RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2331128

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 04.09.2009 09782654.9 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 06.11.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/45 EP 2331128 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61K 39/39 (2006.01) A61K 39/17 (2006.01) A61P 31/12 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Kompozycja zawierająca chitozan do doocznego podawania szczepionki (szczepionek) ptakom

PL/E

P 23

3112

8 T3

(30) Pierwszeństwo:

05.09.2008 US 94642 P 03.04.2009 US 166398 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

15.06.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/24

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.06.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/06

(73) Uprawniony z patentu:

CEVA Santé Animale SA, Libourne, FR

(72) Twórca(y) wynalazku:

YANNICK GARDIN, Cantenay Epinard, FR VILMOS PALYA, Budapest, HU SYLVAIN COMTE, Salleboeuf, FR

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski

SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-4701/VAL EP 2 331 128 B1

Opis

Zakres wynalazku

[0001] Wynalazek dotyczy kompozycji szczepionki zawierających chitozan i szczepionkę, które są podawane ptakom drogą dooczną oraz sposobów albo programów szczepienia obejmujących zastosowanie chitozanu dla zwiększenia lub podwyŜszenia odpowiedzi im-munologicznej na szczepionkę u ptaków. 5

Tło wynalazku

[0002] Szczepionki są preparatami materiałów antygenowych, podawanych osobnikowi dla wzmocnienia odporności na zakaŜenie przez indukowanie czynnej odporności na kon-kretne mikroorganizmy, takie jak bakterie lub wirusy albo pasoŜyty. Szczepionki moŜna podawać wraz z adiuwantami dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Przykłady 10

adiuwantów obejmują chemiczne i polipeptydowe środki immunostymulujące, które wzmacniają odpowiedź układu odpornościowego na antygeny. Takie adiuwanty mogą obejmować przykładowo, wodorotlenek glinu, fosforan glinu, oleje roślinne i zwierzęce, jak teŜ oleje mineralne, toksyny bakteryjne, pochodne chityny oraz chitozan i tym podob-ne, które są podawane ze szczepionką w ilości dostatecznej do poprawienia odpowiedzi 15

immunologicznej. [0003] Szczepionki i adiuwanty są ogólnie podawane drogą wstrzykiwania pozajelitowe-go, takiego jak zastrzyki podskórne lub domięśniowe. MoŜna równieŜ prowadzić bezpo-średnie podawanie na śluzówkę nosa róŜnych gatunków zwierząt, zwłaszcza do leczenia zakaŜeń górnych dróg oddechowych. Przykładowo, w patencie europejskim EP 865 297 20

B1 opisano donosowe wspólne podawanie myszom antygenów białkowych lub polisacha-rydowych z patogenów i chitozanu jako adiuwanta. Te kompozycje donosowe są formuło-wane jako suche proszki w postaci mikrosfer, przez aerozole, krople lub wdmuchiwanie, i pozwalają na podwyŜszenie odpowiedzi immunologicznych, humoralnej śluzówkowej IgA i ogólnoustrojowej IgG, po kilku kolejnych podaniach donosowych. Rehmani S.F., 25

(Preventive Veterinary Medicine 25 (1996), 241-248) ujawnia kompozycję szczepionki zawierającą Ŝywy atenuowany wirus choroby Newcastle dla uodpornienia przez podawa-nie dooczne. [0004] Zgłaszający odkrył obecnie, Ŝe chitozan stosowany w połączeniu z ptasią szcze-pionką w tym samym programie szczepienia wykazuje potencjał znacznego podwyŜszania 30

komórkowej odpowiedzi immunologicznej, przy zachowanej wysokiej humoralnej i ogól-noustrojowej odpowiedzi immunologicznej szczepionych ptaków przy podawaniu drogą dooczną. Ponadto odkryto, Ŝe chitozan działał na ptasie spojówki i powodował znaczący wzrost utrzymywania się szczepionki w ptasich tkankach.

Streszczenie wynalazku 35

[0005] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji szczepionki do podawania doocznego ptakom, jak zdefiniowano w zastrzeŜeniach. Wynalazek dotyczy takŜe zastosowań NDV w połączeniu z chitozanem do wytwarzania kompozycji szczepionki do podawania dooczne-go dla skutecznego uodparniania ptaków przeciwko chorobom zakaźnym. Niniejszy wyna-lazek dotyczy ponadto zestawu do szczepienia ptaków, jak zdefiniowano w zastrzeŜeniach. 40

Krótki opis figur

[0006]

FIGURA 1: ilustruje linię przebiegu czasowego szczepienia.

FIGURA 2: ilustruje protokół przypominania antygenowego.

2

FIGURA 3: przedstawia poziomy wytwarzania γ-interferonu u kur (gęstość optyczną) mierzone 2 do 5 tygodni po podawaniu doocznym CEVAC® VITAPEST L (Ceva Phy-laxia, Węgry) z chitozanem lub bez niego.

FIGURA 4: przedstawia miana szczepu szczepionkowego choroby Newcastle (ND) wyraŜone w dawce zakaŜającej jaja (EID50) w ptasich tkankach kur SPF, które otrzy-5

mały CEVAC® UNI L (Ceva Phylaxia, Węgry), lub CEVAC® VITAPEST L, z chito-zanem lub bez niego drogą dooczną.

FIGURA 5: przedstawia miana szczepu szczepionkowego choroby Newcastle wyra-Ŝone w dawce zakaŜającej jaja (EID50) w ptasich tkankach typowych kur niosek, które otrzymywały CEVAC® UNI L lub CEVAC® VITAPEST L, z chitozanem lub bez nie-10

go drogą dooczną.

FIGURY 6A i 6B: przedstawiają wydolność immunologiczną i swoistą odporność komórkową po szczepieniu SPF (Figura 6A) i typowych kur niosek (Figura 6B) Ŝywą szczepionką choroby Newcastle (NDV). Ptaki szczepiono w wieku jednego dnia, dro-gą dooczną, samym CEVAC® VITAPEST L (czarne kolumny) lub w połączeniu z chi-15

tozanem (szare kolumny). Nieszczepione zwierzęta wskazują białe kolumny. Limfocy-ty śledzionowe stymulowano mitogenem PMA/lono (0,1 µg/ml), antygenem przypo-minającym gp-NDV (1 µg/ml) i supernatanty stymulowanych komórek zebrano po 72 h aktywacji. Wytwarzanie ChIFNγ określono metodą ELISA wychwytywania ChIF-Nγ. Wyniki odpowiadają średniej ± odchylenie standardowe gęstości optycznej (O.D.) 20

w kaŜdym punkcie czasowym (n = 5). Średnie ± odchylenia standardowe bez wspól-nego indeksu górnego róŜnią się istotnie (P < 0,05).

FIGURY 7A i 7B: przedstawiają łzową, pośredniczoną przez przeciwciała, odporność po szczepieniu kur SPF (Figura 7A) i typowych kur niosek (Figura 7B) Ŝywą szcze-pionką ND. Ptaki szczepiono w wieku jednego dnia, drogą dooczną, samym CEVAC® 25

VITAPEST L (czarne kolumny) lub w połączeniu z chitozanem (szare kolumny). Nie-szczepione zwierzęta wskazują białe kolumny. Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe wartości absorbancji (O.D.) określone metodą ELISA w określonym cza-sie po szczepieniu (n = 5). Próbki łez rozcieńczono 1:4 dla IgA/G i 1:32 dla IgM. Średnia ± odchylenie standardowe w punktach czasowych bez wspólnego indeksu 30

górnego róŜnią się istotnie (P < 0,05). N.D. = nie określono, wskutek ograniczonej ilości próbek pozostałych po swoistych dla NDV pomiarach IgA i IgG.

FIGURY 8A i 8B: przedstawiają Ŝółciową, pośredniczoną przez przeciwciała, odpor-ność po szczepieniu kur SPF (Figura 8A) i typowych kur niosek (Figura 8B) Ŝywą szczepionką ND. Ptaki szczepiono w wieku jednego dnia, drogą dooczną, samym 35

CEVAC® VITAPEST L (czarne kolumny) lub w połączeniu z chitozanem (szare ko-lumny). Nieszczepione zwierzęta wskazują białe kolumny. Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe wartości absorbancji (O.D.) określone metodą ELISA w określonym czasie po szczepieniu (n = 5). Próbki Ŝółci rozcieńczono 1:50. Średnia ± odchylenie standardowe w punktach czasowych bez wspólnego indeksu górnego róŜ-40

nią się istotnie (P < 0,05).

FIGURY 9A i 9B: przedstawiają dwunastniczą pośredniczoną przez przeciwciała od-porność po szczepieniu kur SPF (Figura 9A) i typowych kur niosek (Figura 9B) Ŝywą szczepionką ND. Ptaki szczepiono w wieku jednego dnia samym CEVAC® VITA-PEST L (czarne kolumny) lub w połączeniu z chitozanem (szare kolumny). Nieszcze-45

pione zwierzęta wskazują białe kolumny. Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe wartości absorbancji (O.D.) określone metodą ELISA w określonym cza-sie po szczepieniu (n = 5). Odpowiedź Ig mierzono w nierozcieńczonych supernatan-tach hodowli tkanki dwunastnicy ex vivo. Średnia ± odchylenie standardowe w punk-tach czasowych bez wspólnego indeksu górnego róŜnią się istotnie (P < 0,05). 50

3

Szczegółowy opis wynalazku

[0007] Niniejszy wynalazek ujawnia kompozycję szczepionki do podawania doocznego ptakom, która to kompozycja obejmuje jedną lub większą liczbę szczepionek i skuteczną wspomagającą ilość chitozanu. Jak wspomniano powyŜej, niespodziewanie stwierdzono, Ŝe, przy doocznym, wspólnym podawaniu, chitozan i szczepionka znacznie podwyŜszają 5

komórkową odpowiedź immunologiczną ptaków i powodują dłuŜsze utrzymywanie się szczepionki w określonych tkankach szczepionych ptaków. Kompozycje szczepionek ujawnione w niniejszym wynalazku są więc szczególnie skuteczne w poprawianiu długo-okresowej ochrony ptaków przeciwko chorobom ptasim. [0008] Określenie „skuteczna wspomagająca ilość” jest dobrze zrozumiałe przez specjali-10

stów w tej dziedzinie i obejmuje ilość chitozanu, która moŜe stymulować odpowiedź im-munologiczną przeciwko doocznie podawanym antygenom, tj. ilość zwiększającą odpo-wiedź immunologiczną doocznie podawanej kompozycji szczepionek, przykładowo mie-rzoną w odniesieniu do poziomów wytwarzania γ-interferonu przez limfocyty śledzionowe i utrzymywania się szczepionki w tkankach ptasich. W obecności chitozanu obserwowano 15

istotne wzrosty poziomów wytwarzania γ-interferonu i utrzymywania się szczepionki w tkankach. Przykładowo, wzrost odpowiedzi komórkowej moŜna równieŜ udowodnić w te-ście rozmnaŜania komórek (mierzonego przez włączanie 3H tymidyny w dzielące się ko-mórki po przypominającej stymulacji antygenem), przez mierzenie cytotoksycznej aktyw-ności komórek CTL wobec znakowanych radioizotopowo komórek docelowych (oznacze-20

nie uwalniania radioizotopu w pewnym czasie) lub przez test migracji makrofagów. [0009] Szczepionkę moŜe stanowić dowolne ptasie mikroorganizy patogenne lub niepato-genne, takie jak wirusy, bakterie, dowolne inne pasoŜyty lub antygeny. Mogą one być Ŝy-wymi, atenuowanymi mikroorganizmami lub zabitymi, inaktywowanymi mikroorgani-zmami, albo pełnymi mikroorganizmami lub podjednostkami mikroorganizmów, inakty-25

wowanymi mikroorganizmami chimerycznymi lub rekombinowanymi, mikroorganizmami rozbitymi, mikroorganizmami zmutowanymi, mikroorganizmami wadliwymi lub ich połą-czeniami. Szczepionkę moŜe równieŜ stanowić antygen zawierający epitopy lub części an-tygenowe struktury mikroorganizmu, np. wirusa, bakterii lub pasoŜyta, taki jak preparaty antygenowych białek z patogenów, rekombinowane białka, korzystnie wirusowy antygen, 30

taki jak wirusowe białka kapsydu, białka ścian komórkowych, peptydy lub części struktury bakterii lub pasoŜyta, takie jak polisacharydy, lipopolisacharydy i glikoproteiny. Szcze-pionkę moŜe równieŜ stanowić DNA lub rekombinowane DNA, które wytwarza antygen z patogenów w komórkach po wprowadzeniu DNA. Antygeny moŜna dostarczać w postaci oczyszczonej lub nieoczyszczonej. 35

[0010] Gdy szczepionkę stanowi Ŝywy, atenuowany (replikujący się) mikroorganizm, taki jak wirus, bakteria lub inny ptasi patogen, atenuowany patogen zachowuje niepatogenne właściwości, i jest zdolny do odtwarzania. Atenuacja moŜe wynikać z naturalnego lub sztucznego procesu atenuacji. Sztuczna atenuacja jest ogólnie uzyskiwana z uŜyciem róŜ-nych technik, w tym pasaŜowania w Ŝywych zwierzętach lub róŜnych naturalnych poŜyw-40

kach, w tym narządach, komórkach, jajach z zarodkami itp. Sztuczną atenuację moŜna równieŜ uzyskać przez suszenie zakaŜonych narządów, starzenie hodowli, przystosowanie do niskich temperatur lub szczególnych warunków hodowli, genetyczne delecje itp. [0011] Szczepionkę mogą równieŜ stanowić zabite inaktywowane mikroorganizmy. Wy-twarzanie inaktywowanych wirusów do szczepienia ogólnie osiąga się środkami chemicz-45

nymi lub fizycznymi. Chemiczną inaktywację moŜna prowadzić przez traktowanie wiru-sów przykładowo enzymami, formaldehydem, β-propiolaktonem, etylenoiminą lub jej po-chodną. Tak otrzymany inaktywowany wirus moŜna zobojętnić lub stabilizować później. Fizyczną inaktywację moŜna prowadzić poddając wirusy działaniu bogatego w energię promieniowania, takiego jak światło UV, promieniowanie rentgenowskie lub promienio-50

wanie γ.

4

[0012] Takie atenuowane lub inaktywowane mikroorganizmy, np. wirus, bakterie lub inne ptasie pasoŜyty moŜna równieŜ nabyć ze źródeł handlowych. [0013] Szczepionka moŜe być typu homologicznego (taka jak wirus kurzy dla ochrony kur) lub heterologicznego (taka jak wirus indyczy dla ochrony kur). Alternatywnie, prepa-raty szczepionki mogą obejmować połączenia Ŝywych antygenów ze swoistymi przeciw-5

ciałami, nazywanymi szczepionkami z kompleksem immunologicznym. [0014] Według niniejszego wynalazku, szczepionka lub antygen pochodzi z wirusa choro-by Newcastle (NDV). [0015] Chitozan jest pochodną chityny i odpowiada liniowemu polisacharydowi złoŜone-mu z losowo rozmieszczonej związanej β-(1-4) D-glukozaminy (jednostka deacetylowana) 10

i N-acetylo-D-glukozaminy (jednostka acetylowana). Chitozan jest wytwarzany przemy-słowo przez deacetylowanie chityny, która jest strukturalnym składnikiem w egzoszkiele-cie skorupiaków. Stopień deacetylowania moŜna określić metodą spektroskopii NMR. Przykładowo, stopień deacetylowania handlowego chitozanu mieści się w zakresie 60-100%. 15

[0016] Chitozan stosowany w kompozycjach szczepionek według niniejszego wynalazku moŜe być wytwarzany z chityny przez deacetylowanie do stopnia deacetylowania więk-szego niŜ 40%, korzystnie od 50% do 90%, a korzystniej od 70% do 95%. Takie deacety-lowane chitozany są dostępne w handlu pod handlowym oznaczeniem glutaminian chito-zanu „Sea Cure+” z Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norwegia. Masa cząsteczkowa chi-20

tozanu moŜe mieścić się pomiędzy 10 kD a 500 kD, korzystnie pomiędzy 50 kD a 300 kD, a korzystniej pomiędzy 100 kD a 300 kD. [0017] Według niniejszego wynalazku, chitozan moŜna stosować jako skuteczny adiuwant w postaci chitozanu monokarboksymetylowanego (MMC) równieŜ określanego jako kar-boksymetylochitozan (CMC) lub w postaci chlorowodorku chitozanu (HCl Chitozan). HCl 25

Chitozan jest dobrze znany w tej dziedzinie i jest sprzedawany przykładowo przez Kraeber Gmbh & Co. [0018] Przykładowo, stęŜenia HCl Chitozanu stosowanego w kompozycjach szczepionek mogą mieścić się w zakresie 0,1% do 5%, a korzystnie około 0,5% lub około 1%. [0019] Kompozycje szczepionek według wynalazku moŜna stosować do skutecznego 30

uodparniania ptaków przeciwko zakaźnym chorobom ptasim. Jak wspomniano powyŜej, w praktyce stwierdzono, Ŝe przy podawaniu doocznym te kompozycje szczepionek znacznie podwyŜszają komórkową odpowiedź immunologiczną u ptaków, jak teŜ utrzymywanie się szczepionki w licznych tkankach ptasich. Faktycznie, utrzymywanie się szczepionki w tkankach ptasich obserwowano jeden tydzień po szczepieniu, w tkankach ptasich obejmu-35

jących spojówkę, płuca, śledzionę, tchawicę, przewód pokarmowy taki jak dwunastnica, trzustka i migdałki jelit ślepych. Ponadto, takie utrzymywanie się było podtrzymywane pięć tygodni po szczepieniu, szczególnie w spojówce, płucach, dwunastnicy, trzustce i migdałkach jelit ślepych. [0020] Gatunki ptaków, którym moŜna podawać doocznie kompozycje szczepionek we-40

dług niniejszego wynalazku obejmują przykładowo kury, indyki, gęsi, kaczki, baŜanty, przepiórki lub gołębie i ogólniej drób hodowany lub domowy albo ptactwo domowe. [0021] Wynalazek ujawnia zastosowanie kompozycji szczepionek zdefiniowanych tutaj w sposobie szczepienia ptaków przeciwko ptasim zakaŜeniom, który to sposób obejmuje po-dawanie dooczne ptakowi kompozycji szczepionki obejmującej szczepionkę wraz ze sku-45

teczną wspomagającą ilością chitozanu. [0022] Niniejszy wynalazek ujawnia równieŜ zastosowanie skutecznej ilości chitozanu i Ŝywego atenuowanego wirusa choroby Newcastle do wytwarzania kompozycji szczepionki do zwiększania ptasiej odpowiedzi immunologicznej przeciwko ptasiemu patogenowi, gdzie chitozan i szczepionka są podawane ptakom za pośrednictwem kropli do oczu, spre-50

jów lub aerozoli, i gdzie zwiększeniu ulega odpowiedź komórkowa ptaków oraz utrzymy-wanie się patogenu w tkankach ptasich. Szczepionkę stanowi Ŝywy atenuowany wirus cho-

5

roby Newcastle. Chitozan i szczepionkę moŜna równieŜ podawać ptakom oddzielnie lub równocześnie. Gdy chitozan i patogen podaje się kolejno, chitozan moŜna ponadto poda-wać przed szczepionką lub po szczepionce. [0023] Ponadto, zgodnie z kolejnym aspektem, wynalazek dostarcza kompozycję szcze-pionki zdefiniowaną tutaj do stosowania w sposobie podwyŜszania ochronnej komórkowej 5

odpowiedzi immunologicznej i utrzymywania się szczepionki w tkankach ptasich przez podawanie dooczne ptakom kompozycji szczepionki zawierającej NDV i skuteczną wspomagającą ilość chitozanu, jak zdefiniowano wcześniej. [0024] Niniejszy wynalazek ujawnia ponadto sposób uodporniania ptaków obejmujący etap podawania do oczu ptaków kompozycji szczepionki jak opisano powyŜej. Niniejszy 10

wynalazek ujawnia równieŜ sposób zwiększania odporności komórkowej u ptaków i utrzymywania się szczepionki w tkankach ptasich przez podawanie jednej lub większej liczby szczepionek w połączeniu ze skuteczną ilością chitozanu do oczu ptaków. Szcze-pionka i chitozan mogą być podawane oddzielnie, po kolei lub równocześnie. [0025] RównieŜ, zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, podawanie doocz-15

ne moŜna prowadzić przez rozpylanie, aerozol lub krople do oczu. Korzystnie, takie poda-wanie dooczne przeprowadza się po zaniku przeciwciał otrzymanych od matki. [0026] Najkorzystniej, prowadzi się ponadto szczepienie przypominające dla stymulowa-nia odpowiedzi immunologicznej ptaków, które juŜ poddano szczepieniu w jaju lub w wieku kilku dni, tym samym indukując wyŜszą stymulację odpowiedzi immunologicznej. 20

Takie przypomnienie szczepienia moŜna prowadzić w wieku od 1 dnia do 4 tygodni, albo po lub równocześnie z pierwszym uodpornianiem. [0027] Kompozycje doocznych szczepionek według wynalazku moŜna formułować jako ciecze lub suche proszki, do podawania jako aerozole, spreje lub krople do oczu. Kompo-zycje szczepionek moŜna więc podawać ptakom przez rozpylanie bezpośrednio na głowy 25

ptaków. Alternatywnie, jedną lub większą liczbę kropli kompozycji szczepionki moŜna umieszczać bezpośrednio w oczach kaŜdego pojedynczego ptaka, jak u ludzi. Korzystne kompozycje według wynalazku są formułowane jako krople do oczu w postaci cieczy. [0028] Kompozycje do podawania jako aerozole, krople do oczu lub spreje mogą zawierać jedną lub większą liczbę zaróbek typu zwykle zawartych w takich kompozycjach, przykła-30

dowo środki konserwujące, środki regulujące lepkość, środki regulujące toniczność, środki blokujące łzawienie, środki buforujące, środki stabilizujące, nośniki, adiuwanty i tym po-dobne dla preparatu do podawania doocznego. Dla zapewnienia aby chitozan pozostawał rozpuszczalny w środowisku wodnym, a takŜe dla zapewnienia aby antygenowi nie szko-dził zbyt kwaśny odczyn pH, roztwór do podawania doocznego korzystnie ma pH w zakre-35

sie 5,5 do 6,5. Nośnikami mogą być dowolne z wielu wodnych buforów dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie, takie jak, przykładowo, bufory fosforanowe. MoŜna stoso-wać dodatkowe adiuwanty. Są one dobrze znane w tej dziedzinie i mogą obejmować ole-jowe emulsje, sole glinu lub Ŝele, takie jak wodorotlenek glinu lub fosforan glinu, saponi-ny, witaminy, ekstrakty ze ścian bakterii, polimery oparte na polikwasie akrylowym, takie 40

jak środki Carbopol, niejonowe polimery blokowe, aminy kwasów tłuszczowych, takie jak awrydyna i DDA, polimery oparte na dekstranie, takie jak siarczan dekstranu i DEAE-dekstran, biodegradowalne mikrokapsułki, liposomy, wirusowe immunostymulatory, takie jak MDP, LPS i glukany. [0029] Niniejszy wynalazku ujawnia równieŜ produkt lub zestaw do szczepienia ptaków 45

obejmujący środki do dozowania kompozycji doocznych szczepionek obejmujących szczepionkę i skuteczną ilość chitozanu. Dokładniej, zestaw do szczepienia ptaków obej-muje urządzenie dozujące przystosowane do dozowania kompozycji szczepionki bezpo-średnio do oczu ptaków. Takie urządzenie dozujące moŜe, przykładowo, mieć postać ukła-du dostarczania aerozolu, spreju lub kropli do oczu i moŜe być przystosowane do dozowa-50

nia tylko pojedynczej dawki lub wielu dawek do oczu ptaków. Zestaw do szczepienia pta-ków moŜe obejmować odrębne pojemniki zawierające odpowiednio skuteczną ilość chito-

6

zanu i szczepionki. Zestaw do szczepienia ptaków według niniejszego wynalazku moŜe ponadto obejmować instrukcje techniczne z informacjami o podawaniu i dawkowaniu kompozycji farmaceutycznej. [0030] Szczepionka moŜe być podawana w ilości skutecznej do stymulowania komórko-wej odpowiedzi immunologicznej i do zwiększania utrzymywania się szczepionki, takiej 5

jak przykładowo szczep wirusowy szczepionki u ptaków. Przykładowo, szczepionka moŜe być podawana ptakom w jednej lub większej liczbie dawek, przy czym kaŜda dawka za-wiera przykładowo 105 do 108 EID50. [0031] Obecnie stosowane Ŝywe szczepionki mają zwykle ograniczone zastosowanie wskutek obecności w nowo wyklutych ptakach pewnej ochrony przeciwko patogenom za-10

pewnianej przez przenoszenie otrzymanych od matki przeciwciał (MDA), przenoszonych przez Ŝółtko jaja i z kolei resorbowanych i obecnych w surowicy kurczęcia. Te MDA mogą wpływać na szczepienie przez neutralizowanie Ŝywej szczepionki. W konsekwencji, od-powiedź immunologiczna na szczepienie moŜe być opóźniona i/lub ograniczona u typo-wych kur, jak wcześniej obserwowano na poziomie ogólnoustrojowym. 15

[0032] Szczepionki według niniejszego wynalazku są więc korzystnie podawane po zani-ku MDA, co tym samym pozwala na indukowanie dobrej odzpowiedzi immunologicznej, zanim ptaki zostaną prawdopodobnie wystawione na wirulentny szczep NDV. Najkorzyst-niej, szczepienie przypominające wykonuje się dla wieku 2 lub 3 tygodni zgodnie ze spad-kiem MDA. 20

[0033] Jak pokazano bardziej szczegółowo w Przykładach poniŜej, eksperymenty szcze-pienia prowadzono na czterech grupach jednodniowych kur SPF (wolnych od swoistych patogenów) lub typowych niosek (Figura 1). Kompozycje szczepionek były podawane wszystkim grupom kur drogą dooczną, stosując krople do oczu. Grupa oznaczona „Nega-tywne kury” nie otrzymywała Ŝadnej szczepionki. Druga i trzecia grupa były szczepione 25

jedną dawką CEVAC® UNI L lub jedną dawką CEVAC® VITAPEST L, obu odpowiada-jących Ŝywemu atenuowanemu wirusowi choroby Newcastle. Jako adiuwantu równieŜ uŜyto chitozan. Tylko osobniki negatywne i z grupy CEVAC® VITAPEST L były szcze-pione z adiuwantem lub bez niego dla potwierdzenia zaskakującego działania chitozanu na odporność komórkową i utrzymywanie się wirusa szczepionkowego w tkankach ptasich. 30

Próbki pobierano co tydzień od pierwszego do piątego tygodnia. Prowadzono ocenę i po-twierdzanie lokalnej (BALT) odporności. [0034] W szczególności, Zgłaszający wykazał, Ŝe szczególnie wydajna jest aktywacja przypominania antygenowego. W istocie, limfocyty śledzionowe szczepionych kur pobie-rano 2 do 5 tygodnie po szczepieniu (p.v.) i stykano z białkiem wirusa choroby Newcastle 35

dla oceny poziomu wytwarzania γ-interferonu (ChIFNγ). Pomiar γ-interferonu u kur prze-prowadza się metodą gęstości optycznej (O.D.), stosując zestaw Elisa. Poziom wytwarza-nia ChIFNγ wskazuje na poziom stymulacji limfocytów śledzionowych w szczepionych ptakach, tym samym wskazując na poziomy odporności komórkowej (Figura 2). [0035] Ponadto pokazano w Przykładzie 3 poniŜej, Ŝe dooczne szczepienie ptaków zgod-40

nie z niniejszym wynalazkiem skutkowało niespodziewanie wysokim działaniem na od-porność komórkową. Bez Ŝadnych ograniczeń, pozytywny wpływ chitozanu na swoistą odporność komórkową przykładowo udowodniono w odniesieniu do wirusa choroby New-castle, przy podawaniu doocznym. Wykazano, Ŝe wyniki wytwarzania ChIFNγ w grupie CEVAC® VITAPEST L i grupie CEVAC® VITAPEST L z chitozanem (Figura 3). Wyka-45

zano, Ŝe grupa CEVAC® VITAPEST L z chitozanem miała wyŜszy poziom odporności komórkowej niŜ grupa CEVAC® VITAPEST L pomiędzy drugim a piątym tygodniem po szczepieniu kur SPF. Ta róŜnica była statystycznie istotna w tygodniu 2. [0036] Ponadto wykazano, Ŝe podawanie dooczne szczepionki z chitozanem jako adiu-wantem indukowało dłuŜsze utrzymywanie się szczepu wirusa szczepionki w tkankach 50

kur, zarówno u kur SPF, jak i typowych kur niosek (Figura 4). Jak wskazano w Przykła-dzie 2 poniŜej, obecność wirusa choroby Newcastle po doocznym szczepieniu kur SPF

7

oceniono w eksperymentach PCR w czasie rzeczywistym w róŜnych narządach, tj., spo-jówce, płucach, tchawicy, dwunastnicy, trzustce, migdałkach jelita ślepego i śledzionie po-branych w tygodniu 1 i 5 po doocznym szczepieniu kur. [0037] Replikację szczepionkowego szczepu wirusa oceniono w tych róŜnych narządach najpierw u kur SPF. W pierwszym tygodniu po szczepieniu kur SPF, zaobserwowano ten 5

sam poziom replikacji wirusowej dla wirusa szczepionkowego CEVAC® UNI L i wirusa szczepionkowego CEVAC® VITAPEST L w spojówce, płucach i śledzionie. Wirus szcze-pionkowy CEVAC® UNI L ulegał replikacji zasadniczo w tchawicy, ze statystycznie istot-ną róŜnicą w porównaniu z CEVAC® VITAPEST L. Wirus szczepionkowy CEVAC® VI-TAPEST L ulegał replikacji zasadniczo w przewodzie pokarmowym, tak jak w dwunastni-10

cy, trzustce i migdałkach jelita ślepego, ze statystycznie istotną róŜnicą w porównaniu z CEVAC® UNI L. W tygodniu 5. po doocznym szczepieniu kur, oba szczepionkowe szcze-py wirusa ulegały replikacji w spojówce, lecz tylko jedna kura była pozytywna w grupie CEVAC® UNI L. Wirus szczepionkowy CEVAC® VITAPEST L, lecz nie CEVAC® UNI L, ulegał replikacji takŜe w innych narządach. 15

[0038] Podobnie, Zgłaszający udowodnił utrzymywanie się szczepionkowego szczepu wi-rusa u typowych kur niosek. Szczególnie wykazano, Ŝe poziom replikacji jest wyŜszy w grupie CEVAC® UNI L w pierwszym tygodniu po doocznym szczepieniu kur. Gdy chito-zan stosuje się jako adiuwant, wirus wydziela się w większej liczbie narządów i przez dłuŜszy czas. W tygodniu 5. po doocznym szczepieniu kur, dwa szczepionkowe szczepy 20

wirusa są wydzielane tylko w spojówce pewnych szczepionych typowych kur niosek (Fi-gura 5). [0039] Na koniec, Zgłaszający wykazał w Przykładzie 4 poniŜej, Ŝe odporność humoralna indukowana przez róŜne szczepionki u drobiu nie ulegała podwyŜszeniu, przeciwnie do te-go, co ogólnie obserwuje się u ssaków, tym samym wykazując swoiste wyróŜniające dzia-25

łanie kompozycji szczepionki z chitozanem przy podawaniu ptakom drogą dooczną. [0040] Wynalazek zilustrowano, lecz nie ograniczono w Ŝaden sposób, poniŜszymi Przy-kładami.

PRZYKŁADY

Przykład 1: Materiały i metody 30

Przykład 1.1: Kury

[0041] Kury SPF białe Leghorn i typowe kury nioski (SSL: sex sale linked) uzyskano z jaj dostarczonych odpowiednio przez Lohmann Valo (Cuxhaven, Niemcy) i wylęgarnię Wi-jverkens (Halle, Belgia). Jaja typowych kur niosek otrzymano z 28-tygodniowego stada hodowlanego, które przyjęło następujący harmonogram szczepienia ND: szczepienie w 35

wieku 4 i 8 tygodni NOBILIS Clone 30 (Intervet), a następnie dawka przypominająca w wieku 16 tygodni NOBILIS Newcavac (inaktywowana szczepionka, Intervet). Po wyklu-ciu, wszystkie ptaki trzymano w izolatkach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3) i eksperymenty na zwierzętach prowadzono za zezwoleniem i pod nadzorem Bio-safety and Bioethics Committees z Veterinary and Agrochemical Research Institute, zgod-40

nie z przepisami krajowymi i europejskimi.

Przykład 1.2: Szczepionka, adiuwant i szczep prowokujący

[0042] Atenuowaną szczepionkę CEVAC® VITAPEST L i chitozan (chlorowodorek chito-zanu) jako adiuwant dostarczył CEVA-PHYLAXIA Veterinary Biologicals Co Ltd (Wę-gry). Szczepionka jest oparta na asymptomatycznym szczepie PHY.LMV.42 (Meszaros J. 45

Aerosol-vaccination against Newcastle disease. Deut Tierarztl Woch 1991;98:117-164; Meszaros J, Szemeredi M, Tamasi G. Immunization of day-old chickens against Newcastle disease. Acta Vet Hung 1992; 40:121-127), naleŜącym do genotypu I (Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, Wehmann E, Werner O, Lomniczi B. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications. Virus 50

8

Res 2006; 120:36-48). Partię szczepionki roztwarzano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (bufor PBS) dla uzyskania 1 dawki w 50 µl, co odpowiada ≈ 106 EID50/dawkę. Chlorowodorek chitozanu jest chlorkiem nierozgałęzionego podwójnego heteropolisacha-rydu złoŜonego z dwóch jednostek N-acetylo-D-glukozaminy i D-glukozaminy. Otrzyma-no go przez częściowe deacetylowanie chityny, normalnie prowadzące do stopnia deacety-5

lowania 70% do 95%. Chitozan rozpuszczono w buforze PBS przy końcowym stęŜeniu 0,5% (wag./obj.) i uŜyto do odtwarzania oraz rozcieńczania szczepionki do końcowego stęŜenia. Szczep Chimalhuacan NDV uŜyty do prowokacji wyizolowano w Meksyku (Cal-deron NL, Galindo-Muniz F, Ortiz M, Lomniczi B, Fehervari T, Paasch LH. Thrombocy-topenia in Newcastle Disease: haematological evaluation i histological study of bone mar-10

row. Acta Vet Hung 2005;53(4):507-513) i naleŜy on do klasy II genotypu V: jest wysoce zjadliwym, skierowanym na trzewia szczepem z ICPI 1,89. Inokulacja oczno-nosowa lub bezpośrednia dooczna 105 EID50 tego szczepu indukuje 100% śmiertelność w czasie 3-6 dni u kur SPF i handlowych brojlerów z matczyną odpornością prowokowanych w wieku między 3 a 6 tygodni (osobiste obserwacje). 15

Przykład 1.3: Mitogeny i antygeny NDV

[0043] Mitogeny, 12-mirystyniano-13-octan forbolu (PMA) i jonomycynę (lono) zakupio-no z Sigma (Belgia). Przypominające antygeny NDV wytworzono ze szczepu NDV La So-ta, jak opisano wcześniej (Lambrecht B, Gonze M, Meulemans G, van den Berg T. As-sessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken inter-20

feron-gamma in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimula-tion. Avian Path 2004; 33:343-350) i nazwano glikoproteinami NDV (gp-NDV).

Przykład 1.4: Pomiar rozmieszczenia w tkankach i replikacji szczepu szczepionkowe-

go

[0044] Próbki tkanek pobrano ze spojówki dolnej powieki, która okazała się bardziej po-25

datna na NDV (Nakamura K, Ohta Y, Abe Y, Imai K, Yamada M. Pathogenesis of con-junctivitis caused by Newcastle disease viruses in specific-pathogen-free chickens. Avian Path 2004;33(3):371-376), tchawicy, płuc, śledziony, trzustki, dwunastnicy i migdałków jelita ślepego i trzymano w zamroŜeniu do czasu przetworzenia. Rozmieszczenie w tkan-kach i replikację szczepu szczepionkowego CEVAC® VITAPEST L określono metodą 30

QRRT-PCR, swoistą dla CEVAC® VITAPEST L, która pozwala na wykrycie 102 EID50 na reakcję (104,18 EID50 na 20 mg tkanki). Wyniki wyraŜono w postaci mian szczepów szcze-pionkowych na 20 mg tkanki. Jakość próbki i procedurę ekstrakcji RNA potwierdzono sto-sując ptasią α-aktynę jako gen metabolizmu podstawowego, jak opisuje Van Borm S i in., A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction 35

control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian Dis 2007;51:213-220.

Przykład 1.5: Pomiar wydolności immunologicznej i swoistej dla NDV odporności

komórkowej

[0045] Wydolność immunologiczną i swoistą dla NDV odporność komórkową zbadano 40

metodą odpowiednio mitogenowej i antygenowej NDV aktywacji limfocytów śledziony. W skrócie, śledziony aseptycznie usunięto kurom, śledzionowe limfocyty wyizolowano i aktywowano mitogenami (0,1 µg/ml PMA/Iono), jako pozytywna kontrola ex vivo zdolno-ści aktywacji śledzionowych limfocytów, lub antygenami przypominającymi NDV (gp-NDV) (1 µg/ml). Odpowiedzi komórkowe wyraŜone w postaci wartości gęstości optycznej 45

(O.D.) i O.D. równej lub większej od 0,1 uwaŜano za dowód znaczącej aktywacji.

Przykład 1.6: Pomiar swoistej dla NDV humoralnej i lokalnej pośredniczonej przez

przeciwciała odporności

9

[0046] Swoistą dla NDV humoralną odporność określono w teście hamowania hemaglu-tynacji (HI) i metodą swoistych dla NDV ELISA IgG, IgA i IgM. Lokalną, pośredniczoną przez przeciwciała odporność na NDV zmierzono metodą ELISA we łzach, płucu, Ŝółci i dwunastnicy.

Przykład 1.7: Pomiar wydalania z części ustnej gardła i kloaki prowokującego szcze-5

pu NDV

[0047] Wymazy z części ustnej gardła i kloaki zanurzono w 1 ml buforu do próbek z infu-zji z mózgu i serca (37 g rozpuszczone w 1 litrze wody destylowanej) (Becton Dickinson Benelux, Belgia) uzupełnionego antybiotykami (10 000 IU/ml penicyliny, 2 mg/ml strep-tomycyny, 1 mg/ml gentamycyny i 650 µg/ml kanamycyny). Wymazy przechowywano w 10

temperaturze -80°C do dalszej analizy. Do analizy metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (QRRT-PCR), RNA ekstra-howano z 50 µl zanurzonych wymazów, stosując zestaw do wirusowego RNA MagMAX 96 Al/ND Ambion (Applied Biosystems, Lennik, Belgia) na procesorze cząstek magne-tycznych KingFisher (Thermo Scientific), zgodnie z protokołem wytwórcy. Oczyszczone 15

RNA eluowano w 50 µl buforu do elucji. [0048] Liczbę matrycowych kopii genu szczepu prowokującego Chimalhuacan NDV określono metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (QRRT-PCR), jak opisano powyŜej, z małymi modyfikacjami. W skrócie, po początkowym etapie odwrotnej transkrypcji i gorącym starcie jako etapie ak-20

tywacji Taq, przeprowadzono 50 cykli (95°C przez 15 s, 54°C przez 34 s, 72°C przez 10 s) w cyklerze PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems 7500. Startery (M+4100 i M-4220) i sondy MGB-Taqman (M+4169FAM-TAMRA) działały na genie matrycowym i zsyntetyzowano je w Eurogentec (Liège, Belgia). Miano wirusa w kaŜdej próbce określono względem krzywej wzorcowej złoŜonej z całkowitego wirusowego RNA szczepu Chi-25

malhuacan NDV. Tę krzywą wzorcową włączano w kaŜdą analizę. Próg czułości QRRT-PCR NDV swoistej dla szczepu Chimalhuacan NDV (R2 = 0,998, wydajność = 94,17%) określono jako 101 EID50 na reakcję, w oparciu o wyniki krzywej wzorcowej. Oznacza to, Ŝe reakcje QRRT-PCR są całkowicie porównywalne powyŜej 1027 EID50 na ml wymazu i moŜliwe są porównania ilościowe. Wyniki wyraŜono jako miano szczepu prowokującego 30

na ml wymazu. [0049] Ponadto jakość próbki i procedury ekstrakcji RNA potwierdzono stosując ptasią α-aktynę, jak opisuje Van Borm S i in. A universal avian endogenous real-time reverse trans-criptase-polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian Dis 2007;51:213-220. 35

Przykład 1.8: Plan eksperymentu

[0050] Dwa podobne eksperymenty przeprowadzono na kurach SPF (Eksperymenty I i II). W wieku jednego dnia, 105 kur SPF podzielono na trzy grupy, po 35, w izolatkach BSL-3. Tego samego dnia dwie grupy zaszczepiono drogą oczno-nosową pojedynczą dawką szczepionki CEVAC® VITAPEST L, odpowiednio z dodatkiem 0,5% chitozanu lub bez 40

niego. Podobne eksperymenty prowadzi się przez bezpośrednie podawanie dooczne (dane nie pokazane). Trzecia grupa pozostawała nieszczepiona i słuŜyła jako negatywna grupa kontrolna. Dwa dni po szczepieniu (p.v.), kurczęta humanitarnie usmiercono dla pobrania krwi, Ŝółci i dwunastnicy. Od 1 do 5 tygodni p.v., w odstępach tygodniowych, zbierano łzy i od tych samych zwierząt pobrano próbki krwi, śledziony, Ŝółci i dwunastnicy. W tygo-45

dniach 1 i 5, w jednym z eksperymentów, dodatkowo pobrano spojówkę, tchawicę, płuca, trzustkę i migdałki jelita ślepego. W tygodniach 3 i 5, po eutanazji zastrzykiem Nembutalu (CEVA Santé Animale), zebrano popłuczyny z płuc od dodatkowych kur z kaŜdej z grup. W kaŜdym punkcie czasowym stosowano pięć ptaków na grupę. W eksperymencie II po-brano próbki łez, krwi, śledziony, Ŝółci i dwunastnicy w 2, 3, 4 i 5 tygodniu p.v. 50

10

[0051] Dwa dalsze eksperymenty przeprowadzono równieŜ z typowymi kurami nioskami (Eksperymenty III i IV). W wieku jednego dnia, 90 typowych kur niosek przydzielono do 3 grup po 30 kurcząt w izolatkach BSL-3. Tego samego dnia dwie grupy zaszczepiono jak opisano poprzednio; trzecia grupa pozostała nieszczepiona i słuŜyła jako negatywna grupa kontrolna. Układ eksperymentu w eksperymencie III był podobny jak w eksperymencie I, z 5

tym wyjątkiem, Ŝe popłuczyny z płuc zebrano tylko po 5 tygodniach p.v. W eksperymencie IV pobrano próbki łez, krwi, śledziony, Ŝółci i dwunastnicy w 2, 3, 4 i 5 tygodniu p.v. W wieku 5 tygodni, po 10 kur z kaŜdej grupy prowokowano 105 EID50/200 µl szczepu Chi-malhuacan NDV drogą oczno-nosową. Ptaki identyfikowano osobno. Po prowokacji, kury monitorowano codziennie szukając objawów klinicznych (obrzęk głowy, depresja, prostra-10

cja i oznaki nerwowości) oraz śmiertelności. Wymazy z części ustnej gardła i kloaki po-brano 2, 4, 7 i 10 dni po prowokacji (p.ch.). 11 dni p.ch., kury, które przeŜyły, poddano eu-tanazji i pobrano próbki krwi. Śledzionę i dwunastnicę pobrano od 5 kur z grupy.

Przykład 1.9: Analiza statystyczna

[0052] Analizy statystyczne przeprowadzono jak opisano wcześniej, stosując oprogramo-15

wanie Minitab 13 i STATA 10 (programy statystyczne dla Windows 2000) i róŜnice uznawano za istotne przy P < 0,05.

Przykład 2: Rozmieszczenie w tkance i replikacja szczepu szczepionkowego

[0053] Wszystkie próbki narządów wykazywały dodatni sygnał amplifikacji (Ct < 40) dla endogennej kontroli amplifikacji α-aktyny, co potwierdziło ich odpowiednią jakość i czy-20

stość RNA. [0054] Wirus CEVAC® VITAPEST L został wykryty we wszystkich próbkach narządów szczepionych kur SPF 1 tydzień p.v. (Tabela 1). 5 tygodni p.v., szczep szczepionkowy wy-kryto tylko w spojówce, płucu, śledzionie, dwunastnicy, trzustce i migdałkach jelita ślepe-go niektórych kur. Gdy uŜyto chitozanu, szczep szczepionkowy był częściej wykrywany; 25

jednakŜe nie było statystycznej róŜnicy między mianami wirusa. Tydzień po szczepieniu jednodniowych typowych kur niosek, szczep szczepionkowy CEVAC® VITAPEST L był obecny w kilku próbkach spojówki, tchawicy i dwunastnicy (Tabela 1). Gdy szczepionka była uzupełniona chitozanem, wykryto go równieŜ w niektórych próbkach płuca, śledziony i migdałków jelita ślepego. Tym niemniej, w szczepionych typowych nioskach częstości 30

wykrywania i miana były niŜsze niŜ stwierdzane dla szczepionych kur SPF. 5 tygodni p.v., replikację wirusa szczepionkowego moŜna było wciąŜ wykrywać w spojówce. Tabela 1: Wykrywanie wirusa szczepionkowego po szczepieniu jednodniowych kur SPF i typowych kur niosek szczepionką CEVAC® VITAPEST L z chitozanem jako adiuwantem lub bez niego (odpowiednio eksperyment I i III).

Eksp. Tydzień

p.v. Tkanki

Negatyw-

na

Grupya

VITAPEST

VITAPEST+

Chitozan

1 0/5 B 5/5 A 5/5 A 1 (SPF)

Spojówka b c

<4,18 8,12±0,91 A 8,13±0,22 A

Tchawica 0/5 B 5/5 A 5/5 A

<4,18 7,89±1,07 A 7,93±0,84 A

Płuco 0/5 B 5/5 A 5/5 A

<4,18 6,45±1,19 A 6,18±0,27 A

Śledziona 0/5 A 4/5 A 4/5 A

11

Eksp. Tydzień

p.v. Tkanki

Negatyw-

na

Grupya

VITAPEST

VITAPEST+

Chitozan

<4,18 6,97±0,68 A 6,41±0,65 A

Dwunastnica 0/5 B 5/5 A 5/5 A

<4,18 8,77±1,47 8,83±1,76

Trzustka 0 / 5 B 5 / 5 A 5 / 5 A

< 4,18 7,61±0,64A 7,36±1,07A

Migdałki jelita ślepego

0 / 5 B 3 / 5 AB 5 / 5 A

< 4,18 7,60±2,06A 8,08±1,9A

5 Spojówka 0 / 5 B 5 / 5 A 4 / 5 A

< 4,18 4,99 ± 0,48A 4,63±0,30A

Tchawica 0 / 5 A 0 / 5 A 2 / 5 A

< 4,18 < 4,18 4,51±0,11

Płuco 0 / 5 A 2 / 5 A 0 / 5 A

< 4,18 5,46±1,50 <4,18

Śledziona 0 / 5 A 1 / 5 A 1 / 5 A

< 4,18 4,50 6,29

Dwunastnica 0 / 5 A 2 / 5 A 3 / 5 A

< 4,18 5,19±1,09A 5,60±0,26 A

Trzustka 0 / 5 A 1 / 5 A 3 / 5 A

< 4,18 4,69 4,95±0,37

Migdałki jelita ślepego

0 / 5 A 1 / 5 A 3 / 5 A

< 4,18 4,45 4,79±0,34

1 0 / 5 A 4 / 5 A 4 / 5A III (typ.)

Spojówka b c < 2 5,90±0,73A 6,51±1,33 A

Tchawica 0 / 5 A 3 / 5 A 1 / 5 A

< 2 4,49±0,04 5,24

Płuco 0 / 5 A 0 / 5 A 1 / 5 A

< 2 < 2 4,57

Śledziona 0 / 5 A 0 / 5 A 1 / 5 A

<2 < 2 5,16

Dwunastnica 0 / 5 A 2 / 5 A 0 / 5 A

< 2 4,62±0,58 < 2

Trzustka 0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

12

Eksp. Tydzień

p.v. Tkanki

Negatyw-

na

Grupya

VITAPEST

VITAPEST+

Chitozan

<2 < 2 < 2

Migdałki jelita ślepego

0 / 5 A 0 / 5 A 1 / 5 A

< 2 < 2 6,10

5 Spojówka 0 / 5 A 3 / 5 A 4 / 5A

< 2 5,66±0,69 A 5,13±0,62A

Tchawica 0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 < 2

Płuco 0 / 5A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 < 2

Śledziona 0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 < 2

Dwunastnica 0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 < 2

Trzustka 0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 < 2

Migdałki jelita ślepego

0 / 5 A 0 / 5 A 0 / 5 A

< 2 < 2 a Dane wyznaczono metodą QRRT-PCR na 20 mg tkanki przy podanym czasie p.v. Dane bez wspólnego wskaźnika górnego róŜnią się istotnie dla tej tkanki (P < 0,05 lub 0,017 z poprawką Bonferroniego). Odcięcie QRRT-PCR swoistej dla szczepu szczepionkowego CEVAC® VITAPEST L określono jako 104,18 na 20 mg tkanki. b Dane reprezentują częstość (liczba pozytywnych / łączne zbadanych) wykrywania wirusa w 20 mg tkanki. c Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe log10 EID50 NDV w 20 mg tkanki u pozytywnych kur.

Przykład 3: Wydolność immunologiczna i swoista dla antygenu odporność komórko-

wa

[0055] Wyniki otrzymane przy róŜnych punktach czasowych pobierania próbek aktywacji limfocytów śledzionowych mitogenami PMA/Iono wykazały, Ŝe wszystkie kury SPF i ty-powe kury nioski w kaŜdej grupie były podobnie wydolne immunologicznie w kaŜdych z 5

czterech eksperymentów (O.D. > 0,1), co potwierdza moŜliwość aktywacji komórek śle-dziony. Istotnie, chitozan nie wpływa na komórkową odpowiedź immunologiczną, czego dowodzi brak istotnej róŜnicy pomiędzy dwoma szczepionymi grupami w eksperymentach I (Figura 6A) i IV (Figura 6B) odpowiednio na kurach SPF i typowych kurach nioskach. Ta niezmieniona wydolność immunologiczna, gdy Ŝywą szczepionkę ND podawano jed-10

nocześnie z chitozanem, została potwierdzona w eksperymentach II i III (dane nie pokaza-ne).

13

[0056] U kurcząt SPF (eksperyment I), szczep CEVAC® VITAPEST L był zdolny do in-dukowania mierzalnej aktywacji swoistej dla NDV odporności komórkowej w 1 tygodniu p.v., a szczepiona grupa róŜniła się istotnie (P < 0,05) od nieszczepionej grupy kontrolnej od 2 tygodnia i później (Figura 6A). Po uzupełnieniu chitozanem, oczno-nosowa immuni-zacja szczepionką CEVAC® VITAPEST L generowała istotnie wyŜszą swoistą dla antyge-5

nu komórkową odpowiedź immunologiczną od tygodnia 1 do tygodnia 4 p.v. (P < 0,05), jak wykazywało zwiększone wytwarzanie ChIFNγ przez limfocyty śledzionowe. Pozytyw-ny wpływ chitozanu na swoistą odporność komórkową u kur SPF potwierdzono w ekspe-rymencie II (dane nie pokazane). [0057] U typowych kurcząt niosek (eksperyment IV), swoistą dla NDV odporność ko-10

mórkową obserwowano w obu szczepionych grupach od 3 tygodnia p.v. (P < 0,05) (Figura 6B). Ta swoista jest podawany wspólnie dla NDV odpowiedź komórkowa jest wyŜsza, chociaŜ nieistotnie, gdy chitozan z Ŝywą szczepionką ND, w porównaniu ze szczepionką CEVAC® VITAPEST L inokulowaną samodzielnie. Ten sam wynik otrzymano w ekspe-rymencie III (dane nie pokazane). 15

Przykład 4: Odporność humoralna i lokalna pośredniczona przez przeciwciała

[0058] Indukcję odporności humoralnej u szczepionych kur SPF rejestrowano od 1 tygo-dnia p.v. metodą ELISA swoistego dla IgM, lecz tylko od 2 tygodnia p.v. w teście hamo-wania hemaglutynacji, jak teŜ metodą ELISA swoistego dla IgG i IgA (Tabela 2), z mia-nami statystycznie róŜnymi od mian nieszczepionych kur. Profil swoiste dla NDV miana 20

HI i przeciwciał IgG otrzymane dla typowych kur niosek odpowiadają spadkowi biernej matczynej odporności do wieku 4 tygodni i postępującej czynnej indukowanej przez szczepionkę pierwotnej odpowiedzi immunologicznej wykrywalnej od 5 tygodnia p.v. (Tabela 2). Ani IgA, ani IgM swoistego dla NDV nie moŜna było wykryć w osoczu typo-wych zwierząt (dane nie pokazane). Chitozan nie wykazał działania wspomagającego hu-25

moralną odpowiedź immunologiczną ani u kur SPF, ani typowych kur niosek, co wykaza-no brakiem statystycznie istotnych róŜnic w mianach między dwoma szczepionymi gru-pami.

Tabela 2: Odporność humoralna po szczepieniu jednodniowych kur SPF i typowych kur niosek szczepionką CEVAC® VITAPEST L z chitozanem jako adiuwantem lub bez niego (odpowiednio eksperymenty I i III).

Eksp. Odpowiedź humoralna

Czas p.v.

Negatywna

Grupy

VITAPEST

VITAPEST +

Chitozan

HI 2 dni 2,00 ± 0,00A 2,20 ± 0,45A 2,50 ± 0,71A I (SPF)

1 tydzień 2,50 ± 0,58A 2,67 ± 0,58A 2,60 ± 0,55A

2 tygodnie 2,40 ± 0,55B 8,40 ± 2,30A 7,80 ± 3,49A

3 tygodnie 2,00 ± 0,00B 8,00 ± 2,00A 7,00 ± 1,22A

4 tygodnie 2,20 ± 0,45B 7,80 ± 0,84A 8,00 ± 1,22A

5 tygodni 2,00 ± 0,00B 7,40 ± 1,52A 6,40 ± 1,34A

IgG 2 dni 0,080 ± 0,050A 0,085 ± 0,048A 0,061 ± 0,050A

1 tydzień 0,053 ± 0,026A 0,085 ± 0,040A 0,034 ± 0,006A

2 tygodnie 0,036 ± 0,006B 1,297 ± 0,284A 1,255 ± 0,305A

3 tygodnie 0,032 ± 0,007B 1,559 ± 0,081A 1,410 ± 0,070A

4 tygodnie 0,054 ± 0,026B 1,605 ± 0,102A 1,548 ± 0,125A

14

Eksp. Odpowiedź humoralna

Czas p.v.

Negatywna

Grupy

VITAPEST

VITAPEST +

Chitozan

5 tygodni 0,078 ± 0,015B 1,354 ± 0,462A 1,527 ± 0,267A

IgM 2 dni 0,073 ± 0,018A 0,090 ± 0,032A 0,079 ± 0,008A

1 tydzień 0,126 ± 0,016B 0,748 ± 0,384A 0,559 ± 0,194A

2 tygodnie 0,157 ± 0,043B 1,557 ± 0,233A 1,422 ± 0,251A

3 tygodnie 0,169 ± 0,043B 0,950 ± 0,392A 0,891 ± 0,330A

4 tygodnie 0,309 ± 0,073B 1,227 ± 0,153A 0,872 ± 0,254AB

5 tygodni 0,381 ± 0,149B 1,248 ± 0,455A 0,915 ± 0,288AB

IgA 2 dni 0,057 ± 0,010A 0,054 ± 0,007A 0,054 ± 0,003A

1 tydzień 0,057 ± 0,006B 0,211 ± 0,098A 0,160 ± 0,088AB

2 tygodnie 0,112 ± 0,039C 1,031 ± 0,285A 0,565 ± 0,174B

3 tygodnie 0,103 ± 0,031B 0,429 ± 0,213A 0,471 ± 0,148A

4 tygodnie 0,140 ± 0,065A 0,420 ± 0,218A 0,447 ± 0,519A

5 tygodni 0,140 ± 0,029A 0,292 ± 0,146A 0,236 ± 0,146A

HI 2 dni 10,40 ± 1,52A 9,60 ± 0,89A 10,40 ± 0,55A III (typ.) 1 tydzień 9,80 ± 1,30A 920 ± 0,45A 9,20 ± 0,84A

2 tygodnie 6,80 ± 1,30A 7,20 ± 0,84A 7,40 ± 1,14A

3 tygodnie 5,40 ± 0,89B 6,80 ± 0,45A 5,20 ± 0,45B

4 tygodnie 4,20 ± 1,30A 4,60 ± 0,89A 5,20 ± 0,84A

5 tygodni 3,00 ± 0,00B 4,80 ± 0,45A 5,60 ± 0,55A

IgG 2 dni 1,637 ± 0,045A 1,421 ±0,025A 1,555 ± 0,080A

1 tydzień 1,565 ± 0,094A 1,551 ±0,100A 1,503±0,108A

2 tygodnie 1,505 ±0,121A 1,434±0,085A 1,434±0,070A

3 tygodnie 1,250±0,377A 1,364±0,097A 1,241±0,137A

4 tygodnie 0,659±0,556A 0,766±0,383A 0,931±0,506A

5 tygodni 0,143±0,212B 1,036±0,215A 1,080±0,160A

Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe odwrotności log2 rozcieńczenia su-rowicy i wartości absorbancji określone odpowiednio metodą testów HI i ELISA, w okre-ślonym czasie p.v. (n = 5). Próbki surowicy rozcieńczono 1:100. Średnia ± odchylenie standardowe w punktach czasowych bez wspólnego indeksu górnego róŜnią się istotnie (P < 0,05).

[0059] Wpływ chitozanu na łzową, pośredniczoną przez przeciwciała odporność u kur SPF (Figura 7A) i typowych kur niosek (Figura 7B) był wysoce zmienny i róŜnice pomię-dzy kurami szczepionymi CEVAC® VITAPEST L z chitozanem lub bez niego nie były statystycznie istotne w kaŜdym punkcie czasowym. Podobne wahania w działaniu chitoza-nu jako adiuwanta zauwaŜono dla związanej z płucami, Ŝółciowej i dwunastniczej, pośred-5

niczonej przez przeciwciała odporności kur SPF (Tabela 3, odpowiednio Figury 8A i 8A).

15

U typowych kur niosek, swoiste dla NDV przeciwciało IgG pochodzenia matczynego wy-krywano w 1 tygodniu w Ŝółci (Figura 9B) i od wieku 1 do 5 tygodni w dwunastnicy (Fi-gura 9B). 5 tygodni p.v., dwunastnicza odpowiedź IgG była istotnie wyŜsza w szczepio-nych grupach, co wskazuje na postępującą czynną indukowaną przez szczepionkę pierwot-ną odpowiedź immunologiczną w przewodzie pokarmowym. Wspólne podawanie chitoza-5

nu z Ŝywą szczepionką ND nie miało istotnego wpływu na dwunastniczą odporność po-średniczoną przez przeciwciała. Tabela 3 : Płucna odporność pośredniczona przez przeciwciała po szczepieniu jednodnio-wych kur SPF szczepionką CEVAC® VITAPEST L z chitozanem jako adiuwantem lub bez niego (eksperyment I).

Odpowiedź hu-moralna

Tydzień p.v.

Negatywny Grupy VITA-

PEST VITAPEST + Chi-

tozan

IgA 3 0,258±0,012A 0,433±0,327A 0,335±0,040A

5 0,319±0,078A 0,505±0,191A 0,662±0,487A

IgG 3 0,098±0,011A 0,619±0,304A 0,429±0,059A

5 0,055±0,013A 0,300±0,411A 0,358±0,393A

IgM 3 0,323±0,014A 0,385±0,206A 0,282±0,017A

5 0,328±0,043A 0,508±0,127A 0,399±0,165A

Dane reprezentują średnią ± odchylenie standardowe wartości absorbancji określonych metodą ELISA w określonym czasie p.v. (n = 5). Próbki z przemywania płuc były nieroz-cieńczone odpowiednio dla IgA/G i IgM. Średnia ± odchylenie standardowe w punktach czasowych bez wspólnego indeksu górnego róŜnią się istotnie (P < 0,05).

[0060] Ta niezmieniona ogólnoustrojowa i lokalna odpowiedź przeciwciał na Ŝywą szcze-pionkę ND podawaną wspólnie z chitozanem została potwierdzona dla kur SPF i typowych kur niosek w powtarzanych eksperymentach II i IV (dane nie pokazane). 10

Przykład 5: Ochrona i ponowne wydzielanie po prowokacji

[0061] Wszystkie prowokowane kury w nieszczepionej grupie wykazywały objawy kli-niczne, które rozpoczęły się 3 dni po prowokacji (d.p.ch.) i zanikły między 4. i 6. d.p.ch. Dwa zwierzęta w szczepionej grupie CEVAC® VITAPEST L wykazywały objawy klinicz-ne i jedno zdechło w 7. d.p.ch. Kury szczepione CEVAC® VITAPEST L podawanym 15

wspólnie z chitozanem nie wykazywały ani szczególnej zachorowalności, ani śmiertelności podczas eksperymentu. [0062] Wydzielanie wirusa prowokującego rozpoczęło się 2 d.p.ch. w grupie kontrolnej i wszystkie wymazy z części ustnej gardła i kloaki były pozytywne w 4. d.p.ch. (Tabela 4). W kaŜdym punkcie czasowym, wydzielanie przez część ustną gardła i kloakę było ograni-20

czane przez szczepienie. Ponadto, liczba wydzielających ptaków w grupie otrzymującej Ŝywą szczepionkę ND podawaną wspólnie z chitozanem zmniejszyła się w porównaniu z grupą przyjmującą samą szczepionkę. Wydalanie niemal zakończyło się w 7 d.p.ch. i zu-pełnie ustało w 10 d.p.ch. Tabela 4: Wydzielanie szczepu Chimalhuacan NDV po prowokacji szczepionych typo-wych kur niosek szczepionką CEVAC® VITAPEST L z chitozanem jako adiuwantem lub bez niego (eksperyment IV).

16

Dni p.ch. Tkanki

Negatywny

Grupya

VITAPEST

VITAPEST + Chi-

tozan

2 7 / 10 B 1 / 10 AB 0 / 10 A

Część ustna gardła b c 3,74±0,76 2,79 < 2,70

Kloaka 1 / 10 A 0 / 10 A 0 / 10 A

3,57 < 2,70 < 2,70

4 Część ustna gardła

10 / 10A 6 / 10 A 5 / 10 A

4,56 ± 0,50 A 3,99 ± 0,68A 3,79±0,12A

Kloaka 10 / 10 A 8 / 10A 6 / 10A

5,11±0,78A 3,72 ± 0,63B 3,78±0,46B

7 Część ustna gardła

N.D. 1 / 9 A 1 / 10A

4,65 4,07

Kloaka N.D. 1 / 9 A 0 / 10 A

3,47 < 2,70

10 Część ustna gardła

N.D. 0 / 9 A 0 / 10 A

< 2,70 < 2,70

Kloaka N.D. 0 / 9 A 0 / 10 A

< 2,70 < 2,70 a Dane wyznaczono metodą QRRT-PCR w wymazach 1 ml pobieranych w określonych czasach p.ch. Dane bez wspólnego wskaźnika górnego róŜnią się istotnie dla tego wymazu (P < 0,05 lub 0,017 z poprawką Bonferroniego). Odcięcie QRRT-PCR swoiste dla szczepu Chimalhuacan NDV określono na 102,7 na ml wymazu. Łączna liczba testowanych kur zmniejszała się z czasem ze względu na określoną śmiertelność (szczegóły podaje dział wyników). N.D. = nie określono, ze względu na określoną śmiertelność. b Dane reprezentują częstość (liczba pozytywnych / łączne testowanych) wykrywania wi-rusa w 1 ml wymazu.

ZastrzeŜenia patentowe 1. Kompozycja zawierająca Ŝywy atenuowany wirus choroby Newcastle i chitozan do

stosowania do uodporniania lub szczepienia ptaków przez dooczne podawanie kropli do oczu, spreju lub aerozolu.

2. Kompozycja według zastrzeŜenia 1, do stosowania do uodporniania lub szczepienia ptaków gatunków wybranych spośród hodowanego albo udomowionego drobiu lub 5

ptactwa, w tym kur, indyków, gęsi, kaczek, baŜantów, przepiórek lub gołębi. 3. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeŜeń 1 do 2 do zwiększania odporności

komórkowej u ptaków i utrzymywanie się szczepionki w ptasich tkankach. 4. Zastosowanie chitozanu i Ŝywego, atenuowanego wirusa choroby Newcastle do wy-

twarzania kompozycji szczepionki do uodporniania lub szczepienia ptaków przez do-10

oczne podawanie kropli do oczu, spreju lub aerozolu.

17

5. Zestaw do szczepienia ptaków obejmujący, w urządzeniu dozującym wybranym spo-śród kropli do oczu, spreju lub aerozolu, Ŝywy atenuowany wirus choroby Newcastle i chitozan.

Uprawniony: CEVA Santé Animale SA

Pełnomocnik:

dr inŜ. Wojciech Tykarski Rzecznik patentowy

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

DOKUMENTY CYTOWANE W OPISIE

Ta lista dokumentów cytowanych przez Zgłaszającego została przyjęta jedynie dla informacji czytającego i

nie jest częścią składową europejskiego opisu patentowego. Została ona utworzona z duŜą starannością; Eu-

ropejski Urząd Patentowy nie ponosi jednak Ŝadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy i braki.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

• EP 865297 B1 [0003]

Dokumenty niepatentowe cytowane w opisie

• REHMANI S.F. Preventive Veterinary Medici-

ne, 1996, tom 25, 241-248 [0003]

• MESZAROS J. Aerosol-vaccination against Newcastle disease. Deut Tierarztl Woch, 1991, tom 98, 117-164 [0042]

• MESZAROS J ; SZEMEREDI M ; TAMASI G. Immunization of day-old chickens against Newcastle disease. Acta Vet Hung, 1992, tom 40, 121-127 [0042]

• CZEGLEDI A; UJVARI D ; SOMOGYI E ;

WEHMANN E ; WERNER O ; LOMNICZI B. Third genome size category of avian paramy-xovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications. Virus Res, 2006, tom 120, 36-48 [0042]

• CALDERON NL ; GALINDO-MUNIZ F ;

ORTIZ M ; LOMNICZI B ; FEHERVARI T ; PAASCH LH. Thrombocytopenia in Newca-stle Disease: haematological evaluation and hi-stological study of bone marrow. Acta Vet Hung,

2005, tom 53 (4), 507-513 [0042]

• LAMBRECHT B ; GONZE M ; MEULE-MANS G ; VAN DEN BERG T. Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-gamma in re-sponse to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation. Avian Path, 2004, tom 33, 343-350 [0043]

• NAKAMURA K ; OHTA Y ; ABE Y ; IMAI K ; YAMADA M. Pathogenesis of conjunctivitis caused by Newcastle disease viruses in specific-pathogen-free chickens. Avian Path, 2004, tom 33 (3), 371-376 [0044]

• VAN BORM S i in. A universal avian endoge-nous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian

Dis, 2007, tom 51, 213-220 [0044] [0049]