(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420 RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417.8 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 06.03.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/10 EP 2007420 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. C07K 14/33 (2006.01) A61K 39/08 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Rekombinowane, atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka

(30) Pierwszeństwo:

17.04.2006 US 792553 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

31.12.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/01

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08

(73) Uprawniony z patentu:

INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL

(72) Twórca(y) wynalazku:

MARK D. COCHRAN, Carlsbad, US GARY PETERSEN, Omaha, US STEVEN V. LAIR, Temecula, US RICHARD SYNENKI, San Diego, US

(74) Pełnomocnik:

PL/E

P 20

0742

0 T3

rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 2 007 420 B1

1

Opis

ODNOŚNIKI DO ZGŁOSZEŃ POKREWNYCH

5

[0001] To zgłoszenie jest zgłoszeniem nie tymczasowym, które zastrzega pierwszeństwo, zgodnie z §

119(e) 35 U.S.C, zgłoszenia tymczasowego USA nr seryjny 60/792,553, złożonego 17 kwietnia 2006.

DZIEDZINA WYNALAZKU

10

[0002] Ten wynalazek dotyczy atenuowanych organizmów Clostridium, sposobów ich wytwarzania i stoso-

wania oraz mutein toksyny alfa i kodujących je kwasów nukleinowych.

TŁO WYNALAZKU15

[0003] Beztlenowe patogeny bakteryjne stanowią poważne obciążenie ekonomiczne dla przemysłu rolnego.

Bakterie z rodziny Clostridium są szczególnym obciążeniem, ponieważ bakterie te powodują poważne cho-

roby u drobiu i innych ekonomicznie wartościowych zwierząt domowych. Wcześniejsze wysiłki mające na

celu zwalczanie tych organizmów opierały się na środkach sanitarnych i podawaniu antybiotyków w paszy

dla zwierząt.20

[0004] Konkretnie, Clostridium perfringens („C. perfringens”) jest bakterią beztlenową, która znajduje się w

glebie, rozkładając substancję organiczną, a po części we florze jelitowej u ludzi i zwierząt. Różne szczepy

C. perfringens są oznaczone jakoe biotypy od A do E, w zależności od spektrum wytwarzanych toksyn [Ju-

stin i wsp., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL

TOXINS ; F Domer and J Drews (Red.) Pergamon Press, Oxford]. Szczepy biotypu A są szczególnie ważne25

jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych. Szczególnie poważną chorobą jelitową

wywoływaną przez C. perfringens jest nekrotyczne zapalenie jelit (znane również jako „martwicowe zapale-

nie jelit”), zgorzel jelit skutkująca martwicą, posocznicą i hemolizą, zarówno u ludzi, jak i u zwierząt domo-

wych [patrz, Pearson i wsp., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis.

21(2):256-63 (1977)]. W przypadku ptaków, np. kur (Gallus gallus), zgorzelinowe zapalenie jelit to znaczą-30

cym problem. C. perfringens zarówno typu A, jak i typu C, może spowodować znaczne straty, zwłaszcza w

produkcji brojlerów [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, W Diseases of Poultry, wyd. 10., str 261-264

(1997)]. Oprócz strat związanych z wybuchem nekrotycznego zapalenia jelit, istnieją doniesienia o obniżeniu

produktywności w stadach z chorobą związaną z C. perfringens [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology

30:73-81 (2001)]. Jak wspomniano powyżej, środki antybakteryjne dodawane do paszy są najczęściej sto-35

sowaną metodą kontroli. Jednak, środki przeciwbakteryjne, np. antybiotyki, są kosztowne i stanowią przed-

miot rosnących obaw związanych z promowaniem oporności bakterii.

[0005] Niedawno podjęto próby dostarczenia szczepionek przeciwko szkodliwym gatunkom Clostridium. Na

przykład, Lovland i wsp. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] przedstawili szczepionki - kandydatów oparte

na toksoidach (anatoksynach) C. perfringens typu A i typu C, z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Do-40

niesiono, że szczepienie kur rodzicielskich dostarcza specyficznych przeciwciał dla ochrony potomstwa

przed zmianami jelitowymi wywoływanymi przez subkliniczną prowokację C. perfringens. Znane są inne

EP 2 007 420 B1

2

szczepionki oparte na toksoidach, wytworzone z detoksyfikowanych toksyn C. perfringens [patrz np., patent

USA nr 4,292,307, który opisuje anatoksyny C. perfringens typów A, B i D, Cl. oedematiens i Cl. septicum].

[0006] Zaproponowano również preparaty rekombinowanych anatoksyn. Na przykład, Titball i wsp., [patenty

USA nr 5,851,827, 6,403,094 oraz 5,817,317] poinformowali o kwasach nukleinowych, które kodują antyge-

nowe peptydy C. perfringens, jak również same peptydy oraz szczepionki wytworzone z peptydów. Opisane 5

są, na przykład, peptydy, które mają reszty aminokwasowe od 261 do 300 z naturalnej toksyny alfa C. per-

fringens, ale nie mają domen fosfoplipazy C i hydrolizyn sfinogmieliny naturalnej toksyny. Doniesiono rów-

nież, że te peptydy indukują ochronę immunologiczną przeciwko naturalnej toksynie. Ponadto patent USA nr

6,610,300 opisuje szczepionkę opartą na fragmencie antygenowy mmuteiny toksyny beta C. perfringens.

[0007] Jednak bez względu na to, czy szczepionka anatoksynowa pochodzi z organizmu natywnego, czy10

jest uzyskana rekombinacyjnie, uważa się, że wytwarzanie i podawanie białek anatoksyny zwierzętom wy-

magających immunizacji jest uciążliwe ekonomicznie, z wyjątkiem szczególnych okoliczności (np. leczenie

ludzi, którzy mogliby być uczuleni albo wrażliwi na inne składniki oparte na całych organizmach). Ponadto,

szczepionki oparte na białku/anatoksynie zazwyczaj wymagają powtarzanych szczepień przypominających

w celu podtrzymania pełnej skuteczności.15

[0008] Innym proponowanym rozwiązaniem było skonstruowanie antygenowo aktywnego wirusa, który bę-

dzie wytwarzać muteinę toksyny alfa, zamiast toksyny typu dzikiego. Na przykład, Bennet i wsp. [Viral Im-

munol. 12(2):97-105 (1999)] przedstawili rekombinowany wektor wirusa krowianki, który wyraża nietoksycz-

ną domenę C toksyny alfa C. perfringens. Niestety, chociaż podczas ostatnich 20 lat zaproponowano kilka

rekombinowanych szczepionek opartych na wirusie krowianki, nadal istnieją długotrwałe obawy dotyczące 20

bezpieczeństwa uwalniania do środowiska żywych, zakaźnych wirusów krowianki, które mogłyby być prze-

kazywane tym osobom, które nie są odporne na tego wirusa.

[0009] Wiadomo, że toksyna alfa (gen plc) z C. perfringens posiada wiele aktywności biologicznych, w tym

aktywność hemolityczną, fosfolipazy C, sfingomielinazy, fosfodiesterazy, oraz działania letalne. Istnieje wiele

doniesień w tej dziedzinie dotyczących mutacji tej toksyny alfa, które zmniejszają toksyczność. Schoepe i 25

wsp. [Infect. and Immun. 69(11):7194-7196 (2001)] opisują naturalnie występujący szczep C. perfringens,

który wytwarza nietoksyczną toksynę alfa. Jednak, byłoby trudne zmodyfikowanie tego szczepu tak, aby

wywołać ochronę immunologiczną przeciw innemu wariantowi - toksycznemu gatunkowi C. perfringens typu

dzikiego.

[0010] Williamson i Titball [Vaccine 11(12):1253-1258 (1993)] wykazali, że region toksyny złożony z amino-30

kwasów 247 do 370 był wystarczający do immunizacji myszy przeciwko zgorzeli gazowej wywołanej ekspe-

rymentalnie przez C. perfringens. Alape-Girón i wsp. [Eur. J. Biochem. 267:5191-5197 (2000)] donieśli, że

podstawienia w pozycjach Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307 i Tyr331 zmniejszają toksyczność toksyny alfa.

Nagahama i wsp. [Infect. and Immun. 65:3489-3492 (1997)] donieśli, że podstawienia w pozycjach Asp-56,

Asp-130 lub Glu-152 powodowały zmniejszenie toksyczności toksyny alfa. Nagahama i wsp. [J. Bacteriology 35

177:1179-1185 (1995)] donieśli, że podstawienie histydyny w pozycji 68 aminokwasem obojętnym, takim jak

glicyna, w toksynie alfa C. perfringens spowodowało całkowitą utratę aktywności hemolitycznej, fosfolipazy

C, sfingomielinazy i letalej muteiny toksyny alfa. Uważa się, że ta pojedyncza zmiana aminokwasowa inak-

tywuje jedną z trzech domen białka wiążących cynk. Domena wiążąca cynk inaktywowana przez podstawie-

nie His68 została później nazwana Zn2 [Justin i wsp., Biochemistry 41:6253-6262 (2002)].40

EP 2 007 420 B1

3

[0011] Schoepe i wsp., Anaerobe, Londyn, GB, tom. 12, nr 1, luty 2006, str. 44-48 donoszą o ochronie my-

szy przed toksyną alfa Clostridium perfringens przez immunizację przy zastosowaniu wariantu 121A/91-

R212H toksyny alfa.

[0012] Pomimo powyższego, istnieje zapotrzebowanie w tej dziedzinie na bezpieczny, tani i skuteczny spo-

sób ochrony intensywnie hodowanych zwierząt domowych, w tym, ptaków, takich jak kurczęta, przed zaka-5

żeniem gatunkami Clostridium, w tym C. perfringens.

[0013] Przytoczenie tu dowolnego odnośnika nie może być interpretowane jako przyznanie, że taki odno-

śnik jest dostępny jako „dokument wcześniejszy” względem obecnego zgłoszenia.

STRESZCZENIE10

[0014] W celu podjęcia próby przezwyciężenia opisanych powyżej niedociągnięć w tej dziedzinie, obecny

wynalazek dostarcza cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują zasadniczo nietoksyczną muteinę tok-

syny alfa Clostridium perfringens.

15

[0015] Konkretnie, niniejszy wynalazek dostarcza co następuje:

1. Cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clo-

stridium perfringens, gdzie muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3

minus 9 kolejnych aminokwasów rozciągających się od Trp62 do Trp70.

2. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego kodu-20

je muteinę, w której te usunięte dziewięć kolejnych aminokwasów są zastąpione przez pojedynczą

resztę leucynową.

3. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego z SEK

ID NR: 2, w której nukleotydy 268-294 cząsteczki kwasu nukleinowego są usunięte.

4. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 3, w której usunięte nukleotydy są zastąpione przez 25

sekwencję nukleotydową kodującą pojedynczą resztę Leu.

5. Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens, przy czym muteina toksyny

alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus dziewięć kolejnych reszt aminokwa-

sowych, które rozciągają się od Tyr62 do Trp70.

6. Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens według pkt. 5, w której30

dziewięć kolejnych aminokwasów jest usuniętych i zastąpionych przez pojedynczą resztę Leu.

7. Zasadniczo nietoksycznego atenuowanego organizmu Clostridium perfringens uzyskanego przez

włączenie cząsteczki kwasu nukleinowego według dowolnego z pkt. 1-4 do chromosomu nieatenu-

owanego organizmu Clostridium perfringens.

8. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7, w którym cząsteczka kwasu nukle-35

inowego znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki

kwasu nukleinowego kodującego toksynę alfa typu dzikiego obecną w nieatenuowanym Clostridium

perfringens.

9. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7 lub pkt. 8, którym jest Clostridium

perfringens typu A.40

EP 2 007 420 B1

4

10. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 9-7, przy czym nie-

atenuowany Clostridium perfringens, z którego został uzyskany, wyizolowano ze zwierzęcia gospoda-

rza, którym jest albo ssak albo ptak.

11. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 10, przy czym ten ssak jest wybra-

ny z grupy składającej się z bydła, owiec i świń.5

12. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 10, przy czym tym zwierzęciem jest

kura, indyk, gęś, kaczka, łabędź, gołąb (ang. dove, pigeon), głuszcowaty lub kuropatwa.

13. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 7-12, który zawiera co

najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens.

14. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 13, gdzie ten polipeptyd nie z Clo-10

stridium perfringens jest polipeptydem niebakteryjnym.

15. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 14, gdzie polipeptydem niebakte-

ryjnym jest polipeptyd ptasi lub ssaczy.

16. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 15, gdzie polipeptydem niebakte-

ryjnym jest polipeptyd ptasi.15

17. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 15, gdzie polipeptydem niebakte-

ryjnym jest cytokina.

18. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 17, gdzie cytokiną jest kurza IL-18.

19. Atenuowanego Clostridium perfringens, jak określony w poprzednich pkt. 7-18, do zastosowania

jako szczepionka w sposobie wywoływania odporności na choroby powodowane przez zakażenie20

Clostridium perfringens u zwierząt, przy czym ten Clostridium perfringens podaje się w dawce sku-

tecznej immunologicznie.

20. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka

jest do podawania drogą doustną, domięśniową, dożylną, doskórną, podskórną lub donosową.

21. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, gdzie szczepionka jest 25

umieszczana na wierzchu paszy dla zwierzęcia.

22. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka

jest do podawania w postaci spray’u zwierzętom do dostarczania do podawania doustnego.

23. Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-054, mający nr depozytu

ATCC PTA7364.30

24. Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-053, mający nr depozytu

ATCC PTA7365.

25. Szczepionki zawierającej atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z pkt.

7-18, 23 lub 24.

26. Szczepionki według pkt. 25, zawierającej ponadto jedną lub więcej z następujących: farmaceu-35

tycznie dopuszczalny bufor, substancję pomocniczą lub adiuwant.

27. Paszy dla zwierząt, która zawiera szczepionkę według pkt. 25 lub 26.

[0016] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która

zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 18 kolejnych reszt amino-

kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto czą-40

steczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z

sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usu-

EP 2 007 420 B1

5

niętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która

koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co

najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest

His68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która

zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 6 kolejnych reszt amino-5

kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto czą-

steczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z

sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 3 kolejne reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych

reszt aminokwasowych jest His68.

[0017] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, która kodu-10

je muteinę, w której nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji amino-

kwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę,

w której nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z

SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie

więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 15

3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 18

kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3.

[0018] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę, w której dziewięć kolej-

nych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną

jest His68. W konkretnym wykonaniu tego typu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której20

usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciąga się od Tyr62 do Trp70 w SEK. ID. NR: 3. W

dalszym konkretnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której tych usuniętych

dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową.

[0019] W innym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową z SEK. ID.

NR: 2, w której usunięte są nukleotydy 268-294. W konkretnym wykonaniu tego typu, nukleotydy 268-294 z 25

sekwencji nukleotydowej SEK. ID. NR: 2 są zastąpione przez trzy nukleotydy, które kodują pojedynczą resz-

tę leucynową.

[0020] Jak opisano powyżej, wynalazek dostarcza również zasadniczo nietoksycznych mutein toksyny alfa

Clostridium perfringens. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwa-

sową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 18 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usunię-30

tych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwen-

cję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym

jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która

zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych,

przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny 35

alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 6 kolejnych reszt amino-

kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest mute-

ina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 3 kolejne

reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68.

[0021] Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwa-40

sowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera dele-

cję nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujaw-

EP 2 007 420 B1

6

niona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych z se-

kwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej

niż 18 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3.

[0022] Ujawniona jest ponadto zasadniczo nietoksyczna muteina, w której dziewięć kolejnych reszt amino-

kwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną jest His68. W bar-5

dziej konkretnym wykonaniu tego typu, usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciągało się

od Tyr62 do Trp70 w SEK. ID. NR: 3. W dalszym konkretnym wykonaniu, w sekwencji aminokwasowej muteiny

tych usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucy-

nową.

[0023] Wynalazek dostarcza ponadto atenuowanych organizmów Clostridium perfringens, które mają czą-10

steczkę kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium per-

fringens włączoną do ich chromosomów. Korzystnie , włączona cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje

się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do lokalizacji cząsteczki kwasu nukleinowego, która

koduje toksynę alfa typu dzikiego w organizmie Clostridium perfringens typu dzikiego. Zatem, atenuowany

organizm Clostridium perfringens według wynalazku może być zasadniczo nietoksyczny z powodu braku 15

działającego genu plc typu dzikiego. Jak tu przedstawiono przykładowo, atenuowanym organizmem Clostri-

dium perfringens może być Clostridium perfringens typu A.

[0024] W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens

jest Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 (nr depozytu ATCC PTA7364). W innym konkretnym

wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens jest Clostridium per-20

fringens CPERF/ΔαToxin 365-053 (nr depozytu ATCC PTA7365).

[0025] Organizm Clostridium perfringens, który jest atenuowany sposobami według niniejszego wynalazku

może być wyizolowany od zwierzęcia gospodarza, którym jest bądź ssak, bądź ptak. Takie ssaki mogą

obejmować: bydło, owce i świnie. Przykłady odpowiednich ptaków obejmują kury, indyki, kaczki, gołębie

(ang. pigeons i doves), gęsi, łabędzie, kuropatwy i głuszcowate.25

[0026] Niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionek. Takie szczepionki mogą zawierać atenuowane

organizmy Clostridium perfringens według wynalazku. Szczepionki według wynalazku mogą również zawie-

rać dopuszczalne farmakologicznie bufory, substancje pomocnicze i/lub adiuwanty.

[0027] Wynalazek dostarcza ponadto sposobów indukowania odporności na Clostridium perfringens u zwie-

rzęcia. Jedno z takich wykonań obejmuje podawanie zwierzęciu skutecznej immunologicznie dawki szcze-30

pionki według niniejszego wynalazku. Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane wie-

loma drogami, w tym: doustnie, domięśniowo, dożylnie, doskórnie, podskórnie, donosowo. Szczepionka

według niniejszego wynalazku może być nałożona na paszę dla zwierząt i/lub rozpylona na zwierzęta w celu

jej dostarczenia do podawania doustnego. Wynalazek dostarcza ponadto paszy zwierzęcej, która zawiera

szczepionkę według niniejszego wynalazku.35

[0028] Niniejszy wynalazek dostarcza również atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według

niniejszego wynalazku, który, dodatkowo, wyraża co najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostri-

dium perfringens. W jednym z takich wykonań jeden lub więcej polipeptydów nie z Clostridium perfringens to

polipeptydy bakteryjne, takie jak białka antygenowe z E. coli, Salmonella, Lawsonia lub Campylobacter itd.

i/lub ich kombinacje. Alternatywnie albo łącznie z tym, polipeptydem nie z Clostridium perfringens może być 40

polipeptyd niebakteryjny. Przykłady takich polipeptydów niebakteryjnych obejmują białka ssacze lub ptasie,

EP 2 007 420 B1

7

np. cytokiny, takie jak kurza IL-18, wirusów takich jak rotawirus lub koronawirus; oraz pasożytów, takich jak

Eimeria, Isospora i Cryptosporidium.

[0029] Ponadto ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z epitopem, którego brakuje w zasad-

niczo nietoksycznej muteinie toksyny alfa Clostridium perfringens. Takie przeciwciała mogą odróżnić zasad-

niczo nietoksyczną muteinę od toksyny alfa Clostridium perfringens typu dzikiego.5

[0030] Ujawnione są też zastawy testowe, które zawierają ujawnione przeciwciała do stosowania w identyfi-

kowaniu, czy dane zwierzę było szczepione lub alternatywnie, zostało naturalnie zakażone organizmem

Clostridium perfringens.

[0031] A zatem, dostarczone są również sposoby identyfikowania i/lub odróżniania zwierzęcia, które zostało

naturalnie zakażone organizmem Clostridium perfringens od tego, które zostało zaszczepione atenuowanym 10

organizmem Clostridium perfringens. W jednym z takich wykonań sposób obejmuje doprowadzenie do kon-

taktu próbki płynu od zwierzęcia z przeciwciałem, które wiąże się wybiórczo z epitopem znajdującym się w

toksynie alfa Clostridium perfringens typu dzikiego, który został usunięty z zasadniczo nietoksycznej muteiny

toksyny alfa Clostridium perfringens według niniejszego wynalazku. Zatem, przy pomocy przeciwciała można

odróżnić te zwierzęta, które zostały zaszczepione zasadniczo nietoksyczną muteiną toksyny alfa Clostridium 15

perfringens według wynalazku (i/lub atenuowanym organizmem Clostridium perfringens wyrażającym mute-

inę) od tych, które są zakażone lub były zakażone toksyną alfa Clostridium perfringens typu dzikiego. Na-

stępnym krokiem jest określenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu, np., wiąże się z antygenem za-

wartym w próbce płynu. Zwierzę identyfikuje się jako takie, które jest/było naturalnie zakażone organizmem

Clostridium perfringens, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu.20

KRÓTKI OPIS FIGUR[0032]

Fig. 1 przedstawia mapę genomową regionu kodującego toksynę alfa C. perfringens. Pokazane jest

położenie, odpowiednio, dwóch dużych fragmentów (1182 par zasad i 1746 par zasad), które były wy-25

korzystywane do wytworzenia CPERF001. Wskazane jest również położenie uzyskanej delecji 27 par

zasad. „Yplc” oznacza gen yplc (CPE0035), „plc” oznacza gen kodujący toksynę alfa (fosfolipazę C), a

„CobW” oznacza gen leżący poniżej.

Fig. 2A przedstawia sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID. NR: 4; jest to

część SEK. ID. NR: 22, (tj., nukleotydy 262-300) z fragmentu genu plc z CP6] i odpowiadającą mu se-30

kwencję peptydową (SEK ID NR: 5), w której podkreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonu-

kleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji.

Fig. 2B przedstawia sekwencję startera (SEK. ID. NR: 6) stosowaną do utworzenia delecji w rodziciel-

skim szczepie 1240 C. perfringens, z uzyskaniem szczepu z delecją CPERF001. Podkreślenie wska-

zuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI zawarte w starterze dla ułatwienia konstruowania35

delecji. Przedstawiony jest również odpowiadający temu peptyd (SEK. ID. NR: 7).

Figura. 2C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF001 (SEK. ID. NR: 8; nukleotydy 103-

117) i w odpowiadającym temu peptydzie (SEK. ID. NR: 9). Podkreślenie wskazuje przywrócone miej-

sce dla endonukleazy restrykcyjnej BamHI.

Fig. 3A przedstawia ponownie sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID.40

NR: 4, nukleotydy 262-300] i odpowiadającą jej sekwencję peptydową (SEK. ID. NR: 5), w której pod-

kreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji.

EP 2 007 420 B1

8

Fig. 3B przedstawia sekwencję startera (SEK. NR. ID: 10) stosowanego do utworzenia delecji w ro-

dzicielskim szczepie 29 C. perfringens, dającej początek szczepowi CPERF002 z delecją. Przedsta-

wiony jest również odpowiedni peptyd (SEK. ID. NR: 11).

Fig. 3C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF002 (SEK. ID. NR: 12) i odpowiedni peptyd

(SEK. ID. NR: 13).5

SZCZEGÓŁOWY OPIS

[0033] Zatem, wynalazek dostarcza zmodyfikowanych organizmów i hodowli organizmów Clostridia, które

wyrażają jedną lub więcej toksyn Clostridia, np. toksyn alfa, takich jak muteiny, które nie mają wykrywalnej10

toksyczności i/lub mają zasadniczo niską toksyczność w porównaniu z toksynami Clostridia natywnymi lub

typu dzikiego. Korzystnie, zmutowane organizmy C. perfringens według wynalazku można łatwo podawać

zwierzętom jako żywą szczepionkę. Dostarczone są również muteiny toksyn alfa C. perfringens według wy-

nalazku, wraz z cząsteczkami kwasu nukleinowego, które kodują muteiny, wektorami do ekspresji toksyn

alfa i sposobami ich stosowania.15

[0034] W celu dostarczenia jasnego opisu wynalazku, kilka terminów jest zdefiniowanych jak następuje.

Szczepionka jest kompozycją, która zawiera immunogen i inne ewentualne dopuszczalne farmaceutycznie

składniki, obejmujące, w niektórych wykonaniach, odpowiednie adiuwanty. Stosowany tu termin „immuno-

gen” opisuje kompozycję, substancję lub wektor, który po wprowadzeniu do organizmu zwierzęcia, stymuluje

odpowiedź odpornościową. Dla celów niniejszego wynalazku, przyjmuje się, że immunogen obejmuje do-20

wolny wektor zdolny do ekspresji lub wprowadzania muteiny toksyny alfa według wynalazku do zwierzęcia,

które ma być immunizowane. Wektor obejmuje, np., C. perfringens według wynalazku lub inny odpowiedni

drobnoustrój, który wyraża muteinę toksyny alfa według wynalazku, gdy wektor jest wprowadzony do zwie-

rzęcia. Wektor obejmuje również cząsteczki kwasu nukleinowego znane w tej dziedzinie, np. plazmidy i tym

podobne, które ulegają ekspresji do muteiny toksyny alfa według wynalazku, gdy są wprowadzone bezpo-25

średnio do zwierzęcia, np. przez wniknięcie do komórki zwierzęcia i wyrażenie muteiny toksyny alfa u zwie-

rzęcia. Immunogenem jest również białko, takie jak toksyna alfa według wynalazku, zastosowane samo lub

jako część odpowiedniej kompozycji szczepionki.

[0035] Stosowane tu terminy „immunizować” i „szczepić”, o ile nie zaznaczono, że jest inaczej, są synoni-

mami i są stosowane zamiennie dla opisania wprowadzania immunogenu do zwierzęcia w celu wzbudzania30

odpowiedzi odpornościowej u zwierzęcia. Wzbudzona odpowiedź odpornościowa dostarcza traktowanemu

zwierzęciu ochronnej odporności, która ogranicza lub zmniejsza oznaki kliniczne choroby, np., zgorzeli ga-

zowej i/lub śmiertelności u zaszczepionych zwierząt, które są później prowokowane wirulentną dawką ga-

tunku C. perfringens, dla których szczepionka według wynalazku jest ochronna.

[0036] Termin „adiuwant” jest zdefiniowany jako jedna lub więcej substancji, które powodują stymulację35

układu odpornościowego. W tym kontekście, adiuwant jest stosowany do wzmocnienia odpowiedzi odporno-

ściowej wobec jednego lub większej liczby antygenów/izolatów szczepionkowych. Adiuwant można podawać

docelowemu zwierzęciu przed, w kombinacji z lub po podaniu szczepionki. Adiuwanty według wynalazku

można uzyskać z dowolnego z wielu źródeł, w tym ze źródeł naturalnych, źródeł rekombinowanych i/lub są

one syntetyzowane chemicznie, itd. Przykłady związków chemicznych stosowanych jako adiuwanty obejmu-40

ją, ale nie wyłącznie, związki glinu, metabolizowane i niemetabolizowane oleje; polimery blokowe; ISCOM

(kompleksy immunostymulujące); witaminy i minerały (w tym, ale nie wyłącznie: witaminę E, witaminę A,

EP 2 007 420 B1

9

selen, witaminę B12); Quil A (saponiny); usieciowane polimery oparte na kwasie akrylowym (np. polimery

kwasu prop-2-enowego), usieciowane do różnych poziomów z polieterem polialkenylowym, jak sprzedawane

pod znakiem towarowym CARBOPOL®; i/lub jednorodnie zdyspergowane, rozmiarów mikronowych, kropelki

emulsji wodnej, np., jak sprzedawane pod znakiem towarowym Emulsigen®.

[0037] Dodatkowe przykłady adiuwantów, które są niekiedy konkretnie określane wyraźnie jako immuno-5

stymulatory, obejmują składniki ściany komórkowej bakterii i grzybów (np. lipopolisacharydy; lipoproteiny,

glikoproteiny, muramylopeptydy, beta-1,3/1,6-glukany), różne węglowodany złożone pochodzące z roślin

(np. glikany, acemannany), różne białka i peptydy pochodzące ze zwierząt (np. hormony, cytokiny, czynniki

kostymulujące) i nowe kwasy nukleinowe pochodzące z wirusów i innych źródeł (np. dwuniciowy RNA, CpG).

Ponadto, dowolna liczba kombinacji wyżej wymienionych substancji może dostarczyć działania adiuwanto-10

wego, a zatem może stanowić adiuwant według niniejszego wynalazku.

[0038] Stosowany tu termin „przeciwciało”, ma obejmować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklo-

nalne i/lub ich fragmenty lub rekombinowane pochodne, w tym skonstruowane białka wiążące zawierające

domeny zmienne przeciwciał.

[0039] Stosowana tu numeracja reszt i pozycji reszt aminokwasowych białek toksyny alfa według wynalazku 15

opiera się na systemie numeracji opisanym dla szczepu 13 Clostridium perfringens. Toksyna alfa ze szczepu

13 C. perfringens jest opisana pod numerem dostępu GenBank NC 003366, jak pokazano w SEK. ID. NR: 1.

Całe białko ma długość 398 aminokwasów. Toksyna alfa kodowana przez wektory dla muteiny przedstawio-

ne tu przykładowo poniżej odpowiadają białku z SEK. ID. NR: 1 mającego delecję reszt aminokwasowych

90-98. Jest tam 28-aminokwasowa sekwencja sygnałowa, która jest odcinana podczas dojrzewania białka. 20

Zatem przykładowa delecja odpowiada resztom aminokwasowym 62-70 dojrzałego białka, które ma długość

370 aminokwasów (SEK. ID. NR: 3).

[0040] Numeracja kodonów w DNA kodującym białka toksyny alfa według wynalazku opiera się na genie plc

szczepu 13 Clostridium perfringens, jak opisano w GenBank nr dostępu NP 560952 i jak pokazano w SEK.

ID. NR: 2. Sekwencja kodująca dla toksyny alfa rozciąga się od nukleotydu 48590 do 49786 w szczepie 13 25

C. perfringens. Delecja kodonów w przedstawionych tu przykładowo dwóch konstruktach odpowiada nukle-

otydom 48857 do 48883 (włącznie) genu NP 560952. Delecja ta znajduje się w obrębie genu toksyny alfa i

odpowiada nukleotydom 268-294 w sekwencji kodującej SEK. ID. NR: 2.

[0041] Ponadto, stosowanie terminów w liczbie pojedynczej dla wygody w opisie nie ma na celu stanowie-

nia jakiegokolwiek ograniczenia. Zatem, na przykład, odniesienie się do kompozycji zawierającej komórki C. 30

perfringens obejmuje odniesienie się do jednej lub większej liczby takich komórek.

[0042] W konkretnym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczone są nierewertujące mutanty C. perfrin-

gens, które są „zasadniczo nietoksyczne”, tj., organizmy, które wyrażają immunogenną toksynę alfa o małej

toksyczności lub bez, co czyni je odpowiednimi do stosowania jako szczepionki ochronne. Organizmy C.

perfringens według wynalazku wykazują zatem odpowiednio zmniejszoną toksyczność w stosunku do orga-35

nizmów C. perfringens typu dzikiego, aby sprawić, że są dopuszczalne jako szczepionka lub antygen, gdy

stosuje się je w warunkach skutecznych do wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej anty-toksyna alfa lub

anty-C-perfringens u zwierzęcia, które zostało tak zaszczepione. A zatem, organizm C. perfringens według

wynalazku jest „atenuowany” w stosunku do C. perfringens typu dzikiego.

[0043] Zwrot „zasadniczo nietoksyczny” ma mieć również zastosowanie do wyżej wymienionych immuno-40

gennych mutein toksyny alfa, które mają wystarczająco niską toksyczność lub brak, co sprawia, że są od-

powiednie także do stosowania w szczepionce ochronnej.

EP 2 007 420 B1

10

[0044] Zmniejszenie toksyczności mierzy się, np., jednym z następujących testów znanych w tej dziedzinie:

aktywności hemolitycznej, aktywności fosfolipazy C, aktywności sfingomielinazy, aktywności fosfodiesterazy i

ogólnej aktywności letalnej w grupie badanych zwierząt. Na ogół w takich standardowych testach resztkowa

toksyczność nie jest wykrywalna. Jednak obecność minimalnego poziomu jednej lub większej liczby tych

aktywności, np., od około 10-4 do około 10-2, w odniesieniu do toksyczności równoważnej liczby jednostek 5

zakaźnych toksyny alfa C. perfringens typu dzikiego, z której muteina pochodzi, może okazać się dopusz-

czalna w warunkach weterynaryjnych.

[0045] W jednym z wykonań, wynalazek jest wykonywany z zastosowaniem biotypu A szczepów C. perfrin-

gens, które mają szczególne znaczenie jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych.

Konkretnie, toksyna alfa z C. perfringens jest celem dla delecji-atenuacji, ponieważ osłabienie tej toksyny 10

jest wystarczające dla uczynienia C. perfringens wystarczająco nieletalnym w stosunku do szczepów typu

dzikiego.

[0046] Ogólnie, gen plc C. perfringens wyraża muteinę toksyny alfa.

[0047] Muteina toksyny alfa ma delecję, która obejmuje His z pętli Zn2, razem z resztami flankującymi, w

celu znacznego zmniejszenia możliwości jakiegokolwiek mutacji powrotnej do postaci toksycznej. Obecnie 15

stwierdzono, że delecja reszty His z pętli Zn2, np. His68 z SEK. ID. NR: 3, wraz z delecją dodatkowych reszt

flankujących resztę His z pętli Zn2 zapewnia zachowanie dostatecznej immunogenności toksyny alfa dla

indukowania ochronnej odporności u zwierząt zaszczepionych C. perfringens według wynalazku, przy czym

jest także mało prawdopodobne, aby podlegała mutacji powrotnej do kodowania toksyny alfa typu dzikiego.

Dodatkowe reszty, które można usunąć, są usuwane w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N, w sto-20

sunku do His68, a ich liczba może wahać się od około 4 do około 60 reszt w obydwu tych kierunkach. Alter-

natywnie, w podobny sposób mogą być usunięte His148 i reszty flankujące.

[0048] Jedna z mutein toksyny alfa zawiera także, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 30 reszt amino-

kwasowych, z każdej strony (w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N) pozycji His68, w stosunku do

sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 25

20 reszt aminokwasowych z każdej strony His68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina

toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 5 reszt aminokwasowych z każdej strony

His68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Muteina toksyny alfa według wynalazku zawiera delecję od

około reszty 62 do około reszty 70, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Ewentualnie, usunięte reszty

aminokwasowe są zastąpione przez jedną lub więcej innych reszt, na przykład, przez pojedynczą resztę30

leucynową.

[0049] W jeszcze dalszym, innym aspekcie, muteina toksyny alfa C. perfringens jest wytwarzana i izolowa-

na z C. perfringens lub z alternatywnego rekombinowanego organizmu do zastosowania jako odczynnik do

badań i/lub w zestawach diagnostycznych lub testach, np. jako cel dla przeciwciał anty-toksyna alfa. Jeszcze

innym zastosowaniem białek mutein toksyny alfa C. perfringens są wyspecjalizowane szczepionki dla zwie-35

rząt, np. ludzi, którzy mogą nie tolerować szczepienia atenuowanym organizmem C. perfringens według

wynalazku.

[0050] Ponadto, ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z toksyną alfa typu dzikiego w sto-

sunku do mutein toksyny alfa według niniejszego wynalazku.

[0051] Ujawnione jest ponadto przeciwciało, które wiąże się selwktywnie z białkiem toksyny alfa C. perfrin-40

gens typu dzikiego, wykazując minimalne lub brak wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku, np.

unikając wiązania się z muteiną toksyny alfa, która ma delecję, jak opisano szczegółowo powyżej. Dostar-

EP 2 007 420 B1

11

czone przeciwciało jest zatem przydatne do odróżniania muteiny toksyny alfa z delecją od toksyny alfa typu

dzikiego, a zatem jest również przydatne do rozróżniania zwierząt zaszczepionych szczepionką według ni-

niejszego wynalazku od zwierząt, które zostały zakażone C. perftingens typu dzikiego. Sposoby wzbudzania

i wyszukiwania takich wybiórczych przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Podobnie, można wytwarzać prze-

ciwciała, które rozpoznają muteinę toksyny alfa według niniejszego wynalazku, ale nie białko typu dzikiego. 5

Przeciwciała mogą być poliklonalne, monoklonalne („mAb”) albo fragmentami lub fragmentami uzyskanymi

na drodze inżynierii genetycznej lub pochodnymi takich przeciwciał zachowującymi właściwości swoistego

wiązania.

[0052] Techniki wytwarzania i wyszukiwania przeciwciał monoklonalnych zostały obszernie opisane

[patrz, np., Stites. i wsp. (red.) Basic and Clinical Immunology (wyd. 4.), Lange Medical Publications, Los 10

Altos, California (1988); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding,

Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wyd. 2.), Academic Press, New York (1986); i Kohler and

Milstein, Nature 256:495-497 (1975).

[0053] Na przykład i bez ograniczeń, odpowiedź odpornościowa jest wzbudzana w odpowiednich zwierzę-

tach, takich jak mysz lub kura, przez szczepienie oczyszczonym białkiem toksyny alfa C. perfringens typu 15

dzikiego, np. łącznie z odpowiednim adiuwantem. Na przykład, w celu uniknięcia toksyczności białka alfa

typu dzikiego, immunogenem jest peptyd odpowiadający usuniętym resztom i, jeśli to konieczne, immuno-

genność peptydu jest wzmacniana przez skojarzenie z odpowiednim adiuwantem lub połączenie z odpo-

wiednim białkiem nośnikowym. Łączenie z białkiem nośnikowym jest znane w tej dziedzinie i można je

przeprowadzić, np. przez dostarczenie peptydu z końcową cysteiną i przyłączenie go do hemocyjaniny ze 20

skałoczepa (KLH,) lub albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) stosując bądź reakcję chemiczną z użyciem ma-

leimidu, bądź łącznika sulfosukcynimidylo-4-[N maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylowego (od Pier-

ce). Można również zastosować łącznik karbodiimidowy bez wymogu końcowej cysteiny.

[0054] Aby uzyskać przeciwciała monoklonalne, od immunizowanego zwierzęcia można otrzymać limfocyty

śledzionowe, wytworzyć z tych limfocytów hybrydoma i można otrzymać jedną lub większą liczbę tych po-25

tencjalnie odpowiednich hybryda wyrażających przeciwciało anty-białko toksyny alfa. Hybrydoma przeszuku-

je się pod kątem zarówno muteiny, jak i białka alfa typu dzikiego i hybrydoma wyrażające przeciwciało, które

wiąże się tylko z toksyną alfa typu dzikiego identyfikuje się, klonuje i wykorzystuje do wytwarzania przeciw-

ciał monoklonalnych, które wiążą się tylko z białkiem toksyny alfa typu dzikiego. Ewentualnie, ze zidentyfi-

kowanej klonalnej linii hybrydoma otrzymuje się cDNA i przeciwciała rekombinowane lub fragmenty przeciw-30

ciał można wytwarzać w innych, dobrze znanych w tej dziedzinie, układach ekspresyjnych.

[0055] Jak omówiono powyżej, jedną z potencjalnych wad szczepienia jest na ogól to, że uzyskane szcze-

pione zwierzęta mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie, gdy testuje się je pod kątem zakażenia stosując

przeciwciała przeciw naturalnie występującemu szczepowi, co utrudnia identyfikację zwierząt zakażonych.

Zatem, ujawniony jest zestaw testowy do odróżniania osobników – zwierząt, które zostały zakażone wystę-35

pującym naturalnie organizmem C. perfringens, od tych zaszczepionych muteiną toksyny alfa według niniej-

szego wynalazku.

[0056] Jeden z takich zestawów testowych zawiera ilość wybiórczego przeciwciała anty-toksyna alfa typu

dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku.

Zestaw może również zawierać inne odpowiednie odczynniki, wystarczające do przeprowadzenia co naj-40

mniej jednego testu diagnostycznego. W dalszym wykonaniu, przeciwciało zawiera znacznik lub jest wyzna-

kowane łatwo wykrywalną resztą markerową, np. dowolnym znanym w tej dziedzinie markerem enzymatycz-

EP 2 007 420 B1

12

nym, np. peroksydazą; znacznikiem fluorescencyjnym, np. fluoresceiną; kulkami, w tym, kulkami magnetycz-

nymi; i tym podobnymi. Ewentualnie, zestaw może ponadto zawierać znakowane przeciwciało, które wiąże

się wybiórczo z wybiórczym przeciwciałem anty-toksyna alfa typu dzikiego. Testy immunologiczne są dobrze

znane w tej dziedzinie i obejmują kanapkowy test immunologiczny, konkurencyjny test immunologiczny,

enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA, testy radioimmunologiczne (RIA) i inne.5

[0057] Dostarczone są również sposoby identyfikacji i odróżniania zwierzęcia, które zostało zakażone przez

organizm C. perfringens występujący naturalnie, tj. typu dzikiego, od zwierzęcia zaszczepionego szczepion-

ką zawierającą atenuowany organizm C. perfringens według wynalazku, które przeprowadza się na przy-

kład, w następujących etapach:

(a) kontaktowanie próbki płynu od zwierzęcia z opisanym powyżej wybiórczym przeciwciałem anty-10

toksyna alfa typu dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa

według niniejszego wynalazku; i

(b) ustalenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu;

przy czym, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu, zwierzę jest identyfikowane jako to, które zostało zaka-

żone organizmem C. perfringens występującym naturalnie.15

Wytwarzanie atenuowanych szczepów C. perfringens

[0058] Proces przekształcania izolatu C. perfringens typu dzikiego w szczep atenuowany lub zasadniczo

nietoksyczny, odpowiedni do podawania jako szczepionka, można przeprowadzić jak następuje. Gen toksy-20

ny alfa (plc) można zastąpić na chromosomie bakteryjnym genem kodującym jedynie muteinę toksyny alfa,

nie pozostawiając żadnej zdolności organizmu C. perfringens do wytwarzania toksyny alfa typu dzikiego.

Bardzo szeroko, proces wytwarzania organizmu szczepionkowego obejmuje, ale nie wyłacznie, następujące

ogólne etapy, niekoniecznie w podanej kolejności.

(1) Identyfikacja typu zwierzęcia, które ma być chronione przez szczepienie i jednego lub więcej izola-25

tów klinicznych uzyskanych dla celów badań przesiewowych. Etap ten jest zazwyczaj opcjonalny w

przypadku toksyny alfa, ponieważ izolaty z jednego gatunku zwierzęcia prawdopodobnie nie będą za-

pewniać ochrony innym gatunkom zwierząt.

(2) Powielenie genu plc z izolatu lub izolatów C. perfringens, np. przez zastosowanie reakcji PCR lub

innej znanej w tej dziedzinie techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, z odpowiednimi starterami flan-30

kującymi i zastosowanie amplifikacji z odpowiednimi starterami w celu utworzenia żądanej mutacji de-

lecyjnej. Alternatywnie, można przeszukać odpowiednią bibliotekę z użyciem sondy .

(3) Wytworzenie wektora samobójczego zawierającego gen plc z delecją, z którego usunięty został

początek replikacji C. perfringens i/lub początek replikacji, który może replikować się w C. perfringens

po prostu nie jest tam obecny; i w każdym przypadku obejmującego odpowiednie markery selekcyjne, 35

np. markery antybiotykowe, sąsiadujące ze zmutowanym genem plc. Taki wektor można następnie

wprowadzić do organizmów C. perfringens, np. przez elektroporację lub innymi metodami znanymi w

tej dziedzinie.

(4) Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których gen plc dla muteiny został z powodzeniem

włączony do chromosomu bakteryjnego. Dokonuje się tego przez hodowanie organizmów C. perfrin-40

gens z etapu (3) w obecności czynnika selekcyjnego, np. antybiotyku(ów) odpowiadającego(ych) mar-

kerom selekcyjnym. Na przykład, tylko organizm C. perfringens, który rósłby w warunkach selekcji na

EP 2 007 420 B1

13

antybiotyk byłby takim, który przez rekombinację homologiczną ma bezpośrednio włączony do chro-

mosomu bakteryjnego wektor samobójczy z jego genem(ami) oporności na antybiotyki. Te rosnące

organizmy C. perfringens miałby zatem dwa sąsiadujące geny plc, jeden będący typu dzikiego, pod-

czas gdy drugi miałby mutację delecyjną.

(5) Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których nastąpiło dalsze zdarzenie rekombinacyj-5

ne, które usuwa markery selekcyjne, np. markery antybiotykowe, wraz genem plc typu dzikiego. Do-

konuje się tego przez hodowlę organizmów z (4) w nieobecności czynnika selekcyjnego, np. antybio-

tyku i selekcjonowanie klonów niehemolitycznych na agarze z krwią.

[0059] Ponieważ wprowadzenie kwasu nukleinowego dla muteiny można osiągnąć na drodze rekombinacji

homologicznej, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę toksyny alfa jest włączana w pozycji na10

chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej toksynę alfa

typu dzikiego, która jest obecna w nieatenuowanym Clostridium perfringens.

[0060] Bardziej szczegółowo, izolaty polowe C. perfringens otrzymuje się od chorych zwierząt lub z innych

źródeł. Początkowo, genomowy DNA uzyskany z izolatów polowych będących przedmiotem zainteresowania

wstawia się do odpowiedniego wektora wahadłowego dla dwóch mikroorganizmów, np. plazmidu wahadło-15

wego z markerami selekcyjnymi, np. markerami antybiotykowymi, w celu zbadania ich zdolności do trans-

formacji. Ogólnie, odpowiedni wektor wahadłowy będzie obejmować jedną, dwie, trzy lub więcej z następu-

jących właściwości: miejsce do klonowania, początek replikacji C. perfringens, początek replikacji E. coli i

gen oporności na antybiotyk i/lub marker selekcyjny. Znane w tej dziedzinie wektory odpowiednie do tego

celu lub podlegające łatwej adaptacji do tego celu obejmują, na przykład, rekombinowany plazmid wahadło-20

wy pHR106 opisany przez Robertsa i wsp., [Appl. Env Mircobiol 54: 268-270 (1988)]; plazmidy pJIR750 i

pJIR751 opisane przez Bannama i wsp. [Plasmid 29:233-235 (1993)]; bezpromotorowy wektor pPSV do

selekcji promotorów według Matsushita i wsp., 1994, Plasmid 31 317-319; plazmidy wahadłowe pJIR1456 i

pJIR1457, opisane przez Lyrasa i wsp., 1988, Plasmid 39, 160-164 oraz wektor wahadłowy pAK201, opisa-

ny przez Kim i wsp., 1989, Appl. Environ Microbiol 55, 360-365. Usunięcie początku replikacji C. perfringens25

przekształca wektor wahadłowy w wektor samobójczy.

[0061] Na przykład, jednym z plazmidów wahadłowych jest pJIR418, opisany przez Sloan i wsp., 1992,

Plasmid 27, 207-219.

[0062] Izolaty dające ≥104 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i które są wrażliwe na marker

antybiotykowy np. chloramfenikol lub erytromycynę, są potencjalnymi kandydatami dla delecji. Genomowy 30

DNA ze szczepów - kandydatów stosuje się następnie jako matrycę do reakcji PCR o dalekim zasięgu dla

genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących ze szczepów - kandydatów. Na przykład, jak przedstawiono

dla przykładu poniżej, chromosom szczepu 13 C. perfringens zastosowano do identyfikacji starterów do am-

plifikacji genu kodującego toksynę alfa. Startery zastosowano następnie do klonowania genu toksyny alfa z

innego szczepu, który był izolatem CP6 z drobiu.35

[0063] Po subklonowania produktów PCR gen toksyny alfa i regiony flankujące poddano sekwencjonowaniu

i mapowaniu restrykcyjnemu. Zsyntetyzowano nowe startery oligonukleotydowe z flankującymi miejscami

restrykcyjnymi i produkty z dwóch oddzielnych amplifikacji sklonowano do odpowiedniego plazmidu samo-

bójczego (początek replikacji C. perfringens został usunięty), np. jak przedstawiono dla przykładu poniżej,

jako plazmid 1192-23.1, w celu wytworzenia żądanego szczepu szczepionkowego z delecją.40

[0064] Dostarczony(e) wektor(y) samobójczy(e) swoisty(e) dla izolatu(ów) wprowadza się do odpowiedniego

szczepu zwierzęcego C. perfringens dowolną standardową metodą znaną w tej dziedzinie. Na przykład,

EP 2 007 420 B1

14

dokonuje się tego przez elektroporację. Gdy wektor samobójczy (bez początku replikacji C. perfringens)

wprowadza się do C. perfringens, jest on niezdolny do replikacji w cytoplazmie i przeżycia, o ile nie włączy

się z powodzeniem do chromosomu bakteryjnego. Jedynymi organizmami, które będą rosły w obecności

antybiotyku odpowiadającemu nowo wprowadzonemu genowi markera antybiotykowego, są integranty.

[0065] Można zastosować dowolny znany w tej dziedzinie gen markera selekcyjnego, chociaż w wektorach 5

przedstawionych przykładowo poniżej użyte są markery: chloramfenikol i/lub erytromycyna.

[0066] Te zdarzenia rekombinacyjne są wynikiem homologii genu plc typu dzikiego z genem plc z delecją w

DNA plazmidowym. Uzyskane rekombinowane bakterie są nazywane integrantami. Integrant zawiera kopię

wprowadzonego wektora z homologią, który jest włączony w locus genu plc. Zatem uzyskany w rezultacie

integrant zawiera dwie kopie genu plc, oryginalną kopię prawidłową i wprowadzoną wersję z delecją. Wpro-10

wadzone geny oporności na antybiotyki znajdują się między dwiema kopiami genu plc. Między dwiema ko-

piami genu plc mogą pojawić się rzadkie zdarzenia rekombinacji losowej. To zdarzenie rekombinacji może

dać jeden z dwóch wyników. W obu przypadkach zostaje usunięty DNA znajdujący się między dwiema ko-

piami genu plc (w tym geny odporności) . Jako pierwszy wynik, odtworzony zostaje gen plc prawidłowy lub

typu dzikiego, w rezultacie czego następuje odzyskanie wyjściowego szczepu rodzicielskiego bez markerów 15

antybiotykowych. Jako drugi wynik, gen plc typu dzikiego jest zastępowany przez kopię z delecją, dając po-

żądany konstrukt dla toksyny alfa z delecją bez markerów antybiotykowych.

[0067] Usunięcie antybiotyków z pożywki hodowlanej umożliwia tym bakteriom, w których nastąpiła rekom-

binacja, przeżycie i replikację. Rekombinowane klony delecyjne identyfikuje się przez wzrost na agarze z

krwią, bez hemolizy normalnie wykazywanej przez C. perfringens, który wyraża toksynę alfa typu dzikiego.20

Zwierzęta do szczepienia

[0068] Zwierzęta, dla których można wytworzyć szczepionkę z atenuowanym C. perfringens i dla których

można wyizolować przydatne szczepy C. perfringens typu dzikiego, obejmują ogólnie, dowolne zwierzęta, 25

dla których zakażenie C. perfringens stanowi problem. Kręgowce będące przedmiotem zainteresowania

obejmują ptaki, ssaki i ryby, a zwłaszcza zwierzęta ważne w gospodarce i/lub rolnictwie. Poniższa lista zwie-

rząt to te, które jak się uważa, odniosą korzyść ze szczepionki z C. perfringens, i/lub od których można uzy-

skać izolaty C. perfringens typu dzikiego. Chociaż możliwe jest czasami, że takie szczepionki zawierają

składnik (żywy lub nieżywy), który został pierwotnie wyizolowany z tego samego rodzaju lub gatunku zwie-30

rzęcia, który ma być szczepiony, nie stanowi to wymogu.

[0069] Nieograniczająca lista takich zwierząt obejmuje te z rodzin ptaków, bydła, owiec, itd., jak również

zwierząt wodnych, np. które mogą być poddane akwakulturze i/lub zbierane ze środowiska naturalnego i

utrzymywane przy życiu w zbiornikach przez czas przed sprzedażą. Obejmuje to ryby, takie jak pstrąg lub

łosoś i inne gatunki hodowane lub zbierane dla korzyści ekonomicznych. Zwierzęta wodne inne niż kręgow-35

ce obejmują homary, kraby, mięczaki, np., kalmary, ośmiornice, małże, ostrygi, ślimaki, przegrzebki i tym

podobne. Określenie „ptasi” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, kury, indyki, , gęsi, kaczki itp.

Określenie „bydlęcy” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, bydło, wołowina, cielęcina itp. Okre-

ślenie „owczy” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, jagnię, itp.

[0070] Dla celów niniejszego wynalazku, termin „ryba” ma być rozumiany, jako obejmujący, ale nie wyłącz-40

nie,, zgrupowanie ryb Teleosti, tj. doskonałokostnych. W obrębie ugrupowania Teleosti zawarty jest zarów-

EP 2 007 420 B1

15

no rząd Salmoniformes (który obejmuje rodzinę Salmonidae), jak i rząd Perciformes (który obejmuje rodzinę

Centrarchidae).

[0071] Przykłady potencjalnych ryb - biorców obejmują m.in. rodzinę Salmonidae, rodzinę Serranidae, ro-

dzinę Sparidae, rodzinę Cichlidae, rodzinę Centrarchidae, rybę z rodziny luszczowanych (Parapristipoma

trilineatum) i plekostomusa niebieskookiego (Plecostomus spp.).5

Rodzina SalmonidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWACoregonus clupeaformis Sieja amerykańskaCoreqonus hoyi Ryba siejowataOncorhynchus keta Keta (gatunek łososia)Oncorthynchus gorbuscha GorbuszaOncorhynchus kisutch Kiżucz (łosoś srebrny)Oncorhynchus masou SimaOncorhynchus nerka NerkaOncorhynchus tshawytscha Czawycza(łosoś królewski)Prosopium cylindraceum Koniek, wałekOncorhynchus clarki Łosoś ClarkaOncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowySalmo salar Łosoś szlachetny, łosoś atlan-

tyckiSalmo trutta Troć wędrownaSalmo trutta X S. fontinalis Hybrydowy pstrąg tygrysiSalvelinus alpinus Golec zwyczajnySalvelinus confluentus Pstrąg byczy

Salvelinus fontinalis Pstrąg źródlanySalvelinus leucomaenis KundżaSalvelinus malma MalmaSalvelinus namaycush Palia jeziorowa, palia amery-

kańskaThymallus thymallus Lipień pospolity

Niektórzy przedstawiciele rodziny SerranidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWACentropristis ocyurus ang. Bank sea bassCentropristis philadelphicus ang. Rock sea bassCentropristis striata strzępiel czarnyDiplectrum bivittatum ang. Dwarf sandperchDiplectrum formosum Strzępiel piaskowyEpinephelus flavolimbatus Granik strojnyEpinephelus morio Granik morioSerranus phoebe ang. TattlerSerranus tortuqarum ang. Chalk bass

Niektórzy przedstawiciele rodziny SparidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAArchosarqus probatocephalus Sparus owczarzArchosarqus rhomboidalis Sparus jednoplamyCalamus penna ang. Sheepshead porgyLaqodon rhomboides ang. PinfishPagrus Major Pagrus japońskiSparus aurata DoradaStenotomus chrysops Skap

Niektórzy przedstawiciele rodziny CichlidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAequidens latifrons Akra błękitnaCichlisoma nigrofasciatum Pielęgnica zebaCrenichichla sp. ang. Pike cichlidPterophyllum scalare Skalar

EP 2 007 420 B1

16

Tilapia mossambica Tilapia mozambickaOreochromis spp TilapiaSarotherodon aurea Tilapia złota

Niektórzy przedstawiciele rodziny CentrarchidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAmbloplites rupestris Bass czerwonookiCentrarchus macropterus Bass pawik, okoń pawik

Okoń moczarowyElassoma okefenokee ang. Okefenokee pigmy sun-

fishElassoma zonatum Okończyk paskowanyEnneacanthus gloriosus Bassek diamentowyEnneacanthus obesus Bassek zielonyLepomis auritus Bass różowyLepomis cyanellus Bass zielonyLepomis cyanellus X L. qibbosus Bass zielony x bass słoneczny Lepomis gibbosus Bass słoneczny, słonecznica

pstraLepomis gulbsus ang. WarmouthLepomis humilis ang. Orange-spotted sunfishLepomis macrochirus Bass pręgowany, bass błękit-

noskrzelny, bass niebieski Lepomis megalotis ang. Longear sunfishMicropterus coosae ang. Shoal bassMicropterus dolomieui Bass małogębowyMicropterus punctulatus ang. Spotted bassMicropterus salmoides Bass wielkogębowy, oko-

niopstrągPomoxis annularis Bass białyPomoxis nigromaculatus Bass czarny

[0072] W dalszym wykonaniu, zwierzęciem jest zwierzę do towarzystwa lub człowiek. Dla celów niniejszego

wynalazku, termin zwierzę „do towarzystwa” ma być rozumiany jako obejmujący wszystkie zwierzęta - konie

(koniowate), koty (kotowate), psy (psowate) i gryzonie, w tym,gatunki myszy, szczurów, świnek morskich, 5

królików oraz ptaki, takie jak gołębie, papugi, i tym podobne.

[0073] Ptaki otrzymujące takie szczepienie mogą być związane bądź z komercyjną, bądź z niekomercyjną

hodowlą ptaków. Obejmuje to np. Anatidae, takie jak łabędzie, gęsi i kaczki, Columbidae, np. gołębie (ang.

doves and pigeons), takie jak gołębie domowe, Phasianidae, np. kuropatwę, głuszcai indyki, Thesienidae,

np. kury domowe, Psittacines, np. papużki, ary i papugi, np., hodowane jako zwierzęta domowe lub markery 10

dla zbiorników. Kury zilustrowano poniżej.

Źródła izolatów typu dzikiego

[0074] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku można wytwarzać, na ogól, rozpoczynając 15

od C. perfringens typu dzikiego, który został pierwotnie wyizolowany z dowolnego zakażonego zwierzęcia

będącego przedmiotem zainteresowania, jak omówiono powyżej, i/lub ze środowiska. Środowisko obejmuje

dowolny materiał, który zawiera żywotne organizmy C. perfringens i/lub żywotne spory C. perfringens, w tym

na przykład, zanieczyszczoną żywność, glebę, wodę, ściółkę zwierzęcą, odchody i tym podobne.

[0075] Justin i wsp. [Biochemistry 41, 6253-6262 (2002)] scharakteryzowali toksyny alfa z różnych szcze-20

pów C. perfringens, które są niemal identyczne pod względem sekwencji i właściwości biochemicznych.

Jednakże Justin i wsp. opisują również szczep, który został wyizolowany ze źródła ptasiego (łabędzia), który

EP 2 007 420 B1

17

miał toksynę alfa wykazującą duży stopień zmienności sekwencji i zmienioną specyficzność substratową w

porównaniu z innymi szczepami. Z tego powodu uważa się, że większość izolatów będzie, po przekształce-

niu w postać atenuowaną, wzbudzać ochronną odporność na toksynę alfa z wielu innych szczepów C. per-

fringens występujących naturalnie. Niemniej jednak, z uwagi na możliwość różnic w toksynie alfa między

izolatami, często korzystne będzie izolowanie i atenuacja organizmów C. perfringens z gatunków zwierząt, 5

dla których pożądana jest szczepionka anty-C. perfringens. Izolat przedstawiony przykładowo poniżej został

wyizolowany od kury i badany w tym gatunku.

Szczepionki

10

[0076] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku zwykle formułuje się jako farmaceutycznie

dopuszczalne kompozycje szczepionkowe. Kompozycje szczepionkowe formułuje się zgodnie z drogą po-

dawania i są one kompatybilne z aktywnym czynnikiem antygenowym. Aktywnym czynnikiem antygenowym

jest, na przykład, jeden lub więcej szczepów atenuowanych organizmów C. perfringens typu A według wyna-

lazku. Ewentualnie, kompozycja szczepionkowa może również zawierać jeden lub więcej typów nietoksycz-15

nego białka toksyny alfa, w kombinacji z atenuowanymi organizmami C. perfringens typu A.

[0077] Na przykład, zasadniczo wszystkie atenuowane organizmy C. perfringens typu A wchodzące w skład

szczepionki są żywe i żywotne, chociaż w pewnych specyficznych sytuacjach, np. do immunizacji niektórych

ludzi lub zwierząt o upośledzonej odporności, szczepionka będzie zawierać wyłącznie zabite atenuowane

organizmy C. perfringens typu A.20

[0078] Kompozycja szczepionkowa zawiera fizjologicznie kompatybilne bufory i/lub sole, ewentualnie w

kombinacji z adiuwantami i/lub ewentualnymi czynnikami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność

(podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach, np. przed lub po szczepieniu).

[0079] Odpowiednie immunostymulatory obejmują, ale nie wyłącznie, cytokiny, czynniki wzrostu, chemoki-

ny, supernatanty z hodowli komórek limfocytów, monocytów, komórki z narządów limfoidalnych, preparaty 25

komórkowe lub ekstrakty komórkowe (np. Staphylococcus aureus lub preparaty lipopolisacharydowe), mito-

geny lub adiuwanty oraz farmaceutyki o niskiej masie cząsteczkowej. Czynnik immunostymulujący można

podawać in ovo w dowolnym czasie podczas inkubacji. W konkretnym aspekcie, czynnik immunostymulujący

podaje się w pożywce zawierającej atenuowane organizmy C. perfringens typu A.

30

Sposoby podawania szczepionki

[0080] Opisane powyżej szczepionki podaje się, na przykład, przez wstrzyknięcie lub zaszczepienie przez

jedną lub kombinację następujących dróg: doustnie, donosowo, pozajelitowo, podskórne, przez zadrapanie

skóry i/lub podanie domięśniowe, w dowolnej odpowiedniej formulacji znanej w tej dziedzinie, np. w kompa-35

tybilnym buforze i/lub dopuszczalnej fizjologicznie soli, w ewentualnej kombinacji z adiuwantami i/lub czynni-

kami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność (podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach,

np. przed lub po szczepieniu). Dla szczepionek/sposobów szczepienia podawanych doustnie, można łatwo

zastosować dowolny z fizjologicznie odpowiednich buforów lub środków zawieszających, które są znane w

tej dziedzinie. Ponadto, kompozycja może być włączona, np. zmieszana z wodą do picia lub rozpylona na 40

granulki pożywienia, lub posypana lub rozpylona na kukurydzę lub inne ziarna i tym podobne.

EP 2 007 420 B1

18

[0081] Przewód żołądkowo-jelitowy jest częstym miejscem zakażenia C. perfringens, a zatem podawanie

doustne jest rozważane jako jeden ze sposobów inokulacji. Rozważa się możliwość, że obecność żywych

atenuowanych organizmów C. perfringens według wynalazku w przewodzie pokarmowym będzie wywoływać

miejscowe ochronne reakcje odpornościowe zlokalizowane w warstwie błony śluzowej przewodu żołądkowo-

jelitowego i może również działać konkurencyjnie zapobiegając następującej potem kolonizacji C. perfrin-5

gens typu dzikiego.

[0082] Dla ptaków, takich jak drób, w tym kur, kaczek, gęsi, itp., najbardziej przydatnymi drogami szczepie-

nia są sposób doustny lub wstrzykiwanie in ovo. Droga in ovo jest podana jako przykład tu poniżej i daje

aktywną immunizację i ochronę przed prowokacją u wyklutych kurcząt.

10

Ekspresja obcych genów przez C. perfringens

[0083] Stosując techniki opracowane w poprzednich przykładach, dowolny gen niewystępujący naturalnie,

tj., obcy dla C. perfringens, może być ewentualnie wstawiony do chromosomowego DNA C. perfringens. Dla

ekspresji obcych białek, można wytworzyć fuzje genowe, które zabezpieczają sekwencje flankujące gen15

toksyny alfa, promotor toksyny alfa i jej sekwencję sygnałową. W jednym wykonaniu, większość sekwencji

kodującej genu plc jest zastąpiona przez obcy gen. Pozostałe nukleotydy genu plc poniżej wstawionego

genu są poza ramką odczytu, a zatem nie jest wytwarzana funkcjonalna toksyna alfa. Alternatywnie, obcy

gen można wprowadzić w ramce do sekwencji nukleotydowej kodującej muteinę toksyny alfa, tworząc fuzję

białkową toksyna alfa-obce białko.20

[0084] Startery oligonukleotydowe dla obcego genu można zsyntetyzować np. z N-końcową sekwencją

znacznika FLAG i odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi. Produkty PCR można wklonować do wektora

samobójczego; znacznik FLAG i obcy gen są wstawione w ramce z sekwencją sygnałową toksyny alfa. Obce

białko ulega ekspresji pod kontrolą promotora toksyny alfa i jest kierowane do sekrecji przez sekwencję sy-

gnałową plc. Wydzielane obce białko można wykryć w supernatancie hodowlanym przez analizę Western 25

przy użyciu przeciwciała anty-FLAG.

[0085] W ten sposób można wstawić do genomu C. perfringens dowolny odpowiedni obcy gen. Obejmuje

to, na przykład, DNA kodujący antygeny z patogenów przewodu żołądkowo-jelitowego, w tym, np. białka

antygenowe z bakterii, takich jak E. coli, gatunki Salmonella, gatunki Campylobacter, gatunki Lawsonia i tym

podobne; białka antygenowe pasożytów, takich jak gatunki Eimeria, gatunki Isospora, gatunki Cryptospori-30

dium i tym podobne oraz białka antygenowe wirusów, takich jak rotawirusy, koronawirusy i tym podobne, w

celu immunizacji zwierząt traktowanych takim rekombinowanym C. perfringens. Inne białka, które mogą być

wyrażone przez taki rekombinowany C. perfringens obejmują białka lub peptydy terapeutyczne. Ewentualnie,

obejmują one peptydy, które są endogenne dla przewodu żołądkowo-jelitowego, obejmując czynnik trójlistny

lub dowolny typ cytokiny znany w tej dziedzinie, np. kurzą IL-18 i tym podobne.35

[0086] Jeden z takich konstruktów C. perfringens wyraża kurze białko IL-18. Podawanie żywych bakterii

zawierających fuzję genową umożliwi dostarczenie terapeutycznych dawek IL-18 do jelita, będąc jednak

stosunkowo nieszkodliwymi dla zwierzęcia-gospodarza ze względu na brak wytwarzania toksyny alfa. Za

pomocą tego systemu można również uzyskać ekspresję innych środków leczniczych.

[0087] Poniższe konkretne przykłady są włączone dla celów ilustracji i nie mają na celu ograniczenia zakre-40

su wynalazku, o ile nie wskazano, że jest inaczej.

EP 2 007 420 B1

19

Przykład 1WEKTOR W OPARCIU O HOMOLOGIĘ DLA TOKSYNY ALFA C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0088] Wytworzono wektor plazmidowy 1162-55-20 w oparciu o homologię, przydatny w konstrukcji toksyny

alfa C. perfringens z delecjami. Plazmid zawiera wiele ważnych elementów; region replikacji z plazmidu E.

coli pUC18; geny oporności na chloramfenikol (catP) i erytromycynę (ermBP) C. perfringens (obydwa podle-5

gają również ekspresji w E. coli); i gen toksyny alfa (plc) C. perfringens inaktywowany przez konkretną dele-

cję 9 aminokwasów. Plazmid 1162-55-20 został wytworzony w kilku etapach, jak następuje.

[0089] Najpierw sklonowano gen plc z ostatniego ptasiego izolatu C. perfringens (szczepu CP6). Do zapro-

jektowania starterów oligonukleotydowych do zastosowania w klonowaniu genu plc wykorzystano sekwencję

szczepu 13 C. perfringens (GenBank NC 003366, SEK. ID. NR: 2). Te i wszystkie kolejne startery otrzymano10

komercyjnie z Sigma Genosys, Woodlands. Starter sensowny’, położony w obrębie genu yplc (CPE0035),

5’AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEK. ID. NR: 14), odpowiada nukleotydom 47675-47700

szczepu 13 (SEK. ID. NR: 2). Starter antysensowny, położony w obrębie genu cobW (CPE0037),

5'GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEK. ID. NR: 15), jest komplementarny do nukleoty-

dów 50597-50629 szczepu 13. Startery te zastosowano wraz z genomowym DNA ze szczepu CP6 C. per-15

fringens w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o szerokim zasięgu. Produkt o długości 2955 par zasad, od

leżącego po stronie 5’ genu yplc do leżącego po stronie 3’ genu cobW, przewidziano ze znanej sekwencji

szczepu 13 (jak pokazano na Fig. 1). Promotor toksyny alfa, sekwencja sygnałowa i sekwencja kodująca

genu plc (CPE0036) są zawarte w tym fragmencie, tj. między leżącym powyżej genem yplc i leżącym poniżej

3’ genem cob W. Fragment PCR złożony z 2955 par zasad wklonowano następnie do wektora do klonowa-20

nia, pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), otrzymując plazmid 1162-52.1. Z tego fragmentu

określono sekwencję nukleotydową regionu kodującego plc złożonego z 2955 par zasad ze szczepu CP 6

(SEK ID NR: 22, a odpowiedni polipeptyd to SEK. ID. NR: 23) i wykazano, że jest zasadniczo homologiczny

do tego w genie plc ze szczepu 13 C. perfringens (SEK. ID. NR: 2).

[0090] Następnie sklonowano region replikacji E. coli i geny oporności C. perfringens z plazmidu wahadło-25

wego pJIR418 (Sloan i wsp., 1992, Plasmid 27, 207-219; GeneBank M77169)). Plazmid pJIR418 strawiono

enzymami restrykcyjnymi BamHI i SpeI i końce wypełniono przy zastosowaniu polimerazy Klenowa. Ligacja

dużego fragmentu wytworzyła plazmid 1162-45.1 i odtworzyła miejsce restrykcyjne BamHI. Plazmid ten za-

chowuje region replikacji E. coli, ale w przeciwieństwie do pJIR418, nie zawiera początku replikacji C. per-

fringens. Plazmid jest zatem zdolny do autonomicznej replikacji w E. coli, ale nie w C. perfringens.30

[0091] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego 1162-45.1.

Trawienie plazmidu 1162-52.1 BamHI i EcoRI uwolniło fragment złożony z 1742 par zasad zawierający C-

końcową część genu toksyny alfa, od unikatowego miejsca BamHI znajdującego się w obrębie genu plc

poprzez leżący poniżej gen cobW do miejsca EcoRI znajdującego się w miejscu wielokrotnego klonowania

zgrupowaniu miejsc do klonowania plazmidu rodzicielskiego. Fragment złożony z 1742 par zasad wklono-35

wano między miejscami BamHI i EcoRI położonymi w obrębie miejsc wielokrotnego klonowaniaplazmidu

1162-45.1. W uzyskanym plazmidzie 1162-53.7, C-końcowa połowa genu plc jest w tej samej orientacji tran-

skrypcyjnej co geny catP i ermBP plazmidu rodzicielskiego.

[0092] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc wklonowano do unikatowego miejsca BamHI pla-

zmidu 1162-53.7. Osiągnięto toprzez utworzenie fragmentu PCR pochodzącego z genu toksyny alfa, sub-40

klonowanego w plazmidzie 1162-52.1. Starter sensowny, 5' ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC

3' (SEK. ID. NR: 16), był identyczny z wcześniej wymienionym starterem yplc (SEK ID NR: 4), z tą różnicą,

EP 2 007 420 B1

20

że włączono flankujące miejsce BamHI (małe litery). Starter antysensowny, położony w obrębie genu toksy-

ny alfa, 5' ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEK. ID. NR: 17), był komplemen-

tarny do nukleotydów 48824-48857 szczepu 13 i zawierał flankujące miejsce restrykcyjne BamHI i łącznik

nukleotydowy dla zachowania ramki odczytu (małe litery). Fragment BamHI powstały w reakcji PCR z zasto-

sowaniem tych starterów i matrycy DNA plazmidu 1162-52-1 wklonowano w unikatowym miejscu BamHI 5

plazmidu 1162-53.7. Wyizolowano plazmid zawierający dwa regiony genu plc w tej samej orientacji tran-

skrypcyjnej. Ten plazmid, 1162-55.20, zawiera gen plc z pożądaną dziewięcioaminokwasową delecją i do-

daniem reszty Leu między Ala 61 i Asp 71 toksyny typu dzikiego (patrz Fig. 2). Sekwencjonowanie DNA

plazmidu potwierdziło ramkę odczytu i usunięcie w sumie 24 kodonów (kodujących osiem reszt aminokwa-

sowych).10

PRZYKŁAD 2KONSTRUKCJA REKOMBINOWANEGO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CPERF001

[0093] Wersję genu plc z delecją, skonstruowaną w Przykładzie 1, wprowadzono do C. perfringens stosując

następującą strategię. Wektor w oparciu o homologię 1162-55.20 jest nazwany „plazmidem samobójczym”15

C. perfringens, ponieważ jego początek replikacji w C. perfringens został usunięty.

[0094] Gdy tym plazmidem transformowano C. perfringens, nie był on zdolny do replikacji i nie przeżywał.

Jednak, jeśli transformowane bakterie poddaje się selekcji na chloramfenikol i/lub erytromycynę, można

forsować rekombinację plazmidowego DNA z genomem bakterii przez homologię z genem plc. Uzyskana

rekombinowana bakteria jest nazywana integrantem. Integrant zawierał kopię wprowadzonego wektora w 20

poparciu o homologię, który został włączony w locus genu plc. A zatem, otrzymany w rezultacie integrant

zawierał dwie kopie genu plc, prawidłową kopię oryginalną i wprowadzoną wersję z delecją. Wprowadzone

geny oporności znajdowały się między dwiema kopiami genu plc. Po usunięciu selekcji antybiotykowej

względem integranta, nastąpiła rekombinacja między dwiema kopiami genu plc. To zdarzenie rekombinacji

może dawać jeden z dwóch wyników. W obydwu przypadkach, DNA wstawiony między dwie kopie genu plc25

(w tym geny oporności) został usunięty. Jako pierwszy wynik, odtworzony został prawidłowy gen plc, co pro-

wadzi do odzyskania wyjściowego szczepu rodzicielskiego. Jako drugi wynik, prawidłowy gen plc jest zastą-

piony przez kopię z delecją, co daje żądany konstrukt toksyny alfa z delecją. Ponieważ toksyna alfa ze

szczepu z delecją jest inaktywowana, ten szczep był niehemolityczny. Dlatego żądany integrant z delecją był

identyfikowany przez przeszukiwanie pod kątem klonów niehemolitycznych na płytkach agarowych z krwią.30

[0095] Ponieważ spodziewano się, że zdarzenie rekombinacji skutkujące żądanym integrantem wystąpi z

niską częstością, kluczowe było zastosowanie szczepu rodzicielskiego C. perfringens mającego wysoką

wydajność transformacji. Dlatego kilka ostatnich izolatów ptasich C. perfringens analizowano pod kątem

wydajności transformacji. Izolaty transformowano plazmidem wahadłowym pJIR418, jak zostało opisane

przez Allena i Blascheka (Applied and Environmental Microbiology 54:2322 (1988)), z niewielkimi modyfika-35

cjami (opisanymi poniżej). Szczep 1240 wykazał najwyższą wydajność transformacji (patrz Tabela 1), 9,2 x

106 transformantów/µg DNA plazmidu pJIR418. Szczep ten został wybrany jako szczep rodzicielski do kon-

strukcji szczepu z delecją CPERF001. Szczep 29 został wybrany jako szczep rodzicielski dla CPERF002.

40

EP 2 007 420 B1

21

Tabela 1Wydajność transformacji dla ptasich izolatów C. perfringens

Szczep A C. perf. Transformanty/µg pJIR418

29 3,6 x 104

23 5,6 x 102

1220 4,0 x 108

1240 9,2 x 106

CP-2 Żadnych1230 7,1 x 103

5227 Żadnych5230 Żadnych

Źródłem wyżej wymienionych szczepów typu dzikiego była dr J. Glenn Songer, Dept. of Veterinary Scien-ces and Microbiology,University of Arizona, Tucson, Arizona 85721

[0096] Komórki szczepu 1240 C. perfringens z całonocnej hodowli beztlenowej w pożywce TSYC (30 g/l

bulionu sojowego (Tryptic Soy Broth), 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,5 g/l cysteiny) rozcieńczano 1:25 i ho-

dowano do A600= 0,5436. Po odwirowaniu 100 ml komórek przy 18000 x g przez 10 minut, przygotowano

komórki elektrokompetentne przez dwukrotne zawieszenie komórek w równej objętości wstępnie zreduko-5

wanej sacharozy w buforze - fosforanie magnezowym („SMP” wytworzono jako 270 mM sacharoza, 1 mM

MgCl2, 7 mM NaPO4, pH 7,3), a następnie zawieszono ostatecznie w 0,5 ml SMP. Doprowadziło to do koń-

cowej objętości około 2,0 ml.

[0097] Próbki 100 µl komórek poddano elektroporacji przy użyciu 4 µg plazmidu 1162-55.20 w 0,2 cm kuwe-

tach. Zastosowano Bio-Rad Gene Pulser II przy 1,37 kilowoltach, 100 omach oporu i 50 mikrofaradach po-10

jemności. Natychmiast po elektroporacji komórki rozcieńczono w 2,0 ml wstępnie zredukowanej pożywki z

trypsynizowanym ekstraktem sojowym, drożdżowym, z cysteiną („TSYC” wytwarza się jako 30 g bulionu

tryptozowo-sojowego, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g cysteiny, 950 ml wody) i inkubowano przez trzy

godziny w temperaturze 37°C, w beztlenowym słoju. Po okresie regeneracji, rozcieńczone komórki wysie-

wano na płytki z TSYC + 25 μg/ml chloramfenikolu. Płytki te inkubowano w temperaturze 37°C przez noc w 15

beztlenowym słoju.

[0098] Po wzroście przez noc, zaobserwowano średnio 50 kolonii odpornych na chloramfenikol na mikro-

gram DNA 1162-55.20. Pojedyncze kolonie siedmiu domniemanych integrantów hodowano w pożywce nie-

selekcyjnej TSYC w czterech kolejnych hodowlach i wysiewano na nieselekcyjne płytki agarowe z krwią.

Jedna z niepoddawanych selekcji partii, 1192-31.7, wykazywała obecność kilku kolonii niehemolitycznych. 20

Dwadzieścia jeden z tych kolonii niehemolitycznych przeniesiono na nieselektywne płytki wzorcowe i i wyko-

nano replikę na płytkach TSYC + chloramfenikol. Dwie z 21 kolonii były wrażliwe na chloramfenikol.

[0099] Jeden z wrażliwych na chloramfenikol domniemanych klonów z delecją, 1192-32.14, hodowano rów-

nolegle ze szczepem dzikim 1240 i integrantem 1192-31.7 i wysiewano na płytki agarowe z krwią. Szczep

typu dzikiego 1240 wykazał wyraźne strefy hemolizy beta, natomiast szczep z delecją 1192-32.14 był czystą25

hodowlą kolonii niehemolitycznych i został przemianowany na CPERF001.

[0100] Inne płytki z krwią zastosowano jako płytki wzorcowe i repliki dla pożywki selekcyjnej i nieselekcyjnej.

Szczepy, dziki i CPERF001, były wrażliwe na chloramfenikol i erytromycynę. Integrant, 1192-31.7, był opor-

ny zarówno na chloramfenikol, jak i erytromycynę, zgodnie z oczekiwaniem.

EP 2 007 420 B1

22

[0101] Aby wykluczyć możliwość, że geny oporności na antybiotyki były obecne, ale nie podlegały ekspresji

w CPERF001, zsyntetyzowano startery specyficzne dla genów, chloramfenikolowego i erytromycynowego,

do zastosowania w reakcjach PCR. Genomowe DNA wytworzono ze szczepu typu dzikiego, integranta i

CPERF001 i zastosowano jako matryce do reakcji PCR ze starterami genów antybiotykowych. Wyniki anali-

zy PCR wykazały reakcję dodatnią tylko dla plazmidu samobójczego i integranta, a nie rodzicielskiego 1240 5

lub szczepu z delecją CPERF001. Potwierdza to przewidywaną utratę sekwencji genów oporności.

[0102] Aby potwierdzić delecję w obrębie genu toksyny alfa, region 1086 bp otaczający delecję amplifiko-

wano przez PCR stosując odpowiednie startery specyficzne dla toksyny alfa. Amplifikowany fragment sklo-

nowano i zsekwencjonowano. Wyniki sekwencjonowania potwierdziły delecję dziewięciu aminokwasów od

Tyr 62 do Trp 70 z genu toksyny alfa i wprowadzenie pojedynczej Leu (patrz Fig. 2A-2C).10

[0103] CPERF001 badano pod kątem ekspresji inaktywowanego białka anatoksyny alfa. Po 6 godzinach

wzrostu beztlenowego 1 ml próbki komórek zebrano i odwirowano. Piętnaście mikrolitrów niezatężonej po-

żywki z supernatantów analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym i poddano analizie We-

stern z zastosowaniem króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko rekombinowanemu

białku toksyny alfa (Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)). Wyniki pokazały reaktywność swoistego przeciwcia-15

ła z białkiem o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.

[0104] CPERF001 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-

cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep

ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie

przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.20

PRZYKŁAD 3KONSTRUKCJA REKOMBINOWANEGO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CPERF002[0105] W celu skompensowania niższej wydajności transformacji szczepu 29 C. perfringens (patrz Tabela 1,

powyżej) skonstruowano nowy wektor w oparciu o homologię. Nowy wektor zawierał sekwencje C. perfrin-25

gens sklonowane bezpośrednio z genomu szczepu 29. Przewidywano, że będzie to skutkowało bardziej

wydajnym etapem rekombinacji. Nowy wektor, 1192-38.3, wytworzono jak następuje.

[0106] W pierwszym etapie region replikacyjny E. coli i geny oporności C. perfringens sklonowano z plazmi-

du wahadłowego pJIR418 (Sloan i wsp., Plasmid 27, 207 (1992); GeneBank M77169). Plazmid pJIR418

strawiono enzymem restrykcyjnym NdeI. Ligacja dużego fragmentu dała plazmid 1192-23.1. Plazmidowi 30

temu brakuje początku replikacji C. perfringens, ale w przeciwieństwie do plazmidu 1162-45.1, który został

skonstruowany w Przykładzie 1, zachowuje całe miejsce wielokrotnego klonowania z pJIR418.

[0107] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego 1192-23.1.

Genomowy DNA ze szczepu 29 zastosowano jako matrycę do PCR o szerokim zasięgu. Amplifikowano

region genu plc (toksyny alfa) od miejsca BamHI przez część genu CPE0038. Starter sensownydla plc, 5’35

CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEK. ID. NR: 18), odpowiada nukleotydom

48880-48916 szczepu 13 (GenBank NC003366). Starter antydensowny w obrębie genu CPE0038, 5’

actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC 3’ (SEK. ID. NR: 19) jest komplementarny do nukle-

otydów 51244-51275 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące, obejmujące miejsce restrykcyjne PstI (ma-

łe litery). Otrzymano produkt złożony z 2402 par zasad i strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i PstI. 40

Fragment ten poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-23.1 strawionego BamHI i PstI, z wytworzeniem

plazmidu 1192-36.10.

EP 2 007 420 B1

23

[0108] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc sklonowano przez PCR. Starter sensowny, 5’ act-

gagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3’ (SEK. ID. NR: 20) jest komplementarny do nukleotydów

46513-46540 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce SacI (małe litery). Starter antysensowny,

5’ actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3’ (SEK. ID. NR: 21) jest komplementarny do

nukleotydów 48824-48855 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce BamHI. Wytworzono pro-5

dukt złożony z 2363 par zasad i strawiono go enzymami restrykcyjnymi SacI i BamHI. Strawiony fragment

poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-36.10 strawionego SacI i BamHI, z wytworzeniem plazmidu

1192-38.3. Przeprowadzone następnie sekwencjonowanie regionu flankującego miejsce BamHI w plc w

1192-38.3 potwierdziło delecję dziewięciu aminokwasów od Tyr 62 do Trp 70.

[0109] Plazmid 1192-38.3 użyto do elektroporacji komórek szczepu 29 C. perfringens. Wykazano uprzed-10

nio, że szczep 29 daje się transformować z wydajnością 3,6 x 104 transformantów/µg DNA plazmidu

pJIR418. Szczep 29 hodowano i poddano elektroporacji, jak w Przykładzie 2, z tą różnicą, że zastosowano

technikę selekcji płynnej po okresie trzech godzin regeneracji. Zamiast wysiewania, 0,67 ml próbki komórek

rozcieńczano w 12 ml TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i hodowano przez noc w 37°C w beztlenowym słoju.

Zastosowano tę modyfikację ze względu na niższą wydajność transformacji i wysiewania szczepu 29 w sto-15

sunku do 1240. Po wzroście przez noc, komórki rozcieńczono ponownie w pożywce selekcyjnej. Komórki z

drugiej hodowli pasażowano następnie pięciokrotnie bez selekcji przed wysianiem na płytki agarowe z krwią.

Żadna z kolonii z płytek agarowych z krwią nie była niehemolityczna. Dwie płytki z krwią wysiano metodą

replik na płytki TSYC, TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i TSYC + 50 µg/ml erytromycyny. Wszystkie kolonie

były wrażliwe na erytromycynę, ale tylko jedna z 130 kolonii była wrażliwa na chloramfenikol. Ta kolonia, 20

1192-45.4B została przemianowana na CPERF002. Analiza PCR genomowego DNA z CPERF002 ze starte-

rami specyficznymi dla toksyny alfa wykazały dodatni prążek dla toksyny alfa. Ten prążek był mniejszy niż

odpowiadający mu prążek z DNA szczepu 29 typu dzikiego. Startery specyficzne dla genów oporności na

chloramfenikol i na erytromycynę nie amplifikowały DNA CPERF002, ale wykazywały silne pozytywne prążki

z plazmidu 1192-38.3. Sekwencjonowanie alfa-toksyny CPERF002 potwierdziło dziewięcioaminokwasową25

delecję (patrz Fig. 3).

[0110] CPERF002 badano pod kątem ekspresji białka inaktywowanej anatoksyny alfa. Po 6 godzinach

wzrostu beztlenowego próbki 1 ml komórek zebrano i odwirowano. Piętnaście mikrolitrów niezatężonej po-

żywki z supernatantów analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym i poddano analizie We-

stern z zastosowaniem króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko rekombinowanemu30

białku toksyny alfa (Vaccine 11: 1253 (1993)). Wyniki wykazały swoistą reaktywność przeciwciała z białkiem

o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.

[0111] CPERF002 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-

cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep

ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie on 35

przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą wywoływaną przez C. perfringens.

PRZYKŁAD 4SZCZEPIONKI Z C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0112] Szczepy szczepionkowe z delecją, CPERF001 i CPERF002, opisane w Przykładach 2 i 3, oceniano40

pod kątem ich zdolności do dostarczania ochrony przed prowokacją C. perfirngens typu dzikiego. Pierwszą

część badań zaprojektowano w celu określenia, czy podawanie żywych szczepów szczepionkowych ma

EP 2 007 420 B1

24

jakikolwiek negatywny wpływ na wykluwalność z jaj z zarodkami. Przyporządkowanie grup doświadczalnych

i wyniki bezpieczeństwa są opisane w Tabeli 2.

TABELA 2WYNIKI BEZPIECZEŃSTWA

Grupa* Szczepionka (dawka) ** Liczba jaj podlegających wykluciu (%)1 CPERF001 (0,8 x 102)X 18 (90%)2 CPERF001 (0,8 x 103) 17 (85%)3 CPERF001 (0,8 x 104) 11 (55%)4 CPERF001 (0,8 x 105) 16 (80%)5 CPERF002 (1,9 x 102) 16 (80%)6 CPERF002 (1,9 x 102) 17 (85%)7. CPERF002 (1,9 x 104) 14 (70%)8 CPERF002 (1,9 x 105) 12 (60%)9 Szczep 1240 (1,5 x 103) 16 (80%)10 Szczep 29 (3,7 x 103) 13 (65%)11 Kontrole dla pożywki 19 (95%)12 Kontrole niezainkulowane 18 (90%)

* 20 jaj na grup** Dawka 100 µl podawana in ovo w 18 dniu rozwoju zarodka (IM)x Miano na dawkę jest mierzone jako jednostki tworzące kolonie („cfu”)

[0113] Przy dawce 103 lub mniejszej (grupy 1, 2, 5 i 6), wykluwalność w tych grupach nie była znacząco 5

niższa niż w grupie zaszczepionej tylko pożywką (grupa 11) lub w grupie, która nie została zaszczepiona

(grupa 12). Przy najniższej dawce CPERF001 wykazywał tę samą wykluwalność co kontrola z pożywką i

lepszą niż niezaszczepiona grupa kontrolna.

[0114] Ponieważ wyższe dawki szczepów z delecją mogłyby mieć niekorzystny wpływ na wykluwalność jaj,

tylko dwie najniższe grupy dawkowania dla każdego szczepu z delecją włączono do części badania pod 10

kątem skuteczności. Te grupy, razem z ptakami z kontroli dla pożywki (grupa 11), prowokowano szczepem

CP6 C. perfringens (typu dzikiego), który był podawany doustnie w ilości 108 cfu/ml/ptaka, gdy ptaki były w

wieku 20, 21 i 22 dni. Wszystkie ptaki zostały poddane sekcji w 25 dniu życia i zmiany w jelicie cienkim oce-

niano przy zastosowaniu skali ocen dla martwiczego zapalenia jelit (NE, ang. necrotic enteritis) zestawionych

poniżej. 15

Wynik 0 Martwicze zapalenie jelit1+

Martwicze zapale-nie jelit

2+

Martwicze zapalenie jelit3+

Martwicze zapa-lenie jelit

4+Brak dużych zmian NE wjelicie cienkim;jelito ma pra-widłową ela-styczność (samo zwijasię z powro-tem na po otwarciu).

Cienka i wiotka ścia-na jelita (jelito pozo-staje płaskie po otwarciu i nie zwijasię z powrotem do normalnej pozycji);nadmiar lub zagęsz-czony śluz pokrywa-jący błonę śluzowąlub ogniskowe albowieloogniskowe ła-godne zaczerwienie-nie śluzówki lub przekrwienie naczyńbłony surowiczej.

Pojedyncze lub kilka wieloognisko-wych obszarówzaczerwienienia i obrzęku ściany jelita; jedno lub kilka wieloognisko-wych obszarów owrzodzenia lubmartwicy błony śluzowej jelita.

Rozległe wieloogni-skowe obszary mar-twicy i owrzodzenia błony śluzowej jelita ± znaczne krwawie-nie lub warstwa fibry-ny lub szczątkówmartwiczych na po-wierzchni błony ślu-zowej (wygląd ręcz-nika tureckiego).

Martwe zwierzę z dużymi zmianami NE z wynikiem 2+ lub wyższym.

Ocena wyniku z niewielkimi modyfikacjami jest według Charlesa Hofacre, DVM, MAM, Ph.D., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602.

EP 2 007 420 B1

25

[0115] Pięć (5) ptaków z nieszczepionej grupy kontrolnej (nie prowokowanej) poddano sekcji na zakończe-

nie badania, aby potwierdzić, że nie było w ekspozycji na C. perfringens w trakcie badania. Wyniki są przed-

stawione w Tabeli 3.

TABELA 3

GRUPY TRAKTOWANIA DLA OCHRONY* WYNIKIGrupa* Szczepionka Dawka szczepionki in-

ovo (cfu)Dni życia przy prowokacji C.

perfringens N Średnia

1 CPERF001 1x102 20, 21 i 22 9 0,672 CPERF001 1x103 20, 21 i 22 13 0,465 CPERF002 1x102 20, 21 i 22 12 1,336 CPERF002 1x103 20, 21 i 22 12 1,08

11 Kontrola dla po-żywki

Żadna 20, 21 i 22 15 1,80

12 Żaden Żadna Nie prowokowana 5 0,00* Sekcja zwłok w 25 dniu życia

5

[0116] Wyniki dla grup 1 i 2 były znacząco statystycznie niższe w porównaniu z grupą 11 (test kolejności par

Wilcoxona p≤0,0250). Średnie wyniki dla Grup 5 i 6 były niższe niż dla Grupy 11, ale nie różniące się staty-

stycznie (test sumy rang Wilcoxona p≥0,2177). Ocenę skuteczności szczepionki przeprowadzono zgodnie z

procedurą opisaną przez David Siev [Journal of Modern Applied Statistical Methods Tom. 4, nr 2, 500-508

(2005)]. Skuteczność szczepionki w zmniejszaniu ciężkości choroby oceniono na 54% dla Grupy 1, 65% dla 10

Grupy 2, 20% dla Grupy 5 i 27% dla Grupy 6, w porównaniu z Grupą 11.

Przykład 5KONSTRUKCJA ŚWIŃSKIEGO C. PERFRINGENS Z DELECJĄ

15

[0117] Strategie zastosowane w Przykładach 1 i 2, jak wyżej, stosuje się do konstruowania mutantów dele-

cyjnych toksyny alfa ze świńskich szczepów C. perfringens. Początkowo, izolaty polowe od chorych świń

poddaje się elektroporacji z plazmidem pJIR418, aby ocenić ich zdolność do transformacji. Izolaty dające

≥104 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i wrażliwe bądź na chloramfenikol, bądź erytromycy-

nę są kandydatami dla delecji.20

[0118] Genomowy DNA ze szczepów – kandydatów stosuje się jako matrycę dla PCR o dużym zasięgu dla

genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących. Po subklonowaniu produktów PCR, gen toksyny alfa i re-

giony flankujące sekwencjonuje się i mapuje restrykcyjnie. Syntetyzuje się nowe startery oligonukleotydowe

z flankującymi miejscami restrykcyjnymi i produkty dwóch oddzielnych amplifikacji klonuje się w plazmidzie

samobójczym 1192-23.1 w celu wytworzenia delecji 27 par zasad, jak w Przykładzie 1.25

[0119] Świński wektor samobójczy wprowadza się przez elektroporację do odpowiedniego świńskiego

szczepu C. perfringens i izoluje się mutanty delecyjne przy zastosowaniu metod opisanych w Przykładzie 2,

powyżej. Mutanty delecyjne potwierdza się brakiem hemolizy beta na płytkach agarowych z krwią i przez

sekwencjonowanie DNA genu toksyny alfa.

[0120] Ten konstrukt jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens Typu A z 30

delecją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ

ten szczep ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje jeszcze znaczną część antygenowości

toksyny, jest przydatny jako szczepionka do ochrony świń przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.

EP 2 007 420 B1

26

DEPOZYT BIOLOGICZNY

[0121] Hodowle z następujących materiałów biologicznych zostały zdeponowane w następującym między-

narodowym depozycie:

[0122] American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 5

USA, w warunkach, które spełniają wymogi Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznawaniu

depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego.

Organizm Nr dostępu Daty złożenia depozytu

Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 PTA7364 7 lutego 2006

Clostridium perfringens CPERF/ΔαtToxin 365-053 PTA7365 7 lutego 2006

Lista sekwencji10[0123]<110> Cochran, Mark Lair, Steven Synenki, Richard Petersen, Gary

<120> REKOMBINOWANE ATENUOWANE ORGANIZMY CLOSTRIDIUM I SZCZEPIONKA15

<130> AH06175

<150> 60/792,553<151> 2006-4-17

20<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 125<211> 398<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens

<400> 130

EP 2 007 420 B1

27

EP 2 007 420 B1

28

<210> 2<211> 11975<212> DNA<213> Szczep 13 Clostridium perfringens

<400> 2

EP 2 007 420 B1

29

<210> 3<211> 3705<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens

<400> 310

EP 2 007 420 B1

30

<210> 45<211> 39<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 410

aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct 39

EP 2 007 420 B1

31

<210> 5<211> 13<212> PRT<213> Oligopeptyd

5<400> 5

<210> 610<211> 14<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 615

aatgcattgg atcc 14

<210> 7<211> 420<212> PRT<213> Oligopeptyd

<400> 725

<210> 8<211> 15<212> DNA30<213> Oligonukleotyd

<400> 8

aatgcattgg atcct 1535

<210> 9<211> 5<212> PRT<213> Oligopeptyd40

<400> 9

45<210> 10<211> 14<212> DNA<213> Oligonukleotyd

50<400> 10

aatgcggatc cagt 14

<210> 1155<211> 4<212> PRT<213> Oligopeptyd

<400> 1160

<210> 12<211> 1265<212> DNA<213> Oligonukleotyd

EP 2 007 420 B1

32

<400> 12

aatgcggatc ct 125

<210> 13<211> 4<212> PRT<213> Oligopeptyd

10<400> 13

<210> 1415<211> 26<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 1420

agctgcataa gcaaaagttc caactc 26

<210> 15<211> 3325<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 1530

gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc 33

<210> 16<211> 32<212> DNA35<213> Oligonukleotyd

<400> 16

ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 3240

<210> 17<211> 41<212> DNA<213> Oligonukleotyd45

<400> 17

ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 4150

<210> 18<211> 37<212> DNA<213> Oligonukleotyd

55<400> 18

ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37

<210> 1960<211> 40<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 1965

actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 40

EP 2 007 420 B1

33

<210> 20<211> 37<212> DNA<213> Oligonukleotyd

5<400> 20

actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 37

<210> 2110<211> 41<212> DNA<213> Oligonukleotyd

<400> 2115

actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41

<210> 22<211> 119720<212> DNA<213> Szczep CP6Clostridium perfringens

<400> 2225

<210> 2330<211> 398<212> PRT<213> Szczep CP6 Clostridium perfringens

<400> 2335

EP 2 007 420 B1

34

EP 2 007 420 B1

35

5LISTA SEKWENCJI

[0124]<110> Cochran, Mark D10Petersen, Gary RLair, Stephen VSynenki, Richard M

<120> Rekombinowane atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka15

<130> AH06175WO

EP 2 007 420 B1

36

<140> PCT/US2007/009135<141> 2007-04-12

<150> US 60/792,5535<151> 2006-04-17

<160> 23

<170> PatentIn version 3.410

<210> 1<211> 398<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens15

<400> 1

EP 2 007 420 B1

37

<210> 2<211> 11975<212> DNA<213> Szczep 13 Clostridium perfringens

<400> 210

EP 2 007 420 B1

38

<210> 3<211> 3705<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens

<400> 310

EP 2 007 420 B1

39

<210> 45<211> 39<212> DNA<213> Clostridium perfringens

<400> 410aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct 39

<210> 5<211> 13

EP 2 007 420 B1

40

<212> PRT<213> Clostridium perfringens

<400> 55

<210> 6<211> 14<212> DNA10<213> Sztuczna

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

15<400> 6

aatgcattgg atcc 14

<210> 720<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna

<220>25<223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie

<400> 7

30

<210> 8<211> 15<212> DNA<213> Sztuczna35

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 840

aatgcattgg atcct 15

<210> 9<211> 545<212> PRT<213> Sztuczna

<220><223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie 50

<400> 9

55<210> 10<211> 14<212> DNA<213> Sztuczna

60<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 1065

aatgcggatc cagt 14

EP 2 007 420 B1

41

<210> 11<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna

5<220><223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie

<400> 1110

<210> 12<211> 12<212> DNA15<213> Sztuczna

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

20<400> 12

aatgcggatc ct 12

<210> 1325<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna

<220>30<223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie

<400> 13

35

<210> 14<211> 26<212> DNA<213> Sztuczna40

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 1445

agctgcataa gcaaaagttc caactc 26

<210> 15<211> 3350<212> DNA<213> Sztuczna

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie55

<400> 15

gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc 3360

<210> 16<211> 32<212> DNA<213> Sztuczna

65<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

EP 2 007 420 B1

42

<400> 16

ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 32

<210> 175<211> 41<212> DNA<213> Sztuczna

<220>10<223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 17

ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 4115

<210> 18<211> 37<212> DNA<213> Sztuczna20

<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 1825

ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37

<210> 19<211> 4030<212> DNA<213> Sztuczna

<220><223> Zsyntetyzowana chemicznie35

<400> 19

actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 4040

<210> 20<211> 37<212> DNA<213> Sztuczna

45<220><223> zsyntetyzowana chemicznie

<400> 2050

actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 37

<210> 21<211> 41<212> DNA55<213> Sztuczna

<220><223> Zsyntetyzowana chemicznie

60<400> 21

actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41

<210> 2265<211> 1197<212> DNA<213> Szczep CP6 Clostridium perfringens

<400> 2270

EP 2 007 420 B1

43

<210> 23<211> 3985<212> PRT<213> Szczep CP6 Clostridium perfringens

<400> 23

EP 2 007 420 B1

44

EP 2 007 420 B1

45

Zastrzeżenia patentowe5

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium

perfringens, przy czym muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus 9

kolejnych reszt aminokwasowych rozciągających się od Tyr62 do Trp70.

2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, która koduje muteinę, przy czym te usunięte dziewięć

kolejnych aminokwasów jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową.10

3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego z SEK.

ID. NR: 2, w której nukleotydy 268-294 cząsteczki kwasu nukleinowego są usunięte.

4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 3, w której usunięte nukleotydy są zastąpione przez se-

kwencję nukleotydową kodującą pojedynczą resztę Leu.

5. Zasadniczo nietoksyczna muteina toksyny alfa Clostridium perfringens, która zawiera sekwencję amino-15

kwasową z SEK. ID. NR: 3 minus dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciągających się od Tyr62 do

Trp70.

6. Zasadniczo nietoksyczna muteina toksyny alfa Clostridium perfringens według zastrz. 5, w której dziewięć

kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych i zastąpionych przez pojedynczą resztę Leu.

7. Zasadniczo nietoksyczny atenuowany organizm Clostridium perfringens uzyskany przez włączenie czą-20

steczki kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrz. 1 - 4 do chromosomu nieatenuowanego organizmu

Clostridium perfringens.

8. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 7, w którym cząsteczka kwasu nukleinowe-

go znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukle-

inowego kodującego toksynę alfa typu dzikiego obecną w nieatenuowanym Clostridium perfringens.25

9. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 7 albo zastrz. 8, którym jest Clostridium

perfringens typu A.

EP 2 007 420 B1

46

10. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 - 9, przy czym nieatenu-

owany Clostridium perfringens, z którego został uzyskany atenuowany organizm wyizolowano ze zwierzęcia

- gospodarza, którym jest albo ssak albo ptak.

11. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 10, przy czym ssak ten jest wybrany z

grupy składającej się z bydła, owiec i świń.5

12. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 10, przy czym ptakiem tym jest kura, indyk,

gęś, kaczka, łabędź, gołąb, głuszec lub kuropatwa.

13. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 - 12, który zawiera co naj-

mniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens.

14. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 13, w którym polipeptyd nie z Clostridium 10

perfringens jest polipeptydem niebakteryjnym.

15. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 14, w którym polipeptydem niebakteryjnym

jest polipeptyd ptasi lub ssaczy.

16. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 15, w którym polipeptydem niebakteryjnym

jest polipeptyd ptasi.15

17. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 15, w którym polipeptydem niebakteryjnym

jest cytokina.

18. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 17, w którym cytokiną jest kurza IL-18.

19. Atenuowany Clostridium perfringens, jak określono w poprzednich zastrz. 7 - 18, do zastosowania jako

szczepionka w sposobie wywoływania odporności na choroby powodowane przez zakażenie Clostridium 20

perfringens u zwierząt, przy czym ten atenuowany Clostridium perfringens podaje się w dawce skutecznej

immunologicznie.

20. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest do

podawania drogą doustną, domięśniową, dożylną, śródskórną, podskórną lub donosową.

21. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest 25

podawana na wierzchu paszy dla zwierzęcia.

22. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest do

podawania jako spray dla zwierząt w celu jej doustnego dostarczania .

23. Organizm Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-054 o numerze depozytu ATCC

PTA7364.30

24. Organizm Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-053 o numerze depozytu ATCC

PTA7365.

25. Szczepionka zawierająca atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 -

18, 23 albo 24.

26. Szczepionka według zastrz. 25, zawierająca ponadto jedną lub więcej z następujących: farmaceutycznie 35

dopuszczalny bufor, substancję pomocniczą lub adiuwant.

27. Pasza dla zwierząt, która zawiera szczepionkę według zastrz. 25 albo 26.

40

EP 2 007 420 B1

47

EP 2 007 420 B1

48

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

EP 2 007 420 B1

49

ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

SEK

. ID

. NR

:SE

K. I

D. N

R:

EP 2 007 420 B1

50

Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona

części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką staranno-

ścią, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EUP nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym wzglę-

dzie.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

Literatura niepatentowa cytowana w opisie