(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1971571 RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 18.10.2006 06799607.4 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 28.11.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/48 EP 1971571 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61Q 19/08 (2006.01) C07C 233/08 (2006.01) A61K 8/42 (2006.01) C07C 231/02 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Zastosowanie amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego w wytwarzaniu kompozycji przeciwdziałających starzeniu się

(30) Pierwszeństwo:

20.10.2005 PL 37774705

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

24.09.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/39

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

31.05.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/05

(73) Uprawniony z patentu:

INSTYTUT CHEMII BIOORGANICZNEJ PAN, Poznań, PL

(72) Twórca(y) wynalazku:

KATARZYNA ROLLE, Gadki, PL JAN BARCISZEWSKI, Poznań, PL LESZEK RYCHLEWSKI, Poznań, PL LECH CELEWICZ, Poznań, PL KRZYSZTOF CISZEWSKI, Poznań, PL ELIZA WYSZKO, Poznań, PL

(74) Pełnomocnik:

PL/E

P 19

7157

1 T3

rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. ul. Żurawia 47/49 00-680 Warszawa

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

15917/13/P-RO/MW EP 1 971 571

Zastosowanie amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego w wytwarzaniu kompozycji przeciwdziałających starzeniu się

Opis

[0001] Floretamid wykazuje szereg właściwości biologicznych i można go stosować jako przeznaczoną do pielęgnacji skóry kompozycję o doskonałym działaniu przeciw starzeniu się, zapobiegającą wiotczeniu skóry oraz utracie jej blasku.

[0002] Amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego (floretamid) wykazuje szereg właściwości biologicznych. Zawarte w sokach roślinnych związki o niskiej masie cząsteczkowej odgrywają niezwykle istotną rolę we wzroście i rozwoju pędów roślinnych. Wykazano, iż sok roślinny Malus domestica (cv. Lobo) zawiera amid kwasu 3-(p-hydroksyfenylo)propanowego, zwany również floretamidem (Nr CA 23838-70-2). Został on zidentyfikowany przy użyciu spektrometrii masowej oraz spektroskopii NMR. Co ważne, stężenie floretamidu jest znacznie wyższe w wydzielanym soku roślinnym w porównaniu do soku zawartego wewnątrz rośliny [H. Rybicka Phloretamid in fruitlets of apple tree (Malus domestica), www.app-oline.pl, Acta Physiologiae Plantarum, vol. 18/1996, str. 359]. Związki strukturalnie zbliżone, takie jak kwasy hydroksycynamonowe, są jednymi z głównych związków fenolowych występujących w roślinach. A zwłaszcza kwas p-hydroksycynamonowy jest częstym składnikiem występującym w roślinach wyższych [Bearder, J.R. Plant hormonem and Rother growth substances - their backround, structures and occurence. Encycl. Plant Physiol., New ser., vol. 9, 9-112, Sringer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1980; HarboncJ.B. Plant phueolics, Encycl. Plant Physiol., New ser., vol. 8, 329-402, Sringer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1980; Herrmann, K. Hydroxyzimtsaeure und Hydroxybenzoesaeure enthaltende Natrstoffe in Pflanzen, Fortschr. Chem. Org. Naturstoffe 35, 73-132 (1978)]. Stwierdzono, że drugorzędowe amidy kwasów hydroksycynamonowych występują w znacznych ilościach w płodnych kwiatach Araceae, podczas gdy nie występują one w kwiatach wysterylizowanych [Ponchet M., Martin-Tannguy J., Maras A., Martin C. Hydroxycinnamoyl acid amides and aromatic amines in the inflorescences of some Aracede spacies, Phytochemistry 21,2865-69, 1982.].

Ponadto, w niektórych roślinach stwierdzono obecność kwasów dihydroksycynamonowych [HarboneJ.B. Plant phenolics, Encycl. Plant Physiol., New ser., vol, 3, 329-402, Sringer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1980; Herrmann, K. Hydroxyzimtsaeure und Hydroxybenzoesaeure enthaltende Natrstoffe in Pflanzen, Fortschr. Chem. Org. Naturstoffe 35, 73-132 (1978)]. A mianowicie, znaleziono kwas floretynowy (kwas dihydro-p-hydroksycynamonowy, kwas 3-[p-hydroksyfenylo]-propionowy) w wierzchołkach korzeni. Obecność floretamidu w soku ksylemowym (soku roślinnym tkanki drzewnej), wydzielanym pod wpływem ciśnienia przez drzewa jabłoni w okresie kwitnienia odgrywa prawdopodobnie ważną rolę w ich fizjologii. Jest to potwierdzone obecnością drugorzędowych amidów kwasów hydroksycynamonowych w tkankach rozrodczych tych roślin [H. Rybicka 3-[p-

- 2 -  

hydroxyphenyl]-propionic acid amide (phloretamide) In root exudate of Malus, Biochcm. Physiol. Pflanzen 179, 303-309, 1984].

[0003] Badania krótkoterminowe są najbardziej odpowiednie do ustalenia, czy badane związki wykazują jakiekolwiek bezpośrednie działanie toksyczne lub czy są mitogenne. Z punktu widzenia starzenia się skóry jest niezwykle istotne aby wyeliminować takie prawdopodobieństwo. Oznacza to, iż aby jakakolwiek substancja chemiczna była potencjalnie użyteczna jako związek przeciwdziałający starzeniu się, nie powinna ona ani zabijać komórek, ani indukować podziału komórkowego w fibroblastach. W oparciu o wyniki tych badań można dokonać selekcji w celu przeprowadzenia badań nad długofalowym działaniem przeciw starzeniu się.

[0004] Znany jest sposób otrzymywania amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego. Polega on na wykorzystaniu roztworu amoniaku w bezwodnym metanolu do potraktowania estru etylowego kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego w wysokiej temperaturze. Reakcja ta odbywa się w autoklawie lub w skalowanej rurce szklanej (przy podwyższonym ciśnieniu).

W zgłoszeniu patentowym EP1523469 (opublikowanym 20.04.2005) przedstawiono sposób otrzymywania amidowych pochodnych kwasu cynamonowego, stosowanych jako selektywne inhibitory oksydazy aminowej (MAO-B).

W opisach patentowych US2001039035 (opublikowano 08.11.2001) i WO0028077 (opublikowano 18.05.2000) przedstawiono sposób zwiększenia wydajności konwersji pochodnych fenolowych do produktów, przy zastosowaniu peroksydazy. Sposób ten obejmuje następujące etapy reakcji koniugatu zawierającego wykrywalny, znakowany fenol z peroksydazą, w obecności katalizatora. Może to być sól nieorganiczna lub związek organiczny, charakteryzujące się określonymi wzorami, w których X oznacza B(OH)2, Y wynosi 1, lub w którym X oznacza OH, Y jest halogenem lub Q-R, w którym Q jest liniowym, lub rozgałęzionym alkilem 1-12 heteroatomowym, w którym wiążące heteroatomy stanowią C, N, O lub S, w którym wiązanie łączące heteroatomowe łańcuchy alkilu może ewentualnie zawierać podstawnik wybrany spośród OH, -COOH, -NH2, i -SH, gdzie R zostaje dodatkowo wybrany spośród -OH, -COOH- oraz, -NH2 lub -CH3; lub mieszaniny soli organicznych i nieorganicznych. Opis ten obejmuje ponadto związki, w których R1 oznacza -CH2OH lub –COOH, a n wynosi 1-8.

W opisie patentowym CA2009009 (opublikowano 02.08.1990) przedstawiono farmaceutyczne zastosowanie pochodnych amidów kwasu cynamonowego. W rozwiązaniu tym, pochodne tych amidów charakteryzują się wzorami, w których X jest halogenem, będącym czynnikiem zwiotczającym mięśnie.

W opisie patentowym CN1035034 (opublikowano 30.08.1989) przedstawiono środki zakłócające lot owadów. W związkach tych, X<1> i X<5> są albo wodorem, albo C1-4 alkilem, halogenem lub podstawionym halogenem C1-4 alkilem; X<2>, X<3> i X<4> wybiera się spośród wodoru i C1-4 alkilu, hydroksylu, C1-4 alkoksy i fenoksy; R<1> i R<2> stanowią albo wodór, albo C1-4 alkil; R<3> i R<4> z których każdy jest albo wodorem, albo które wspólnie tworzą wiązanie podwójne wiążące -CR<1>R<3>- i -CR<2>R<4>-; natomiast

  

- 3 -  

Y oznacza grupę hydroksymetylową, formylową, cyjanową lub karbamoilową N-podstawioną jedną lub dwiema identycznymi, lub różnymi grupami C1-4 alkilowymi, estrem karboksylowym lub karboksylem, lub też solą karboksylanu. W opisie patentowym HU185312 (opublikowanym 28.01.1985) przedstawiono proces usuwania ochronnych grup aminokwasowych z peptydów w reakcji z ciekłym sodem metalicznym.

W opisie patentowym JP57046915 (opublikowano 17.03.1982) przedstawiono związki antyalergiczne zawierające pochodne cynamidów.

W opisie patentowym DE2540552 (opublikowano 25.03.1976) przedstawiono pochodne cykloalkilo-1-aryloksy-3-amino-2-propanoli.

W opisie patentowym DE2412032 (opublikowano 16.10.1975) przedstawiono rozpuszczalne w wodzie barwniki dwuazowe.

W opisie patentowym IL.47892 (opublikowano 30.04.1978) przedstawiono pochodne cynamidów, ich syntezę oraz zawierające je kompozycje farmaceutyczne. W rozwiązaniu tym opisano związki cynamidowe charakteryzujące się wzorami, w których X jest chlorkiem, bromkiem lub jodkiem, natomiast R jest wodorem lub alkilem, zawierającym 1 do 3 węgli, przy czym jako kompozycja farmaceutyczna znajduje on zastosowanie w leczeniu, lub zapobieganiu drgawkom. W opisie patentowym GB923357 (opublikowano 10.04.1963) przedstawiono pochodne cynamidów oraz proces ich wytwarzania. Rozwiązanie to dotyczy związków, w których R stanowi podstawnik alkoksylowy, natomiast R1 i R2 stanowią wodór lub alkil, w których rodnik zawiera najwyżej 6 atomów węgla, natomiast n wynosi 0, 1 lub 2, lub nietoksyczne sole ich kwasów. Rozwiązanie to opisuje ponadto sposób ich wytwarzania na drodze kondensacji określonych amin pirydylowych lub amin pirydylo-alkilowych z podstawnikami acylowymi odpowiednio podstawionego kwasu cynamonowego, na przykład halogenowanego, estryfikowanego, lub z bezwodnikiem.

[0005] Wynalazek dostarcza zastosowanie amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu oraz zastosowanie kompozycji zawierającej amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu. Zastosowanie tego związku jako preparatu przeciw starzeniu uwzględnia kompozycję do stosowania zewnętrznego na skórę, o doskonałym działaniu przeciw starzeniu się, zapobiegającą wiotczeniu skóry oraz utracie jej blasku.

[0006] Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu.

[0007] Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu. Korzystnie, kompozycja ta zawiera amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego w stężeniu wynoszącym 1-500 μM.

[0008] Załączone figury ułatwiają objaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 przedstawia syntezę floretamidu.

  

- 4 -  

Figura 2 przedstawia wpływ na morfologię dermofibroblastów (SNF25 p23) po 11 dniach traktowania floretamidem (powiększenie 20x).

Figury 2: A, B, C, D i E otrzymano z krzywej wzrostu jednoetapowego doświadczenia, po 11 dniach traktowania. Przy większych dawkach, komórki wydawały się większe, nieregularnie rozmieszczone i nieliczne (Fig.2 E).

Figura 3 przedstawia wykonaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lokalizację JC-1 w komórkach SNF25 p44 wykorzystujących floretamid. Populacja komórek pokazanych na fig. 3 przedstawia spolaryzowane mitochondria żyjących komórek oznaczonych punktowym barwieniem fluorescencyjnym pomarańczowo-czerwonym przy tworzeniu i zachowaniu J-agregatów.

Figura 4 przedstawia wpływ floretamidu na SF25 p29 z wybarwieniem lizosomalnym (20x).

Figura 5 przedstawia wpływ floretamidu na morfologię komórek w późnym stadium po 7 i 14 dniach.

Figura 6 przedstawia analizę poziomu ekspresji genu GAPDH w fibroblastach potraktowanych floretamidem po 5 tygodniach traktowania.

Figura 7 przedstawia analizę poziomu ekspresji genu GAPDHII w komórkach HeLa potraktowanych floretamidem po 48 godzinach hodowli.

[0009] Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wyżej zdefiniowanego wynalazku.

Przykład 1. Synteza amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego

[0010] Do schłodzonego (0°C) roztworu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego (2 g, 0,012 mol) i 4-nitrofenolu (1,95 g, 0,014 mol) w octanie etylu (25 cm3) dodano N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (2,48 g, 0,012 mol) i poddano mieszaniu magnetycznemu przez 30 minut. Następnie, mieszaninę reakcyjną poddano 2-godzinnemu mieszaniu magnetycznemu w temperaturze pokojowej. Następnie, odsączono wytrącony N,N'-dicykloheksylomocznik, przepłukano octanem etylu (5 cm3) a połączone przesącze odparowano do sucha. Dodano bezwodny metanol nasycony amoniakiem (10 cm3) a mieszaninę reakcyjną poddano mieszaniu magnetycznemu przez 2 godziny, następnie mieszaninę odparowano do sucha a pozostałość naniesiono na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem krzemionkowym 60H firmy Merck (5-40 μm). Kolumnę eluowano mieszaniną chloroformu i metanolu (50:1, v/v). Chromatograficznie oczyszczony produkt krystalizowano z metanolu a następnie suszono pod próżnią nad pięciotlenkiem fosforu, uzyskując 1,45 g amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego (wydajność 75%) (Fig. 1).

Przykład 2. Zastosowanie w przeciwdziałaniu starzeniu się

[0011] Celem tych doświadczeń było określenie wpływu krótkotrwałego traktowania fibroblastów skóry ludzkiej nowymi „związkami testowymi” na różne cechy biologiczne ludzkich dermofibroblastów w celu przeprowadzenia selekcji pod kątem potencjalnych właściwości przeciwdziałania starzeniu. Badane parametry obejmowały: przyleganie komórek, przeżycie, wzrost, aktywność mitochondrialną, badania rewersji, aktywność

  

- 5 -  

proteasomalną, aktywność lizosomalną oraz morfologię hodowli ludzkich dermofibroblastów w środkowym stadium. Dodatkowo przeprowadzono pewne badania pilotażowe z późnym stadium bliskim starzeniu, żeby zbadać „efekty antystarzeniowe”.

[0012] Sporządzenie roztworu do badań: Roztwory podstawowe 8 mM dla amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego sporządzono poprzez rozcieńczenie około 30 mg/ml w buforze Hanka do ostatecznej objętości wynoszącej 30 ml. Pokrótce, roztwory podstawowe poddano sterylizacji filtrowej, następnie przechowywano w 4°C, a ich odpowiednie rozcieńczenia w pożywkach hodowlanych wykorzystano w doświadczeniach, zgodnie z wymogami.

[0013] Hodowla komórek: Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na hodowlach linii prawidłowych ludzkich fibroblastów ze skóry dorosłej, ze środkowego i późnego stadium, określonych jako Senetek SNF25 (długość życia w 40-75% ukończona). W celu sprawdzenia wpływu badanych związków na starzejące się komórki zastosowano komórki w późnym stadium, które ukończyły około 75% długości życia. Linię komórkową SNF25 otrzymano z biopsji skóry ssaka, którą przeprowadzono w trakcie operacji zmniejszenia biustu u młodej, niepalącej i zdrowej kobiety. Zastosowano zwykłe warunki hodowli wobec pożywki (DMEM) zawierającej antybiotyki, 10% płodową surowicę cielęcą oraz inkubację w 37°C, 5% CO2 i przy 95% wilgotności. Wpływ badanych związków określono w następujących warunkach:

[0014] Charakterystyka wzrostu: doświadczenia wzrostu krótkotrwałego przeprowadzono przy zastosowaniu 24-studzienkowych płytek do hodowli tkankowych (obszar wzrostu 1,9 cm2) oraz płytek z 96 studzienkami o płaskim dnie (obszar wzrostu 0,328 cm2). Zastosowano świeżo przygotowane zawiesiny komórkowe z masowych hodowli komórek SNF25 utrzymywanych w laboratorium. Do 6 zestawów płytek 24-studzienkowych wysiano około 10,000 komórek/studzienkę. Komórki pozostawiano na 24 godziny w zwykłej pożywce hodowlanej, umożliwiając im przytwierdzenie i stabilizację lub dodawano je bezpośrednio do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu (od 40 μM do 500 μM). Pożywkę hodowlaną zmieniano co tydzień wraz z dodaniem związków chemicznych. Ilość komórek liczono po różnych dniach traktowania/leczenia, w 2 studzienkach z każdego stężenia badanego związku, zgodnie z metodą trypsynizacji i liczenia komórek, stosując analizator Coulter Counter. Trzecią studzienkę każdej kategorii utrwalono zimnym metanolem i barwiono barwnikiem Giemsa, celem udokumentowania i zapisania na fotografii. Doświadczenia kontynuowano aż do momentu, kiedy hodowle były w pełni konfluentne a dalszy wzrost był niemożliwy.

[0015] Przeżycie komórek, toksyczność i barwienie JC-1: Przeżywanie komórek po ekspozycji na różne dawki zbadano 5-difenylobromkiem tetrazoliny (MTT)za pomocą oznaczenia 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2. Na 96-studzienkową płytkę wysiano około 5,000 komórek przypadających na studzienkę na 24 godziny przed doświadczeniem. Następnie komórki potraktowano różnymi dawkami badanego związku. Studzienki przepłukano roztworem Hanka i dodano nową pożywkę. Po trzech dniach dodano 0,5 mg/ml MTT (Sigma, M2128) w pożywce. Po 4 godzinach usunięto MTT i na 12 – 16 godzin dodano izopropanol oraz HCl w celu rozpuszczenia kryształków MTT. Absorbancję mierzono przy 595 nm.

  

- 6 -  

[0016] Aktywność lizosomalna: Czerwień obojętna jest preferencyjnie wychwytywana przez lizosomy komórkowe. Komórki fibroblastów hodowano i eksponowano na szereg stężeń badanych związków. Hodowle poddano kontroli wzrokowej po 72 godzinach i określono liczbę zdolnych do życia komórek i/lub zawartość białek komórkowych po 72 godzinach ekspozycji, wykorzystując metodę wychwytywania czerwieni neutralnej. Do poszczególnych studzienek 96-studzienkowej mikrotitracyjnej płytki do hodowli tkankowej wysiano 0,2 ml odpowiednich pożywek zawierających komórki (zazwyczaj 3x103 komórek). Po jednodniowej inkubacji usunięto pożywki i zastąpiono je pożywką niemodyfikowaną (kontrolną) lub pożywką modyfikowaną różnymi stężeniami badanych związków. Po 3 dniach ekspozycji na związek pożywki usunięto i zastąpiono pożywką zawierającą 0,001% NR. Następnie, płytkę testową umieszczono w inkubatorze na kolejne 3 godziny, umożliwiając wychwycenie barwnika przeżyciowego przez lizosomy żywotnych komórek. Pożywki usunięto a komórki szybko przepłukano 0,5% formaldehydem - 1% CaCl2 a następnie 0,2 ml roztworu 1% kwasu octowego – 50% etanolu w celu wyekstrahowania barwnika z komórek. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej oraz krótkim, niemniej jednak szybkim wytrząsaniu na wytrząsarce do płytek mikrotitracyjnych, płytki przeniesiono do spektrofotometru mikropłytkowego, wyposażonego w filtr 540 nm, w celu zmierzenia absorbancji wyekstrahowanego barwnika. Toksyczność różnych związków porównano ze związkami stosowanymi w hodowlach kontrolnych poprzez komputerowe przetwarzanie zebranych danych.

[0017] Aktywność proteasomalna: W trakcie rozkładu in vitro oligopeptydów w proteasomie, określono aktywność podobną do chymotrypsyny w ekstraktach komórkowych sporządzonych z komórek potraktowanych i niepotraktowanych.

[0018] Znakowanie 5-bromo-2'-deoksyurydyną i wykrywanie za pomocą czytnika płytek testem Elisa: Badania toksyczności przeprowadza się przy zastosowaniu oznaczenia BrdU, opierającego się na pomiarze inkorporacji 5-bromo-2-deoksyurydyny podczas syntezy DNA oraz markera proliferacji komórek. Proporcja komórek podlegających duplikacji DNA, czyli wchodzących w następną rundę podziałów komórkowych, określana była poprzez znakowanie komórek bromodeoksyurydyną, przy zastosowaniu dostępnego na rynku zestawu (Roche Diagnostics GmbH). Pokrótce, komórki hodowano na 96-studzienkowej płytce mikrotitracyjnej. Po dodaniu BrdU do hodowli, została ona inkorporowana do nowo syntetyzowanego DNA (uzyskane stężenie 110 μM). Następnie, płytkę inkubowano przez 2-18 godzin i po przepłukaniu PBS-em, utrwalono 200 μl środka utrwalającego z etanolem (0,5 μM etanol/HCl). 100 μl roboczego roztworu nukleazy (rozcieńczenie 1:100 buforem do inkubacji) na studzienkę przez 30 minut w temperaturze 37°C przy braku obecności CO2 traktowanie jądrowe wzmacnia dostępność BrdU przy wykrywaniu przeciwciała. Do 100 μl fragmentów Fab anty-BrdU-POD dodano 9,9 μl PBS i BSA (stężenie końcowe 200 μg/ml), następnie koniugat przeciwciała usunięto i przepłukano PBS-em. Końcowy etap obejmuje dodawanie 100 μl peroksydazy na inkubowaną studzienkę w temperaturze pokojowej aż do uzyskania zielonego zabarwienia w próbkach pozytywnych, które to zabarwienie wyraźnie różni się od zabarwienia czystego substratu peroksydazy. Absorbancję mierzono przy 405 nm

  

- 7 -  

z punktem odniesienia przy 490 nm i porównano ją bezpośrednio z poziomem BrdU inkorporowanego w komórce.

Wyniki i uwagi

[0019] Przywieranie komórek – Nie wykazano znacznego wpływu na odsetek komórek przywierających do powierzchni kolby hodowlanej, po sześciu godzinach traktowania 40 μM do 2 mM floretamidu.

[0020] Zwiększone przywieranie zaobserwowano przy 40 uM i 80 μM (20-30%). Związek ten nie jest bezpośrednio toksyczny dla ludzkich dermofibroblastów. Dlatego też, we wszystkich przyszłych doświadczeniach możliwe jest dodawanie floretamidu do pożywki hodowlanej w momencie wysiania komórek.

[0021] Wzrost krótkotrwały – wpływ traktowania floretamidem na wzrost krótkotrwały przedstawiono na wykresie i fig. 2.

  

- 8 -  

[0022] Maksymalny wzrost komórek dla niemal wszystkich dawek zaobserwowano dnia piątego. W przypadku komórek traktowanych floretamidem o stężeniu 40 μM – 200 μM, po 11 dniach traktowania zaobserwowano 10-20% wzrost liczby komórek. Natomiast większe stężenia (500 μM) wyraźnie hamowały wzrost komórek. Oznacza to, iż zakres dawek floretamidu pomiędzy 40 μM – 200 μM wydaje się odpowiedni do długoterminowego traktowania ludzkich dermofibroblastów.

[0023] Wpływ na morfologię dermofibroblastów (SNF25 p23) po 11 dniach traktowania amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego (przy powiększeniu 20x) – Zdjęcia przedstawione na Fig. 2: A, B, C, D i E pochodzą z doświadczenia jednoetapowej krzywej wzrostu po 11 dniach traktowania. Cytotoksyczność komórek obserwowano przy dawkach większych niż 200 μM. Przy większych dawkach komórki wydawały się większe, nieregularnie rozmieszczone i nieliczne (Fig.2 E).

[0024] Aktywność mitochondrialna – Poniżej przedstawiono szeroki zakres dawek w zakresie (od 0,01 μM – 500 μM) na testowane dermofibroblasty w średnim wieku, badane w celu określenia efektów mitochondrialnych na floretamid.

[0025] Przy dawce do 500 μM, traktowanie amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-proponowego nie wywiera negatywnego wpływu na aktywność mitochondriów w dermofibroblastach. Nie wykazano indukcji wzrostu komórek w zakresie badanych dawek.

[0026] Wykonaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lokalizację JC-1 w komórkach SNF25 p44 wykorzystujących floretamid przedstawiono na fig.3.

[0027] Barwienie pod kątem JC-1 wykonano po uprzednim 3-dniowym traktowaniu dermofibroblastów floretamidem, w celu zaobserwowania potencjału mitochondrialnego. Populacja komórek pokazanych na fig. 4 przedstawia spolaryzowane mitochondria żyjących komórek oznaczonych punktowym barwieniem fluorescencyjnym pomarańczowo-czerwonym przy tworzeniu i zachowaniu J-agregatów. Punktowe pomarańczowo-czerwone barwienie fluorescencyjne zaobserwowano w obrębie komórek potraktowanych wszystkimi dawkami amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego.

  

- 9 -  

[0028] Wpływ amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego na współczynnik aktywności lizosomalnej – Oznaczenie NRU (wychwytywanie czerwieni neutralnej) ułatwia szybką ocenę cytotoksyczności różnych badanych związków. Obrazy przedstawione na Fig.4 sugerują, iż wzór wybarwienia komórek wskazuje na autofagię (autofagocytozę) (40 μM i 80 μM), natomiast dane z wykresu poniżej wskazują na to, iż do 200 μM współczynnik lizosomalny komórek potraktowanych amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego ulegał zmniejszeniu zależnie od dawki w porównaniu do komórek niepotraktowanych.

[0029] W zakresie dawki od 40 μM do 80 μM wyniki wykazały 15-40% obniżenie autofagii lizosomalnej. Podsumowując, w komórkach potraktowanych dawkami floretamidu wynoszącymi powyżej 40 μM, zaobserwowano obniżenie aktywności lizosomalnej.

[0030] Wpływ amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego na aktywność podobną do chymotrypsyny – Nie wykazano żadnego wpływu traktowania floretamidem (40 μM do 200 μM) na aktywność proteasomalną komórek ludzkich.

  

- 10 -  

[0031] Wpływ na komórki z późnego stadium - Organizacja cytoszkieletu: komórki w późnym stadium, o ponad 75% długości życia potraktowano różnymi dawkami floretamidu w celu sprawdzenia, czy takie traktowanie może odwrócić jakiekolwiek zmiany związane z wiekiem. Otrzymany po 3 dniach wzór wybarwienia aktyny w komórkach będących w średnim wieku nie ujawnił jakichkolwiek widocznych różnic pomiędzy komórkami potraktowanymi i niepotraktowanymi.

[0032] Wpływ amidu kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego na morfologię komórek w późnym stadium po 7 i 14 dniach – Morfologia komórek starzejących się: Fibroblasty w późnym stadium (około 75% długości życia ukończena) potraktowano różnymi dawkami floretamidu w celu sprawdzenia, czy takie traktowanie może odwrócić zmiany związane z wiekiem zachodzące w ich morfologii. Jak widać na fig. 5, w wyglądzie komórek widoczne są nieznaczne różnice po siedmiu i po czternastu dniach traktowania. W komórkach tych nie zaobserwowano zachowania heterogenicznego. Po 14 dniach traktowania nie wykryto poprawy w komórkach.

Przeżycie komórek: W osobnych kolbach wysiano równe ilości starzejących się komórek i potraktowano je różnymi stężeniami floretamidu. Po trypsynizacji i ponownym zawieszeniu komórek po 7 i 14 dniach traktowania, liczbę komórek określono przy zastosowaniu licznika Coulter’a.

[0033] Liczba komórek po 7 i 14 dniach traktowania amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego – na poniższym wykresie widać, iż liczby żyjących komórek z późnego stadium, które traktowano amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego były niemal identyczne, bez większych różnic po jednym tygodniu i po dwóch tygodniach. Jednakże, przy większych dawkach, po 7 i 14 dniach traktowania zaobserwowano redukcję wzrostu komórek zależną od dawki.

  

- 11 -  

[0034] Indukcja proliferacji komórek (syntezy DNA) – W celu upewnienia się, czy floretamid indukował dodatkową proliferację komórek, zbadano stopień syntezy DNA.

[0035] Nasze wyniki wykazały brak znaczących różnic w syntezie DNA w fibroblastach, które wcześniej potraktowano amidem kwasu 3-p-hydroksyfenylo-propanowego w porównaniu do kontroli.

[0036] Wykonano analizę RT-PCR RNA wyizolowanego z komórek linii 1 (nietraktowanych floretamidem) i komórek linii 2 (potraktowanych floretamidem o stężeniu 100 uM). Za pomocą Phosphorimagera oraz oprogramowania ImageQant określono różnice w ekspresji genu GAPDH. Dane przedstawiono na Fig. 6.

[0037] Wykonano analizę RT-PCR RNA wyizolowanego z komórek linii 1 (nietraktowanych floretamidem) i komórek linii 2 (potraktowanych floretamidem o stężeniu 100 uM). Za pomocą Phosphorimagera oraz oprogramowania ImageQant określono różnice w ekspresji genu GAPDH. Dane przedstawiono na Fig. 7.

[0038] Wniosek – Wyniki uzyskane w serii doświadczeń nad krótkotrwałym wpływem floretamidu na ludzkie dermofibroblasty wskazują, że związek ten ma znacząco korzystne działanie przeciwko starzeniu się i możliwe jest przeprowadzenie długofalowego badania fibroblastów skóry. Podczas analizy jednoetapowej krzywej wzrostu (do 11 dni) można obserwować zwiększone przyleganie komórek (10-20%) przy 40 i 80 μM oraz stymulację wzrostu komórek przy 40 i 80 μM.

Sporządziła i zweryfikowała

Mirosława Ważyńska

Rzecznik patentowy

  

- 12 -  

Zastrzeżenia

1. Zastosowanie amidu kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu się.

2. Zastosowanie kompozycji zawierającej amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego jako środka przeciwdziałającego starzeniu się.

3. Zastosowanie według zastrzeżenia 2, przy czym kompozycja zawiera amid kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)propanowego w stężeniu 1-500 μM.

Sporządziła i zweryfikowała

Mirosława Ważyńska

Rzecznik patentowy

  

- 13 -  

 

 

 

 

 

 

  

- 14 -  

 

 

  

- 15 -  

 

 

 

 

  

- 16 -  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

- 17 -  

 

 

 

 

 

 

 

 

  

- 18 -  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

- 19 -