é o órgão ou tecido
que apresenta as mesmas características em todas as direções, portanto: isotropia =
37
homogeneidade. Por isso cortes histológicos isotrópicos são aqueles onde a
estrutura aparece homogeneamente, diferente dos cortes anisotrópicos, onde há
uma orientação na apresentação do material.
Atualmente a avaliação de muitos parâmetros estereológicos necessita de
cortes UIR como requisito. O coração é um órgão anisotrópico. As fibras
ventriculares têm disposição espiral. O coração deve ser seccionado em dois cortes
consecutivos. O primeiro corte deve ser realizado num ângulo determinado
aleatoriamente (por sorteio, por exemplo). Depois a face de corte deve ser apoiada e
novamente o coração deve ser seccionado seguindo também um ângulo aleatório.
Agora já podemos admitir que os fragmentos obtidos contenham tecido de modo
isotrópico. O procedimento poderá ser repetido outras vezes se quisermos maior
segurança nos casos em que o material for altamente anisotrópico (MANDARIM-DE-
LACERDA, 1995).
5.4.2 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia de
Luz
As amostras do ventrículo esquerdo foram fixadas em solução tamponada de
formol a 10% por um período de 24 horas. Após esse período, foram desidratadas
em sequências de álcool etílico (70%, 80%, 95% e 100%), diafanizadas em xilol e
incluídas em parafina. Posteriormente, as amostras foram lavadas em solução salina
fosfatada (PBS) a 0,1M e pH 7,4 e seccionadas por micrótomo em cortes
histológicos não seriados com 5 µm de espessura cada um. Os cortes realizados
foram perpendiculares ao eixo longitudinal das fibras musculares. Os fragmentos de
tecido foram coletados em lâminas de vidro, sendo a resina Entellan utilizada para
fixação da lamínula sobre a lâmina.
As lâminas com a coloração Hematoxilina/Eosina (HE) foram utilizadas para a
visualização dos núcleos, citoplasma dos miócitos e dos capilares do interstício no
microscópio de luz da marca Zeiss, do Laboratório de Estudos Morfológicos e
Imunohistoquimicos da Universidade São Judas Tadeu).
38
As lâminas com a coloração Picrossirius red foram utilizadas para a
visualização de fibras colágenas I e III (Junqueira et al., 1979), realizadas no
microscópio de luz polarizada da marca Zeiss da Universidade São Judas Tadeu.
5.4.3 Processamento para Imunohistoquìmica
Para a realização das análises imunohistoquímicas, as amostras do ventrículo
esquerdo foram fixadas em solução tamponada de formol a 10% por um período de
24 horas. Após esse período, foram desidratadas em sequências de álcool etílico
(70%, 80%, 95% e 100%), diafanizadas em xilol e incluídas em parafina.
Posteriormente, os blocos com os segmentos do ventrículo esquerdo foram cortados
com espessura de 4 m em micrótomo e aderidos em lâminas silanizadas.
5.5 Análises Morfométricas e Estereológicas
A morfometria aplicada foi analisada através de um sistema digital de
processamento e análise de imagens em computador, do Laboratório de Estudos
Morfológicos e Imunohistoquímicos da Universidade São Judas Tadeu. O sistema
consiste de uma microcâmera de vídeo Sony, acoplada ao Microscópio Zeiss, que
capta as imagens das lâminas histológicas e as transmite para um computador
equipado com software específico para análises quantitativas.
Para a realização da análise morfométrica das imagens digitalizadas foi
utilizado o programa de análise de imagens Software Axio Vision 3.8, Zeiss.
A análise estereológica tem por função determinar a ocupação relativa das
estruturas na área teste e permite a observação quantitativa das estruturas
tridimensionais, possibilitando quantificar as modificações adaptativas patológicas ou
normais das estruturas celulares (PEREIRA et al., 1998).
Para a realização da análise estereológica das imagens digitalizadas,
utilizamos o software Image J, do Instituto Nacional de Saúde, USA.
39
5.5.1 Área da secção transversa do cardiomiócito e nuclear (AST)
A morfometria foi utilizada para medir a área da secção transversa do miócito,
realizada em imagens digitalizadas, de maneira semiautomática, com o referido
programa de análise, utilizando-se aumento de 400x e imagens em JPG.
Cada miócito e núcleo foi delimitado e medido sua área em µm2, (Figura 5).
Seus valores foram anotados e utilizados nos tratamentos estatísticos. Foram
capturadas quatro imagens em dois campos aleatórios de cada animal (oito imagens
por animal, 40 imagens por grupo, 192 imagens total).
Fig.5 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400, onde foi medida a área da secção transversa do miócito (µm2), submetida ao software Axion Vision 3.8, Zeiss.
40
5.5.2 Densidade de volume das fibras colágenas tipo I (Vv[col I]) e
tipo III (Vv[col III])
As lâminas foram coradas pelo método Picrossirius e examinados ao
microscópio de luz dotado de filtros polaroides. A disposição e concentração do
colágeno no interstício ventricular cardíaco foi analisada em 4 campos aleatórios de
cada lâmina por animal (20 análises por grupo, 80 análises totais). As análises foram
realizadas através de estereologia (MANDARIM DE-LACERDA, 1995), com sistema
teste de 494 pontos com auxílio do software Image J (versão 1.47 - National
Institutes of Health; Collins, 2007) pelo software Image Pró-Plus (Figura 6).
Fig.6 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus em aumento de x 400 em microscópio de luz polarizada, aplicado o software Image Pró- Plus e sobre ele o software Image J. Barra com 50 µm
41
5.5.3. Densidade de volume nuclear (Vv[nuc]), dos miócitos
(Vv[mio]), do interstício (Vv[int]) e dos capilares (Vv[cap])
A densidade de volume expressa a fração de volume ocupada pela estrutura
de interesse pelo número total de pontos. Para ser estimada a densidade de volume
de cada componente utiliza-se um sistema teste composto por pontos delimitados e
por linhas de exclusão e inclusão, dispostas sistemática e uniformemente
sobrepostas às imagens capturadas.
Foram utilizados 2 cortes não seriados por animal, sendo analisados 4 campos
aleatórios de cada corte (8 imagens por animal, 40 imagens por grupo, 160 imagens
total), em aumento de 400X, e um sistema teste dotado de 494 pontos, com auxílio
do software Image J (versão 1.47 - National Intitutes of Health; Collins, 2007) (Figura
7). As densidades de volume de cada estrutura de interesse foram expressas
levando em consideração para efeito de contagem somente os pontos que
coincidiram sobre a estrutura estudada e os valores foram apresentados em
porcentagens.
42
Fig.7 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400 submetida ao software Image J.
5.6 Análise Imunohistoquímica para Metaloproteinases 2 e 9
Para detecção da expressão de Metaloproteinase as lâminas silanizadas
contendo amostras do ventrículo esquerdo, foram desparafinizadas utilizando estufa
a 57ºC pernoite e imersas em banhos de xilol na seguinte sequência de duração: 30,
5 e mais 5 minutos. Em seguida foram hidratadas em álcool etílico nas
concentrações decrescentes de 100%, 80% e 70%, cada um com uma duração de 5
minutos e posteriormente lavadas em água corrente. Na sequência teve início a
etapa da recuperação antigênica, feita em forno de micro-ondas (potência máxima
de 700 Watts), sendo as lâminas colocadas em tampão de citrato de sódio, pH=6,0,
durante 45 minutos, e a seguir, lavadas em água corrente.
O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com 4 banhos de 5 minutos
cada, em peróxido de hidrogênio (H2O2) a 20 volumes, seguido de lavagem em água
43
corrente destilada e em PBS (solução salina tamponada com fosfatos), pH= 7,4 7,6.
Foi utilizado o anticorpo MMP2/72kDa Collagennase IV (Human, Mouse, Rat e Cow)
Parafin diluído em BSA 1% (soro albumina bovina) no título de 1: 150. Todas as
lâminas foram colocadas em câmara úmida a 4ºC, pernoite. O material foi lavado
com tampão PBS e incubado com anticorpo secundário biotinilado. A seguir,
lavagem com solução PBS. Para revelação da reação foi utilizado um substrato
cromogênico, a solução DAB (33-Diaminobenzidina) na proporção de 0,06g para
100 ml de PBS e 1 ml de H2O2 a 20 volumes, por cinco minutos a 37ºC.
Como produto final da reação, observou-se ao microscópio a forma de um
precipitado castanho escuro. O material foi lavado em água corrente e contracorado
com “Hematoxylina Mayer” por 3 minutos. A seguir, foi submetido a 3 banhos de xilol
para diafinizar. Por fim, as lâminas foram montadas com lamínulas e Entellan®.
Para a análise imunohistoquímica da MMP2 e MMP9 foi feita uma análise
quantitativa em Pixel% das regiões onde eram evidentes a presença das MMP2 e 9.
44
6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados são apresentados como média ± erro padrão. As normalidades dos
dados foram verificadas com o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. As
comparações entre os grupos através do teste de análise de variância (ANOVA) de
duas vias, quando identificado o p <0,05 foi realizado o post teste de Tukey. Foram
analisados grupos comparados dois a dois através do teste t de student, quando
necessário. As correlações realizadas foram feitas através do teste de correlação de
Pearson, quando os dados eram de distribuição normal. A significância foi
determinada a p<0,05. Os dados foram analisados através do programa SPSS
(Statiscal Package for Social Sciences) versão 20.0.
45
7. RESULTADOS
Esse trabalho teve como objetivo analisar as alterações dos componentes do
VE de ratos infartados submetidos a um programa de exercícios físicos.
Os dados apresentados nessa tese serão apenas referentes aos animais do
grupo que foi sacrificado sete dias após o Infarto, uma vez que aceitamos sugestões
de melhoria da metodologia e isso resultou em diversificação do trabalho,
encurtando o tempo hábil para o processamento do restante do material. A
discussão dos dados na íntegra será realizada nos artigos que serão publicados
posteriormente.
7.1 Massa corporal e relação dos componentes cardíacos
A figura 8 visa elucidar a variação da massa corporal dos animais ao longo do
estudo, uma vez que o próprio desenvolvimento e o treinamento dos animais
implicariam em variação e dessa forma, poderiam interferir na interpretação dos
resultados de nossa amostra.
Para análise da massa corporal média dos animais, foram realizadas
pesagem aos 3 meses de idade antes da cirurgia e do protocolo de treinamento,
dois dias após a cirurgia e por último no dia do sacrifício, sendo os valores
elencados a seguir (fig 9).
O peso dos animais de todos os grupos diminuiu após a cirurgia de IAM e
aumentou sete dias após o infarto, onde terminamos o protocolo de treinamento
desse grupo. Podemos relacionar essa queda de peso ao fato dos animais ficarem
debilitados após a cirurgia e durante os sete dias subseqüentes o peso dos animais
aumentar devido a sua recuperação.
Os grupos SS e IS apresentaram maior peso corporal em relação aos animais
dos grupos ST e IT. Isso significa que o sedentarismo resulta em aumento de peso
corporal nos animais sendo mais evidente nos animais do grupo SS.
46
Fig.8 – Análise do peso dos animais em 3 momentos. c, p< 0.15 vs. Momentos anteriores, para o
mesmo grupo. *, p< 0,05 diferente do grupo SS, para o mesmo momento. **, p< 0,01 diferente do
grupo SS, para o mesmo momento. Letras são para comparações intra-grupos. Letras semelhantes
representam semelhanças estatísticas; letras diferentes representam que os valores dentro do
mesmo grupo são diferentes.
47
Após a eutanásia, os corações foram pesados e separados os V.E que
também foram pesados. Em seguida foram analisadas as relações em porcentagem:
Peso cardíaco / Peso corporal (PCd / PC %) e peso do V.E / peso cardíaco (PVE /
PCd %). Os resultados estão apresentados na tabela 1.
Grupos PC, g PCd, g PVE, g PCd / PC % PVE / PCd %
IT n=5 317,8 ± 19,76 a 1,18 ± 0,12 a 0,68 ± 0,06 a 0,37 ± 0,03 a 57,98 ± 5,08 a
IS n=5 328,2 ± 18,44 a 1,30 ± 0,37 a 0,67 ± 0,14 a 0,39 ± 0,08 a 54,55 ± 17,18 a
ST n=5 317,0 ± 13,07 a 0,90 ± 0,06 b 0,67 ± 0,03 a 0,28 ± 0,01 b 74,48 ± 4,02 b
SS n=4 373,5 ± 30,65 b 0,88 ± 0,06 b 0,63 ± 0,06 a 0,23 ± 0,02 b 71,50 ± 2,98 b
Tabela 1: Valores das médias ± desvio padrão, n = nº de ratos, PC = peso corporal, PCd = peso cardíaco, PVE = peso do ventrículo esquerdo, PCd/PC = relação peso cardíaco/pesocorporal, PVE/PCd = relação peso do ventrículo esquerdo/peso cardíaco. Letras semelhantes representam semelhanças estatísticas; letras diferentes representam que os valores dentro do mesmo grupo são diferentes.
48
7.2 Análise Estereológica
Densidade de volume nuclear (Vv[nuc]), dos miócitos (Vv[mio]), do interstício (Vv[int]) e dos capilares
(Vv[cap])
A organização dos componentes morfológicos do miocárdio do ventrículo
esquerdo dos animais estudados está apresentada na Figura 9.
SS
ST
49
fig. 9 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corados em H/E
em aumento de x400 dos vários grupos, evidenciando cardiomiócitos (seta
vermelha), interstício (seta verde) e capilares sanguíneos (seta amarela). Barra: 20
µm.
IS
IT
50
Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[col])
A organização das fibras colágenas do tipo I e do tipo III no miocárdio do
ventrículo esquerdo dos animais estudados está apresentada na Figura 10.
SS
ST
51
Fig. 10 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em Picrosirius em aumento de x400 dos animais dos vários grupos, evidenciando em vermelho e alaranjado as fibras colágenas do tipo I (seta amarela) e em verde as fibras colágenas do tipo III (seta verde), presentes no miocárdio. Barra: 20 µm.
IS
IT
52
Densidade de volume dos capilares (Vv[cap])
As análises das densidades dos capilares (Vv[cap]) no VE dos grupos de
ratos estudados estão apresentadas em porcentagem (%) na figura 11.
Fig.11 – Variação (%) da densidade de volume de capilares (Vv[cap]) no ventrículo
esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. Valores representam média ±
EPM. **p <0,01 vs. SS e ST. #p = 0,08. Letras semelhantes representam
semelhanças estatísticas; letras diferentes representam que os valores dentro do
mesmo grupo são diferentes.
53
Densidade de volume dos miócitos (Vv[mio])
As análises das densidades de volume dos miócitos cardíacos (Vv[mio]) no
VE dos grupos de ratos estudados estão apresentadas em porcentagem (%) na
figura 12.
Fig.12 – Variação (%) da densidade de volume de miócitos (Vv[mio]) no ventrículo
esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. Valores representam média ± DP.
54
Densidade de volume do Espaço Intersticial (Vv[int])
As análises das densidades de volume do espaço intersticial (Vv[int]) no VE
dos grupos de ratos estudados serão apresentadas em porcentagem (%) na figura
13.
Fig.13 - Variação (%) da densidade de volume do Espaço Intersticial (Vv[int]) no
ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais.
55
Densidade de volume nuclear (Vv[nuc])
As análises das densidades de volume nuclear (Vv[nuc]) no VE dos grupos de
ratos estudados serão apresentadas em porcentagem (%) na figura 14.
Fig.14 - Variação (%) da densidade de volume nuclear (Vv[nuc]) no ventrículo
esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. **, p <0,01 vs. IS e IT. #, p= 0,19
vs. IT. Letras semelhantes representam semelhanças estatísticas; letras diferentes
representam que os valores dentro do mesmo grupo são diferentes.
56
Densidade de volume do colágeno I e III (Vv[col I]) (Vv[col III])
As análises das densidades de volume do colágeno I e III (Vv[col I]) (Vv[col
III]) no VE dos grupos de ratos estudados serão apresentadas em porcentagem (%)
na figura 15.
Fig.15 - Variação (%) da densidade de volume de colágeno tipo I e tipo III (Vv[col I])
- (Vv[col III]), no ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. #p
<0,19 vs. IT. Letras semelhantes representam semelhanças estatísticas para o
mesmo tipo de colágeno; letras diferentes representam que os valores dentro do
mesmo tipo de colágeno são diferentes. No colágeno tipo III a diferença foi p <
0,001.
57
7.3 Análise Morfométrica
Área de secção transversa dos miócitos cardíacos (ASTm) e aera de secção
transversa nucleares (ASTn)
Os resultados da ASTm e ASTn dos cardiomiócitos estão representados na
figura 16.
Fig.16 – Variação da área de secção transversa dos miócitos (ASTm) e da Área de
secção transversa nuclear (ASTn) no ventrículo esquerdo após o sacrifício dos
grupos de animais. *p <0,05 vs. SS. #p <0,05 vs. ST. Letras semelhantes
representam semelhanças estatísticas; letras diferentes representam que os valores
dentro do mesmo grupo são diferentes.
7.4 Expressão das Metaloproteinases 2 e 9 ( MMP2 e MMP9)
A expressão da MMP2 (Figura 17) e da MMP9 (Figura 18) no miocárdio do
ventrículo esquerdo dos animais de estudo estão apresentadas a seguir (seta):
58
SS
ST
59
Figura 17 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de
x400 evidenciando a expressão da MMP2 nos vários grupos estudados. Barra de
20µm.
IS
IT
60
SS
ST
61
Figura 18 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x400 evidenciando a expressão da MMP9 nos vários grupos estudados. Barra de 20µm.
IS
IT
62
Os resultados da análise de Imunodetecção da expressão gênica
(semiquantitativa) da MMP2 e 9 (resultados em percentual de pixel) estão
apresentadas na figura 19.
Figura 19 - Variação de imunodetecção da expressão gênica (semiquantitativa) da
MMP2 e 9 no ventrículo esquerdo após o sacrifício dos grupos de animais. *p <0,05
vs. SS. #p <0,05 vs. ST. Letras diferentes representam que os valores dentro do
mesmo grupo são diferentes. *, p< 0,05 vs. MMP2 dos grupos SS e ST.
63
8. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demostraram que o IAM promoveu
alterações deletérias no coração, aumentando os seguintes parâmetros: massa
cardíaca, (Vv[mio]) e (Vv[nuc]) e fibrose intersticial (Vv[col I]) e (Vv[col III]). O
protocolo de exercício resistido em escada melhorou a capacidade física dos
animais e reduziu a fibrose intersticial no ventrículo esquerdo.
8.1 Parâmetros biométricos
Na pesagem corporal realizada antes da cirurgia de IAM e SHAM, nenhuma
diferença estatística foi observada no peso dos animais dos quatro grupos
estudados, fato que comprova a homogeneidade entre os grupos. Dois dias após as
cirurgias os animais foram pesados novamente e quando comparado os grupos
também não houve diferença estatística. Porém os animais do grupo ST
apresentaram diferença dentro do mesmo grupo. Esse fato não tem ser explicação
lógica, pois os animais receberam os mesmos cuidados dos animais dos outros
grupos e o protocolo de treinamento ainda não tinha se iniciado.
No dia da eutanásia foi realizada a última pesagem dos animais. Os animais
dos grupos IT, IS e ST apresentaram semelhantes pesos corporais, porém o grupo
SS apresentou uma tendência em aumentar o peso corporal, o que pode ser
explicado pelas alterações morfofuncionais causadas pelo IAM que podem ter
causado debilidade e pelo treinamento (7 dias).
Os animais do grupo SS apresentaram maior peso corporal em relação aos
demais grupos. Esses animais não se exercitaram e não estavam debilitados por
não sofrerem a cirurgia de IAM.
Freitas (2015) em seu estudo com animais infartados que realizaram corrida
em esteira, não encontrou diferença estatística entre os grupos treinados infartados
no início e no final do protocolo de exercício; isso pode ser explicado pelo diferente
tipo e tempo de treinamento realizado.
O peso cardíaco dos animais dos grupos infartados em relação aos animais
do grupo SHAM teve aumento significante, esse resultado que pode ser explicado
64
pelo processo inflamatório que frequentemente ocorre no tecido cardíaco
imediatamente após o processo de infarto.
Em relação ao peso do VE não ocorreu diferença entre os quatro grupos.
Morfologicamente isso pode ser explicado pela perda de miócitos da região infartada
causando aumento da fibrose, e inflamação da região não infartada nos grupos IS e
IT causando um “equilíbrio” do peso do V.E em relação aos animais dos grupos SS e
ST.
Os animais dos grupos infartados tiveram aumento significante na relação
PCd / PC % em relação aos grupos SHAM, que pode ter ocorrido pela hipertrofia
concêntrica fisiológica nos animais do grupo IT e hipertrofia concêntrica patológica
no grupo IS. Em relação aos animais do grupo SHAM quando comparados entre si
observamos que no grupo ST ocorreu um aumento não significante em relação ao
grupo SS, mas esse aumento pode ter sido causado pela hipertrofia concêntrica
fisiológica devido ao treinamento resistido.
Os animais do grupo treinado apresentaram aumento do peso do VE em
relação aos animais sedentários, o que comprova que o exercício físico causa
hipertrofia concêntrica fisiológica nesse grupo de animais.
Quando analisamos a relação PVE / PCd % observamos que os animais do
grupo infartado tiveram uma diminuição estatística quando comparados com os
grupos SHAM. Isso pode ser explicado pelo necrose em torno de 40% do VE
causando estreitamento da parede infartada.
8.2 Parâmetros estereológicos
8.2.1 Miócitos cardíacos
Em relação a (Vv[mio]) os grupos de animais não apresentaram diferenças
estatísticas. Os animais do grupo IS apresentaram menores (Vv[mio]). Animais
infartados apresentam apoptose e necrose dos miócitos, desorganização celular e
aumento da fibrose. Esse fenômeno é bem evidente em nosso estudo quando
apresentamos os dados estatísticos da quantidade de colágeno do grupo IS. A
apoptose, ou morte celular programada, é um fenômeno regulado de forma ativa por
células próprias destinadas à destruição. Este fenômeno ocorre normalmente
65
durante o desenvolvimento cardíaco, na maturação pós-natal, na hipóxia, isquemia,
na sobrecarga e na insuficiência cardíaca (ÁGUILA, 1998).
No presente estudo foi provocada uma isquemia cardíaca em torno de 40%
do V.E. A morte celular programada serve para equilibrar a divisão celular. Se as
células não desempenham mais sua função elas cometem “suicídio”, ativando um
processo de morte celular. A célula morre de forma ordenada e não prejudica as
células vizinhas e seus componentes são reciclados pelas células que a ingeriram
(ÁGUILA, 1998).
Já a necrose é a morte celular devido a uma lesão aguda, nesse caso a célula
aumenta o volume e a membrana se rompe expelindo seu conteúdo sobre as células
vizinhas, provocando uma resposta inflamatória. Em nosso estudo quando
observamos as lâminas de microscopia de luz nitidamente percebemos a
desorganização celular no grupo IS. Os animais do grupo IT apresentaram (Vv[mio])
maior em relação ao grupo IS que pode ser justificado pela hipertrofia causada pelo
treinamento (ÁGUILA, 1998; ALBERTS, 2006; ZAZYCKI, 2009).
8.2.2 Capilares
A análise da quantidade de vasos no tecido cardíaco revelou que em 7 dias
após o infarto, a região da cicatriz apresentava um percentual maior de vasos
sanguíneos em comparação com os animais SHAM. A proliferação de pequenos
vasos sanguíneos e mitoses de células endoteliais são visíveis 48 horas após o
evento isquêmico e se mantêm em níveis elevados no tecido totalmente cicatrizado
(FISHBEIN et al., 1978).
Segundo Freitas (2015) o aumento de vasos sanguíneos na região de cicatriz
encontrado no presente estudo indica que houve uma revascularização da região
necrosada como tentativa de atenuar os danos em decorrência do infarto.
66
8.2.3 Colágeno
A massa cardíaca e a (Vv[col I]) e (Vv[col III]) aumentaram nos animais dos
grupos infartados. O grupo IS apresentou aumento significante da % do colágeno
tipo III em relação aos demais grupos, o que constitui característica típica da
hipertrofia patológica que ocorre durante o remodelamento cardíaco. O colágeno tipo
I aumentou no grupo IS em relação aos demais grupos, mas só foi observada
diferença significante em relação ao grupo ST. Isso pode ser explicado pelo
treinamento físico dos grupos IT e ST, e pelo grupo SS não sofrer fibrose associada
ao infarto.
A fibrose está associada com aumento da rigidez do miocárdio, piora da
contração cardíaca, disfunção diastólica, piora do fluxo coronário e arritmias
malignas. A presença de fibrose pode causar mortalidade em pacientes com
disfunção cardíaca, pois o conteúdo de colágeno desempenha papel crítico na
manutenção da arquitetura e da função cardíaca. No processo de remodelação pós-
infarto, entretanto, pode ocorrer desequilíbrio entre a síntese e degradação do
colágeno com diversos efeitos deletérios (AZEVEDO et al, 2015).
Brilla (1996) afirma que esta remodelação do tecido cardíaco ocorre em
resposta ao exercício físico, melhorando o desempenho cardíaco, aumentando a
complacência ventricular, aumentando a reserva coronariana com potencial de
oxigenação e nutricional para o miócito, o que diminui os riscos de disfunções
ventriculares.
Nosso estudo foi realizado com animais que praticavam exercício resistido,
porém apresentaram resultados positivos semelhantes aos estudos com ratos que
praticavam exercício aeróbio. Existem poucos estudos com exercícios resistidos em
ratos infartados, pois a grande maioria são com exercícios aeróbios.
Pósa (2015) em seu estudo com exercício aeróbio através de cortes
transversais do V.E, observou uma diminuição da área infartada. Alguns estudos
demonstraram diminuição da deposição de colágeno, hipertrofia excêntrica
fisiológica, aumento no diâmetro dos miócitos, favorecimento da angiogênese no
miocárdio. Esses resultados demonstram que o exercício aeróbico melhora a
complacência ventricular, ocorre uma melhora na contratilidade provocada pela
67
insuficiência cardíaca, além de atenuar no remodelamento patológico, assim
preservando a função cardíaca (ALMEIDA et al, 2014; NUNES et al, 2013; BATISTA
et al, 2013; KRALJEVIC et al, 2013; KEMI et al; 2011; LEOSCO et al, 2008; XU et
al, 2008).
8.2.4 Espaço intersticial
A (Vv[int]) não apresentou diferença estatística significante, entre os grupos.
Os animais do grupo IS, porém mostraram um leve aumento na (Vv[int]) que pode
ser explicado pela (Vv[col I]) e (Vv[col III]) estatísticamente significante nesse grupo.
Esse resultado também pode ter ocorrido pela hipertrofia miocárdica concêntrica
fisiológica do exercício e pela hipertrofia concêntrica patológica causada pelo infarto.
Nossos animais participaram de um protocolo de treinamento de somente
sete dias, e que talvez, se esse tempo de treinamento fosse maior o remodelamento
poderia mostrar diferentes resultados.
8.3 Parâmetros morfométricos
8.3.1 Área de secção transversa dos miócitos (ASTm)
Os grupos infartados (IS e IT) e o grupo SHAM treinado (ST) não
apresentaram diferenças estatísticas entre si. O grupo SS mostrou diferença
significante em relação aos demais grupos. A área de secção transversa dos
miócitos foi menor nesse grupo, porém não apresentaram desorganização celular. O
grupo ST também não apresentou desorganização celular, porém apresentou maior
ASTm. Esse achado pode ter sido causado pela hipertrofia fisiológica causada pelo
exercício.
No estudo de Barauna (2005) foi confirmado que o exercício resistido gera um
aumento da pressão intraventricular, maximizando o estresse na parede do
miocárdio gerando assim um estímulo para a hipertrofia fisiológica desse tecido.
Outros estudos também demonstram que como resposta ao exercício é
desencadeada uma hipertrofia concêntrica aumentando a espessura da parede
68
ventricular esquerda e os miócitos nesse contexto, aumentam sua ASTm, com a
finalidade de gerar aumento da contratilidade intrínseca celular (KEMI et al, 2005;
MARON & PELLICIA, 2006, HAYKOWSKY et al, 2000; LEVINGER et al, 2005).
Os animais do grupo IT apresentaram ASTm mais organizadas em relação ao
grupo IS, porém apresentaram núcleos descentralizados em relação aos grupos SS
e ST. O grupo ST apresentou pequena hipertrofia dos miócitos em relação ao grupo
SS que pode ser resultante do exercício resistido (BARAUNA, 2005).
Os animais do grupo IS apresentaram maior ASTm, apesar de não ser
estatisticamente diferentes dos grupos ST e IT podemos observar em nosso estudo
que os miócitos apresentavam deformações e disparidades nas ASTm em relação
aos demais grupos quando observados em microscopia óptica. Esse resultado pode
ser explicado pela apoptose e necrose celular causada pela isquemia miocárdica e
sedentarismo dos animais desse grupo.
A hipertrofia cardíaca fisiológica e a patológica estão associadas ao aumento
do tamanho do coração. No entanto, a patológica está tipicamente associada com
perda de miócitos por necrose ou apoptose, aumento dos elementos intersticiais que
induzirão à formação de fibrose, disfunção cardíaca e aumento do risco de morte
(MCMULLEN & JENNINGS, 2007). Em nosso estudo observamos nos animais
infartados que ocorreu um aumento desses elementos intersticiais (Vv[col I]), (Vv[col
III]), (Vv[mio]) e (Vv[cap]) sendo menos proeminente no grupo IT que apresentou
melhor arranjo dos miócitos, que pode ser explicado por uma hipertrofia fisiológica
devido ao treinamento.
8.3.2 Área de secção transversa nuclear (ASTn)
Os animais infartados apresentaram maior ASTn em relação aos animais
SHAM. O grupo IT foi diferente estatisticamente dos grupos SS e ST. Os animais do
grupo IS apresentaram maior ASTn em relação aos grupos SHAM mas só
apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo ST.
Esse maior volume nuclear dos animais treinados está relacionado à maior
demanda/expressão gênica no sentido de recuperar o tecido ou solucionar a lesão e
a inflamação. Uma análise mais aprofundada provavelmente mostraria diferenças
69
importantes entre os genes expressos quando comparados os grupos IT e IS, no
entanto, esse não foi um dos objetivos do trabalho.
8.4 Parâmetros imunohistoquímicos
As metaloproteinases de matriz são enzimas associadas a processos de
remodelamento tecidual entre outros. Também conhecidas como Gelatinases elas
apresentam características funcionais fundamentais ao processo de remodelamento
cardíaco bem como ao desenvolvimento tumoral no organismo (COGNI et al., 2013).
A MMP9 está associada à cicatrização tecidual e o estudo de Cogni et al.,
2013 mostra uma relação de aumento da MMP9 com uma diminuição do processo
de remodelamento ventricular, enquanto níveis elevados de MMP2 seriam
considerados um importante preditor do remodelamento ventricular.
Nossos resultados mostram uma diminuição significativa dos valores de
MMP2 no grupo IS com alguma recuperação no grupo IT, com valores se
aproximando dos animais do grupo SHAM, isso pode ser considerado um
prognóstico de remodelamento que está sendo afetado pelo exercício físico.
No entanto, esses resultados provavelmente refletem o momento do sacrifício
dos animais. Embora o prazo de sete dias após o infarto signifique um processo
inflamatório exacerbado e de remodelamento ativo, o comportamento da MMP2 já
aponta para alterações fisiológicas positivas importantes, enquanto o da MMP9
provavelmente seria diferente se observássemos a enzima por um período mais
longo.
70
9. CONCLUSÃO
Após a realização desse trabalho, pudemos concluir que o treinamento
resistido mostrou-se eficiente em relação às respostas biométricas, morfométricas e
estereológicas apresentadas pelos ratos infartados estudados em nosso trabalho.
Isso quer dizer que esse tipo de exercício pode constituir uma interessante
estratégia de intervenção não farmacológica no tratamento de indivíduos infartados.
A intervenção do infarto, em ratos submetidos a um protocolo de exercício
resistido, proposto nesse trabalho promoveu maior ganho de peso médio corporal
em todos os animais, aumento do peso cardíaco dos animais infartados, aumento da
massa ventricular esquerda nos grupos treinados quando comparados aos grupos
sedentários, aumento da relação PCd / PC % dos animais infartados, confirmando a
presença de hipertrofia cardíaca e diminuição da relação PVE / PCd % dos animais
infartados, mostrando a diminuição da espessura da parede do VE na região
infartada.
Ainda observamos um aumento da ASTm e deformação dos miócitos nos
animais infartados sedentários que foi revertido pelo treinamento nos animais
infartados treinados se assemelhando aos animais do grupo SHAM, aumento do
ASTn que está relacionado à maior demanda/expressão gênica no sentido de
recuperar o tecido ou solucionar a lesão e a inflamação, aumento significante da
Vv[col I] e Vv[col III] no grupo IS, indicando uma maior fibrose resultante do IAM,
nos animais SHAM e IT observamos uma diminuição da Vv[col I] e Vv[col III],
comprovando que o exercício pode reverter esse quadro patológico e, por fim,
observamos uma redução da MMP2 nos grupos infartados, sendo considerado um
prognóstico de remodelamento afetado positivamente pelo exercício físico.
Todas essas informações nos levam a conclusão que o exercício físico
resistido não só é importante para o paciente infartado como também deve ser
iniciado a curtíssimo prazo, já podendo promover efeitos significativos que devem
ser mantidos ou melhorados no médio prazo.
71
REFERÊNCIAS
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miocárdio de ratos jovens e idosos. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.70, n.2,
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ALBERTS, B; et al. Biologia molecular da célula. 4.ed. Porto Alegre: Artmed,
2004. p.1001
ALMEIDA, S. A.; CLAUDIO, E. R. G.; MENGAL, V. F.; OLIVEIRA, S. G.; MERLO, E.;
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BARAUNA, V. G.; JUNIOR, M. L. B.; ROSA, C.; CASARINI, D. E.; KRIEGER, J. E.;
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