RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1713934

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 11.02.2005 05708322.2 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 02.03.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/09 EP 1713934 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Oznaczanie oporności na TB

PL/E

P 17

1393

4 T3

(30) Pierwszeństwo:

11.02.2004 GB 0403039

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

25.10.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/43

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

29.07.2011 Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/07

(73) Uprawniony z patentu:

Health Protection Agency, London, GB

(72) Twórca(y) wynalazku:

Timothy BROWN, London, GB

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska

PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O.O. SKR. POCZT. 37 02-770 Warszawa 130

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 1 713 934 B1

1

Opis

[0001] Wynalazek ten dotyczy oznaczenia diagnostycznego dla wielolekoopornej Mycobacterium sp. , w

szczególności Mycobacterium tuberculosis i odczynników i zestawów do tego celu.

5

[0002] Mycobacterium tuberculosis i blisko spokrewnione gatunki tworzą małą grupę mykobakterii znanych

jako kompleks Mycobacterium tuberculosis (- MTC). Ta grupa obejmuje pięć gatunków - M. tuberculosis, M.

microti, M. bovis, M. caneti i M. africanum – które są czynnikiem sprawczym w większości przypadków zaka-

żeń Mycobacterium tuberculosis (TB) na świecie.

10

[0003] M. tuberculosis jest odpowiedzialna za ponad trzy miliony zgonów rocznie na świecie. WHO szacuje,

że aż jedna trzecia populacji na świecie jest zakażona Mycobacterium tuberculosis i globalnie ktoś umiera

na TB co 15 sekund. Inne mykobakterie też są patogenne u człowieka i zwierząt, na przykład, M. avium

subsp. paratuberculosis, która wywołuje chorobę Johne'a u przeżuwaczy, M. bovis która wywołuje gruźlicę u

bydła, M. avium i M. intracellulare, które wywołują gruźlicę u pacjentów z upośledzonym układem odporno-15

ściowym (np. pacjenci z AIDS i pacjenci po przeszczepie szpiku kostnego) i M. leprae, która powoduje trąd u

ludzi. Innym ważnym gatunkiem mykobakterii jest M. vaccae.

[0004] Dane epidemiologiczne pokazują wysokie częstości występowania zakażeń Mycobacterium sp., w

tym zakażeń MTC takich jak zakażenie Mycobacterium tuberculosis, we wszystkich krajach byłego Związku 20

Radzieckiego. W Rosji zanotowano częstość występowania TB 90,7/100000 w 2000 r. Podobnie donoszono

o wysokich częstościach lekooporności, szczególnie wielolekooporności powodowane przez wielolekoopor-

ną Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis MDRTB), co wpływa na niskie częstości wyle-

czeń i upośledza skuteczność programów TB. Donoszono o częstości MDRTB tak wysokiej jak 14% nowo

zdiagnozowanych przypadków w Estonii. W 2000, podano, że częstości pierwotnej i wtórnej oporności na 25

przynajmniej jeden lek w Rosji Północnej wynoszą odpowiednio 33% i 85% w okręgu Archangielskim. Wyso-

kie częstości lekooporności odnotowano w Samarze i St Petersburgu. Przeciwnie, choć donoszono o dużych

instytucjonalnych nagłych wystąpieniach wielolekoopornych MDRTB w USA, Wielkiej Brytanii i innych kra-

jach europejskich ogólny zasięg MDRTB i prewalencja są niskie.

30

[0005] Szereg czynników wpłynęło na problem oporności mikroorganizmów. Jednym jest nagromadzenie

mutacji w czasie i następne poziome i pionowe przeniesienie zmutowanych genów do innych organizmów.

Tak więc, dla danego patogenu całe klasy antybiotyków stały się nieaktywne. Dalszym czynnikiem był brak

nowej klasy antybiotyków w ostatnich latach. Pojawienie się wielolekoopornych patogennych bakterii ,takich

jak Mycobacterium sp., w szczególności gatunków MTC, takich jak Mycobacterium tuberculosis, stanowi 35

poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i istnieje pilna potrzeba nowych form terapii.

[0006] Oporność wielolekowa u Mycobacterium sp., takiej jak Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)

jest oceniana w odniesieniu do dwóch leków - ryfampiny i izoniazydu. Pojawiają się szczepy wielolekooporne

(MDR), które są określane jako oporne na INH i RIF i doniesiono o ich udziale w kilku nagłych wystąpieniach40

choroby. Obecnie dostępne metody wykrywania oporności na leki obejmują mikroskopię plwociny i metody

oparte na wzroście , które mierzą wzrost bakterii na podłożach stałych lub płynnych (zazwyczaj podłoża

EP 1 713 934 B1

2

Lowensteina-Jensena) w obecności leków – badanie podatności na leki („Drug Susceptibility Testing” -

DST). Wadą technik opartych na wzroście jest to, że są one ograniczone przez szybkośćwzrostu Mycobacte-

rium sp., takiej jak M. tuberculosis, której czas podwajania wynosi 16 godzin (porównaj E. coli, której czas

podwajania wynosi 20 minut). Skutkiem tego określenie lekoopornej Mycobacterium sp. tą metodą typowo

trwa przynajmniej 10-14 dni (typowo 21-30 dni po izolacji kultury pierwotnej). Zastosowanie niestandaryzo-5

wanych metod także upośledza dokładność DST.

[0007] Żywotność Mycobacterium sp., takiej jak M. tuberculosis, po ekspozycji na leki (i w efekcie lekoopor-

ność) można monitorować badając zdolność mykobakteriofaga do skutecznego zakażania organizmu. Opi-

sano dwie metody. W jednej metodzie Mycobacterium sp., tak jak M. tuberculosis, są traktowane lekiem, a10

następnie stosuje się fagi do zakażenia traktowanej lekiem M. tuberculosis.

[0008] Zewnątrzkomórkowe fagi są niszczone, zanim M. tuberculosis ulegnie lizie i fagi liczy się na muraw-

ce szybko rosnących mykobakterii. Liczba fagów jest proporcjonalna do liczby żywotnych M. tuberculosis. W

drugiej metodzie, luminescencyjny fag jest stosowany do zakażenia poddanych działaniu leku Mycobacte-15

rium sp., takich jak M. tuberculosis, aluminescencja jest proporcjonalna do liczby żywotnych M. tuberculosis.

Wadą każdej z tych metod jest to, że obie wymagają około 2 dni do identyfikacji lekoopornych Mycobacte-

rium sp.

[0009] Doniesiono, że przynajmniej 11 genów bierze udział w rozwoju oporności na główne leki anty-TB. 20

Wykrywanie oporności na ryfampinę (oporność na RIF) lub oporności na izoniazyd (oporność na INH), jest

ważne klinicznie i dla kontroli TB w zdrowiu publicznym.

[0010] Oporność na ryfampinę i izoniazyd jest nadawana przez mutacje w trzech genach. Oporność na RIF

jest na ogół związana z podstawieniami pojedynczych nukleotydów. Wiadomo, że mutacje w regionie rdze-25

nia 81 pz genu rpoB (kodującego podjednostkę ß polimerazy RNA) są odpowiedzialne za ponad 90% opor-

ności na RIF - około 60-70% mutacji znajduje się w obrębie dwóch kodonów, 531 i 526.

[0011] Wiadomo, że mutacje w dwóch różnych genach są odpowiedzialne za oporność na izoniazyd. W

ponad 75% przypadków oporność na INH występuje ze względu na podstawienia w genie katG (kodującym 30

katalazę-peroksydazę), w szczególności w kodonie 315 (AGC-ACC). Rzadziej, oporność na INH jest spowo-

dowana przez mutacje w genach inhA i ahpC.

[0012] Częstość występowania mutacji w kodonie 315 genu katG zmienia się w zależności od badanego

regionu geograficznego w procentach od 35% w Bejrucie do ponad 90% na Łotwie i w Rosji, podczas gdy 35

przeważajaca mutacja inhA zmienia się geograficznie od 3,3% do ponad 32%.

[0013] Specyficzne pojedyncze mutacje związane z opornością na INH lub RIF można wykryć w czasie

krótszym niż 1 dzień stosując amplifikację PCR kwasu nukleinowego Mycobacterium sp., takiego jak kwas

nukleinowy M. tuberculosis, po której następuje analiza sekwencji DNA.40

[0014] W dziedzinie stosowano różne metody do analizy sekwencji specyficznych pojedynczych mutacji

EP 1 713 934 B1

3

Mycobacterium sp., takie jak elektroforeza w żelu agarozowym. Ta metoda wymaga specyficznej względem

mutacji amplifikacji – wielkość powstałego produktu PCR na żelu wskazuje na obecność danej mutacji. Inna

metodą analizy sekwencji jest SSCP (– analiza polimorfizmu konformacji pojedynczych łańcuchów), w której

region DNA zawierający daną mutację jest amplifikowany za pomocą PCR, następnie ten produkt PCR jest

denaturowany i powstały jednoniciowy DNA przesuwa się żelu poliakryloamidowegom –widać typowy wzór 5

migracji dla każdej mutacji. Kolejną techniką analizy sekwencji jest analiza krzywych topnienia. Krzywe top-

nienia można uzyskać stosując urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym, takie jak LightCycler (Roche), i

każda mutacja będzie miała typową krzywą. Mutacje w produktach PCR można także identyfikować stosując

sondy fluorescencyjne. Sekwencje kwasów nukleinowych można także określić stosując handlowo dostępne

urządzenia do sekwencjonowania. 10

[0015] Wadą wszystkich powyższych technik sekwencjonowania jest to, że nie mogą być wykonywane w

formie multipleksów w stopniu pozwalającym na przeprowadzenie całej analizy DNA w pojedynczym teście.

Choć teoretycznie może być możliwe zidentyfikowanie szeregu miejsc mutacji przez zastosowanie oznacze-

nia z LightCycler PCR, w praktyce występują problemy spowodowane przez interakcje, gdy stosuje się sze-15

reg różnych barwników. Zatem te znane metody nie pozwalają na identyfikację wszystkich docelowych

miejsc mutacji jednocześnie.

[0016] Alternatywną do analizy sekwencji metodą jest odwrotna hybrydyzacja. Generuje się znakowany

produkt PCR, który zawiera mutację będącą przedmiotem zainteresowania i jest to stosowane do przebada-20

nia szeregu sond immobilizowanych na stałym nośniku. System wykrywania mutacji w rpoB związanych z

opornością na RIF jest dostępny w handlu (INNO-LiPA Rif.TB, Innogenetics, Gandawa, Belgia). Zastosowa-

nie tego zestawu do celach skriningu jest jednak ograniczone w regionach z wysoką częstością TB i wysoką

częstością MDRTB, ze względu na stosunkowo wysoki koszt i niemożność analizy oporności na INH.

25

[0017] Niehandlowe strategie dot-blot, oparte na amplifikacji fragmentów genów, o których wiadomo, że

nadają oporność na INH, z późniejszą hybrydyzacją z sondami oligonukleotydowymi zmutowanymi i typu

dzikiego, okazały się być najbardziej ekonomiczną metodologią, przewidującą oporność na RIF w 90% przy-

padków lub oporność INH w 75% przypadków.

30

[0018] Istnieje więc potrzeba dostarczenia alternatywnego i/lub ulepszonego systemu wykrywania Myco-

bacterium sp. wielolekoopornej, w szczególności tych członków MTC, takich jak wielolekooporna M. tubercu-

losis (MDRTB). Ta potrzeba jest spełniona przez niniejszy wynalazek, który rozwiązuje jeden lub więcej z

określonych powyżej problemów technicznych.

35

[0019] W US 5,658,733 opisano sposób wykrywania opornych na izoniazyd szczepów M. tuberculosis.

[0020] Torres, M. i wsp., Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (2003) Tom 45, strony 207-212,

opisują PCR w czasie rzeczywistym do szybkiego wykrywania oporności na ryfampinę i izoniazyd w izola-

tach klinicznych M. tuberculosis.40

[0021] Youil R. i wsp., Genomics, 1996, Tom 32, strony 431-435, opisują wykrycie 81 z 81 znanych mutacji

EP 1 713 934 B1

4

w promotorze beta-globiny myszy za pomocą endonukleazy T3.

[0022] Youil R. i wsp., PNAS Tom 92, 1995, strony 87-91, opisują skrining pod kątem mutacji za pomocą

trawienia niesparowanych zasad endonukleazą VII T4.

5

[0023] Oleykowski C.A. i wsp., Nucleic Acids Research (1998) Tom 26, strony 4597-4602, opisują wykry-

wanie mutacji z zastosowaniem nowej endonukleazy roślinnej

[0024] Condie A. i wsp., Human Mutation (1993), Tom 2, strony 58-66, opisują wykrywanie mutacji punkto-

wych w genie p53 za pomocą polimorfizmu konformacji pojedynczych łańcuchów, elektroforezy w żelu przy 10

stałej ilości czynnika denaturującego i technik z hydroksyloaminą i tetratlenkiem osmu.

[0025] Zatem pierwszy aspekt tego wynalazku dostarcza zestaw sond kwasów nukleinowych do stosowania

w oznaczeniu do wykrywania w próbce wielolekoopornej Mycobacterium sp , który to zestaw obejmuje sondę

1 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z pierwszą sekwencją do-15

celową ACCAGCGGCA lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 2 zawierającą sekwencję kwasu

nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją docelową GCCGGTGGTG lub z se-

kwencją do niej komplementarną; sondę 3 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego 10 nukleotydów,

która wiąże się z trzecią sekwencją docelową TATCGTCTCG lub z sekwencją do niej komplementarną; son-

dę 4 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z czwartą sekwencją20

docelową TATCATCTCG lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 5 zawierającą sekwencję kwasu

nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencją docelową GAATTGGCTC lub z sekwen-

cją do niej komplementarną; sondę 6 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która

wiąże się z szóstą sekwencją docelową CTGGTCCATG lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 7

zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z siódmą sekwencją docelo-25

wą GGTTGTTCTG lub z sekwencją do niej komplementarną; sondą 8 zawierającą sekwencję kwasu nukle-

inowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z ósmąj sekwencją docelową CCCGACAGCGlub z sekwencją do

niej komplementarną; sondę 9 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże

się z dziewiątą sekwencją docelową GCTTGTGGGT lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 10

zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą sekwencją doce-30

lową CCAGTGCCGA lub z sekwencja do niej komplementarną; przy czym każda z tych sond ma 18-25 nu-

kleotydów długości i gdy sonda jest związana z odpowiednią sekwencją docelowąj, dostarczony jest wykry-

walny sygnał.

[0026] Korzystnie , każda sonda zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów. Zatem w jed-35

nym wykonaniu, sonda 1 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z

pierwszą sekwencją docelową ATCACCAGCGGCATC lub z sekwencją do niej komplementarną; sonda 2

zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją docelową

GATGCCGGTGGTGTA lub z sekwencją do niej komplementarną; sonda 3 zawiera sekwencję kwasu nukle-

inowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z trzecią sekwencją docelową ACCTATCGTCTCGCC lub z se-40

kwencją do niej komplementarną; sonda 4 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która

wiąże się z czwartą sekwencją docelową ACCTATCATCTCGCC lub z sekwencją do niej komplementarną;

EP 1 713 934 B1

5

sonda 5 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencją doce-

lową ATGAATTGGCTCAGC, lub z sekwencją do niej komplementarną; sonda 6 zawiera sekwencję kwasu

nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z szóstą sekwencją docelowa GTTCTGGTCCATGAA lub z

sekwencją do niej komplementarną; sonda 7 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów,

która wiąże się z siódmą sekwencją docelową GCGGGTTGTTCTGGT lub z sekwencją do niej komplemen-5

tarną; sonda 8 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z ósmą sekwen-

cją docelową AACCCCGACAGCGGG lub z sekwencją do niej komplementarną; sonda 9 zawiera sekwencję

kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z dziewiątą sekwencja docelową GGCGCTTGT-

GGGTCA lub z sekwencją do niej komplementarną; sonda 10 zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z 15

nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą sekwencją docelową GCCCCAGTGCCGACA lub z sekwencją do 10

niej komplementarnej.

[0027] Zatem niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania starannie wybranego zestawu sond, które pozwa-

lają na równoczesne wykrycie mutacji w trzech genach docelowych (katG, inhA i rpoB) w pojedynczym

oznaczeniu. Częściowe sekwencje genu dla wersji typu dzikiego każdego z tych genów są dostarczone jako 15

numery dostępu Genbank MTU06270, MTU66801 i Z95972, odpowiednio.

[0028] Z zestawu sond dostarczonych przez ten wynalazek, sondy 1 i 2 celują w pierwszy gen na oporność

na INH (katG), sondy 3 i 4 celują w drugi gen na oporność na izoniazyd (inhA), i sondy 5-10 tworzą macierz

do skanowania regionu 81 par zasad w obrębie rpoB związanym z opornością na RIF. Sondy według wyna-20

lazku zoptymalizowano zarówno indywidualnie jak i jako grupę – każda jest wysoce specyficzna, pozwalając

na wykrycie mutacji poszczególnych zasad.

[0029] Sondy według wynalazku starannie zaprojektowano do wiązania się z sekwencją docelowego genu

w oparciu o wybór żądanych parametrów. Korzystnie warunki wiązania są takie, że zapewniony jest wysoki 25

poziom specyficzności – tj. wiązanie zachodzi w „warunkach ostrych”. Na ogół warunki ostre wybiera się

tak,aby były około 5°C niższe niż termiczna temperatura topnienia (Tm) dla specyficznej sekwencji przy okre-

ślonej mocy jonowej i pH. Tm jest temperaturą (przy określonej mocy jonowej i pH), przy której 50% sekwen-

cji docelowej wiąże się z idealnie dopasowaną sondą. W tym względzie, Tm każdej sondy według niniejszego

wynalazku, przy stężeniu soli około 0,02M lub niższym przy pH 7, jest korzystnie powyżej 60°C, bardziej 30

korzystnie około 70°C. Zmieszane uprzednio roztwory do wiązania są dostępne (np. EXPRESSHYB Hybridi-

sation Solution z CLONTECH Laboratories, Inc.), a wiązanie można przeprowadzić zgodnie z instrukcją

producenta. Alternatywnie, specjalista w dziedzinie może opracować warianty tych warunków wiązania.

[0030] Po wiązaniu, cząsteczki kwasu nukleinowego można wypłukać,a by usunąć niezwiązane cząsteczki 35

kwasu nukleinowego, w warunkach ostrych (korzystnie bardzo ostrych). Typowe ostre warunki płukania

obejmują płukanie w roztworze 0,5-2x SSC z 0,1 % SDS w 55-65°C. Typowe bardzo ostre warunki płukania

obejmują płukanie w roztworze 0,1-0.2x SSC z 0,1%SDS w 55-65°C. Specjalistamoże łatwo opracować

równoważne warunki, na przykład, przez stosowanie SSPE zamiast SSC w roztworze do płukania.

40

[0031] Korzystne jest przeszukanie sond, w celu zminimalizowania samokomplementarności i tworzenia się

dimerów (wiązanie sonda-sonda). Korzystne sondy według niniejszego wynalazku wybiera sie tak, by miały

EP 1 713 934 B1

6

minimalną homologię z ludzkim DNA. Proces selekcji może obejmować porównanie sekwencji sondy-

kandydata z ludzkim DNA i odrzucenie sondy, jeśli homologia jest większa niż 50%. Celem tego procesu

selekcji jest zmniejszenie przyłączania sondy do zanieczyszczających ludzkich sekwencji DNA i w ten spo-

sób umożliwienie polepszonej specyficzności oznaczenia.

5

[0032] W jednym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza zestawu sond, który obejmuje sondę 1 zawiera-

jącą sekwencję TGCCGCTGGT, lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji;

sondę 2 zawierającą sekwencję CACCACCGGC, lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji; sondę 3 zawierającą sekwencję CGAGACGATA, lub sekwencję mającą z nią przynajmniej

90% identyczności sekwencji ; sondę 4 zawierającą sekwencję CGAGATGATA lub sekwencję mającą z nią 10

przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 5 zawierającą sekwencję GAGCCAATTC lub sekwencję

mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji ; sondę 6 zawierającą sekwencję CATGGACCAG

lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 7 zawierającą sekwencję

CAGAACAACC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 8 zawierającą

sekwencję CGCTGTCGGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 9 15

zawierającą sekwencję ACCCACAAGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności se-

kwencji; sondę 10 zawierającą sekwencję TCGGCACTGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90%

identyczności sekwencji; przy czym podkreślone nukleotydy w obrębie sekwencji sond 1, 2, 3 i 4 są nie-

zbędne i nie mogą być podstawione przez żaden inny nukleotyd, a każda z tych sond ma długość 18-25

nukleotydów.20

[0033] W korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza zestawu 10 sond, który to zestaw obejmuje

sondę 1 zawierającą sekwencję GATGCCGCTGGTGAT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji; sondę 2 zawierającą sekwencję ATCACCACCGGCATC lub sekwencję mającą z nią

przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 3 zawierającą sekwencję GGCGAGACGATAGGT lub 25

sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji ; sondę 4 zawierającą sekwencję GGC-

GAGATGATAGGT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 5 zawiera-

jącą sekwencję AGCTGAGCCAATTCATG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności se-

kwencji; sondę 6 zawierającą sekwencję AATTCATGGACCAGAACA lub sekwencję mającą z nią przynajm-

niej 90% identyczności sekwencji ; sondę 7 zawierającą sekwencję ACCAGAACAACCCGC lub sekwencję 30

mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 8 zawierającą sekwencję ACCCGCTGTC-

GGGGTT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 9 zawierającą se-

kwencję TGACCCACAAGCGCC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji;

sondę 10 zawierającą sekwencję CTGTCGGCACTGGGGCC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90%

identyczności sekwencji; przy czym podkreślone nukleotydy w obrębie sekwencji sond 1, 2,3 i 4 są niezbęd-35

ne i nie mogą być podstawione przez żaden inny nukleotyd, a każda z tych sond ma długość 18-25 nukle-

otydów.

[0034] Szczególnie dobre wyniki uzyskano stosując zestaw 10 sond zawierających po jednej z każdej z

sond SEK NR ID. 1-10 (patrz Tabela 1 poniżej).40

[0035] Zatem niniejszy wynalazek dostarcza w korzystnym wykonaniu, zestawu sond, który obejmuje son-

EP 1 713 934 B1

7

dę 1 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 1 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności se-

kwencji; sondę 2 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 2 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji; sondę 3 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 3 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej

90% identyczności sekwencji do niej; sondę 4 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 4 lub sekwencję mającą z

nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 5 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 5 lub sekwencję 5

mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 6 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 6 lub

sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji do niej; sondę 7 zawierającą sekwencję

SEK NR ID. 7 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 8 zawierającą

sekwencję SEK NR ID. 8 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 9

zawierającą sekwencję SEK NR ID. 9 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwen-10

cji; sondę 10 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 10 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identycz-

ności sekwencji;

przy czym reszta nukleotydowa 11 w SEK NR ID. 1 i 2 jest niezbędna i nie może być podstawiona żadnym

innym nukleotydem;

i gdzie reszta nukleotydowa 8 w SEK NR ID. 3 i 4 jest niezbędna i nie może być podstawiona żadnym innym15

nukleotydem;

a każda z tych sond ma długość 18-25 nukleotydów.

Tabela 1

SEK NR ID. SONDA NUMER NAZWA SONDY SEKWENCJA SONDY

1 1 K315WTC10T ctc gat gcc gct ggt gat cgc

2 2 K315GC10T gcg atc acc acc ggc atc gag

3 3 tomiwt10T ggc gag acg ata ggt tgt cgg

4 4 tomimut110T ggc gag atg ata ggt tgt cgg

5 5 MRURP3 gcc agc tga gcc aat tca tgg ac

6 6 MRURP615T gcc aat tca tgg acc aga aca acc

7 7 MRURP9 tgg acc aga aca acc cgc tgt c

8 8 MRURP12 aca acc cgc tgt cgg ggt tga c

9 9 MRURP17 ggt tga ccc aca agc gcc gac

10 10 MRU1371A cga ctg tcg gca ctg ggg ccc gg

20

[0036] Gdy w niniejszym wynalazku jest odniesienie do sekwencji mających „przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji” z sekwencją według wynalazku, wynalazek niniejszy obejmuje także sekwencje sond, które

mają korzystnie przynajmniej 95% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 98% identycz-

ności sekwencji, najbardziej korzystnie przynajmniej 99% identyczności sekwencji z sekwencją sondy we-

dług niniejszego wynalazku.25

[0037] Sekwencje sond mające przynajmniej 90% identyczności sekwencji, korzystnie przynajmniej 95%

identyczności sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 98% identyczności sekwencji, najbardziej korzyst-

nie przynajmniej 99% identyczności sekwencji z sekwencjami sond według niniejszego wynalazku można

zidentyfikować przez przyrównania sekwencji stosując konwencjonalne oprogramowanie, na przykład, pakiet30

EP 1 713 934 B1

8

Bioedit™, dostępny bezpłatnie w sieci i pakiet Sequencher™ dostarczany przez Sequencher Gene Codes

Corporation, 640 Avis Drive Suite 310, Ann Arbor MI 48108.

[0038] Alternatywnym sposobem określania sekwencji sond, które są homologiczne z sekwencjami sond

według niniejszego wynalazku, jest określenie liczby nukleotydów, które różnią się między sekwencją homo-5

logiczną i sekwencją według wynalazku. W tym względzie niniejszy wynalazek obejmuje sekwencje sond,

które różnią się od sekwencji sond według wynalazku o nie więcej niż 5 nukleotydów, korzystnie nie więcej

niż o 4 nukleotydy, bardziej korzystnie nie więcej niż o 3 nukleotydy, jeszcze bardziej korzystnie nie więcej

niż o 2 nukleotydy, a najbardziej korzystnie nie więcej niż o 1 nukleotyd. Nie należy jednak zamieniać pod-

kreślonych nukleotydów w sekwencjach sond 1, 2, 3 i 4, na jakikolwiek inny nukleotyd.10

[0039] W niniejszym wynalazku „dopełnienie” lub „nić komplementarna” oznacza niekodującą (antysensow-

ną) nić kwasu nukleinowego, która może wiązać się przez komplementarne parowanie zasad z nicią kodują-

cą. Zatem niniejszy wynalazek obejmuje także zastosowanie dopełnień tu opisanych sond. Jako przykład,

dopełnienie Sondy 1, powyżej, ma sekwencję GAG CTA CGG CGA CCA CTA GCG, a dopełnienie sondy 2 15

powyżej, ma sekwencję CGC TAG TGG TGG CCG TAG CTC. Dobrze wiadomo w dziedzinie, jak uzyskać

sekwencję nici komplementarnej przez stosowanie reguły parowania komplementarnych zasad, jeśli jest

znana sekwencja nici kodującej.

[0040] W jednym wykonaniu według niniejszego wynalazku, sondy mogą być immobilizowane na stałym 20

nośniku lub platformie. Nośnik może być sztywnym stałym nośnikiem wykonanym z, na przykład, szkła lub

tworzywa sztucznego lub też nośnik może być membraną nylonową lub nitrocelulozową, lub inną. Macierze

3D są odpowiednimi nośnikami do stosowania z niniejszym wynalazkiem – np. żele poliakrylamidowe lub

PEG. W jednym wykonaniu, stały nośnik może być w postaci kuleczek, które mogą być sortowane pod

względem wielkości lub fluoroforów. 25

[0041] Sondy można immobilizować na stałym nośniku różnymi sposobami. Przykładowo, sondy można

immobilizować na nylonowej membranie przez sieciowanie za pomocą UV. Sondy znakowane biotyną mo-

gą wiązać się z substratami powleczonymi streptawidyną, a sondy przygotowane z linkerami aminowymi

można immobilizować na silanizowanych powierzchniach. Innym sposobem immobilizacji sondy jest sposób 30

przez ogon poli-T, korzystnie na końcu 3'. Ogon poli-T składa się z kolejnych od 1 do 100 reszt tymidyno-

wych dodanych do sondy na końcu 3' za pomoca terminalnej transferazy. Korzystnie, dodaje się od 1 do 20

reszt tymidynowych. Ogon poli-T następnie zapieka się lub łączy za pomocą wiązania pod wpływem UV do

stałego podłoża. Dodanie ogona poli-T wydaje się mieć dwie funkcje. Po pierwsze, ogon poli-T zwiększa

ilość sondy, która jest immobilizowana na stałym nośniku. Po drugie, ogon poli-T wpływa na konformację35

sondy w taki sposób, aby poprawić wydajność hybrydyzacji. Gdy sonda według niniejszego wynalazku wiąże

się z docelowym kwasem nukleinowym Mycobacterium sp. (np. M. tuberculosis), dostarczony jest wykrywal-

ny sygnał, który można wykryć znanymi sposobami. Wykrywalny sygnał może być sygnałem radioaktywnym,

ale korzystnie jest sygnałem fluorescencyjnym (najbardziej korzystnie zmianą fluorescencji), lub sygnałem

chromogennym stosującym biotynę lub digoksygeninę.40

[0042] Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu wykrywania wielolekoopornej Mycobacterium sp. w

EP 1 713 934 B1

9

próbce, w szczególności członków MTC, takich jak M. tuberculosis.Sposób obejmuje kontaktowanie zestawu

sond według niniejszego wynalazku z próbką zawierającą kwas nukleinowy, gdzie, gdy sonda wiąże się z

docelowym kwasem nukleinowym Mycobacterium sp. w próbce, dostarczony jest wykrywalny sygnał i wy-

krywanie tego sygnału.

5

[0043] Próbka może być na przykład próbką żywności, ścieków lub próbką kliniczną. Szczególnym zasto-

sowaniem sposobu jest wykrywanie Mycobacterium sp. w próbce klinicznej. Próbki kliniczne mogą obejmo-

wać próbki z popłuczyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego ( BALS), indukowane plwociny, popłuczyny

części ustnej gardła, krew lub inne próbki płynów ustrojowych.

10

[0044] W niniejszym sposobie, korzystnie obecność wielolekoopornej Mycobacterium sp. w tej próbce po-

twierdza się przez wykrycie w próbce wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 2 i 4 i ich odpo-

wiednio związane docelowe sekwencje kwasu nukleinowego z Mycobacterium sp; i wykrycie braku wykry-

walnego sygnału dostarczonego przez sondy 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 i ich odpowiednie docelowe sekwencje

kwasu nukleinowego z Mycobacterium sp.15

[0045] Korzystnie, niniejszy sposób umożliwia potwierdzenie braku wielolekoopornej Mycobacterium sp. w

tej próbce przez wykrycie wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 i ich od-

powiednio związaną docelową sekwencję kwasu nukleinowego z Mycobacterium sp. w próbce; i wykrycie

braku wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 2 i 4 i ich odpowiednie docelowe sekwencje kwasu 20

nukleinowego Mycobacterium sp.

[0046] W tymwzględzie sondy 2 i 4 wiążą się ze zmutowanym kwasem nukleinowym M. tuberculosis. Sonda

2 wiąże się ze specyficznym zmutowanym miejscem docelowym w obrębie genu katG, a sonda 4 wiąże się

zespecyficznym zmutowanym miejscem docelowym w obrębie genu inhA. Sondy 2 i 4 tylko wiążą się z ich25

specyficzną zmutowaną sekwencją, a nie wiążą sekwencji docelowej typu dzikiego. Wiązanie sondy 2 i/lub 4

z kwasem nukleinowym M. tuberculosis w próbce wskazuje więc, że próbka zawiera kwas nukleinowy mają-

cy mutację w katG i/lub inhA, odpowiednio. Mutacje, które są wykrywane przez sondy 2 i 4, biorą udział w

oporności na izoniazyd.

30

[0047] Sondy 1, 3 i 5-10 wiążą się z kwasem nukleinowym M. tuberculosis typu dzikiego. Sonda 1 wiąże się

z miejscem docelowym w obrębie genu katG – wersji typu dzikiego sekwencji, z którą wiąże się sonda 2.

Sonda 3 wiąże się z miejscem docelowym w obrębie genu inhA - wersji typu dzikiego sekwencji związanej z

sondą 4. Zatem wiązanie sondy 1 i/lub 3 z kwasem nukleinowym w próbce wskazuje, że próbka zawiera

kwas nukleinowy, który ma sekwencję typu dzikiego katG i/lub inhA, odpowiednio. Sondy 1 i 3 wiążą tylko 35

sekwencję typu dzikiego, a nie wiążą się, gdy ich docelowa sekwencja jest zmutowana.

[0048] Sondy 5-10 wiążą się tylko z kwasem nukleinowym M. tuberculosis typu dzikiego w obrębie docelo-

wego regionu 81 par zasad genu rpoB typu dzikiego. Jeśli próbka zawiera kwas nukleinowy rpoB typu dzi-

kiego, to wszystkie sondy 5-10 będą się z nim wiązały. Z drugiej strony, jeśli kwas nukleinowy w próbce ma 40

specyficzne mutacje rpoB związane z opornością na ryfampinę, wówczas zwiąże się mniej niż 6 sond rpoB.

EP 1 713 934 B1

10

[0049] Bardziej szczegółowo, obecność kwasu nukleinowego z wielolekoopornej Mycobacterium sp. jest

potwierdzona w próbce przez wykrycie związania się przynajmniej jednej z sond 2 i 4 ze zmutowanym kwa-

sem nukleinowym (tj. wykrycie wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondę 2 i/lub 4 i ich odpowiednie

związane sekwencje docelowe), i wykrycie braku związania przynajmniej jednej z sond 1, 3 i przynajmniej

jednej z sond 5-10 z kwasem nukleinowym typu dzikiego (tj. wykrycie braku wykrywalnego sygnału dostar-5

czonego przez sondy 1, 3 i 5-10 i ich odpowiednie sekwencje docelowe).

[0050] Z drugiej strony, jeśli sondy 2 i 4 nie zwiążą się z kwasem nukleinowym w próbce (co jest wykazane

przez brak wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 2 i 4 i ich odpowiednie sekwencje docelowe),

ale obie sondy 1, 3 i wszystkie sondy 5-10 zwiążą się z kwasem nukleinowym w próbce (co jest wykazane 10

przez wykrycie wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 1, 3 i 5-10 i ich odpowiednie związane

sekwencje docelowe), wskazuje to, że próbka nie zawiera kwasu nukleinowego z wielolekoopornej Myco-

bacterium tuberculosis.

[0051] Jeśli wykrywalny sygnał jest dostarczony przez wszystkie sondy i ich odpowiednie docelowe se-15

kwencje kwasu nukleinowego wskazuje to na obecność w próbce kwasu nukleinowego Mycobacterium tu-

berculosis z bakterii, które mają gen rpoB typu dzikiego - tzn. wrażliwy na ryfampinę. Próbka ta zawiera tak-

że kwas nukleinowy z Mycobacterium tuberculosis, które mają zmutowane geny katG i inhA - tj. oporne na

izoniazyd, jak i kwas nukleinowy z Mycobacterium tuberculosis, które mają geny katG i inhA typu dzikiego -

tj. wrażliwe na izoniazyd. Zatem wykryta jest mieszanina Mycobacterium tuberculosis z pojedynczą oporno-20

ścią na INH i Mycobacterium tuberculosis typu dzikiego (wrażliwa na RIF/ INH).

[0052] Jest możliwe zastosowanie więcej niż 10 sond - tj. włączenie kolejnych sond w dodatku do 10 sond

opisanych tu szczegółowo. Kolejne sondy mogą być przydatne do wykrywania mutacji w innych genach My-

cobacterium sp. lub do wykrywania kwasów nukleinowych innych niż kwas nukleinowy z Mycobacterium sp., 25

na przykład, jako część szerszego zestawu diagnostycznego do analizy innych gatunków bakterii.

[0053] W jednym wykonaniu, jedna lub więcej z sond 5-10 opisanych szczegółowo powyżej (SEK NR ID.: 5-

10) może być podstawiona lub stosowana w kombinacji z jedną lub więcej, korzystnie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, 21 lub 22 sond dostarczonych w Tabeli 1a poniżej (sondy 11-32, SEK 30

NR ID.: 11-32). Każda z sond 11-32 wiąże się z kwasem nukleinowym z M. tuberculosis typu dzikiego, w

obrębie genu rpoB typu dzikiego. Zatem jeśli próbka zawiera kwas nukleinowy genu rpoB typu dzikiego,

sondy 11-32 zwiążą się z kwasem nukleinowym w próbce, a jeśli próbka zawiera kwas nukleinowy zmuto-

wanego genu rpoB, wówczas przynajmniej jedna z sond 11-32 nie zwiąże się z kwasem nukleinowym w

próbce. Zatem, sondy 11-32 są przydatne do wykrywania M. tuberculosis, które są oporne na ryfampinę. 35

Tabela 1a

SEK NR ID. SONDA NUMER NAZWA SONDY SEKWENCJA SONDY

11 11 MRURP1 cag cca gcc agc tga gcc aat tc

12 12 MRURP2 cca gcc agc tga gcc aat tca tg

13 13 MRURP4 agc tga gcc aat tca tgg acc ag

EP 1 713 934 B1

11

SEK NR ID. SONDA NUMER NAZWA SONDY SEKWENCJA SONDY

14 14 MRURP5- tga gcc aat tca tgg acc aga aca

15 15 MRURP7 aat tca tgg acc aga aca acc cgc

16 16 MRURP8 tca tgg acc aga aca acc cgc tg

17 17 MRURP10 acc aga aca acc cgc tgt cgg g

18 18 MRURP11 aga aca acc cgc tgt cgg ggt t

19 19 MRURP13 acc cgc tgt cgg ggt tga ccc

20 20 MRURP14 cgc tgt cgg ggt tga ccc aca a

21 21 MRURP15 tgt cgg ggt tga ccc aca agc g

22 22 MRURP16 cgg ggt tga ccc aca agc gcc

23 23 MRURP18 tga ccc aca agc gcc gac tgt c

24 24 MRURP19 ccc aca agc gcc gac tgt cgg

25 25 MRURP20 aca agc gcc gac tgt cgg cgc

26 26 MRURP21 agc gcc gac tgt cgg cgc tgg

27 27 MRURP22 gcc gac tgt cgg cgc tgg ggc

28 28 MRURP23 gac tgt cgg cgc tgg ggc ccg

29 29 MRUR24 tgt cgg cgc tgg ggc ccg gc

30 30 MRURP25 cgg cgc tgg ggc ccg gcg gt

31 31 MRURP26 cgc tgg ggc ccg gcg gtc tg

32 32 MRURP27 tgg ggc ccg gcg gtc tgt cac

[0054] Niniejszy wynalazek obejmuje także sekwencje sond, które mają przynajmniej 90% identyczności

sekwencji, korzystnie przynajmniej 95% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 98% iden-

tyczności sekwencji, najbardziej korzystnie przynajmniej 99% identyczności sekwencji z sekwencjami sond

11-32 według niniejszego wynalazku.5

[0055] Niniejszeoznaczenie może być stosowane z lub bez uprzedniego etapu amplifikacji, w zależności od

stężenia kwasu nukleinowego z M. tuberculosis, który jest dostępny. Amplifikację można przeprowadzić za

pomocą metod znanych w dziedzinie, korzystnie za pomocą PCR.

10

[0056] Korzystnie, etap amplifikacji kwasu nukleinowego Mycobacterium sp. w próbce zawierającej kwas

nukleinowy przeprowadza się przed wykrywaniem sygnału. Najbardziej korzystnie, etap amplifikacji kwasu

nukleinowego Mycobacterium sp. w próbce przeprowadza się przed skontaktowaniem zestawu sond z

próbką zawierającą kwas nukleinowy.

15

[0057] Amplifikację kwasu nukleinowego M. tuberculosis korzystnie przeprowadza się stosując parę starte-

rów specyficznych względem sekwencji, które wiążą się z miejscem docelowym w kwasie nukleinowym M.

tuberculosis i są wydłużane, dając syntezę kwasu nukleinowego. Startery zaprojektowano do wiązania się z

sekwencją docelowego genu w oparciu o wybór pożądanych parametrów, stosując konwencjonalne opro-

gramowanie, takie jak Primer Express (Applied Biosystems). Pod tym względem, korzystnie warunki wiąza-20

EP 1 713 934 B1

12

nia są takie, że zapewniony jest wysoki poziom specyficzności. Temperatura topnienia (Tm) starterów wynosi

korzystnie 50°C lub więcej i najbardziej korzystnie około 60°C. Startery są korzystnie poddane skriningowi w

celu zminimalizowania samokomplementarności i tworzenia dimerów (wiązanie starter-starter).

[0058] Para starterów obejmuje lewe i prawe startery oligonukleotydowe. Starter lewy to taki, który wiąże się 5

z komplementarną, niekodującą (antysensowną) nicią docelowego kwasu nukleinowego M. tuberculosis, a

prawy starter to taki, który wiążę się z kodującą (sensowną) nicią docelowego kwasu nukleinowego M. tu-

berculosis.

[0059] Lewy i prawy starter oligonukleotydowy typowo mają długość 10 do 50 nukleotydów, korzystnie 10 10

do 40 nukleotydów, bardziej korzystnie 15-25 nukleotydów. Na ogół korzystne jest stosowanie krótkich star-

terów, ponieważto pozwala na szybsze przyłączanie się do docelowego kwasu nukleinowego.

[0060] Uzyskano szczególnie dobre wyniki stosując lewe (F) i prawe (R) startery oligonukleotydowe przed-

stawione w Tabeli 2 poniżej. 15

Tabela 2

SEK NR ID. Gen Nazwa startera Sekwencja startera F lub R

33 katG KatGP5BIO CGCTGGAGCAGATGGGCTTGG F

34 katG KatGP6BIO GTCAGCTCCCACTCGTAGCCG R

35 inhA INHAP3BIO GCAGCCACGTTACGCTCGTGG F

36 inhA TOMIP2BIO CGATCCCCCGGTTTCCTCCGG R

37 rpoB FTIP1BIO GGTCGGCATGTCGCGGATGG F

38 rpoB BrpoB1420R GTAGTGCGACGGGTGCACGTC R

[0061] Jednak będzie zrozumiałe, że mogą być stosowane warianty, które różnią się od wymienionych po-

wyżej sekwencji startera jednym lub więcej nukleotydami. Pod tym względem, korzystne są podstawienia 20

konserwatywne. Jest też korzystne, aby startery nie różniły się od wyżej wymienionych starterów w więcej

niż 5 pozycjach nukleotydowych.

[0062] Sonda może być znakowana, jednak korzystnie, sonda jest nieznakowana i zamiast tego znakowa-

ny jest docelowy kwas nukleinowy Mycobacterium sp. w próbce. Docelowy kwas nukleinowy może być zna-25

kowany w czasie amplifikacji PCR przez zastosowanie znakowanych starterów. Zatem w jednym wykonaniu,

docelowy kwas nukleinowy w próbce jest znakowany i oznaczenie obejmuje wykrycie znacznika i korelację

obecności znacznika z obecnością kwasu nukleinowego Mycobacterium sp. Znacznik może być znacznikiem

radioaktywnym, ale korzystnie jest nieradioaktywnym, takim jak biotyna, digoksygenina lub sygnałem fluore-

scencji, takim jak izotiocyjanian fluoresceiny ( FITC). Znacznik może być wykrywany bezpośrednio, tak jak 30

przez ekspozycję na kliszę fotograficzną lub rentgenowską, lub pośrednio, na przykład, w systemie dwufa-

zowym. Przykładem pośredniego wykrywania znacznika jest wiązanie się przeciwciała ze znacznikiem. W

innym przykładzie, docelowy kwas nukleinowy znakuje się biotyną i jwykrywa stosując streptawidynę zwią-

zaną z wykrywalną cząsteczką lub enzymem, który generuje wykrywalny sygnał. Można też stosować sys-

EP 1 713 934 B1

13

temy detekcji kolorymetrycznej, takie jak fosfataza alkaliczna plus NBT/BCIP.

[0063] Także jest odniesienie do pojedynczej sondy wybranej z grupy złożonej z: sondy 5 zawierającej se-

kwencję GAGCCAATTC lub sekwencję do niej komplementarną; lub sekwencję mającą z nią przynajmniej

90% identyczności sekwencji, lub sekwencję do niej komplementarną; sondy 6 zawierającej sekwencję 5

CATGGACCAG lub sekwencję do niej komplementarną; lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji lub sekwencję do niej komplementarną; sondy 7 zawierającej sekwencję CAGAACA-

ACC lub sekwencję do niej komplementarną; lub sekwencję mającąj z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji lub sekwencję do niej komplementarną; sondy 8 zawierającej sekwencję CGCTGTCGGG lub

sekwencję do niej komplementarną; lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji , 10

lub sekwencję do niej komplementarną; sondy 9 zawierającej sekwencję ACCCACAAGC lub sekwencję do

niej komplementarną; lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji, lub sekwencję

do niej komplementarną; sondy 10 zawierającej sekwencję TCGGCACTGG lub sekwencję do niej komple-

mentarną; lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji lub sekwencję do niej

komplementarną; do stosowania w oznaczeniu do wykrycia w próbce wielolekoopornej Mycobacterium sp. .15

[0064] Gdy w obecnym opisie powołuje się sekwencje mające „przynajmniej 90% identyczności sekwencji”

z sekwencją według niniejszego wynalazku, powołuje się też na sekwencje sond, które mają korzystnie

przynajmniej 95% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 98% identyczności sekwencji,

najbardziej korzystnie przynajmniej 99% identyczności sekwencji do sekwencji sond według niniejszego 20

wynalazku.

[0065] Niniejszy wynalazek dostarcza także zastosowania pojedynczej sondy według niniejszego wynalaz-

ku do wytwarzania kompozycji do wykrywania kwasu nukleinowego z wielolekoopornej Mycobacterium sp.,

korzystnie kwasu nukleinowego MTC wielolekoopornej, takiegojak kwas nukleinowy z wielolekoopornej M. 25

tuberculosis w próbce.

[0066] Niniejszy wynalazek dostarcza także zestawu do wykrywania kwasu nukleinowego z wielolekoopor-

nej Mycobacterium sp., korzystnie kwasu nukleinowego z wielolekoopornej MTC, takiego jak kwas nukleino-

wy z wielolekoopornej M. tuberculosis, obejmującego zestaw sond według niniejszego wynalazku.30

[0067] Zgodnie z alternatywnym aspektem wynalazku, dostarczony jest alternatywny zestaw sond kwasu

nukleinowego do zastosowania w oznaczeniu do wykrywania w próbce wielolekoopornej Mycobacterium sp.,

który to zestaw obejmuje sondę 1 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wią-

że się z pierwszą sekwencją docelową ACCAGCGGCA lub zsekwencją do niej komplementarną; sondę 2 35

zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją docelową

GCCGGTGGTG, lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 5 zawierającą sekwencję kwasu nukle-

inowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencją docelową GAATTGGCTC lub z sekwencją do

niej komplementarną; sondę 6 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże

się z szóstą sekwencją docelowa CTGGTCCATG lub z z sekwencją do niej komplementarnąj; sondę 7 za-40

wierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z siódmą sekwencja docelową

GGTTGTTCTG lub z sekwencją do niej komplementarną; sondę 8 zawierającą sekwencję kwasu nukleino-

EP 1 713 934 B1

14

wego z 10 nukleotydów, która wiąże się z ósmą sekwencją docelowa CCCGACAGCG lub z sekwencją do

niej komplementarną; sondę 9 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże

się z dziewiątą sekwencją docelową GCTTGTGGGT lub z sekwencjiądo niej komplementarną; sondę 10

zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą sekwencją doce-

lową CCAGTGCCGA lub z sekwencją do niej komplementarną; i gdzie przy stosowaniu, gdy sonda jest 5

związana z odpowiednią sekwencją docelową, dostarczony jest wykrywalny sygnał i gdzie każda z tych sond

ma długość 18-25 nukleotydów.

[0068] Ten alternatywny zestaw sond różni się od opisanego wcześniej zestawu sond tym, że sondy 3 i 4

(których celem jest gen inhA) nie są niezbędne. Jednak ten zestaw sond obejmuje sondy 1 i 2, które celują w10

gen katG i sondy 5-10, których celem jest gen rpoB. Zatem, ten zestaw sond jest użyteczny do wykrywania

mutacji w genie rpoB (nadających oporność na RIF) i genie katG (nadających oporność na INH).

[0069] Korzystnie, ten alternatywny zestaw sond obejmuje sondę 1 zawierającą sekwencję TGCCGCTGGT

lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 2 zawierającą sekwencję 15

CACCACCGGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 5 zawierają-

cą sekwencję GAGCCAATTC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę

6 zawierającą sekwencję CATGGACCAG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności se-

kwencji ; sondę 7 zawierającą sekwencję CAGAACAACC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90%

identyczności sekwencji ; sondę 8 zawierającą sekwencję CGCTGTCGGG lub sekwencję mającą z nią 20

przynajmniej 90% identyczności sekwencji ; sondę 9 zawierającą sekwencję ACCCACAAGC lub sekwencję

mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; sondę 10 zawierającą sekwencję TCGGCACTGG

lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji; przy czym podkreślone nukleotydy w

obrębie sekwencji sond 1, 2,3 i 4 są niezbędne i nie mogą być podstawione przez żaden inny nukleotyd.

25

[0070] Zgodnie z tym alternatywnym aspektem wynalazku, jest także dostarczony sposób wykrywania w

próbce obecności lub braku wielolekoopornej Mycobacterium sp., obejmujący: (a) kontaktowanie alternatyw-

nego zestawu sond jak opisany powyżejz próbką zawierającą kwas nukleinowy, gdzie, gdy sonda zwiąże

się z kwasem nukleinowym Mycobacterium sp. w próbce, dostarczony jest wykrywalny sygnał i (b) wykrycie

tego wykrywalnego sygnału. Zatem sposób ten pozwala na wykrywanie równocześnie mutacji w genach 30

katG i rpoB w pojedynczym oznaczeniu.

[0071] Niniejszy wynalazek dostarcza także zestawu do wykrywania kwasu nukleinowego z wielolekoopor-

nej Mycobacterium sp. obejmującego alternatywny zestaw sond jak opisany powyżej. Stosując ten zestaw

można wykrywać równocześnie mutacje w genach rpoB i katG w pojedynczym oznaczeniu.35

[0072] Wykonania wynalazku są omówione bardziej szczegółowo za pomocą Przykładów opisanych poni-

żej. Wyniki, do których jest odniesienie w Przykładach, są zilustrowane przez towarzyszące rysunki, w któ-

rych:

na Fig.1 przedstawiono projekt poszczególnych makromacierzy według niniejszego wynalazku;40

na Fig. 2 przedstawiono wygląd wywołanych membran do makromacierzy;

EP 1 713 934 B1

15

na Fig. 3 przedstawiono spektrum mutacji związanych z opornością na RIF i INH zidentyfikowanych w izola-

tach Samara.

na Fig. 4A przedstawiono schemat makromacierzy do skriningu MDR;

na Fig. 4B przedstawiono wzory wygenerowane przez szczepy M. tuberculosis.

5

[0073] Bardziej szczegółowo, na Figurze 1A zilustrowano makromacierz do skriningu zawierającą 6 różnych

sond niezmutowanego genu rpoB (1) (typu dzikiego), sondę niezmutowanego katG (2a), sondę niezmuto-

wanego (kodon 315) genu katG (2b), sondę niezmutowanego genu inhA (3a), sondę zmutowanego (kodon

280) genu inhA (3b) i sondę do kontroli wywoływania koloru (4).

10

[0074] Na Figurze 1B zilustrowano makromacierz do skanowania zawierającą sondy niezmutowanego (typu

dzikiego) rpoB (1-27), sondę do kontroli wywoływania koloru (B) i plamę atramentu dla orientacji (A).

[0075] Na Figurze 2A,B zilustrowano wygląd wywołanej membrany makromacierzy, którą kontaktowano z

izolatami typu dzikiego Mycobacterium tuberculosis niemającymi mutacji w genach rpoB, katG lub inhA (tzn.15

izolaty wrażliwe na RIF/INH). Wszystkie sondy 1, 3 i 5-10 wiązały kwasy nukleinowe w próbce, wskazując na

obecność genotypu wrażliwego na RIF/ INH.

[0076] Na Figurze 2C,D zilustrowano wygląd wywołanej membrany mikromacierzy, którą kontaktowano z

izolatami Mycobacterium tuberculosis mającymi mutację w kodonie 531 rpoB (1) i kodonie 315 katG (2). 20

Mniej niż 6 z sond rpoB wiąże się, wskazując wykrycie mutacji rpoB, a sonda zmutowanego katG wiąże się,

wskazując na wykrycie mutacji katG – zatem wskazując na obecność genotypu opornego na RIF/INH (tj.

wielolekoopornego).

[0077] Na Figurze 3A zilustrowano mutacje związane z opornością na INH w izolatach Samara. 92,9% mu-25

tacji jest tylko w katG, z 2,0% mutacji tylko w inhA i 5,1% mutacji w obu genach.

[0078] Na Figurze 3B zilustrowano mutacje związane z opornością na RIF w izolatach Samara. Sonda 3

zestawu skanującego wykryła 1,3% mutacji, sonda 6 wykryła 2,5% mutacji, sonda 9 wykryła 1,1 % mutacji,

sonda 12 wykryła 0,8% mutacji, sonda 17 wykryła 4,2% mutacji i sonda 22 wykryła 90,0% mutacji.30

[0079] Na Figurze 4A zilustrowano makromacierz według niniejszego wynalazku, jak stosowano w Przykła-

dzie 4 (poniżej). Klucz do plam jest następujący:

1 plama atramentu

2 kontrola35

3 sonda MtbC do wykrycia sondą specyficznego dla kompleksu M. tuberculosis locus rpoB M. tubercu-

losis

4 sonda 1 (z Tabeli 1 powyżej)

5 sonda 2 (z Tabeli 1 powyżej)

6 sonda 3 (z Tabeli 1 powyżej)40

7 sonda 4 (z Tabeli 1 powyżej)

8 sonda 5 (z Tabeli 1 powyżej)

EP 1 713 934 B1

16

9 sonda 6 (z Tabeli 1 powyżej)

10 sonda 7 (z Tabeli 1 powyżej)

11 sonda 8 (z Tabeli 1 powyżej)

12 sonda 9 (z Tabeli 1 powyżej)

13 sonda 10 (z Tabeli 1 powyżej)5

[0080] Na Figurze 4B zilustrowano wzory uzyskane dla różnych szczepów M. tuberculosis:

wzór 1 szczep z mutacją katG315 AGC-ACC + zmutowanym allelem rpoB526;

wzór 2 szczep z mutacją katG315 AGC-ACC + insercją w genie rpoB (ins TTC w kodonie 514);

wzór 3 szczep typu dzikiego;10

wzór 4 szczep ze zmutowanym allelem rpoB531;

wzór 5 szczep z mutacją katG315 AGC-ACA;

wzór 6 szczep z mutacją inhAC-15T w regionie regulatorowym operonu mabA- inhA;

wzór 7 szczep ze zmutowanym allelem rpoB516.

15

Przykłady

Przykład 1 - Amplifikacja kwasu nukleinowego z Mycobacterium tuberculosis

[0081] W sumie 234 izolaty kliniczne z Mycobacterium tuberculosis z Samary (Środkowa Rosja) były do-20

stępne do testowania fenotypowego i genotypowego.

[0082] Wszystkie próbki plwociny hodowano na podłożach Lowenstein-Jensen i potwierdzono ich tożsa-

mość stosując kombinację wzrostu, wyglądu makroskopowego i mikroskopowego i testów hybrydyzacji DNA.

Badanie wrażliwości na leki przeprowadzono stosując znaną metodę stopnia oporności.25

[0083] DNA ekstrahowano przez podgrzanie zawiesin komórek z równą objętością chloroformu w +80°C

przez 30 minut, następnie chłodzono w lodzie i wirowano. Górna faza (surowy lizat komórkowy) była użyta

do amplifikacji PCR.

30

[0084] Amplifikację multipleksowym PCR regionów genów rpoB, katG i inhA przeprowadzono stosując trzy

pary starterów z późniejszą hybrydyzacją typu dot-blot produktów amplifikacji z normalnymi i zmutowanymi

sondami oligonukleotydowymi (jednoniciowe fragmenty genów rpoB, katG i inhA, w których występują muta-

cje) immobilizowanymi na paskach nylonowej membrany (Osmonics Inc., USA).

35

[0085] Bardziej szczegółowo, znakowane biotyną produkty PCR generowano w multipleksowym PCR stosu-

jąc trzy pary starterów. Pierwsza para była do amplifikacji fragmentu obejmującego 81 pz region „rdzenia”

genu rpoB, do wykrywania mutacji zgodnych z opornością na RIF. Druga para była do amplifikacji fragmentu

genu katG, obejmującego kodon 315. Trzecia para była do amplifikacji fragmentu genu inhA, obejmującego

region regulatorowy.40

[0086] PCR przeprowadzono w objętości 20 µl, zawierającej 2 µl 10x buforu do PCR (Bioline Ltd., Londyn,

EP 1 713 934 B1

17

Zjednoczone Królestwo); 0,5 jednostki polimerazy Taq (Bioline); 0,5 µl 2mM mieszaniny dNTP (Bioline); po

20 µM każdego z sześciu starterów i 1 µl ekstraktu DNA przygotowanego jak opisano powyżej. Cykle ter-

miczne przeprowadzono w Perkin Elmer 9700 Thermocycler stosując następujące parametry programu am-

plifikacji:

Trzymać 5 min. 95°C5

15 sek. 95°C

30 cykli 30 sek. 65°C

60 sek. 72°C

Trzymać 5 min 72°C

10

[0087] Obecność produktów PCR (3 fragmenty o długości 260 pz; 150 pz; 140 pz) wykryto za pomocą elek-

troforezy w 2,0% żelach agarozowych barwionych bromkiem etydyny. Produkty PCR były wówczas dostępne

do hybrydyzacji, z zastosowaniem systemu wywoływania koloru streptawidyna-fosfataza alkaliczna do wizu-

alizacji wyników.

15

Przykład 2 - Hybrydyzacja

[0088] W celu wytworzenia macierzy (patrz Figura 1) na membrany nakrapiano sondy oligonukleotydowe

używając urządzenia do nakrapiania (BioGene, Zjednoczone Królestwo ) w specyficznym porządku. Po

usieciowaniu UV i dwukrotnym płukaniu 0,5x SSC, membrany wysuszono na powietrzu i pocięto na odrębne20

paski i umieszczono w 2 ml probówkach plastikowych.

[0089] Pierwszy zestaw zastosowano do skriningu izolatów i obejmował on sondy do wykrywania najczęst-

szych mutacji w genach rpoB, katG i inhA (patrz Figura 1A). Dla genu rpoB, zestaw obejmował 6 niezmuto-

wanych sond (sonda 3 do wykrywania mutacji w kodonach 511, 513 i 514; sondy 6 i 9 dla kodonów 513, 51425

i 516; sonda 12 dla kodonu 516; sonda 17 dla kodonu 526 i sonda 22 dla kodonu 531). Sondy dla typu dzi-

kiego i najbardziej częstych mutacji w genie katG (AGC→ACC w kodonie 315) i regionie regulatorowym

genu inhA (G→T w kodonie 280) były także włączone.

[0090] Opracowano drugi zestaw do skanowania, aby wykrywać inne mniej powszechne mutacje w genie30

rpoB. Zaprojektowano w sumie 27 niezmutowanych sond oligonukleotydowych dla genu rpoB, aby pokryć

cały region rdzenia 81 pz - tj. sekwencję, w której znajdują się mutacje odpowiedzialne za oporność na ry-

fampinę (patrz Figura 1 B).

[0091] Hybrydyzację przeprowadzono jak następuje. Pokrótce, produkty amplifikacji zdenaturowano przez 35

dodanie równej objętości roztworu do denaturacji (0,4 M NaOH, 0,02 M EDTA) przez 15 min. w temperaturze

pokojowej. Do każdej probówki zawierającej pojedynczy zestaw dodano 500 µl roztworu do hybrydyzacji

(5xSSPE; 0,5% SDS) i dodano 20 µl zdenaturowanych produktów PCR. Hybrydyzację przeprowadzono w

obrotowych probówkach w piecu do hybrydyzacji w 72°C przez 30 min. Membrany następnie przepłukano

dwukrotnie 0,1 M roztworem Tris-0,1 M NaCl (pH 7,5) i inkubowano przez 1 min. w 0,1 % roztworze odczyn-40

nika blokującego (Roche, Mannheim, Niemcy). Po inkubacji w roztworze koniugatu streptawidyna-fosfataza

alkaliczna (1:100) (BioGenex, San Ramon, USA) przez 30 min. w temperaturze pokojowej i płukaniu, mem-

EP 1 713 934 B1

18

brany inkubowano w roztworze 1:250 NBT-BCIP (Nitro Blue Tetrasolium, USB, Cleveland, USA, 75 mg/ml w

DMF, fosforan bromo-chloro-indolilu, USB, Cleveland, USA, 50 mg/ml w DMF) w niedostępnym dla światła

pojemniku dla wywołania barwy, płukano i suszono na powietrzu.

Sekwencjonowanie5

[0092] Sekwencjonowanie fragmentów genów rpoB i katG wybranych izolatów przeprowadzono w celu

sprawdzenia wyników testów wrażliwości na leki na makromacierzach. DNA matrycowy wytworzono jak opi-

sano powyżej przez ekstrakcję chloroformem. Produkty amplifikacji rozcieńczono 1:25 w wodzie i sekwen-

cjonowano stosując Beckman Coulter SEQ8000 Genetic Analysis System. Dane sekwencyjne analizowano 10

stosując oprogramowanie SEQ8000.

Wyniki

[0093] Wszystkie hodowle Samara (poza jedną, zidentyfikowaną jako M. fortuitum) prawidłowo zaklasyfiko-15

wano jako M. tuberculosis, stosując rutynowe testy fenotypowe w laboratorium referencyjnym.

[0094] Udała się multipleksowa amplifikacja 233/234 okazów z rosyjskich hodowli mykobakterii (z wyjątkiem

M. fortuitum). Wygląd wywołanych membran przedstawiono na Figurze 2. Wyniki testów wrażliwości na leki

na makromacierzach z przedstawiono w Tabeli 3 poniżej. 20

Tabela 3

Wyniki wykrywania oporności na ryfampinę i izoniazyd z zastosowaniem techniki skriningu z makromacierząw nowych przypadkach i przewlekłych przypadkach

Obecność mutacji Nowe przypadki (n=78) Przewlekłe przypadki (n=156)

Mutacje zgodne z opornością na RIF (gen rpoB) 32 (41,0%) 8 (56,4%)

Mutacje zgodne z opornością na INH (geny katG i inhA) 45 (57,7%) 22 (78,2%)

Mutacje zgodne z opornością zarówno na RIF i na INH

29 (37,2%) 87 (55,8%)

[0095] W sumie, 48,7% izolatów miało mutacje zgodne z opornością na ryfampinę, 67,9% izolatów z opor-

nością na izoniazyd i 46,5% izolatów miało mutacje zarówno w genach rpoB i katG (lub inhA). Wszystkie z 25

wyjątkiem jednego szczepy M. tuberculosis wyizolowane od pacjentów z przewlekłą gruźlicą z mutacjami

zgodnymi z opornością na ryfampinę miały także mutacje zgodne z opornością na izoniazyd.

[0096] Wyniki testowania genotypowej (makroamacierz) i fenotypowej wrażliwości na leki były zgodne w

90,4% dla oporności na izoniazyd i w 79,3% dla oporności na ryfampinę. Różnice w większości przypadków30

(w ponad 60% przypadków) były wynikiem oporności określonej fenotypowo przy braku mutacji związanych

z opornością zidentyfikowanych przez makromacierz do skriningu. To sugeruje, że oporność na RIF lub INH

może być także związana z innymi mutacjami.

EP 1 713 934 B1

19

[0097] Następnie przeanalizowaliśmy spektrum mutacji zgodnych z opornością na ryfampinę i izoniazyd

(patrz Figura 3). W ponad 90% przypadków, oporność na INH była wynikiem mutacji tylko w kodonie 315

genu katG. W 2,0% przypadków, oporność była wynikiem mutacji tylko w genie inhA, a w 5,1% przypadków

oba geny miały udział w powstaniu oporności (patrz Figura 3A). Ze wszystkich izolatów niosących mutacje

zgodne z opornością na RIF 90,0% miało mutacje w kodonie 531, a 4,2% w kodonie 526 genu rpoB (patrz 5

Figura 3B). Inne mutacje (w kodonach 511-516) wykryto w mniej niż 6,0% opornych szczepów. Drugą ma-

kromacierz zaprojektowano w celu wykrywania dodatkowych mutacji w obrębie regionu rdzenia 81 pz, które

mogłyby być zgodne z opornością na ryfampinę w 27 próbkach DNA M. tuberculosis, które uprzednio okre-

ślono jako „typ dziki” w zestawie do skriningu (patrz Tabela 4).

10

Tabela 4

Wyniki skanowania powtórzonego molekularnego DST dla próbek z rozbieżnościami

Wyniki macierzy

skanującej

Liczba rozbieżnych wyników

Makromacierz „typ dziki” ale fenotypowo oporny na RIF (n=27)

Makromacierz typ „zmutowany” ale fenoty-powo wrażliwy na RIF (n=20)

Mutant 20 3

Typ dziki 7 17

[0098] Z 27 izolatów M. tuberculosis, dla których uprzednio sugerowano, że należą do typu dzikiego, dwa-

dzieścia próbek (74,7%) miało dalsze mutacje zgodne z opornością na ryfampinę; ale siedem próbek

(25,9%), które były fenotypowo oporne, nie miało żadnych mutacji w regionie rdzenia.15

[0099] Aby sprawdzić wyniki testu oporności na leki za pomocą makromacierzy, zsekwencjonowano frag-

menty genów rpoB i katG w wybranych izolatach. Przeprowadzono sekwencjonowanie genu rpoB dla sied-

miu fenotypowo opornych na ryfampinę izolatów wymienionych powyżej. Stwierdzono, że dwa z tych izola-

tów miało mutacje punktowe w genie rpoB: jeden ma podstawienie CAC→CTC (H→Y) w kodonie 526, a inny 20

ma podstawienie CTG→CCG (L→P) w kodonie 533. W pięciu innych izolatach (4,2% całkowitej liczby

szczepów opornych na ryfampinę) nie wykryto mutacji, sugerując, że w tych przypadkach oporność na ry-

fampinę była wynikiem mutacji w innych genach.

[0100] Fragmenty genu katG zsekwencjonowano z 6 opornych i 6 wrażliwych izolatów wybranych zgodnie z 25

wynikami na makromacierzy. Stwierdzono, że wszystkie fenotypowo wrażliwe izolaty są typu dzikiego i nie

zawierają mutacji. W 6 izolatach mających mutacje w genie katG według makromacierzy, wykryto najbardziej

powszechne podstawienie AGC→ACC (S315T).

Dyskusja30

[0101] Połączenie wyników z dwóch makromacierzy pozwoliło na wykrycie mutacji zgodnych z opornością

w 95,3% hodowli, które były fenotypowo oporne na ryfampinę i w 90,4% hodowli, które były fenotypowo

oporne na izoniazyd. Te dane dla zgodności są wyższe niż uprzednio podawane dla niekomercyjnych sys-

temów molekularnej analizy wrażliwości na leki, potwierdzając, że włączenie dodatkowych sond do zestawu 35

EP 1 713 934 B1

20

poprawia działanie systemu. Analiza sekwencji genów rpoB i katG udowodniła, że metoda makromacierzy

jest wysoce specyficzna.

Przykład 3

5

Badane hodowle:-

[0102] Panel pierwszy. Użyto 465 opornych na INH szczepów M. tuberculosis z lub bez współistniejącej

oporności na RIF, do oceny oporności wielolekowej (MDR) z macierzą do skriningu w badaniu retrospektyw-

nym. Te szczepy przedstawiały wszystkie oporne na INH szczepy od stycznia 1998 do grudnia 2003 zgło-10

szone do jednostki referencyjnej oporności mykobakterii HPA (HPA Mycobacterial Reference Unit (MRU)).

[0103] Panel drugi. W prospektywnym badaniu funkcjonowania makromacierzy zastosowano 605 kolejnych

hodowli mykobakterii przesłanych do HPA MRU w celu identyfikacji i testowania wrażliwości na leki między

wrześniem i grudniem 2003..15

[0104] Hodowle mykobakterii hodowano na podłożach Lowenstein-Jensen lub płynnych podłożach hodow-

lanych (MGIT, Becton Dickinson, Zjednoczone Królestwo albo MB BacT Alert, Biomerieux, Cambridge, Zjed-

noczone Królestwo). Hodowle identyfikowano z zastosowaniem kombinacji wyglądu mikroskopowego i ma-

kroskopowego, cech wzrostu, testów biochemicznych i hybrydyzacji DNA (Accuprobe; Genprobe, San Die-20

go, USA). Oporność na izoniazyd i rifampicynę określono stosując metodę stopnia oporności na podłożu

Lowenstein-Jensen (REF).

Ekstrakcja DNA

25

[0105] DNA ekstrahowano z mykobakterii za pomocą ekstrakcji chloroformem. Ezę hodowli bakterii lub 100

µl podłoża hodowli płynnej przeniesiono do probówki do mikrowirówki i zawieszono w 100 µl oczyszczonej

wody i dodano równą objętość chloroformu. Probówki podgrzewano w 80°C przez 20 minut, umieszczono w

zamrażarce na 5 minut, mieszano krótko za pomocą worteksu i wirowano przez 3 minuty przy 12000 ob-

r./min. tuż przed dodaniem do PCR.30

PCR

[0106] Docelowy DNA amplifikowano za pomocą PCR stosując startery biotynylowane na końcu 5' w celu

wyznakowania produktów PCR. Mieszanina reakcyjna 20 µl zawierała 5 µl oczyszczonej wody, 10 µl 2x bu-35

foru do reakcji, 5 µl mieszaniny starterów, 0,2 µl polimerazy DNA Taq (5 jednostek/µl, Bioline) i 1 µl matrycy

DNA. 2x bufor do reakcji zawierał 2,0 ml 10x amonowego buforu do reakcji (NH4 Bioline), 600 µl 50 mM

chlorku magnezu (MgCl2, Bioline), po 40 µl każdego 100 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP, Bioline) i

7240 µl oczyszczonej wody. Mieszanina starterów zawierała 2,5 µl starterów katPGBIO i katP6BIO (200 µM

każdy), 10 µl starterów inhAP, TomiP2BIO, IP1 (de Beenhouwer i wsp., 1995) i BrpoB1420R (200 µM każdy)40

i 455 µl oczyszczonej wody.

EP 1 713 934 B1

21

[0107] Reakcję amplifikacji przeprowadzano w termocyklerze DNA (GeneAmp PCR System 9700, Applied

Biosystems, Zjednoczone Królestwo). Warunki reakcji termocyklera były 3 min. w 95°C, 15 sek. w 95°C, 30

sek. w 65°C, 60 sek. w 72°C przez 30 cykli i końcowy cykl wydłużania 5 min. w 72°C.

Makromacierz do skriningu MDR5

[0108] Makromacierz składała się z 11 sond immobilizowanych jako plamy na pasku z membrany nylonowej

(MagnaGraph Nylon Transfer Membrane 0,22 Micron, OSMONICS, USA). Pierwsza sonda (MRUMtb) była

specyficzna dla kompleksu M. tuberculosis. Cztery kolejne sondy zaprojektowano, do wykrywania oporności

na izoniazyd:- dwie sondy (katGwt i inhAwt) były homologiczne do regionów typu dzikiego każdego genu, a10

dwie (katGS315T i inhAmut) były homologiczne do najczęściej spotykanych mutacji (mutacja S315T w genie

katG i mutacja inhAC-15T na końcu 5' przypuszczalnego miejsca wiązania rybosomu w promotorze inhA).

Następne sześć sond (P3, P6, P9, P12, P17 i 1371A) zastosowano do wykrywania mutacji związanych z

opornością na rifampicynę i stanowią one cały region hiperzmienny 81 pz (RRDR) genu rpoB.

15

[0109] Stosowano starter IP1 (de Beenhouwer i wsp., (1995)) jako kontrolę wywoływania barwy, a atrament

Deskjet 690C (Hewlett-Packard, Zjednoczone Królestwo) stosowano jako punkt do orientacji.

Hybrydyzacja i wykrywanie barwy:

20

[0110] 10 µl produktów PCR denaturowano w 10 µl roztworu do denaturacji (400 mM NaOH, 20 mM EDTA).

Hybrydyzację produktów PCR do pasków nylonowych zawierających immobilizowane sondy, przeprowadzo-

no przez inkubację membran w 500 µl buforu do hybrydyzacji (5xSSPE, 0,5%SDS) w 60°C przez 15 min.

Paski płukano w ostrym buforze do płukania (0,4%SSPE, 0,5% SDS) w 60°C przez 10 min. Bufor odrzucano

i dodano 25 ml buforu do płukania (0,1 M Tris 0,1 M NaCl, pH 7,5), i mieszano przez 1 minutę w wytrząsarce25

orbitalnej. Następnie bufor odrzucano i ten etap powtarzano jeden raz.

[0111] Paski inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej w 5 ml buforu SAP (bufor do płukania,

0,5% odczynnik blokujący B-M) z 25 µl fosfatazy alkalicznej skoniugowanej ze streptawidyną (400 µg/ml),

aby wykryć zhybrydyzowane biotynylowane produkty PCR. Paski płukano dwa razy w buforze do płukania i 30

równoważono w buforze 0,1M Tris, 0,1 M NaCl (pH 9,5). Ostatecznie bufor odrzucono i membrany inkubo-

wano w 5 ml tego samego buforu zawierającego 15 µl BCIP fosforan (5-bromo-4-chloro-3-indolilu) i 10 µl

NBT (błękit nitrotetrazoliowy) przez 5 minut. Te chromogeny służyły jako substrat dla fosfatazy alkalicznej

dając wzór na pasku, który można było interpretować.

35

Wyniki

Badanie retrospektywne

[0112] W sumie 465 izolatów opornych na INH przeanalizowano za pomocą macierzy do skrinigu MDR.40

Mutacje w regionie regulatorowym mabA-inhA zidentyfikowano w 250 izolatach (53,8%). Wśród tych izolatów

sonda inhmut (specyficznie zaprojektowana by wykrywała mutację inhAC-15T) była dodatnia w 240/250 izola-

EP 1 713 934 B1

22

tów (96,0%). Sonda katGS315T (specyficznie zaprojektowana by wykrywała mutację S315T w genie katG)

wykazywała dodatni sygnał hybrydyzacji w 161/465 (34,6%) izolatów. Zarówno sondy katGwt jak i

katS315T nie hybrydyzowały w 9 (1,9%) izolatach. Cztery (0,9%) izolaty wykazały dodatni wzór katGS315T i

ujemny inhAmut i inhAwt. Czterdzieści jeden (8,8%) izolatów dało profil wrażliwy na leki.

5

Badanie prospektywne

[0113] Skrining MDR zastosowano do 609 izolatów klinicznych i wyniki porównano z rutynową identyfikacją i

testami wrażliwości na izoniazyd i rifampicynę.

10

• Wykrywanie kompleksu M. tuberculosis:

[0114] Z 609 hodowli otrzymanych w celu identyfikacji i analizy wrażliwości na leki w okresie badań, uzy-

skano produkty PCR z 497 hodowli (81,6%). Z tych 497 dodatnich reakcji stosując hybrydyzację z makroma-

cierzą, 356 (71,6%) zidentyfikowano jako kompleks M. tuberculosis, a 141 (28,4%) zidentyfikowano jako 15

niegruźlicze mykobakterie (- NTM). Z 356 hodowli zidentyfikowanych genotypowo jako kompleks M. tubercu-

losis, 353 (99,2%) potwierdzono jako kompleks M. tuberculosis za pomocą badań fenotypowych. Ze 141

zidentyfikowanych genotypowo NTM, 137 (97,2%) potwierdzono fenotypowo.

•Wykrywanie wrażliwych izolatów M. tuberculosis20

[0115] Z 356 izolatów zidentyfikowanych jako kompleks M. tuberculosis, 289 (81,2%) zidentyfikowano jako

izolaty M. tuberculosis wrażliwe na INH i RIF stosując makromacierz. Dwieście siedemdziesiąt siedem

(95,8%) było zgodnych z identyfikacją i rutynowymi testami wrażliwości; 3 (1,1 %) sklasyfikowano fenotypo-

wo jako oporne na INH, a jeden (0,3%) sklasyfikowano fenotypowo jako oporny na RIF.25

• Wykrywanie mutantów M. tuberculosis rpoB, katG i mabA-inhA

[0116] Z 356 zidentyfikowanych izolatów kompleksu MTB, 38 (10,7%) zidentyfikowano jako szczepy poje-

dynczo oporne na INH, 16 (4,5%) jako szczepy wielolekooporne ( MTB) i 13 (3,6%) jako pojedynczo oporne 30

na RIF. Z 38 izolatów M. tuberculosis opornych na INH na podstawie analizy makromacierzy 30 (78,9%)

prawidłowo zaklasyfikowano zgodnie z rutynowym testowaniem wrażliwości, 2 (5,3%) fenotypowo zaklasyfi-

kowano jako MDR-TB, i 5 (13,2%) fenotypowo zaklasyfikowano jako wrażliwe izolaty M. tuberculosis. Z tych

5 izolatów dwa dało negatywne sygnały hybrydyzacji dla sond inhAwt i inhAmut, jeden izolat miał dodatni

sygnał hybrydyzacji dla sond katGwt i katGS315T, a 2 izolaty miały dodatni sygnał dla sondy inhAmut. Son-35

da inhAmut i katGS315T były negatywne dla odpowiednio 18 i 15 izolatów. Pięć izolatów dało negatywną

reakcję z obiema sondami.

[0117] Wśród 13 izolatów M. tuberculosis opornych na sam RIF, 8 (61,5%) zidentyfikowano fenotypowo

jako oporne na RIF, 4 (30,8%) zidentyfikowano fenotypowo jako MDR-TB, a 1 (7,7%) zidentyfikowano feno-40

typowo jako wrażliwy (negatywny sygnał hybrydyzacji dla sond P3 i P6).

EP 1 713 934 B1

23

[0118] Wszystkie 16 MDR-TB zidentyfikowano fenotypowo jako MDR-TB. Z tych 16 izolatów, 12 miało do-

datni sygnał dla katGS315T, 1 dla inhAmut, a 3 dla obu sond.

[0119] Biorąc pod uwagę wszystkie szczepy określone na podstawie makromacierzy jako oporne albo na

INH albo RIF, 48/54 (88,9%) było zgodnych pod względem oporności na INH, a 28/29 (96,6%) pod wzglę-5

dem oporności na RIF.

Dyskusja

[0120] Opisana tu makromacierz do skriningu MDR stanowi szybki i czuły sposób wykrywania M. tuberculo-10

sis i określania wrażliwości na INH i RIF w izolatach klinicznych. Podstawową zasadą macierzy do skriningu

MDR opracowanego w tym badaniu jest to, że każda zmiana nukleotydu powinna blokować hybrydyzację

celu z odpowiednią sondą typu dzikiego (sondy P3, P6, P9, P17, 1371A, katGwt i inhAwt), lub pozwolić na

hybrydyzację celu i odpowiedniej zmutowanej sondy (sondy katGS315T i inhAmut).

15

[0121] Reakcja PCR była dodatnia dla wykrywania kompleksu M. tuberculosis w 356 z 363 izolatów (czu-

łość 98,1 %) od pacjentów, których później diagnozowano za pomocą technik konwencjonalnych. Osiem

izolatów, zaklasyfikowanych jako M. tuberculosis za pomocą rutynowych procedur identyfikacji, nie zostało

zidentyfikowanych przez makromacierz. Tylko 1 izolat z 356 dodatnich PCR dla kompleksu M. tuberculosis

był zidentyfikowany fenotypowo jako NTM (swoistość 99,7%).20

[0122] Wyniki makromacierzy do skriningu MDR były zgodne z wynikami konwencjonalnej identyfikacji i

testowania wrażliwości dla 331 z 356 przypadków M. tuberculosis (93,0%) i 137 ze 141 izolatów NTM

(97,2%). Niektóre z rozbieżnych izolatów wykazywały wzory na macierzy typu dzikiego, ale było sklasyfiko-

wanych fenotypowo jako oporne (3 oporne na izoniazyd i jeden oporny na rifampicynę) lub były fenotypowo 25

sklasyfikowane jako MDR-TB i miały wzór makromacierzy o pojedynczej oporności na RIF lub pojedynczej

oporności na INH. Uprzednie badania wykazały, że około 4% izolatów opornych na RIF i 30-40% izolatów

opornych na INH nie ma mutacji w obrębie regionu 81-pz genu rpoB (region związany z opornością na RIF) i

w obrębie regionu regulatorowego operonu mabA-inhA/ w genie katG, odpowiednio.

30

[0123] Ponad 95% szczepów opornych na RIF jest związanych z mutacjami w obrębie regionu 81-pz genu

rpoB. Macierz stosowana w tym badaniu jest zdolna do wykrywania znanych mutacji, w tym, mutacji punkto-

wych, insercji i delecji, ponieważ sondy umieszczone w macierzy stanowią cały region hiperzmienny 81 pz

typu dzikiego. Ta makromacierz ma potencjał do szerokiego zastosowania, ponieważ nie ma znaczących

różnic w rozmieszczeniu globalnym mutacji w rpoB.35

[0124] Macierz stosowana w tym badaniu jest prosta do wykonania i interpretacji, wymaga tylko podstawo-

wej znajomości biologii molekularnej, aby ją z powodzeniem wykonać. Choć sekwencjonowanie DNA jest

proste dla laboratoriów, w których jest już rutynowo przeprowadzane, koszt wyposażenia i jego utrzymania

nie czynią go ekonomicznym wariantem dla wielu laboratoriów klinicznych. Koszt naszej macierzy jest waż-40

nym czynnikiem dla jej szerokiego zastosowania. Ten zestaw korzystnie kosztuje mniej niż $5, podczas gdy

handlowy zestaw INNOLiPA kosztuje $720 i wykrywa tylko oporność na RIF.

EP 1 713 934 B1

24

[0125] W tym badaniu wykazano potencjał makromacierzy MDR do testowania różnych celów. Opisana tu

macierz może być rozszerzona w celu wykrywaniaa innych specyficznych mutacji w genie katG. Można rów-

nież dodać markery epidemiologiczne do macierzy do testowania związanego z epidemiami lub sporadycz-

nego rozprzestrzeniania się szczepów.5

Przykład 4

Izolaty bakterii

10

[0126] Zebrano panel 40 izolatów M. tuberculosis w celu podaniać zakresu genotypów w loci rpoB RRDR,

katG315 i mabA-inh-15. Te izolaty hodowano na LJ i przeprowadzono testy wrażliwości na leki stosując me-

todę stopnia oporności na podłożach Lowenstein-Jensen.

Przygotowanie ekstraktów DNA15

[0127] Pastę komórek z podłoża LJ zawieszono w 100 µl oczyszczonej wody i dodano równą objętość chlo-

roformu. Probówki podgrzano w 80°C przez 20 minut, umieszczono w zamrażarce na 5 minut i krótko wy-

mieszano stosując mieszalnik typu worteks. Bezpośrednio przed użyciem jako matrycy do PCR próbówki

wirowano przez 3 minuty przy 12000 obr./min.20

PCR

[0128] Biotynylowane docelowe produkty PCR wygenerowano w 20 µl multipleksowej PCR. Zawierała ona

1 x amonowy bufor do reakcji (Bioline Ltd., Londyn, Zjednoczone Królestwo), dNTP po 0,2 mM każdy

(Amersham Biosciences, Chalfont St Giles, Zjednoczone Królestwo), MgCl2 1,5 mM (Bioline), startery25

KatGP5IO i KatGP6BIO po 0,25 mM, startery INHAP3BIO, TOMIP2BIO, FTP1BIO i BrpoB1420R po 1 mM

(ThermoHybaid, Ulm, Niemcy), 1 jednostkę polimerazy Taq (Bioline) i 1 µl matrycy DNA. Sekwencje starte-

rów podano w Tabeli 2. Cykle termiczne przeprowadzono na Perkin Elmer 9700 Thermocycler stosując na-

stępujący program: 5 min. w 95°C, 30X(30sek. w 65°C, 60sek. w 72°C), trzymać 5min. w 72°C.

30

Konstrukcja makromacierzy do skriningu MDR

[0129] Do wytworzenia makromacierzy użyto 10 sond zilustrowanych w Tabeli 1, powyżej, użyto do wypro-

dukowania makromacierzy, razem z dodatkową sondą ukierunkowaną na specyficzne dla kompleksu M.

tuberculosis locus rpoB M. tuberculosis. Sondy 1-4 z Tabeli 1 są zaprojektowane do analizy loci związanych35

z opornością na INH. Sondy 1 i 3 (K315WTC i tomiwt), wykrywają genotypy typu dzikiego (WT) w katG315 i

w mabA-inhA-15, podczas gdy sondy 2 i 4 (K315GC i tomimut1), wykrywają najczęściej spotykany genotyp w

każdym locus, katG315AGC→ACC i mabA-inhA -15C→T odpowiednio. Sondy 6-10 (MRURP3, MRURP6,

MRURP9, MRURP12, MRURP17 i MRU1371A) tworzyły macierz do skanowania do wykrywania genotypu

WT z RRDR rpoB M. tuberculosis. W celu zoptymalizowania działania sondy w obrębie macierzy, sondy 40

oligonukleotydowe zsyntetyzowano z ogonami 3' poli-T. Sondy oligonukleotydowe (Invitrogen, Paisley, Zjed-

noczone Królestwo) rozcieńczono do 20 µM w wodzie zawierającej 0,001 % błękit bromofenolowy i nano-

EP 1 713 934 B1

25

szono na membranę nylonową (Magnagraph 0,22 µM, Osmonics, Minnetonka USA) stosując ręczne urzą-

dzenie do macierzy (VP Scientific, San Diego USA).

[0130] Oprócz sond, na membranę naniesiono plamę z trwałego atramentu w celu zorientowania zestawu i

plam startera FTIP1BIO w stężeniu 2 µM jako kontrol wywoływania barwy. Sondy połączono z membraną 5

nylonową za pomocą wiązania krzyżowego UV. Membrany przepłukano w 0,5% 20XSSC (Sigma, Poole,

Zjednoczone Królestwo) następnie wysuszono, pocięto i umieszczono w 2 ml polietylenowej probówce do

hybrydyzacji (Alpha Labs, Eastleigh, Zjednoczone Królestwo).

Hybrydyzacja i wykrywanie barwy10

[0131] Znakowane biotyną produkty PCR zdenaturowano przez dodanie równej objętości roztworu do dena-

turacji (0,4 M NaOH, 0,02 M EDTA) i inkubację w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Próbkę 20 µl zde-

naturowanego PCR dodano do probówki zawierającej macierz i 500 µl roztworu do hybrydyzacji (5xSSPE;

0,5% SDS), który mieszano w piecu do hybrydyzacji w 60°C przez 15 minut. Paski następnie przemyto bufo-15

rem do przemywania (0,4% SSPE, 0,5% SDS) w 60°C przez 10 min. w piecu do hybrydyzacji. Następnie

zestawy wytrząsano w buforze do płukania (0,1 M Tris 0,1 M NaCl, pH 7,5) w temperaturze pokojowej (RT)

przez 1 minutę. Etap płukania powtórzono jeszcze raz stosując bufor do płukania zawierający 0,1 % odczyn-

nik do blokowania (Roche, Lewes Królestwo Zjednoczone). Zestawy następnie wytrząsano w temperaturze

pokojowej RT przez 15 minut w buforze do płukania z 0,1 % odczynnikiem blokującym i 1/25 rozcieńczeniem 20

koniugatu streptawidyna-fosfataza alkaliczna przy 400 µg/ml (BioGenex, San Ramon USA). Membrany na-

stępnie przemyto dwukrotnie roztworem do przemywania i jeden raz buforem substratowym (0,1 M Tris, 0,1

M NaCl, pH 9,5) przed inkubacją w RT przez 5 minut w buforze substratowym zawierającym 0,34 mg/ml

NBT (USB, Cleveland, USA) i 0,17mg/ml BCIP (USB). Membrany przepłukano wodą przed wysuszeniem ich

na powietrzu i zapisano wzory hybrydyzacji.25

Interpretacja makromacierzy

[0132] Hybrydyzacja z dowolną z sond skierowanych na rpoB jest wskazaniem genotypu typu dzikiego w

tym locus, przeciwnie, brak hybrydyzacji z daną sondą rpoB jest wskazaniem genotypu mutanta w tym locus. 30

Hybrydyzacja z K315WTC jest wskazaniem genotypu katG315 WT, podczas gdy jej brak jest wskazaniem

genotypu mutanta w tym locus lub jego otoczeniu. Brak hybrydyzacji z K315WTC i hybrydyzacja z K315GC

jest wskazaniem genotypu katG315 AGC>ACC. Podobnie, hybrydyzacja z TOMIWT jest wskazaniem geno-

typu mabA-inhA-15 WT, podczas gdy brak jej jest wskazaniem genotypu mutanta w tym locus lub jego oto-

czeniu. Brak hybrydyzacji z TOMIWT i hybrydyzacja z TOMIMUT1 jest wskazaniem genotypu mabA-inhA-3515C→T.

Sekwencjonowanie DNA

[0133] Zastosowano pojedyncze pary starterów (patrz Tabela 2, powyżej) do wygenerowania pojedynczych 40

produktów rpoB, katG lub inhA PCR stosując sposób podany powyżej. Rozcieńczono je 1/100 w oczyszczo-

nej wodzie i sekwencjonowano stosując zestawy CEQ Quick Start do sekwencjonowania i przyrząd CEQ

EP 1 713 934 B1

26

8000 (Beckman Coulter, High Wycombe, Zjednoczone Królestwo ) zgodnie z instrukcjami producenta. Pro-

dukty PCR sekwencjonowano w obu kierunkach stosując startery do amplifikacji podane w Tabeli 2, powy-

żej.

Wyniki5

[0134] Panel 40 izolatów M. tuberculosis zawierał 30 izolatów MDR, 5 izolatów o pojedynczej oporności na

RIF, 1 izolat o pojedynczej oporności na INH i 4 izolaty wrażliwe na RIF i INH. Sekwencjonowanie RRDR

rpoB tych izolatów wykazało 36 różnych genotypów oprócz WT. Analiza kodonów najczęściej związanych z

opornością na RIF wykazała dwie różne mutacje w kodonie 531, 6 różnych mutacji w kodonie 526 i 4 różne 10

mutacje w kodonie 516. Zaobserwowano również mutacje w kodonach 509, 511, 513, 515, 522, 528, 529 i

533. Siedem izolatów zawierało dwa oddzielne podstawienia pojedynczych zasad, cztery izolaty zawierały

insercje, a trzy zawierały delecje. Określono genotyp katG315 i mabA-inhA-15 28 z izolatów. Trzy genotypy

oprócz WT stwierdzono w katG315 i podstawienie C do T oprócz WT stwierdzono w w mabA-inhA-15 . Geno-

typy poszczególnych izolatów przedstawiono w Tabeli 5, poniżej. 15

Tabela 5

IzolatWrażliwość

według fenotypugenotyp

katG315/ mabA-inhA-15

genotyp rpoB Sondy niehybrydy-zujące

Wrażliwość według zestawu

INH RIF INH RIF

01/07786 R R 1302C>G / S509R + 1351C>T / H526Y

P2 P5 P10 R R

236-02 R R AGC>ACC /WT 1307T>C / L511P + 1322A>G / D516G

P2 P5 P8 P7 R R

98/05219 S R 1307T>C / L51 1 P + 1351C>G / H526D

P3 P5 P6 P10 S R

2936-99 R R WT/WT 1312C>A / Q513K P3 P5 P6 P7 S R

Is20043 R R 1313A>C / Q513P P2 P5 P6 P7 R R

98/05844 R R AGC>AAC/ WT 1313A>T / Q513L P2 P3 P5 P6 P7 R R

02/07435 R R 1314 CCAACT ins 513

P2 P5 P6 P7 R R

2651-96 R R AGC>ACC /WT 1315 TTC ins 514 P2 P5 P6 P7 R R

Is14373 R R 1315-1323 Del TT-CATGGAC 514-516

P2 P5 P6 P7 R R

Is11195 R R WT/WT 1316-1318 Del TCA 514-515

P3 P5 P6 P7 S R

Is14786 R R 1318A>G / M515V + 1351C>A / H526N

P3 P4 P6 P7 P10 R R

1763-97 R R AGC>AAC/ WT 1318lns ATTCAT 515 P2 P3 P5 P6 P7 R R

98/07530 R R 1320G>A / M515I P2 P5 P7 P8 R R

2883-97 R R AGC>ACC /WT 1321-26 Del GAC-CAG 516-517

P2 P5 P6 P7 P8 R R

EP 1 713 934 B1

27

IzolatWrażliwość

według fenotypugenotyp

katG315/ mabA-inhA-15

genotyp rpoB Sondy niehybrydy-zujące

Wrażliwość według zestawu

INH RIF INH RIF

Is11125 R R AGC>ACC /WT 1321-2GA>TT / D516F

P2 P4 P7 R R

1579-96 S R WT/WT 1321G>T / D516Y P3 P5 P7 S R

Is14027 R R 1322A>G / D516G P3 P4 P7 P10 R R

1004-01 R R AGC>ACA/ WT 1322A>T / D516V P5 P7 R R

1071-98 R R AGC>ACC /WT 1322A>T / D516V + 1351C>G / H526D

P2 P5 P6 P7 P8 P10

R R

98/00699 R R 1334 AGAACAACC ins 520

P3 P4 R S

1992-00 R R WT/WT 1339-40TC>CA / S522Q

P3 P5 P9 S R

1445-01 R R AGC>ACC /WT 1340C>G / S522W P2 P5 P9 R R

395-98 R R AGC>ACC /WT 1340C>T / S522L P2 P5 P9 R R

03/02007 R R WT/WT 1350-1 CC>TT / T525 + 1351C>T / H526Y

P3 P5 P10 S R

2323-02 R R AGC>ACC /WT 1351-2CA>TG / H526C

P2 P5 P10 R R

1828-00 R R WT/inhA C-15T 1351C>G / H526D P3 P4 P10 R R

2031-02 S R WT/WT 1351C>T / H526Y P3 P5 P10 S R

3381-97 R R AGC>ACC /WT 1352 A>G / H526R P2 P5 P10 R R

740-97 R R AGC>ACC /WT 1352A>C / H526P P2 P5 P10 R R

1810-96 R R AGC>AAC/ WT 1352A>T / H526L P2 P3 P5 P10 R R

01/03682 S S 1359C>T / R528R P3 P5 P10 S R

02/06539 S R 1361G>C / R529P P3 P5 P10 S R

1255-98 R R WT/inhA C-15T 1363C>A / L530M + 1367C>T / S531 L

P3 P4 P6 P7 P11 R R

01/11196 R R 1367C>G / S531W P2 P5 P11 R R

Is5 R R WT/WT 1367C>T / S531L P3 P5 P11 S R

02/03056 S R WT/WT 1373T>C / L533P P3 P5 P11 S R

03/06044 S S WT/WT WT P3 P5 S S

03/04307 S S WT/WT WT P3 P5 S S

03/05269 S S WT/WT WT P3 P5 S S

1182-01 R S AGC>ACA/ WT WT P5 R S

[0135] Surowe ekstrakty DNA z każdego z izolatów w panelu analizowano stosując makromacierz do skri-

ningu MDR, której wzór przedstawiono na Figurze 4, jako reprezentacyjne przykłady opracowanych macie-

rzy. Wszystkie izolaty wytworzyły możliwe do interpretacji wzory hybrydyzacji z macierzą i w 39 z 40 wykryto

mutacje, gdy były obecne. Jeden izolat, dla którego nie stwierdzono genotypu mutanta stosując macierz,5

EP 1 713 934 B1

28

zawierał insercję dziewięciu par zasad w RRDR rpoB. Wszystkie inne izolaty prawidłowo zidentyfikowano

jako mutanty lub typ dziki. Wykryto mutację we wszystkich 35 izolatach opornych na RIF. Wykryto także

mutację w izolacie wrażliwym na RIF, który rzeczywiście niósł mutację synonimiczną. Stosując macierz mu-

tacje w katG315 lub mabA-inhA-15 w dwudziestu siedmiu z 31 izolatów opornych na INH, pozostałe cztery

były typu dzikiego w tych loci.5

[0136] Kodony aminokwasów 516, 526 i 531 są najbardziej powszechnymi kodonami biorącymi udział w

oporności na ryfampinę. Te trzy kodony mogą być odpowiedzialne za 80% przypadków M. tuberculosis

opornych na RIF. Wszystkie izolaty z mutacjami w tych pozycjach zidentyfikowano prawidłowo. Allele zmu-

towane rpoB531, rpoB526 i rpo516 wykazały negatywny sygnał hybrydyzacji ze swoimi odpowiednimi son-10

dami (patrz Figura 4B, wzory 4, 1 i 7).

[0137] Prawidłowo zidentyfikowano inne mniej częste mutacje w kodonach 511, 513, 515, 522, 529 i 533 i 6

podwójnych pojedynczych mutacji, 3 różne delecje i dwie insercje. Tylko jeden szczep z insercją 9 nukleoty-

dów (AGAACAACC) w kodonie 520 zidentyfikowano nieprawidłowo.15

[0138] Cztery izolaty z opornością MDR wykazały wzór typu dzikiego dla oporności na izoniazyd z dodatnim

sygnałem hybrydyzacji dla sond katGwt i inhA; Jest to możliwe, ponieważ oporność na izoniazyd jest wywo-

łana przez szereg różnych mutacji w kilku loci chromosomalnych M. tuberculosis. Mutacje w katG i regionie

regulatorowym operonu mabA-inhA nie zostały wykryte uokoło 30-50% izolatów M. tuberculosis opornych na 20

INH.

[0139] Wszystkie izolaty ze znanymi sekwencjami istotnej części genu katG i regionu regulatorowego ope-

ronu mabA-inhA zidentyfikowano prawidłowo. Prawidłowo zidentyfikowano oporne na INH izolaty M. tuber-

culosis z różnymi mutacjami w pozycji aminokwasu 315 w genie katG . Oporne na INH izolaty z mutacją 25

S315T miały wzór z negatywnym sygnałem hybrydyzacji w katGwt i dodatnim sygnałem hybrydyzacji dla

sondy katGmut (Figura 1 B(2)). Różne inne mutacje (S315 ACA, S315 AAC lub S315 AGG) wykazały wzór z

negatywnym sygnałem hybrydyzacji dla obu sond (Figura 1B(5)). Oporne na INH izolaty M. tuberculosis z

mutacją inhAC-15T wykazały negatywny sygnał hybrydyzacji dla sondy inhAwt, a dodatni sygnał hybrydyzacji

dla sondy inhAmut (Figura 1 B(6)).30

Dyskusja

[0140] Wykrywanie oporności na leki w izolatach M. tuberculosis przez określenie genotypu jest atrakcyjną

alternatywą dla konwencjonalnego fenotypowego badania wrażliwości, ponieważ można uzyskać wyniki w 35

ciągu godzin z minimalną manipulacją żywym organizmem. Oczywiście to podejście może być tylko stoso-

wane, gdy zidentyfikowano genotypowe markery dla oporności na leki. Tak jest w przypadku MDRTB, gdzie

szereg mutacji w RRDR rpoB jest wysoce swoistych dla izolatów opornych na RIF i 2 mutacje punktowe,

jedna w genie katG i jedna związana z inhA, są wysoce swoiste dla izolatów opornych na INH. Przez analizę

tych 3 różnych loci można zidentyfikować MDRTB. Stosując analizę makromacierzy można analizować rów-40

nolegle wszystkie te loci. Opisaliśmy takie oparte na makromacierzy oznaczenie do wykrywania MDRTB

powyżej. Zasada oznaczenia skriningowego MDR polega na tym, że mutacja powinna przeszkadzać w hy-

EP 1 713 934 B1

29

brydyzacji celu z odpowiednią sondąWT lub w przypadku loci katG315 lub inhA, powinna pozwolić na hy-

brydyzację z odpowiednią zmutowaną sondą. Można było wykryć 35/36 różnych mutacji w RRDR rpoB, 3/3

różnych mutacji w katG315 i 1/1 w inhA-15.

[0141] Gdy określa się wrażliwość na podstawie genotypu, są trzy źródła rozbieżności z bardziej definityw-5

nym testowaniem fenotypowym. Po pierwsze, oporny izolat może nie zawierać markera. Zgodnie z literaturą

obseruje się to to w <5% izolatów opornych na RIF i między 10 a 30% izolatów opornych na INH przy stoso-

waniu markera używanego w tym badaniu. Ten typ rozbieżności wystąpił w 4 izolatach opornych na INH w

tym badaniu. Identyfikacja kolejnych markerów i włączenie ich do oznaczenia zmniejszyłaby te rozbieżności.

Po drugie, wrażliwy izolat może zawierać synonimiczną mutację, która, gdy będzie wykryta prowadziłaby do 10

określenia izolatu jako opornego. Jakiekolwiek rozbieżności powodowane przez synonimiczne mutacje w loci

stosowanych w tym oznaczeniu mogą być zmniejszone przez identyfikację tych mutacji albo za pomocą

sekwencjonowania zmutowanych loci albo przez włączenie na makromacierzy sond skierowanych na

wszystkie możliwe mutacje. Jeden taki mutant rpoB napotkano w obecnym badaniu. Trzecim źródłem roz-

bieżności jest niezdolność do prawidłowego wykrycia mutacji, które są obecne. Ten typ rozbieżności jest 15

zminimalizowany w tym oznaczeniu przez staranne dobranie stosowanych sond. Ponieważ trudno jest prze-

widzieć zachowanie w hybrydyzacji danej kombinacji sondy i celu, jest niezbędna walidacja wszystkich sond

z potencjalnymi celami. W tym badaniu nie wykryto tylko jednej mutacji. Była to insercja 9 zasad, która w

efekcie powodowała niesparowanie 3 zasad na końcu 5' sondy z 22 zasad MRURP9 (Sonda 7 z Tabeli 1),

co przypuszczalnie nie destabilizowało dupleksu hybrydyzacyjnego w wystarczającym stopniu, aby zapobiec 20

wykryciu hybrydyzacji.

[0142] W podumowaniu, opisana powyżej makromacierz do skriningu MDR wykrywała izolaty kompleksu M.

tuberculosis oporne na izoniazyd i/lub rifampicynę, dwa najważniejsze leki w leczeniu gruźlicy. Oznaczenie

jest proste do przeprowadzenia i interpretacji i mogłoby być włączone do rutynowej praktyki laboratoriów 25

klinicznych, choć najbardziej użytecznie w obszarach z wysoką częstością występowania MDR M. tubercu-

losis.

[0143] Powyższe Przykłady wykazują szerokie zastosowanie makromacierzy zawierających sondy według

niniejszego wynalazku do wykrywania mutacji zgodnych z opornością na RIF i INH u gatunków Mycobacte-30

rium, w szczególności u członków kompleksu Mycobacterium tuberculosis, takich jak M. tuberculosis. Ten

system jest prosty i bezpieczny w stosowaniu i pozwala na szybką identyfikację MDRTB. To oznaczenie

prowadzi więc do wcześniejszego wprowadzenia odpowiedniej chemioterapii, w ten sposób poprawiając

prawdopodobieństwo wyleczenia danej osoby i ogólnie poprawiając zdrowie publiczne.

35

Literatura

[0144]

Kruuner A, Hoffner SE, Sillastu H, Danilovits M, Levina K, Svenson SB et.al. Spread of drug-resistant pul-

monary tuberculosis in Estonia. J.Clin. Microbiol. 2001; 39: 3339-4540

World Health Organization, International Union Against Tuberculosis. Antituberculosis drug resistance in the

world. Geneva, Switzerland, 2000.

EP 1 713 934 B1

30

Pablos-Mendez A, Raviglione MC, Laszlo A, i wsp. Global surveillance przez antituberculosis-drug oporność,

1994-1997. N Engl J Med 1998; 338:1641-9

Perelman MI. TB control analysis in Russia in 2001. Problemy tuberculeza. 2003; 2:3-11 (in Russian).

KruunerA, Sillastu H, Danilovits M, Levina K, Svenson SB Hoffner SE, Kallenius G. et.al. Drug resistant tu-

berculosis in Estonia. Int. J.Tuberc. Lung. Dis. 1998; 2: 130-335

Toungoussova OS, Sandven P, Mariandyshev AO, Nizovtseva NI, Bjune G, Caugant DA. Spread of drug-

resistant Mycobacterium tuberculosis szczeps of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J Clin

Microbiol. 2002;40:1930-7

Drobnievski FA, Balabanova YM, Ruddy M, Weldon L, Jeltkova K, Brown T. i wsp. Ryfampina- i Multidrug-

resistant tuberculosis in Russian civilians i prison inmates: dominance of the Beijing szczep family. Emerg. 10

Infect. Dis. 2002; 8:1320-1326

Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T, i wsp. High prevalence of KatG Ser315Thr Substitution among Izo-

niazyd-Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from Northwestern Russia, 1996 to 2001.

Antimicr Agent Chemother 2002; 46: 1417-24

Munsiff SS, Bassoff T, Nivin B, Li J, Sharma A, Bifani P, Mathema B i wsp. Molecular epidemiology of multi-15

drug-resistant tuberculosis, New York City, 1995-1997. Emerg Infect Dis. 2002; 8:1230-8

Agerton T,Valway SE, Blinkhorn RJ, Shilkret KL, Reves R, Schluter WW i wsp. Spread of szczep W, a highly

drug-resistant szczep of Mycobacterium tuberculosis, across the United States. Clin. Infect. Dis. 1999; 29:

85-92

Breathnach AS, De Ruiter A. Holdsworth GMC, Bateman NT, O'Sulliovan DGM Rees PJ, i wsp. An outbreak 20

of multi-drug resistant tuberculosis in a London teaching hospital. J.Hosp. Infect. 1998; 39:111-7

Espinal MA. The global situation of MDR-TB. Tuberculosis 2003; 83:44-51

TB microbiological diagnostics standardization. USSR Ministry of healthcare Order No 558, 8/06/1978. (in

Russian).

Rattan A, Kalia A, Ahmad N. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives. Emerg 25

Infect Dis. 1998;4:195-209

Bodmer T, Zurcher K, Imboden P, Telenti A. Mutacja position i type of substitution in the b-subunit of the

RNA polymerase influence in-vitro activity of rifampicins in Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis.

J. Antimicr. Chemother. 1995; 35:345-48

Fluit AC, Visser MR, Schmitz RJ. Molecular Detection of Antimicrobial Oporność. Clin. Microbiol.Rev. 2001; 30

14: 836-71

Musser JM Antimicrobial agent oporność in Mycobacteria: molecular genetic insights. Clin. Micr. Rev.1995;

8:496-514

Alvarado-Esquivel C, Rossau R, Martinez-Garcia S i wsp. Characterization of rpoB gene mutacje in rifampi-

cin resistant Mycobacterium tuberculosis szczeps isolated from pulmonary tuberculosis patients at 5 Mexican 35

public hospitals. Rev Invest Clin 2001; 56:526-530

Bártfal Z, Somoskövi A, Ködmön C i wsp. Molecular Characterization of ryfampina-resistant izolaty of Myco-

bacterium tuberculosis from Hungary by DNA sekwencjonowanie i the line sondę assay. Clin Microbiol.

2001; 39:3736-39

Zhang Y., Heym B., Allen B. i wsp. The Catalase-peroxydase Gene i izoniazyd Oporność of Mycobacterium 40

tuberculosis. Nature. 1992; 358: 591-93

EP 1 713 934 B1

31

Wilson TM, Collins DM. AhpC, a gene involved in izoniazid oporność of the Mycobacterium tuberculosis

complex. Molecular Microbiology. 1996; 19: 1025-34

Garcia de Viedma G. Rapid detection of oporność in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing mole-

cular approaches. Clin Microbiol Infect. 2002; 9:349-359

van Rie A, Warren R, Mshanga I i wsp. Analysis przez a limited number of gene kodons can predict drug 5

oporność of Mycobacterium tuberculosis in a high-incidence community. Clin. Microbiol. 2001; 39: 636-641.

Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. Organization i Practice. 2nd Edition. 1997;

Oxford: Butterworth-Heinemann.

Yates MD, Drobniewski FA, Wilson SM Evaluation of a rapid PCR-based epidemiological typing method

przez routine studies of Mycobacterium tuberculosis J.Clin. Microbiol 2002; 40:712-4.10

Ahmad, S., E. Fares, G. F. Araj, T. D. Chugh, i A. S. Mustafa. 2002. Prevalence of S315T mutacja within the

katG gene in izoniazyd-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis izolaty from Dubai i Beirut. Int. J. Tu-

berc. Lung Dis. 6: 920-926.

Bakonyte, D., A. Baranauskaite, J. Cicenaite, A. Sosnovskaya, i P. Satakenas. 2003. Molecular characteriza-

tion of izoniazyd-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical izolaty in Lithuania. Antimicrob. Agents Che-15

mother. 47: 2009-20011

Martilla, H., H. Soini, E. Eerola, E. Vyshnevskaya, B. Vyshnevskiy, T. Otten, A. Vasilyef, i M. Viljanen. 1998.

A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobac-

terium tuberculosis izolaty originating from the St. Petersburg area in Russia. Antimicrob. Agents Chemother.

42: 2443-2445.20

Tracevska, T., I. Jansone, L. Broka, O. Marga, i V. Baumanis. 2002. Mutacje in the rpoB i katG genes lead-

ing to drug oporność in Mycobacterium tuberculosis in Latvia. J. Clin. Microbiol. 40: 3789-3792.

Narvskaya, O., Otten, T., Limeschenco, E., Sapozhnikova, N., Graschenkova, N., Steklova, L., Nikonova, A.,

Filipenko, M.L., Mokrousov, I., Vyshnevskiy. B., 2002. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculo-

sis caused by a szczep of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg Russia. Eur. J. Clin 25

Microbiol. Infect Dis. 21, 596-602.

Davies, P.D., 2003. The worldwide increase in tuberculosis: how demographic changes, HIV, infection i in-

creasing numbers in poverty are increasing tuberculosis. Ann. Med. 35-235-243.

De Beenhouwer, H., Liang, Z., Jannes, G., Mijs, W., Machtelinckx, L., Rossau, R., Traore, H., Portaels, F.,

1995. Rapid detection of ryfampina oporność in sputum i biopsy specimens from tuberculosis patients by 30

PCR i line sondę assay. Tubercle Lung. Dis. 76, 425-430.

Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. Organization i Practice. 2nd Edition. 1997;

Oxford: Butterworth-Heinemann.

Brown, T., Anthony,R., 2000.The addition of low numbers of 3' thymine bases can be used to improve the

hybrydyzacja sygnał of oligonukleotydów przez use within arrays on nylon supports. J Micro Methods. 35

42,203-207.

Bifani, P.J., Plikaytis, B., Kapur, V., Stockbauer, K., Pan, X., Lutfey, M.L., Moghazeh, S.L., Eisner, W., Da-

niel, T.M, Kaplan, M.H., Crawford, J.T., Musser, J.M., Kreiswirth, B.N., 1996. Origin i interstate spread of

New York City multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clone family. JAMA. 275,452-457.

40

EP 1 713 934 B1

32

LISTA SEKWENCJI

[0145]

<110> Health Protection Agency

<120> Oznaczenie oporności TB5

<130> P26141WO-MRM/PJG

<150> GB 0403039.1

<151> 2004-02-11

<160> 78

<170> PatentIn version 3.210

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>15

<223> sonda

<400> 1

ctcgatgccg ctggtgatcg c 21

<210> 2

<211> 2120

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 225

gcgatcacca ccggcatcga 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna30

<220>

<223> sonda

<400> 3

ggcgagacga taggttgtcg g 21

<210> 435

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda40

<400> 4

ggcgagatga taggttgtcg g 21

EP 1 713 934 B1

33

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>5

<223> sonda

<400> 5

gccagctgag ccaattcatg gac 23

<210> 6

<211> 2410

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 615

gccaattcat ggaccagaac aacc 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna20

<220>

<223> sonda

<400> 7

tggaccagaa caacccgctg tc 22

<210> 825

<211> 22

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda30

<400> 8

acaacccgct gtcggggttg ac 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA35

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 9

ggttgaccca caagcgccga c µ2140

<210> 10

<211> 23

EP 1 713 934 B1

34

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 105

cgactgtcgg cactggggcc cgg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna10

<220>

<223> sonda

<400> 11

cagccagcca gctgagccaa ttc 23

<210> 1215

<211> 23

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda20

<400> 12

ccagccagct gagccaattc atg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA25

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 13

agctgagcca attcatggac cag 2330

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>35

<223> sonda

<400> 14

tgagccaatt catggaccag aaca 24

<210> 15

<211> 2440

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

EP 1 713 934 B1

35

<220>

<223> sonda

<400> 15

aattcatgga ccagaacaac ccgc 24

<210> 165

<211> 23

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda10

<400> 16

tcatggacca gaacaacccg ctg 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA15

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 17

accagaacaa cccgctgtcg gg 2220

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>25

<223> sonda

<400> 18

agaacaaccc gctgtcgggg tt 22

<210> 19

<211> 2130

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 1935

acccgctgtc ggggttgacc c 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna40

<220>

<223> sonda

EP 1 713 934 B1

36

<400> 20

cgctgtcggg gttgacccac aa 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA5

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 21

tgtcggggtt gacccacaag cg 2210

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>15

<223> sonda

<400> 22

cggggttgac ccacaagcgc c 21

<210> 23

<211> 2220

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 2325

tgacccacaa gcgccgactg tc 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna30

<220>

<223> sonda

<400> 24

cccacaagcg ccgactgtcg g 2135

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>40

<223> sonda

EP 1 713 934 B1

37

<400> 25

acaagcgccg actgtcggcg c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA5

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 26

agcgccgact gtcggcgctg g 2110

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>15

<223> sonda

<400> 27

gccgactgtc ggcgctgggg c 21

<210> 28

<211> 2120

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 2825

gactgtcggc gctggggccc g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna30

<220>

<223> sondę

<400> 29

tgtcggcgct ggggcccggc 20

<210> 3035

<211> 20

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda40

<400> 30

cggcgctggg gcccggcggt 20

EP 1 713 934 B1

38

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>5

<223> sondę

<400> 31

cgctggggcc cggcggtctg 20

<210> 32

<211> 2110

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sondę

<400> 3215

tggggcccgg cggtctgtca c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna20

<220>

<223> lewy starter

<400> 33

cgctggagca gatgggcttg g 21

<210> 3425

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> prawy starter30

<400> 34

gtcagctccc actcgtagcc g 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA35

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> lewy starter

<400> 35

gcagccacgt tacgctcgtg g 2140

<210> 36

<211> 21

EP 1 713 934 B1

39

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> prawy starter

<400> 365

cgatcccccg gtttcctccg g 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna10

<220>

<223> lewy starter

<400> 37

ggtcggcatg tcgcggatgg 20

<210> 3815

<211> 21

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> prawy starter20

<400> 38

gtagtgcgac gggtgcacgt c 21

<210> 39

<211> 10

<212> DNA25

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 39

accagcggca 10

<210> 40

<211> 1030

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 40

gccggtggtg 10

<210> 4135

<211> 10

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 41

tatcgtctcg 1040

<210> 42

<211> 10

EP 1 713 934 B1

40

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 42

tatcatctcg 10

<210> 435

<211> 10

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 43

gaattggctc 1010

<210> 44

<211> 10

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 4415

ctggtccatg 10

<210> 45

<211> 10

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis20

<400> 45

ggttgttctg 10

<210> 46

<211> 10

<212> DNA25

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 46

cccgacagcg 10

<210> 47

<211> 1030

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 47

gcttgtgggt 10

<210> 4835

<211> 10

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 48

ccagtgccga 1040

<210> 49

<211> 15

EP 1 713 934 B1

41

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 49

atcaccagcg gcatc 15

<210> 505

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 50

gatgccggtg gtgta 1510

<210> 51

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 5115

acctatcgtc tcgcc 15

<210> 52

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis20

<400> 52

acctatcatc tcgcc 15

<210> 53

<211> 15

<212> DNA25

<213> mcyobacterium tuberculosis

<400> 53

atgaattggc tcagc 15

<210> 54

<211> 1530

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 54

gttctggtcc atgaa 15

<210> 5535

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 55

gcgggttgtt ctggt 1540

<210> 56

<211> 14

EP 1 713 934 B1

42

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 56

aaccccgaca gcgg 14

<210> 575

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 57

ggcgcttgtg ggtca 1510

<210> 58

<211> 15

<212> DNA

<213> mycobacterium tuberculosis

<400> 5815

gccccagtgc cgaca 1

<210> 59

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna20

<220>

<223> prob

<400> 59

tgccgctggt 10

<210> 6025

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda30

<400> 60

caccaccggc 10

<210> 61

<211> 10

<212> DNA35

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 61

cgagacgata 1040

<210> 62

<211> 10

EP 1 713 934 B1

43

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 625

cgagatgata 10

<210> 63

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna10

<220>

<223> sonda

<400> 63

gagccaattc 10

<210> 6415

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda20

<400> 64

catggaccag 10

<210> 65

<211> 10

<212> DNA25

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 65

cagaacaacc 1030

<210> 66

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>35

<223> sonda

<400> 66

cgctgtcggg 10

<210> 67

<211> 1040

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

EP 1 713 934 B1

44

<220>

<223> sonda

<400> 67

acccacaagc 10

<210> 685

<211> 10

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda10

<400> 68

tcggcactgg 10

<210> 69

<211> 15

<212> DNA15

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 69

gatgccgctg gtgat 1520

<210> 70

<211> 15

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>25

<223> sonda

<400> 70

atcaccaccg gcatc 15

<210> 71

<211> 1530

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 7135

ggcgagacga taggt 15

<210> 72

<211> 15

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna40

<220>

<223> sonda

EP 1 713 934 B1

45

<400> 72

ggcgagatga taggt 15

<210> 73

<211> 17

<212> DNA5

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 73

agctgagcca attcatg 1710

<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>15

<223> sonda

<400> 74

aattcatgga ccagaaca 18

<210> 75

<211> 1520

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda

<400> 7525

accagaacaa cccgc 15

<210> 76

<211> 16

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna30

<220>

<223> sonda

<400> 76

acccgctgtc ggggtt 16

<210> 7735

<211> 15

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>

<223> sonda40

<400> 77

tgacccacaa gcgcc 15

EP 1 713 934 B1

46

<210> 78

<211> 17

<212> DNA

<213> sekwencja syntetyczna

<220>5

<223> sonda

<400> 78

ctgtcggcac tggggcc 17

Zastrzeżenia10

1. Zestaw sond kwasu nukleinowego do zastosowania w oznaczeniu do wykrywania w próbce wieloleko-

opornej Mycobacterium sp., który obejmuje:

sondę 1 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z pierwszą sekwen-

cją docelową ACCAGCGGCA lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 2 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją15

docelową GCCGGTGGTG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 3 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z trzecią sekwencją

docelową TATCGTCTCG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 4 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z czwartą sekwen-

cją docelową TATCATCTCG lub z sekwencją do niej komplementarną;20

sondę 5 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencją

docelową GAATTGGCTC lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 6 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z szóstą sekwencją

docelową CTGGTCCATG lub zsekwencją do niej komplementarną;

sondę 7 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z siódmą sekwencją25

docelową GGTTGTTCTG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 8 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z ósmą sekwencją

docelową CCCGACAGCG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 9 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziewiątą sekwen-

cją docelową GCTTGTGGGT lub z sekwencją do niej komplementarną; i30

sondę 10 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą se-

kwencją docelową CCAGTGCCGA lub z sekwencją do niej komplementarną;

gdzie każda z tych sond ma długość 18-25 nukleotydów;

i gdzie przy stosowaniu, gdy sonda jest związana z odpowiednią sekwencją docelową, dostarczony jest wy-

krywalny sygnał.35

2. Zestaw sond według zastrz. 1, który obejmuje:-

sondę 1 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z pierwszą sekwen-

cją docelową ATCACCAGCGGCATC lub zo sekwencją do niej komplementarną;

sondę 2 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją40

docelową GATGCCGGTGGTGTA lub z sekwencją do niej komplementarną;

EP 1 713 934 B1

47

sondę 3 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z trzecią sekwencją

docelową ACCTATCGTCTCGCC lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 4 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z czwartą sekwen-

cją docelową ACCTATCATCTCGCC lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 5 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencją5

docelową ATGAATTGGCTCAGC lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 6 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z szóstą sekwencją

docelową GTTCTGGTCCATGAA lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 7 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z siódmą sekwencją

docelową GCGGGTTGTTCTGGT lub z sekwencją do niej komplementarną;10

sondę 8 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z ósmą sekwencją

docelową AACCCCGACAGCGGG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 9 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z dziewiątą sekwen-

cją docelowąj GGCGCTTGTGGGTCA lub z sekwencją do niej komplementarną

sondę 10 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 15 nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą se-15

kwencją docelową GCCCCAGTGCCGACA lub z sekwencją do niej komplementarną.

3. Zestaw sond według zastrzeżenia 1 lub zastrzeżenia 2, który obejmuje:- sondę 1 zawierającą sekwencję

TGCCGCTGGT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności sekwencji;

sondę 2 zawierającą sekwencję CACCACCGGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-20

ści sekwencji;

sondę 3 zawierającą sekwencję CGAGACGATA lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 4 zawierającą sekwencję CGAGATGATA lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;25

sondę 5 zawierającą sekwencję GAGCCAATTC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

sondę 6 zawierającą sekwencję CATGGACCAG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 7 zawierającą sekwencję CAGAACAACC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-30

ści sekwencji;

sondę 8 zawierającą sekwencję CGCTGTCGGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 9 zawierającą sekwencję ACCCACAAGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;35

sondę 10 zawierającą sekwencję TCGGCACTGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identycz-

ności sekwencji;

gdzie podkreślone nukleotydy w obrębie sekwencji sond 1, 2,3 i 4 są niezbędne i nie mogą być podstawione

przez żaden inny nukleotyd.

40

4. Zestaw sond według zastrz. 3, w którym:-

EP 1 713 934 B1

48

sonda 1 zawiera sekwencję GATGCCGCTGGTGAT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji;

sonda 2 zawiera sekwencję ATCACCACCGGCATC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identycz-

ności sekwencji;

sonda 3 zawiera sekwencję GGCGAGACGATAGGT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-5

tyczności sekwencji;

sonda 4 zawiera sekwencję GGCGAGATGATAGGT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji do niej;

sonda 5 zawiera sekwencję AGCTGAGCCAATTCATG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji;10

sonda 6 zawiera sekwencję AATTCATGGACCAGAACA lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji;

sonda 7 zawiera sekwencję ACCAGAACAACCCGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji;

sonda 8 zawiera sekwencję ACCCGCTGTCGGGGTT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-15

tyczności sekwencji;

sonda 9 zawiera sekwencję TGACCCACAAGCGCC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% iden-

tyczności sekwencji;

sonda 10 zawiera sekwencję CTGTCGGCACTGGGGCC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90%

identyczności sekwencji;20

gdzie podkreślone nukleotydy w obrębie sekwencji sond 1, 2,3 i 4 są niezbędne i nie mogą być podstawione

przez żaden inny nukleotyd.

.

5. Zestaw sond według dowolnego uprzedniego zastrzeżenia, który obejmuje:-

sondę 1 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 1 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności 25

sekwencji;

sondę 2 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 2 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

sondę 3 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 3 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;30

sondę 4 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 4 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

sondę 5 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 5 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

sondę 6 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 6 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności 35

sekwencji do niej;

sondę 7 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 7 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

sondę 8 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 8 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;40

sondę 9 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 9 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności

sekwencji;

EP 1 713 934 B1

49

sondę 10 zawierającą sekwencję SEK NR ID. 10 lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

gdzie reszta nukleotydowa 11 w obrębie SEK NR ID. 1 i 2 jest niezbędna i nie może być zastąpiona żadnym

innym nukleotydem;

i gdzie reszta nukleotydowa 8 w obrębie SEK NR ID. 3 i 4 jest niezbędna i nie może być zastąpiona żadnym 5

innym nukleotydem.

6. Zestaw sond kwasu nukleinowego do zastosowania w oznaczeniu do wykrywania w próbce wieloleko-

opornej Mycobacterium sp., który obejmuje:-

sondę 1 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z pierwszą sekwen-10

cją docelową ACCAGCGGCA lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 2 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z drugą sekwencją

docelową GCCGGTGGTG lub do sekwencją do niej komplementarną;

sondę 5 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego 10 nukleotydów, która wiąże się z piątą sekwencjąi

docelową GAATTGGCTC lub z sekwencją do niej komplementarną;15

sondę 6 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z szóstą sekwencją

docelową CTGGTCCATG lub z sekwencją do niej komplementarna

sondę 7 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z siódmą sekwencja

docelową GGTTGTTCTG lub z sekwencją do niej komplementarną;

sondę 8 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z ósmą sekwencją20

docelową CCCGACAGCG lub z sekwencją do niej komplementarna;

sondę 9 zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziewiątą sekwen-

cją docelowa GCTTGTGGGT lub z sekwencja do niej komplementarna; i sondę 10 zawierającą sekwencję

kwasu nukleinowego z 10 nukleotydów, która wiąże się z dziesiątą sekwencją docelową CCAGTGCCGA lub

z sekwencją do niej komplementarna25

gdzie każda z tych sond ma długość 18-25 nukleotydów;

i gdzie przy stosowaniu, gdy sonda wiąże się z odpowiednią sekwencją docelową, dostarczony jest wykry-

walny sygnał.

7. Zestaw sond według zastrz. 6, który obejmuje:-30

sondę 1 zawierającą sekwencję TGCCGCTGGT lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 2 zawierającą sekwencję CACCACCGGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 5 zawierającą sekwencję GAGCCAATTC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczności 35

sekwencji;

sondę 6 zawierającą sekwencję CATGGACCAG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 7 zawierającą sekwencję CAGAACAACC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;40

sondę 8 zawierającą sekwencję CGCTGTCGGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

EP 1 713 934 B1

50

sondę 9 zawierającą sekwencję ACCCACAAGC lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identyczno-

ści sekwencji;

sondę 10 zawierającą sekwencję TCGGCACTGG lub sekwencję mającą z nią przynajmniej 90% identycz-

ności sekwencji;

gdzie podkreślone nukleotydy w obrębie sekwencji sond 1 i 2 są niezbędne i nie mogą być podstawione 5

przez żaden inny nukleotyd.

8. Zestaw sond według dowolnego uprzedniego zastrzeżenia, w którym jedna lub więcej z sond 5, 6, 7, 8, 9

i 10 jest zastąpiona przez jedną lub więcej sond mających przynajmniej 90% identyczności sekwencji z se-

kwencją wybraną z SEK NR ID: 11-32.10

9. Zestaw sond według dowolnego z zastrzeżeń 1-7, zawierający ponadto jedną lub więcej sond mających

przynajmniej 90% identyczności sekwencji z sekwencją wybraną z SEK NR ID.: 11-32.

10. Zestaw sond według dowolnego uprzedniego zastrzeżenia, w którym te sondy są immobilizowane na 15

stałym nośniku.

11. Zestaw sond według dowolnego uprzedniego zastrzeżenia, w którym każda z tych sond ma ogon 3'

poli-T.

20

12. Zestaw sond według dowolnego uprzedniego zastrzeżenia, w którym te wielolekooporne Mycobacte-

rium sp. są wielolekoopornymi członkami kompleksu Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculo-

sis complex - MTC).

13. Zestaw sond według zastrz. 10, w którym te wielolekooporne Mycobacterium sp. są wielolekoopornymi25

Mycobacterium tuberculosis.

14. Sposóbwykrywania obecności lub braku wielolekoopornej Mycobacterium sp. w próbce, obejmujący:

(a) kontaktowanie zestawu sond określonych w dowolnym z zastrzeżeń 1-13 z próbką zawierającą kwas

nukleinowy, gdzie, gdy sonda wiąże się z kwasem nukleinowym Mycobacterium sp. w próbce, dostarczony 30

jest wykrywalny sygnał; i

(b) wykrycie tego wykrywalnego sygnału;

przy czym te sondy są immobilizowane na stałym nośniku.

.

15. Sposób według zastrz. 14, w któryme obecność wielolekoopornej Mycobacterium sp. w tej próbce jest 35

wykrywana przez:

(i) wykrycie wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 2 i 4 i ich odpowiednie związane docelowe

sekwencje kwasu nukleinowego Mycobacterium sp. w próbce: i

(ii) wykrycie braku wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 i ich odpowied-

nie docelowe sekwencje kwasu nukleinowego Mycobacterium sp.40

EP 1 713 934 B1

51

16. Sposób według zastrz. 14, w którym nieobecnośćw próbce wielolekoopornej Mycobacterium sp. wy-

krywa się przez:

(i) wykrycie wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 i ich odpowiednie zwią-

zane docelowe sekwencje kwasu nukleinowego Mycobacterium sp. w próbce: i5

(ii) wykrycie braku wykrywalnego sygnału dostarczonego przez sondy 2 i 4 i ich odpowiednie docelowe se-

kwencje kwasu nukleinowego Mycobacterium sp.

17. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 14-16, dalej obejmujący etap amplifikacji kwasu nukleinowego

Mycobacterium sp. w próbce przed wykrywaniem sygnału.10

18. Sposób według zastrz. 17, w którym etap amplifikacji przeprowadza się przed kontaktowaniem zestawu

sond z próbką zawierającą kwas nukleinowy.

19. Sposób według zastrz. 17 lub 18, w którym ten etap amplifikacji obejmuje etap znakowania kwasu nu-15

kleinowego Mycobacterium sp.

20. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 14-19, w którym ten wykrywalny sygnał jest sygnałem fluore-

scencji.

20

21. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 14-20, w którym ta próbka jest próbką kliniczną.

22. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 14-21, w którym ta wielolekooporna Mycobacterium sp. jest

wielolekoopornym członkiem kompleksu Mycobacterium tuberculosis ( MTC).

25

23. Sposób według zastrzeżenia 22, w którym ta wielolekooporna Mycobacterium sp. jest Mycobacterium

tuberculosis.

24. Zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego wielolekoopornej Mycobacterium sp. zawierający zestaw

sond określonych w dowolnym z zastrzeżeń 1-13.30

35

40

EP 1 713 934 B1

52

Figura 1

5

10

15

PróbkaNr

Próbka

EP 1 713 934 B1

53

Figura 2

5

10

15

20

25

EP 1 713 934 B1

54

Figura 3

5

10

tylko KatG

tylko InhA

Oba geny

Sonda 3

Sonda 6

Sonda 9

Sonda 12

Sonda 17

Sonda 22

EP 1 713 934 B1

55

5

Figura 4

10

15

20

25

EP 1 713 934 B1

56

ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE

Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona

części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką staranno-

ścią, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EPO nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym wzglę-5

dzie.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

Literatura niepatentowa cytowana w opisie10

EP 1 713 934 B1

57

5