scriptie angiogenese nieuw

Inhoudstafel

Abstract ...........................................................1 1) Inleiding .....................................................2 2) Methodologie .............................................2 3) Resultaten...................................................4 4) Discussie.....................................................5 5) Referentielijst ...........................................38

Ontrafeling van de angiogenese-signaalwegen in kanker.

Abstract

1


1. InleidingElk jaar sterven in de VS meer dan 50.000 mensen ten gevolge van colorectaal carcinoom (CRC). CRC vormt binnen de EU de 2de belangrijkste oorzaak van kankersterfte. CRC is bij mannen de derde en bij vrouwen de tweede meest gediagnosticeerde kanker. Deze feiten beklemtonen zowel de ernst als de frequentie van dit type kanker. (Jemal et al., 2008) Tot op vandaag is de exacte oorzaak onbekend. Wel zijn enkele risicofactoren, zoals een positieve familiale anamnese, hoge leeftijd, inflammatoire darmziekten (o.a. ziekte van Crohn) en bepaalde genetische syndromen (Hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) en Familial adenomatous polyposis (FAP)), beschreven. Toch kan in 75% van de gevallen geen specifieke oorzaak aangeduid worden. De therapiemogelijkheden zijn chirurgische resectie (primaire tumor en metas), radiotherapie en chemotherapie (5-fluorouracil, irinotecan, capecitabine, oxaliplatin, bevacizumab, cetuximab en panitumumab). (Peeters, 2009) De prognose is afhankelijk van de locatie van de tumor, de behandeling en het stadium waarin de tumor zich bevindt. Vroege detectie (bijv. door screening ((virtuele) coloscopie, occult bloed in feces, ) naar een adenomateuze poliep en/of invasief carcinoom) zorgt voor een betere prognose met een goede 5-jaarsoverleving, maar indien laat gedetecteerd en gemetastaseerd valt deze drastisch terug. (Van Imschoot et al., 2009) Reeds in het embryo voorzien de bloedvaten de groeiende organen van de noodzakelijke nutrinten zoals zuurstof, suiker, elektrolyten, vitaminen, en draineren ze de geproduceerde afvalstoffen. De bloedvaten bestaan uit 3 tunicae: de tunica intima (endotheel met basale membraan eronder), media (vasculaire gladde spiercellen (vGSC)) en adventitia (bindweefsel) m.a.w. de endotheelcellen (EC) en de murale cellen. De kleinste vaatjes, de capillairen, bestaan enkel uit EC omgeven door pericyten (PC). (Karamysheva, 2008) De bloedvaten ontstaan uit mesodermale cellen die zich differentiren in Endotheliale PrecursorCellen (de EPCs). Deze vormen na aggregatie de zogenaamde bloedeilandjes. Fusie van deze bloedeilandjes geeft aanleiding tot vorming van de primaire capillaire plexi in de dooierzak en het embryo zelf. Door verdere ontwikkeling van het vaatnetwerk ontstaat een 96.000 km lange bloedcirculatie die door een hirarchisch net van arterin, arteriolen, capillairen, venulen en tenslotte venen stroomt. Het proces waarbij vanuit voorlopercellen een nieuw bloedvat wordt aangelegd noemt de vasculogenese. (Ribatti et al., 2009) Angiogenese daarentegen wordt gedefinieerd als de vorming van nieuwe bloedvaten uitgaande van het endotheel van de reeds aangelegde vasculatuur. Dit proces is zowel in fysiologische als in pathologische omstandigheden van groot belang. Dit kan gebeuren via verschillende manieren. Sprouting angiogenese houdt in dat geactiveerde EC, na basale membraan degradatie, prolifereren en migreren tot ze een naburig bloedvat bereiken (anastomose). Hierbij wordt er op het uiteinde van de groeiende aftakking een tip-cel met uitsteeksels, filipodia genaamd, gezien. Vervolgens wordt er een lumen gevormd wellicht door vacuole fusie binnen en tussen EC. Daarnaast kan ook

2


intussusceptie optreden. Hierbij verplaatst de bloedvatwand zich gedeeltelijk naar binnen en verdeelt het lumen in 2. Zo wordt 1 bloedvat uiteindelijk verdeeld in 2. (Dme et al., 2007) Fysiologische angiogenese speelt een cruciale rol tijdens het wondherstel, tijdens de menstruele cyclus t.h.v. het endometrium en het corpus luteum, in het vet- en spierweefsel, tijdens de embryogenese en in nog vele andere processen. (Carmeliet, 2005) Pathologische angiogenese speelt een essentile rol in talloze ziektebeelden waaronder proliferatieve diabetische retinopathie, leeftijdsgerelateerde maculaire degeneratie, atherosclerose, reumatode artritis, psoriasis, post-ischemische vascularisatie na acuut myocard infarct en ten slotte tumorgroei en metastase. Hierdoor is er reeds 3 decennia onderzoek bezig naar pro- en anti-angiogene middelen die gezien de waaier aan gekoppelde pathologien een enorm therapeutisch potentieel hebben. (Moreira et al., 2007) Voor de koppeling tussen de hieronder besproken moleculaire systemen en de farmaceutische realiteit anno 2009 wordt in bijlage een overzicht gegeven van de (pre)klinische antiangiogene middelen. Angiogenese is een multi-step proces die genitieerd is door de stimulatie van EC d.m.v. angiogene groeifactoren zoals de families van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en de fibroblast groeifactor (FGF). Na focale degradatie van de basale membraan en de extracellulaire matrix (ECM) door proteolytische enzymen gaan de geactiveerde EC invaderen en migreren in de richting van de stimulusgradint. Hierbij treedt er proliferatie van een selecte groep van endotheelcellen op en vormen ze samen een groeiende buisvormige structuur tot de verbinding met een aanpalend bloedvat is gelegd. Ten slotte start de maturatie van het bloedvat wat gepaard gaat met rekrutering van pericyten en/of andere murale cellen zoals vGSC en fibroblasten. Het uiteindelijke resultaat van de angiogenesecascade is een stabiel en functioneel bloedvat. Deze toegenomen bevloeiing compenseert de proangiogene locale hypoxie die in het (tumor)weefsel heerst. (Adams and Alitalo, 2007) Evenwel is het belangrijk op te merken dat men vaststelt dat de bloedvaten die zorgen voor de bevloeiing van tumoren lekkend (partile endotheelaflijning), tortueus en onregelmatig (wisselende i.p.v. afnemende diameter) zijn. (Eichhorn et al., 2007) De hypothese dat de groei van tumoren afhankelijk is van de vorming van nieuwe bloedvaten is voor het eerst geformuleerd door Folkman (1971). Hierbij maakte hij de bedenking dat inhibitie van de tumor angiogenese de tumor kon herleiden tot microscopische proporties. Deze veronderstelling was gebaseerd op de vaststelling dat tumoren die geen extra bloedvaten kunnen aanleggen en dus enkel bloed kunnen krijgen via diffusie vanuit nabijgelegen vaten beperkt zijn tot een volume van 2-3 mm3. De tumor wordt als het ware uitgehongerd door afsluiting van de bloedvoorziening en gaat vervolgens t.g.v. apoptose, vooral t.h.v. het centrum (minst bevloeid), geleidelijk afsterven. Toch duurde het nog tot het begin van de jaren 90 vooraleer de eerste specifieke angiogeneseinhibitoren beschreven werden. Momenteel zijn er verschillende inhibitoren erkend voor de behandeling van kanker waaronder CRC. Het eerste bewijs van klinische werkzaamheid kwam er pas met de studie van Hurwitz et al. (2004). Hierbij werden 2 groepen met gemetastaseerd CRC

3


vergeleken waarbij de ene groep chemotherapie met placebo en de andere chemotherapie met bevacizumab (Avastin) kreeg. In deze studie stelde men een toename van 5 maanden (15,6 m VS 20,3 m) in de mediane overlevingsduur vast. Later werd aangetoond dat bevacizumab in combinatie met standaard chemotherapie ook bij gevorderd niet-kleincellig longcarcinoom de overlevingsduur verbeterd. Vervolgens bewezen twee andere anti-angiogene middelen, sorafenib (Nexavar, Bayer) en sunitinib (Sutent, Pfizer), hun effectiviteit in monotherapie bij metastatische niercelkanker. Daarnaast werd sorafenib monotherapie erkend in de behandeling van hepatocellulair carcinoom en sunitinib monotherapie bij gastro-intestinale stromale tumoren. Ten slotte bevinden er zich momenteel vele producten met veelbelovende preklinische resultaten in de verschillende fasen van klinisch onderzoek. (Reinacher-Schick et al., 2008) Toch kan men tot nu toe niet spreken van een spectaculair succes. De toename in overleving is bescheiden (enkele maanden) en lost de hoge verwachtingen niet in (Kerbel, 2008). Ook is de behandeling nogal duur en heeft ze verscheidene nevenwerkingen zoals hypertensie, trombose, gastrointestinale perforatie, e.a. (Kuo, 2008). Door deze teleurstellende klinische resultaten heeft men ingezien dat de regulatie en cordinatie van dit proces toch complexer is dan oorspronkelijk gedacht. Opeenvolgende activaties van vele verschillende receptoren en ontelbare liganden leiden tot een subtiele balans tussen meerdere pro- en anti-angiogene signalen. Hierbij kan elke sequentile stap in de angiogene cascade worden beschouwd als een potentieel doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe moleculaire medicatie tegen de tumorigenese. Men hoopt ooit met anti-angiogenese therapie de expansie en metastasering van de tumor levenslang te kunnen onderdrukken. (Moreira et al., 2007) Ook heeft men vastgesteld dat het al dan niet aanleggen van nieuwe vasculatuur niet kan gereduceerd worden naar een enkele factor, maar een evenwicht is die naargelang de aan- of afwezige pro- of antiangiogene stimuli naar de ene of naar de andere zijde kantelt. Men vergelijkt dit fenomeen met een on/off-knop, de zogenaamde angiogene switch. De vele endogene stimulatoren, maar ook inhibitoren bepalen de uiteindelijke angiogene status van het weefsel. (Eichhorn et al., 2007; Kuo, 2008) Tevens heeft men vastgesteld dat, naast de TC zelf, ook de tumor stromacellen, tumor EC en circulerende cellen (EPC, plaatjes en macrofagen) krachtige angiogene stoffen kunnen loslaten. (Kerbel, 2008)

2. MethodologieTijdens het proces van het literatuuronderzoek in het kader van deze masterproef werden verschillende databanken geraadpleegd. De belangrijkste elektronische databanken waren PubMed, Cochrane collaboration library en UpToDate. Hierbij werden volgende trefwoorden gebruikt: angiogenesis, colorectal cancer, VEGF en vele andere. De databank ISI Web of Science werd gebruikt om te controleren op citaties naar een gevonden artikel. Zodoende kon steeds het meest recente artikel geraadpleegd worden.

4


Tevens werden steeds de referenties zelf gecontroleerd op niet te missen artikels. Ook werd het oude artikel uit 1971 NEJM van J. Folkman (Tumor angiogenesis: Therapeutic implications) uit het kelderarchief van de Biomedische Bibliotheek Gent opgevraagd en gekopieerd gezien de historische waarde van dit artikel als begin van de anti-angiogenese therapie. Ten slotte werden de reeds verschenen nummers in het archief van het trimestrieel tijdschrift Angiogenesis geraadpleegd. Vervolgens werd dit tijdschrift continu opgevolgd vanaf september 2008 tot juni 2009. Dit tijdschrift werd gevonden via de elektronische databank van de Universiteitsbibliotheek Gent.

3. Resultaten3.1 De VEGF-familie: de superieure regulatorHet belangrijkste regulatorsysteem van de angiogenese is VEGF en zijn receptoren. Dit versuikerd homodimeer komt voor onder verschillende vormen. Tot de VEGF-familie horen VEGF-A,-B,-C,-D en -E, de Placentaire groeifactor (PlGF) en enkele slangengif-VEGFs. Alle leden uitgezonderd VEGF-E (virale homologen) en slangengif-VEGFs worden in het menselijk genoom teruggevonden. VEGF-A speelt een hoofdrol in zowel de vasculo- als angiogenese. Beide allelen van het VEGF-A gen (8 exonen ter hoogte van chromosoom 6p21.3) zijn noodzakelijk voor embryonale overleving. VEGFA omvat ten gevolge van alternatieve exon splicing 3 subtypes: 121, 165 en 189 aminozuren (AZ). Hiervan is VEGF-A-165 dominant in zowel hoeveelheid als activiteit, welke meestal verhoogd is in tumoraal weefsel. Deze kan ook binden aan heparine (deel van de extracellulaire matrix (ECM)) en neuropiline (co-receptor) wat een gradint oplevert die belangrijk is voor de endotheliale stimulatie. (Shibuya, 2008; Moreira et al., 2007) De regulatie van de VEGF-A genexpressie is multifactorieel. Hypoxie (via blokkering van de afbraak van de Hypoxie-Induceerbare Factor (HIF) protenen), verschillende groeifactoren (Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Insulin-like Growth Factor (IGF) 1, Transforming Growth Factor (TGF), ), Interleukine (Il) 1 en 6, oestrogenen, Nucleaire Factor (NF)--B en -catenin signaalwegen. (Shibuya, 2008; Easwaran et al., 2003) Daarnaast kunnen genetische veranderingen m.n. inactivatie van tumor suppressor genen (bijv. p53, Von Hippel-Lindau (VHL) en Phosphatase and TENsin homoloog (PTEN)) en activatie van oncogenen (bijv. rat sarcoma (ras) en sarcoma (src) oncogen) zorgen voor verhoogde expressie van VEGF in TC. (Kerbel, 2008) VEGF-A activeert VEGF receptor (VEGFR, een receptor tyrosine kinase (RTK)) 1 en 2, maar niet 3. PlGF en VEGF-B activeren enkel VEGFR-1 die qua tyrosine kinase activiteit 10 maal zwakker is dan VEGFR-2. (fig. 1) Toch kan verhoogde hoeveelheid PlGF en VEGF-A via binding op de VEGFR-1 van monocyten/macrofagen deze laatste rekruteren en zo de tumor angiogenese bevorderen. VEGFR-1 kan ook functioneren als negatieve regulator voor angiogenese door zijn hoge affiniteit, maar lage

5


intracellulaire signaalwegactivatie. Hiermee kan het VEGF sekwestreren en binding op VEGFR-2 verhinderen. VEGFR-2 is essentieel voor de ontwikkeling van bloedvaten. Zijn sterke tyrosine kinase activiteit zorgt voor autofosforylatie op tyrosine 1175 wat noodzakelijk is voor binding met Phospholipase C (PLC ) die downstream zorgt voor Protene Kinase C (PKC) activatie. VEGFR-2 staat niet alleen in voor endotheelproliferatie, maar ook voor migratie en tubulaire formatie. (Shibuya, 2008; Ellis and Hicklin, 2008) VEGFR-3 is voornamelijk belangrijk voor vorming van lymfevaten en wordt geactiveerd door VEGFC en D. Toch is deze receptor ook aangetoond op tumor microvasculatuur en dus niet strikt beperkt tot lymfatisch endotheel. (Tammela et al., 2008) Fig. 1: VEGF-familie en VEGFRs. Nrp= Neuropiline, sVEGFR-1= soluble of wateroplosbaar VEGFR-1 die VEGF kan capteren, svVEGF= snake venom of slangengif VEGF. Acroniemen tussen haakjes onder VEGFR-1, -2 en -3 zijn alternatieve namen voor de bovenstaande receptor. (Shibuya, 2008) VEGF benvloedt tumor angiogenese

door effect op EC proliferatie, migratie en overleving. Men heeft vastgesteld dat het effect op EC overleving ook in

afwezigheid van pathologie (m.n. door een autocriene loop t.h.v. de EC) van belang is. (Lee et al., 2007) Dit effect verloopt via de PhosphoInositide-3 Kinase (PI-3K)-Akt signaalweg en opregulatie van anti-apoptotische eiwitten B-cel lymfoma protein 2 (Bcl2), A1 survivin en Xchromosoomgebonden Inhibitor van Apoptotische Protenen XIAP. (Moreira et al., 2007) Ook autocriene effecten t.h.v. de VEGF secreterende TC op overleving en invasie zijn vastgesteld. (Ellis and Hicklin, 2008) Daarnaast zorgt VEGF voor: 1) Chemotaxis van cellen vanuit het beenmerg; 2) Toename van de vasculaire permeabiliteit en diameter (o.a. door stijging van stikstofmonoxide en prostacycline); 3) Blokkering van de maturatie van de dendritische cellen zodat TC-afkomstige antigenen niet gepresenteerd kunnen worden aan de T-lymfocyten, hetgeen zorgt voor immunotolerantie (Ellis and Hicklin, 2008); 4) Modulatie van adulte hepatische erytropoietine synthese (Kuo, 2008); 5) Stimulatie van de antitrombotische werking van de EC door opregulatie van tissue Plasminogen Activator (tPA) en downregulatie van PAI-1 (Inhibitor) (Fischer et al., 2007). Functies 2) en 5) kunnen verklaren waarom bevacizumab resp. hypertensie en trombose in de hand werkt. Deze functies komen tot uiting via verscheidene pathways. Bijv. EC proliferatie verloopt vnl. als volgt: VEGF-A VEGFR-2 PLC PKC Raf MEK Mitogen-Activated Protein

6


Kinase(MAPK) DNA synthese; terwijl EC migratie vermoedelijk via src kinase en vervolgens actine cytoskelet veranderingen verloopt. Deze EC migratie gaat gepaard met VEGF-afhankelijke productie van ECM afbraakenzymen (collagenases, matrix metalloproteinases (MMPs), ) die tevens zorgen voor loslating van ECM-gebonden VEGF moleculen. Volgens Zhang et al. (2009) blijkt VEGF-B eerder een overlevingsfactor dan een angiogene factor te zijn. Evenwel is dit overlevingssignaal niet alleen belangrijk voor EC, maar ook voor vGSC en PC. Dit effect zou verlopen via regulatie van verscheidene overlevingsgenen via VEGFR-1 en Nrp1. VEGF-B blokkering kan een nieuwe therapeutische optie worden.

De humane PlGF komt t.g.v. alternatieve splicing voor onder 4 isovormen: PlGF-1 (131 AZ), -2 (152 AZ), -3 (203 AZ) en -4 (224 AZ). Deze vertegenwoordigen verscheiden bindingsaffiniteiten (fig. 2). Fig. 2: PlGF-isovormen en bindingsaffiniteit met VEGFR-1, heparansulfaat proteoglycanen (HSPG, deel van ECM) en neuropiline (Nrp)-1 en -2. (Ribatti, 2008a) Hoofdzakelijk bindt deze, zoals eerder vermeld, VEGFR-1. Deze bevindt zich, naast op EC, ook op beenmergafkomstige cellen zoals macrofagen. Dit leidt tot rekrutering van macrofagen die locaal proteasen en angiogene factoren kunnen loslaten. Deze rekrutering gebeurt onafhankelijk van de VEGFR-2 (gezien inhibitie van deze receptor de migratie niet vermindert). (Fischer et al., 2007) De PlGF komt tot expressie in de placenta waar het instaat voor de controle van de groei van de trofoblast en de vascularisatie in de maternale decidua tijdens de vroege embryonale periode. I.t.t. VEGF is de PlGF niet noodzakelijk voor de embryonale vascularisatie en komt het in normale weefsels op adulte leeftijd slechts in verwaarloosbare hoeveelheden voor. Wel stijgt de concentratie bij bepaalde pathologien zoals ischemie (infarct) en tumor. Men kan stellen dat de PlGF enkel in groeiende, maar niet in statische bloedvaten de overleving van EC stimuleert. Zo ziet men minder angiogenese en macrofagen als respons op ischemie bij PlGF -/- knock-out muizen die evenwel perfect viabel zijn. Het effect op angiogenese kan volgens 4 verschillende mechanismen verlopen: 1) Direct effect van de VEFGR-1; 2) PlGF verdringt VEGF van VEGFR-1, waardoor meer op VEGFR-2 bindt; 3) VEGFR-1 gestuurde verhoging van de gevoeligheid van de EC voor VEGF; 4) Rekrutering van circulerende cellen. Verschillende theorien verklaren de synergie die met VEGF is vastgesteld. In het kader van ontwikkeling van nieuwe therapien is het belangrijk te vermelden dat i.t.t. VEGF de PlGF expressie beperkt is tot een deel van de tumoren (o.a. borst en maagcarcinoom). Wel heeft men vastgesteld dat na chemo-, radio- en anti-VEGF-therapie de expressie toeneemt. Zo stelde Willett et al. (2005) een 3 10 maal toename vast in CRC na bevacizumab. Hetgeen doet vermoeden dat de PlGF van belang is als de hoofdweg ter compensatie van de hypoxie (m.n. VEGF) wordt geblokkeerd. (Ribatti, 2008a)

3.2 De 4 families met primaire rol in geleiding van zowel bloedvat- als axongroei

7


Men heeft vastgesteld dat bepaalde factoren die instaan voor de geleiding van axongroei ook de angiogenese kunnen moduleren. Het onderliggend principe voor het vormen van een bepaald vertakkingpatroon is in essentie voor bloedvaten en zenuwen vergelijkbaar, wat deze vaststelling dan ook plausibel maakt. Zo kan men de tip-cel met filopodia vergelijken met het uiteinde van een migrerend axon, de groeiconus, die ook gekenmerkt is door zon puntige uitsteeksels. Deze factoren behoren tot de Semaphorin, Netrin, Slit en Ephrin families. (Adams and Alitalo, 2007)

Ten eerste bespreken we de rol van de Semaphorines (SEMA). De receptoren van de SEMA, de Plexines en Neuropilines (Nrp, cfr. supra), werden gevonden op EC en TC. Hetgeen een rol in de regulatie van de tumorprogressie deed vermoeden. De SEMA zijn onderverdeeld in 8 klassen waarvan klasse 3-7 deze van de gewervelden omvat. Hiervan wordt enkel klasse 3 (SEMA 3) gesecreteerd, de overige (4-7) zijn vastgeankerd in de plasmamembraan (PM). (Neufeld and Kessler, 2008) Weliswaar kan dit anker ev. door een protease worden afgekliefd en ontstaat zo een vrij en wateroplosbaar SEMA (bijv. SEMA 4D). (Basile et al., 2007) De 9 verschillende plexines worden onderverdeeld in plexine A-D. Deze transmembranaire receptoren hebben een intracellulair GTP-ase activerenddomein die instaat voor de signaaltransductie. SEMA 3E en 4-7 binden direct specifieke plexines, Fig. 3: SEMA 3A bindt Nrp1 in het Nrp1Plexin A1 complex. Door de conformationele verandering treedt er dissociatie op van het FARP2 die door vervanging van GDP naar GTP RAC1 activeert. Dit RAC1 en het constitutief geactiveerd RND1 zorgen voor activatie van het GTPase-activerend proteine(GAP)domein van het plexin A1. Dit zorgt voor inactivatie van RRAS waardoor ook het integrine wordt genactiveerd en de EC loskomt van de ECM. De interactie tussen RND1 en plexine A1 kan worden genhibeerd d.m.v. RHOD die op dezelfde site bindt. (Neufeld and Kessler, 2008) maar de andere klasse 3 SEMA binden op Nrp die complexeert met plexine A en D1. In dit complex staat Nrp voor ligand-receptorbinding en plexine voor signaaltransductie in. Het effect van de SEMA op de TC zelf is vnl. inhibitie (3B, 3F), daarentegen kan SEMA ook progressie induceren (bijv. SEMA 3A bij CRC (Nguyen et al., 2006)). Verschillende SEMA 3 worden gesecreteerd door EC, hetgeen een autocriene loop doet vermoeden. SEMA 3A kan in vitro en in vivo (chick chorioallantoic membrane angiogenesis assay (CCAMA) waarbij angiogene substanties onder de schaal worden gentroduceerd en het effect op de bloedvaten in het membraan wordt gevalueerd) angiogenese onderdrukken enerzijds door inhibitie van de binding tussen VEGF en Nrp1, maar anderzijds ook door directe signaaltransductie. Tevens werd er verhoogde vasculaire permeabiliteit vastgesteld na toediening van exogeen SEMA 3A. Ook de door p53 gecontroleerde SEMA 3F inhibeert angiogenese. Voor SEMA 3E en 4A zijn er

8


aanwijzingen die inhibitie van tumor angiogenese suggereren, maar dit is nog niet duidelijk bewezen. SEMA 3C promoot EC adhesie/migratie door integrine activatie. Het onderliggend mechanisme van de anti-angiogene werking van bepaalde SEMA is grotendeels gekend. Bij angiogenese moeten de EC migreren in de richting van een bepaalde stimulus. Tijdens dit strikt gereguleerd proces moeten de EC focale contacten met de ECM d.m.v. integrines maken. Het moleculair mechanisme waarbij SEMA 3A celadhesie inhibeert gaat als volgt: zie fig. 3. (Neufeld and Kessler, 2008) SEMA 3A veroorzaakt collaps van het actine cytoskelet van EC via een nog niet volledig uitgeklaard mechanisme. De mogelijke verklaringen voor de vastgestelde actine depolymerisatie worden samen gevat in Neufeld and Kessler (2008). Op lange termijn veroorzaakt SEMA 3A EC apoptose door activatie van Caspase 3 en inhibitie van het extracellulair signaal gereguleerde kinase (ERK) 1 en 2. Daarentegen stelden Basile et al. (2007) vast dat het afgeknipte extracellulair deel van SEMA 4D in staat is om angiogenese te induceren. Het wordt vnl. door macrofagen die zich in het tumorstroma bevinden geproduceerd. Het knippen gebeurt door het membraan type 1-metalloproteinase (MT1MMP) die in vele types TC wordt geproduceerd. Serini et al. (2009) vatte samen dat er 2 autocriene loops (VEGF-A en SEMA 3A) t.h.v. EC voorkomen die een mutueel antagonistische werking hebben. Herstel van SEMA 3A in TC d.m.v. een virale vector leidde tot daling van de vasculaire densiteit, minder vertakkingen, toename in PC, maar ook tot TC apoptose. Globaal zag men inkrimping van het tumorvolume en toename van de functionaliteit van de bloedvaten. Bloedvat normalisatie leidt tot betere locale afgifte van medicatie en zuurstof waardoor betere resultaten na resp. chemo- en radiotherapie. Nrp bestaat in 2 varianten, Nrp1 en Nrp2. Deze hebben elk hun eigen affiniteit t.a.v. SEMA 3 (bijv. SEMA 3 A, B en F binden resp. Nrp1, beide en Nrp2). Het intracellulair deel wordt als te kort voor signaaltransductie beschouwd. Naast op neuronen, komen Nrp voor op EC en TC. Hier complexeren ze met verschillende receptoren (plexines, VEGFR-1, -2 en -3, Hepatocyt groeifactor (HGF) receptor, PDGF-B homodimeer receptor (murale cellen rekrutering) en TGF-receptor). Door ligandbinding versterkt Nrp het signaal. Het belang van dit systeem wordt aangetoond door het feit dat muizen zonder Nrp geen bloedvaten kunnen ontwikkelen. Nrp expressie correleert met tumorprogressie in verschillende types waaronder CRC (Kamiya et al., 2006). Blokkering van de Nrp1 bindingsfunctie d.m.v. antilichamen inhibeert tumorprogressie en angiogenese en heeft een additief effect in combinatie met bevacizumab (Pan et al., 2007). Nrp2-antilichamen inhiberen CRC ontwikkeling (Gray et al., 2008).

Ten tweede bespreken we het Netrine systeem. In zoogdieren bestaan er 3 Netrines (1, 3 en 4) die allen gesecreteerd worden. Er bestaan 6 receptoren voor Netrin1 die verdeeld worden in 2 families: de Immunoglobuline-familie (Neogenin en Deletie in Colon Cancer (DCC)) die zorgt voor aantrekking en de Uncoordinated5-familie (Unc5 A-D) die zorgt voor afstoting. Bijgevolg is Netrin1 bifunctioneel i.f.v. de aanwezige receptor. Bij co-expressie treedt, via associatie van het

9


cytoplasmatisch domein van beide receptoren, afstoting op. Men heeft vastgesteld dat de aanwezigheid van Unc5B noodzakelijk is voor het uitoefenen van de anti-angiogene effecten van Netrin1 m.a.w. kan men stellen dat Netrin1 Unc5B-expresserende cellen afstoot. Het gen van Unc5B staat onder directe controle van p53 en er is aangetoond dat men door binding van Netrin1 op Unc5B de door p53 genduceerde apoptose kan tegengaan. T.h.v. de TC kan men DCC en Unc5 receptoren zien als tumor suppressors. In afwezigheid van Netrin1 induceren ze apoptose, in aanwezigheid wordt tumorigenese gepromoot door apoptoseinhibitie. Wel heeft men al downregulatie van deze receptoren in verschillende types TC waaronder CRC kunnen aantonen, maar overexpressie van het Netrin1 oncogen heeft men (nog) niet vastgesteld. T.h.v. de EC constateert men dat Unc5B sterk gexpresseerd is in tumorale bloedvaten i.t.t. de zwakke expressie in normale rustende bloedvaten. Hetgeen dit als target natuurlijk interessant maakt. Activatie van Unc5B leidt tot retractie van de tipcel filopodia m.a.w. inhibeert de tumor angiogenese. (Freitas et al., 2008) Netrin4 wordt overgexpresseerd in VEGF-gestimuleerde EC die 3 verschillende receptoren bleken te hebben: Neogenin, Unc5B en C. Men stelde vast dat, i.t.t. Netrin1, Netrin4 enkel kon binden met Neogenin, maar niet met Unc5B en C. Ook constateerde men dat de aanwezigheid van zowel Neogenin als Unc5B noodzakelijk waren om de EC migratie te inhiberen. Deze 2 feiten samen suggereren een associatie tussen beide. Samengevat zou Netrin4 een anti-angiogene factor zijn door binding met Neogenin en rekrutering van Unc5B. (Lejmi et al., 2008) Nguyen and Cai (2006) vonden dat Netrin1 angiogenese induceert door een DCC-afhankelijke stijging in NO-productie volgend op de activatie van ERK en endotheliaal Nitric Oxide Synthase (eNOS).

Ten derde bespreken we het Slit-Roundabout (Robo) systeem. De Robo-familie van receptoren bestaat uit 4 leden: Robo 1-4. De Slits zijn gesecreteerde glycoprotenen die functioneren als liganden voor de Robo-receptoren (1-3). Bij de gewervelden onderscheiden we 3 leden: Slit 1-3. Robo 1 komt voor in zowel neuronen als EC. In de neurogenese staat Robo 1 in voor afstoting t.h.v. de middenlijn. Bij knock-out zien we onregelmatige commissuren heen en weer over de middenlijn. Men heeft in TC Fig. 4: Mogelijke Slit 2Robo1 signaalweg voor stimulatie van celmigratie. PI-3K= phosphoinositide-3 kinase. (Legg et al., 2008) een weefselspecifieke expressie vastgesteld. Robo 1 kan beschouwd worden als tumor suppressor die minder wordt gexpresseerd in borst, nier, long en prostaat, maar in CRC ziet men opregulatie. Men heeft vastgesteld dat Slit 2-Robo 1 signalering de tumor angiogenese bevordert en dat een Slit-gradint migratie naar de hoogste concentratie induceert. Dit zou verlopen via PI-3K met vervolgens vorming van het fosfolipide fosfoinositol-3,4,5-trifosfaat. Deze laatste activeert GTPasen die het actine cytoskelet kunnen remodelleren. (fig. 4) Daarnaast binden Rho GAPs op een intracellulair domein van geactiveerd Robo 1. Zij inactiveren Cdc42 waardoor actine polymerisatie, locaal onder het deel van de PM waarop Slit 2 bindt, wordt genhibeerd en migratie in deze richting wordt afgestoten. Blokkering van dit signaal in

10


tumordragende muizen geeft verlaagde vasculaire densiteit en tumormassa. Weliswaar kan deze blokkering ook andere Slits die ev. pro-angiogene eigenschappen hebben inhiberen. In vivo onderzoek met CCAMA zou hier oplossing brengen. Robo 4 wordt enkel in EC tot uiting gebracht. Het is een goede tumorEC marker en ev. target voor kankertherapie. Expressie is sterk in EC van verschillende types tumoren waaronder CRC, maar is nauwelijks detecteerbaar in normale weefsels in vivo. (Legg et al., 2008) Grne et al. (2006) stelde vast dat in CRC de expressie van zowel Robo 1 als Robo 4 verhoogd was, maar histologisch onderzoek van de CRC-specimens toonde aan dat Robo 1 vnl. t.h.v. TC en Robo 4 vnl. t.h.v. tumorEC wordt geproduceerd. Er werd tevens geen verschil in expressie van Slit 2 tussen tumor en normaal weefsel waargenomen, maar Dallol et al. (2003) toonde dat Slit 2 frequent genactiveerd is in CRC en de groei ervan onderdrukt. Uit de resultaten van Bedell et al. (2005) bleek dat Robo 4 essentieel is voor angiogenese in vivo en cordinatie van de vertakkingen. Sheldon et al. (2009) toonde aan dat blokkering van Robo 1 of 4 d.m.v. siRNA leidt tot inhibitie van EC migratie. Ook binding van Robo4 intracellulair met Mena, (neuraal) Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP), WASP interactie protene en Syndapin werd bevestigd. Deze zijn allen actine cytoskelet regulerende protenen. Tevens werd bevestigd dat Robo 4 Robo 1 nodig heeft voor signaaltransductie en dat er een heterodimeer wordt gevormd. De directe binding van Slit 2 op Robo 4 is controversieel gezien de belangrijkste aminozuren ontbreken. Tot nu toe is er geen ligand gekend voor deze receptor. Meldingen van EC migratie inhibitie door Slit 2 Robo 4 interactie zijn wellicht tot stand gekomen door onbekende heterodimerisatie met Robo 1. Co-expressie, die enkel op EC mogelijk is, leidt dus tot inhibitie van de migratie bevorderende signalen van Robo 1. Overexpressie van Robo 4 leidde tot vorming van filopodia (groeiend actine polymeer vormt skelet van dit uitsteeksel) over de ganse breedte van de tipcel. Normaal is er voor directionele beweging een gepolariseerd front nodig die zich naar een signaal beweegt. Ongepolariseerde vorming van filopodia zorgt voor verminderde netto migratieafstand. De Rho familie (Rho, Rac en Cdc42) van GTPasen zijn belangrijke regulatoren van het actine cytoskelet en spelen een centrale rol in de Robo-signaalweg. GTP binding veroorzaakt conformatieverandering waardoor verhoogde affiniteit voor hun doelwiteffectoren (in casu kinasen zoals Rho kinase, p21-geactiveerde kinasen (PAKs), de WASP en het SCAR complex) ontstaat. Door conversie tussen de inactieve GDP-gebonden en de actieve GTP-gebonden vorm kunnen deze GTPasen de signaaltransductie controleren. Deze conversie gebeurt o.i.v. Guanine nucleotide Exchange Factoren (GEFs) en GTPase Activerende Protenen (GAPs) (cfr. supra). (Legg et al., 2008) Ten vierde bespreken we het ephrin-Eph receptor systeem. Eph RTK wordt gebonden door het ligand ephrin waardoor het intracellulaire kinase-domein wordt geactiveerd. Ephrins worden gepresenteerd via een glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anker (ephrin-A subklasse) of via een transmembranaire

11


(TM) regio (ephrin-B subklasse). Eph-A en -B binden in het algemeen bij voorkeur resp. ephrin-A en B. Er bestaan 10 Eph-A (A1-10) en 6 Eph-B (B1-6) receptoren. Ook bestaan er 6 ephrin-A (A1-6) en 3 ephrin-B (B1-3) liganden. Forward-signalering is het effect van de conventionele liganden op hun receptor. Reverse-signalering daarentegen komt tot stand door het feit dat ephrins capabel zijn om signalen door te sturen in de cel waar deze moleculen Fig. 5: Overzicht ligand-receptor en type op het celoppervlak worden gepresenteerd. Men spreekt signalering. (Kuijper et al., 2007) van bidirectionele signaaltransductie zowel in de receptor (forward) als in de ligand (reverse)

expresserende cel. Reverse signalering is het best begrepen voor ephrin-B die intracellulair via hun tyrosine (Y) fosforylering sites of hun C-terminaal PDZbindingsmotief eiwitten kunnen rekruteren. (fig. 5) Sommige van deze eiwitten zijn adaptors (Grip1 en 2, Syntenin, Par3, PICK1 en Dvl2) die op hun beurt additionele eiwitten rekruteren. Andere hebben een specifieke functie zoals het fosfatase FAP1/PTP-BL, Tiam1 die de GTPase Rac1 activeert en PDZ-RGS3 die de G-protene gekoppelde receptor (GPCR)signaalwegen inhibeert. Fosforylering van de ephrin-B tyrosine residus signalering verloopt via activiteit van de Src familie kinasen. Ephrin-A met GPI-anker zou via enerzijds tot nu toe onbekende TM protenen of anderzijds via clustering van meerdere ephrins in lipid rafts (klein deel van de PM die andere biofysische eigenschappen heeft t.o.v. het volledig oppervlak) ook in staat zijn tot reverse signalering. De Eph receptor signaalweg verloopt via activatie van Src familie kinasen en Abelson kinase. Het daaropvolgend netwerk bestaat uit fosfotyrosine-bindende adaptors (Nck, Groeifactor receptor-gebonden protene (Grb)2 en 10, Crk en SLAP), PDZ-bindende eiwitten (Syntenin, Pick1, Grip1 en AF-6), PI-3K, modulatoren van de Rho en Ras familie GTPasen (SHEP1, RasGAP en Ephexin) en het fosfatase LMW-PTP. Het forward signaal leidt in de meeste gevallen tot afstoting. Paradoxaal kan dit signaal ook aanleiding geven tot adhesie en groei. Bijv. hoge concentratie ephrinA2 stoot af, maar lage concentratie promoot groei. 1 Dit verschil zou te verklaren zijn door de kinaseactiviteit van de receptor: aanwezigafstoting, afwezigadhesie. 2 Knippen van ephrins door ADAM10 (membraangebonden metalloprotease) kan ook deze paradox verklaren. Bijv. binding van ephrin-A5 op Eph-A3 veroorzaakt knippen van de eerstgenoemde. De loslating van een deel van dit ephrin zorgt voor afstoting. Blokkering van het knippen leidt tot adhesie. 3 Ook endocytose van Ephephrin complex in de receptordragende cel converteert adhesie in afstoting. Recente bevindingen geven aan dat cel-cel contact niet de enige interactie is die invloed heeft op de signaaltransductie. Bijv. ephrin-A5 kan Eph-A3 binden indien ze beiden op hetzelfde celoppervlak staan. Hetgeen zorgt voor receptor inactivatie. Men spreekt van cis-inhibitie. Ook stelde men vast dat ephrin-B2 motiliteit en adhesie benvloedt in vGSC zonder cel-cel contact.

12


Eph-B4 en zijn ligand ephrin-B2 zijn belangrijke actoren in het cardiovasculair systeem. VEGF stimuleert ephrin-B2 expressie in pathologische angiogenese. Ephrin-B2 is predominant aanwezig in arterile EC, terwijl zijn receptor Eph-B4 specifiek voor veneuze EC is. Daarnaast zijn de Notchsignaalweg (cfr. infra) en hemodynamische factoren van belang voor deze AV-specifieke expressie. Experimenten toonden dat zowel forward als reverse signalering sprouting angiogenese promoot. EphB4 activatie leidt tot EC proliferatie en migratie via PI-3K en Akt. Maar ook inhibitie van deze EC functies werd gerapporteerd. Dit met onderdrukking van Ras en MAPK. De verschillende mechanismen die kunnen aanleiding geven tot deze paradox werden reeds hierboven besproken. Reverse signalering van B-klasse ephrins naar integrines bevordert migratie, adhesie en promoot angiogenese. Hierbij zijn Rac1, Crk en p130Cas betrokken. Afwezigheid van PC en verminderde hechting van PC aan tumorEC zou deels verantwoordelijk zijn voor de lekkende en chaotisch georganiseerde tumor vasculatuur. 4 ligand-receptorsystemen reguleren murale cel differentiatie en rekrutering: binding van 1) PDGF-B op PDGFR- 2) TGF op TGF-R2, Alk 1 en 5 en Endoglin 3) sphingosine-1-fosfaat op endotheel differentiatie gen-1 4) Angiopoietines (Ang) 1 en 2 op Tie2. Recent werd aangetoond dat ook Eph-ephrin hierop invloed heeft. Ephrin-B2 deficinte PC zijn slecht gehecht aan EC, maar hun aantal blijft onveranderd. Hetzelfde geldt voor vGSC. Ephrin-A1 inhibeert vGSC motiliteit door inhibitie van Rac1 en Pak1. Binding van ephrin-A1 op Eph-A4 versterkt de activiteit van een GSC-specifiek GEF voor RhoA. Hetgeen zorgt voor opbouw van actine vezels. Verschillende Eph-ephrin moleculen zijn opgereguleerd in tumorweefsel waaronder CRC. Blokkering van Eph-A reduceert de grootte en vascularisatie van tumoren. EphA in TC en EC blijken een belangrijke rol te spelen. Hetgeen de receptor een potentieel target maakt. Ephrin-B overexpressie in TC correleert met verhoogde tumor vascularisatie en invasie. Eph-B daarentegen blijkt een tumor suppressor in CRC te zijn, maar in andere types (prostaat, blaas en melanoom) een oncogen. TC expressie van Eph-B4 promoot angiogenese door interactie met EC ephrin-B2. Recent werd echter gerapporteerd dat Eph-B4 enerzijds het vertakken of sprouting van bloedvaten inhibeert, maar anderzijds de circumferentile groei van het bloedvat stimuleert. Dit zou verlopen via reverse signalering door ephrin-B2 die de associatie murale cel met tumor EC versterkt door activatie van de Ang1-Tie2 signaalweg. Blokkering van Eph-B4/ephrin-B2 interactie reduceert groei en vascularisatie van de tumor. Hetgeen ook deze interactie een potentieel target maakt. (Kuijper et al., 2007)

3.3 De Notch-signaalwegDit cel-cel communicatiesysteem staat in voor laterale inhibitie en bestaat uit 4 types TM Notch receptoren (1-4) en 5 TM liganden (Jagged-1 en -2 en Delta-like (Dll) -1 en -4). Na ligandbinding wordt Notch geactiveerd door knippen en loslating van het Notch IntraCellulair Domein (NICD). Dit knippen gebeurt door 2 proteasen: TNF converterend enzym (TACE, ook bekend als ADAM17 (cfr. infra)) en -secretase. Nucleaire translocatie van NICD en interactie met Recombinatie signaalsequentie-Binding Protene (RBP)

13


leidt tot transcriptie van o.a. Hes en Hey genen. (Fig. 6) Verscheidene componenten zijn aanwezig in EC (Notch1 en 4, Jagged1, Dll-1 en -4, Hes1 en Hey1 en -2) en murale cellen (idem + Notch3). Fig. 6: Overzicht Notch-signaalweg. Vooraf wordt Notch-receptor geknipt door furin-like convertase in het Golgi-apparaat. Uitleg signaalweg: zie tekst. Ubiquitinatie door Mindbomb (MIB) induceert endocytose met vervolgens ev. ontstaan van bidirectionele signalering. (Sainson and Harris, 2007) Notch3 en Jagged1 mutaties liggen aan de basis van resp. CADASIL en Alagille syndroom. Net als bij VEGF is knock-out van slechts 1 allel reeds lethaal voor de embryo. Deze haplo-insufficintie wordt slechts bij deze 2 systemen van alle angiogene factoren waargenomen. Deze feiten benadrukken het belang van deze signaalweg. Functioneel ziet men dat het signaal EC

proliferatie blokkeert. Dit is afhankelijk van inhibitie van p21cip1 en cyclinD-cdk4. Ook stimuleert het EC overleving door apoptose inhibitie via Bcl-2 activatie. (Fig. 7) Dll-4 komt vnl. voor in arterin en capillairen, maar is afwezig in venen. De expressie is laag in adulte bloedvaten, maar sterk aanwezig in tumorEC. Dll-4 is ook aanwezig in TC zelf. Dll-4 expressie wordt gestimuleerd door VEGF, FGF, IL-6 (via STAT3-JAK signaalweg), HIF1, Foxc protenen en Fig. 7: Overzicht interactie VEGF- en NICD (positieve feedback) zelf. (Sainson and Harris, Notch-signaalwegen met duiding van hun 2007) Naast de transcriptie activatie van Hes en Hey functie.(Sainson and Harris, 2007) genen, wordt downstream de VEGF-signaalweg negatief gereguleerd door Dll-4 (downregulatie

VEGFR-2 en PlGF en opregulatie VEGFR-1 en zijn oplosbare vorm die VEGF capteert). (Harrington et al., 2008) Dit is een negatief feedback mechanisme in de VEGF-signaalweg die de transitie van een sterk migrerend en groeiend naar een inactief en functioneel bloedvat induceert. Tot slot verhoogt Dll-4 de arterile marker ephrin-B2 en verlaagt het de veneuze marker Fig. 8: Dll-4 zorgt voor een gepaste reactie op VEGF- COUP-TF2. Toch is de rol in AV-differentiatie onduidelijk. (Fig. 7) gradint (zelf genduceerd De retinale bloedvaten van een Dll-4 +/- muis zijn meer vertakt en door hypoxie). (Thurston and groter (toegenomen proliferatie). Ook stelt men vast dat de stalkKitajewski, 2008) cellen (EC over ganse lengte van de groeiende aftakking met uitzondering van het uiteinde, de tip-cel) hier meerdere filopodia hebben en tip-cel markers (PDGF-B, Unc5B) expresseren. In normale

14


omstandigheden komen filopodia en die markers enkel op de tip-cel voor. Ook Dll-4 en de afwezigheid van een Notch-receptor (normaal aanwezig op de stalk-cel) zijn tip-cel kenmerken. Samen benadrukt dit de functie van laterale inhibitie door Dll-4 in de selectie van EC die migreren naar een angiogene stimulus. Bij afwezigheid hiervan reageren alle nabijgelegen EC als tip-cellen en ontstaat overdreven vertakking en enorme toename van het aantal anastomosen. Kortom Dll-4 voorkomt dat EC tip-cellen worden. (Hellstrm et al., 2007) (Fig. 8) Bij toepassing van Dll-4 blokkerende agentia stelde men, naast afgenomen tumorgroei, vast dat de vasculaire densiteit verhoogd, het aantal vertakkingen verhoogd, het lumen gecollabeerd, de perfusie gedaald en ten slotte het aantal PC gedaald was. (Fig. 9) Deze laatste observatie suggereert een rol in de murale cel rekrutering. (Fig.7) Kortom Dll-4 blokkering inhibeert tumorgroei door toegenomen, maar weliswaar niet functionele angiogenese. Deze paradox wordt bevestigd door de waarneming van verhoogde hypoxie, ondanks de toegenomen angiogenese, in Fig. 9: Effect van Dll-4 blokkering het tumorweefsel. Dit doorbreekt het dogma dat sinds de jaren op tumorale bloedvaten. (Sainson 70 postuleert dat de tumorgroei genhibeerd wordt door and Harris, 2007) blokkering van de angiogenese. Dit dogma leidde tot de ontwikkeling van verscheidene succesvolle therapien. Evenwel kan deze nieuwe strategie leiden tot pro-angiogene, maar toch antitumorale medicatie. Het therapeutisch potentieel van deze agentia blijkt uit de observatie dat ook bij anti-VEGF resistente tumoren de groei wordt gereduceerd. (Sainson and Harris, 2007)

3.4 De Angiopoietine/Tie-signaalwegVervolgens wordt de Angiopoietine (Ang)Tie receptor (Tyrosine kinase met Ig- en EGFhomologie domeinen) signaalweg besproken. De Ang (gesecreteerde glycoprotenen) worden onderverdeeld in 4 types (Ang 1-4 waarvan 1, 2 en 4 bij mens en 3 bij muis) en zijn allen ligand van de Tie2 RTK. Tie2 activatie vereist oligomerisatie (associatie van meerdere subunits). De Tie1 receptor is een wees-receptor m.a.w. men heeft nog geen endogeen ligand voor deze receptor gevonden. Ang1 wordt primair gexpresseerd in perivasculaire mesenchymale cellen (PC en vGSC) en gaat vervolgens paracrien binden op EC Tie2 waardoor activatie. Tevens werd vastgesteld dat Ang1 door TC zelf wordt geproduceerd. Ang2 wordt enkel in EC gexpresseerd waar het opgeslagen is in Weibel-Palade bodies. Na cytokine (bijv. histamine of trombine) activatie van de EC wordt Ang2 hieruit losgelaten. Het bindt autocrien als homodimeer of multimeer op Tie2 zonder activatie van deze RTK. Ang2 wordt opgereguleerd door hypoxie en bepaalde pro-angiogene moleculen (VEGF, FGF, maar ook trombine en TNF) en wordt vnl. gexpresseerd tijdens vasculaire remodellering. Bekend is dat 2 transcriptiefactoren (Ets-1 en FOXO-1) de expressie reguleren. Daarnaast wees onderzoek uit dat Ang2 ook bij pathologie m.n. in tumorEC en in TC zelf (waaronder CRC) tot uiting komt. Kortom beide binden Tie2, maar slechts Ang1 kan de receptor activeren waardoor Ang2 als een competitieve

15


inhibitor van het Ang1/Tie2-signaal kan worden beschouwd. Ook de oorsprong is anders: Ang1 is een paracriene Tie2-agonist en Ang2 is een autocriene Tie2-antagonist. Tie1 en Tie2 zijn EC-specifieke RTK. Tie1 kan complexeren met Tie2. Studies toonden dat Tie1 extracellulair proteolytisch wordt geknipt na VEGF-stimulatie en dat het membraangebonden restant kan interageren met het Tie2signaal. Tie2 komt, naast op EC (vnl. van grote vaten), ook op hematopoietische cellen, EPC en TC voor. Zo is de angiogene activiteit van macrofagen in tumoraal weefsel geassocieerd met een Tie2+ subpopulatie van monocyten. Ook neemt de Tie2 expressie toe tijdens tumor angiogenese. Ang/Tie benvloedt de interactie met murale cellen (PC en vGSC). Ang2-injectie in muisretina veroorzaakt verlies van PC bedekking. Ang1-deficinte hebben net als Tie2-deficinte muizen zeer slechte PC rekrutering. Het exacte mechanisme is onduidelijk, maar verschillende wegen kunnen de Fig. 10: Effect op murale cellen. (eigen schema, 2009) waargenomen effecten verklaren: 1. Het EC-afkomstige HeparineBindend EGF-achtige groeifactor (HB-EGF) wordt opgereguleerd door Ang1 op voorwaarde dat de EC in contact staat met murale cellen. ErbB (HB-EGF receptor) activatie induceert vGSC migratie. 2. Ook HGF speelt een rol in de Ang1-gemedieerde vGSC migratie. 3. PDGF-B induceert Ang1. PDGF-B uit EC bindt PDGFR- op de PC. Dit signaal bevordert murale cel proliferatie en rekrutering. Blokkering van dit signaal zorgt voor een afwezigheid van PC die kan ongedaan gemaakt worden door Ang1-injectie. Hetgeen een additionele rol van Ang1 suggereert. 4. TGF- wordt opgereguleerd door Ang1. Ang1 zelf wordt downgereguleerd door TGF- .

Samengevat kan men de invloed weergeven als fig. 10. (Thomas and Augustin, 2009) Controle van de bloedvatdiameter is Fig. 11: Ang/Tie2-signaalwegen bij een geactiveerde EC. (Thomas and Augustin, 2009) Tie2-afhankelijk en verloopt via een autocriene loop van Apelin op zijn receptor APJ. Activatie van Tie2 resulteert in verschillende effecten (EC overleving, en migratie, inflammatie)

permeabiliteit

afhankelijk van de context. Tie2 expressie gebeurt gepolariseerd

m.a.w. in een rustende EC wordt Tie2 t.h.v. de EC-EC junctie en in een geactiveerde EC t.h.v. ECM gensereerd. Bij deze laatste bindt Tie2 ECM-gebonden Ang1 wat leidt tot EC migratie, lekkage en inflammatie. 1. EC migratie verloopt via focaal adhesie kinase (FAK) activatie door PI-3K (p85-p110), adaptor eiwitten die interageren met Dok-R zoals Nck en PAK en ten slotte SHP-2. Deze laatste defosforyleert de autofosforylatie-sites van Tie2 RTK zodat men opnieuw in de uitgangssituatie terecht komt. Activatie van FAK, die interageert met integrine

16


v3, leidt tot Paxillin fosforylering waardoor ERK verder wordt geactiveerd en leidt tot migratie. Ook leidt Ang1 tot secretie van plasminogeen en MMP hetgeen via ECM afbraak de migratie bevordert. 2. Interactie met Abin-2 interfereert met de NF-B signaalweg via het IKK-complex. Dit veroorzaakt inflammatie en destabilisatie. 3. De toename van de EC permeabiliteit ontstaat door Rho blokkering. Rho stimuleert mDia om met Src te complexeren en bijgevolg te inhiberen. Hierdoor kan Src geen aanleiding geven tot activatie en vervolgens internalisatie van Vasculair Endotheliaal (VE)Cadherin. Src wordt geactiveerd door VEGF-gemedieerde VEGFR-2 activatie. Dit verloopt via VAV, een GEF voor Rac. Rac activeert vervolgens VE-Cadherin en -arrestin2 wordt gerekruteerd waardoor VE-Cadherin d.m.v. clathrin wordt genternaliseerd. Enerzijds zullen de verminderde cel-cel contacten Fig. 12: Ang1/Tie2-signaalwegen bij een rustende EC. Uitleg: zie tekst. (Thomas and Augustin, 2009) EC migratie bevorderen, maar anderzijds ook de permeabiliteit doen toenemen. (Fig. 11) In rust komt de Tie2 receptor t.h.v. de EC-EC junctie met waar Tie2 Ang1 van de

complexvorming

nabijgelegen EC veroorzaakt en vervolgens activatie. 1. PI-3K activeert Akt. Ook zal genactiveerd FAK Akt verder activeren. Akt stimuleert overleving door inhibitie van pro-apoptotische eiwitten (BAD en pro-Caspase 9) en stimulatie van antiapoptotische eiwitten (Survivin en eNOS). FOXO-1 fosforylering en bijgevolg inactivering leidt tot overleving en stabilisatie. FOXO-1 induceert Ang2 productie, maar inhibeert zijn loslating. Bijgevolg zal Ang1 Ang2-expressie onderdrukken. Ang2 is onafhankelijk van de context een inhibitor van de Ang1/Tie2-signaalweg. 2. Inhibitie van de EC proliferatie gebeurt via Grb2- en DokR-gemedieerde inhibitie van de MAPK-cascade. 3. Activatie van de GTPasen Rho reduceert permeabiliteit (cfr. supra). Meer VE-Cadherin adhesie maakt het bloedvat minder doorlatend. Indien er cel-cel contact is associeert VE-PTP met Tie2 waardoor een soort barrire wordt gevormd. Permeabiliteit afname door Ang1 gebeurt ook door PKC inactivatie en sfingosine kinase-1 activatie. Lekkende tumorale bloedvaten worden door fouten in de regulatie van verscheidene systemen veroorzaakt. (Fig. 12) (Thomas and Augustin, 2009) Ang2 wordt zwak in fysiologische EC, maar sterk in tumorale EC gexpresseerd. (Ahmad et al., 2001) Ang2 alleen leidt tot vasculaire regressie, maar in combinatie met angiogene factoren (VEGF of FGF) induceert Ang2 angiogenese. Ang2-blokkering vermindert tumorgroei. Ang2-antilichamen inhiberen niet alleen Ang2-, maar ook VEGF-genduceerde EC migratie en proliferatie tijdens angiogenese. (Oliner et al., 2004) Dit wijst op een versterkende functie van Ang2 op VEGF-gemedieerde angiogenese. Ev. leidt het verlies van PC-bedekking o.i.v. Ang2 tot meer blootstelling van de EC aan de angiogene factoren die ontstaan vanuit de TC eromheen. Tevens werd de gecordineerde

17


samenwerking tussen VEGF en Ang2 in vivo vastgesteld in zones van vasculaire initiatie in tumorweefsel. De rol van Ang1 in tumor angiogenese blijft onduidelijk en lijkt afhankelijk van het type tumor, dosage en hoeveelheid Ang2 in tumor. Zo leidt Ang1-overexpressie tot verminderde tumorgroei en toegenomen PC-bedekking, maar werd in andere types tumorgroei promotie vastgesteld. (Thomas and Augustin, 2009) Herbst et al. (2009) rapporteerde recent over fase1onderzoek op 32 patinten waaronder 9 met CRC waarbij men AMG386 I.V. (inhibeert interactie van Ang1 en Ang2 met Tie2) toedient. In preklinische experimenten inhibeerde AMG386 tumorEC proliferatie en tumor groei, maar niet de TC proliferatie in vitro. Hetgeen consistent is met het antiangiogene werkingsmechanisme. In deze studie ziet men slechts milde bijwerkingen optreden die verschillend zijn van deze bij anti-VEGF therapie gezien hier een andere as wordt genhibeerd. Bijgevolg wordt combinatietherapie (anti-VEGF/anti-Ang) mogelijk zonder accumulatie van de toxiciteit, maar betere tumorgroei onderdrukking. Hetgeen reeds bevestigd is in preklinische resultaten in CRC-modellen met combinatie bevacizumab en AMG386. Dynamisch Contrast-Enhanced (DCE)MR toonde de vasculaire effecten van AMG386 aan.

3.5 De PI-3K/Akt/mTOR-signaalweg in regulatie van de tumor angiogeneseVervolgens bespreken we de rol van de PI-3K/Akt/mammalian Target Of Rapamycine (mTOR)signaalweg in de regulatie van de tumor angiogenese. Akt (ook bekend als PKB) is een centrale regulator van cel overleving, metabolisme, migratie, proliferatie, eiwit synthese en tumorgroei, maar recent werd ontdekt dat Akt ook angiogenese reguleert. (Jiang and Liu, 2008b) De eerste observatie van de rol van Akt in angiogenese regulatie in vivo was een CCAMA waarbij d.m.v. een retrovirale vector Akt geforceerd gexpresseerd werd. Hierbij werd angiogenese inductie met toegenomen sprouting en grotere bloedvaten vastgesteld. (Jiang et al., 2000) Daarnaast leidde inhibitie van zowel PI-3K als Akt d.m.v. hun siRNA tot minder tumor angiogenese en groei. Maar ook andere moleculen (LY294002, ON-III, capsacine, SU5416 en apigenin) die het PI-3K/Akt-signaal inhiberen bleken tumor-genduceerde angiogenese te onderdrukken. Upstream componenten (bijv. PI-3K, Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosoom 10 (PTEN) en Ras) van de Akt-signaalweg zijn frequent gemuteerd in TC. Zo is bewezen dat de genen voor beide subunits (de regulatoire p85 en de katalytische p110) van PI-3K in een aanzienlijk deel van CRC gemuteerd zijn. (Ollikainen, 2007; Philp, 2001) Akt wordt geactiveerd door groeifactoren (VEGF, FGF, EGF, HGF, IGF en Ang1). In TC kunnen activerende mutaties of amplicaties van oncogenen Ras, Src of PI-3K, maar ook inactiverende mutaties of deleties van tumor suppressor PTEN Akt activeren. Zo is het regulerend domein (p85) van PI-3K constitutief geassocieerd met en wordt gefosforyleerd door VEGFR-2. De PI-3K/Aktsignaalweg speelt een belangrijke rol in het Ang1/Tie2-signaal. Ang1 induceert in EC PI-3K activatie die op zijn beurt Akt activeert. Inhibitie van deze signaalweg leidde tot volledig wegvallen van het effect op EC overleving door Ang1. (Jiang and Liu, 2008b) De PI-3K/Akt-signaalweg is complex. Dysregulatie van dit systeem in carcinoom is frequent en gezien

18


zijn belang in de angiogenese regulatie en tumorgroei wordt hierop nader ingegaan. In respons op groeifactor-gemedieerde activatie van de RTK localiseert PI-3K naar de PM. Naast RTKs kunnen

ook intracellulaire protenen zoals PKC, SHP1, Rac, Rho, Ras en Src PI-3K activeren. Dezefosforyleert PI(4,5)P2 tot PI(3,4,5)P3. Deze laatste bindt en activeert specifieke eiwitten (Akt, GEF voor Rac, GAPs, ) t.h.v. de PM. Akt is belangrijk voor cellulaire functie regulatie. Doordat Akt naar de PM wordt gerekruteerd via binding met PIP3 wordt het gefosforyleerd en geactiveerd door Phosphoinositide-Dependent Kinase 1 (PDK1). Na activatie gaat Akt van cytosol naar nucleus waar het meerdere downstream targets fosforyleert. Akt bevordert cellulaire overleving door inhibitie van FOXO, die leidt tot transcriptie van o.a. Fas ligand (FasL) en BIM, en BAD, die BclXL inhibeert. Ook inductie van IKappaB Kinase (IKK), die NF-B inhibeert, Fig. 13: Overzicht PI-3K/Aktsignaalweg. (Jiang and Liu, 2008a) en Human Double Minute 2 (HDM2), die p53 inhibeert, blokkeert apoptose. Akt bevordert

celcyclusprogressie via invloed op c-Myc, Cyclin D en p27Kip1. Akt reguleert protene synthese door inhibitie van

Tubereuze

sclerose

complex

(TSC)

waardoor mTOR activatie. Dit mTOR activeert p70S6K1 (S6K) en fosforyleert de translatie initiatie factor 4EBP. Daarnaast medieert Akt het glucose-metabolisme door invloed op Glycogeen Synthase Kinase 3 (GSK3), Glucose-6-Phosphatase (G6Pase) en Glucose Transporter 4 (GLUT4). PTEN defosforyleert de 3-fosfaat van PIP 3 waardoor Akt inhibitie. PTEN overexpressie inhibeert angiogenese, maar ook teveel Akt activiteit veroorzaakt abnormale vascularisatie. Hetgeen suggereert dat een geschikte downregulatie van Akt essentieel is in bloedvatvorming. (Fig. 13) (Jiang and Liu, 2008a) Er bestaan 3 isovormen van Akt: Akt 1-3. Akt 1 heeft een belangrijke rol in foetale ontwikkeling en vascularisatie. Akt 1 is de predominante isovorm in vasculaire cellen en is noodzakelijk voor ischemie- en VEGF-genduceerde angiogenese. Zo hebben Akt 1 -/- muizen minder EPC mobilisatie in respons op ischemie. Akt 2 is in muizen nodig voor de insuline-signaalweg en glucose homeostase. Akt 3 -/- muizen hebben enkel een kleiner hersenvolume. (Jiang and Liu, 2008b) Onderzoek toonde aan dat Akt de VEGF-expressie reguleert: enerzijds stimuleert zowel Ras als HGF en insuline de VEGF-productie via PI-3K/Akt en anderzijds zal PI-3K inhibitor LY294002 de VEGFexpressie verminderen. Kortom VEGF activeert via VEGFR PI-3K/Akt die op zijn beurt de expressie van VEGF en VEGFR reguleert. Anders gezegd Akt en VEGF vormen een autocriene loop die tumorgroei en angiogenese reguleert. Akt activatie is voldoende en noodzakelijk voor VEGF- en HIFexpressie in TC. Hypoxie-induceerbare factor 1 (HIF-1) is een heterodimere transcriptiefactor die

19


bestaat uit HIF-1 en HIF-1. HIF-1 wordt genduceerd door hypoxie, groeifactoren en oncogenen. HIF-1 daarentegen is constitutief aanwezig. HIF-1 reguleert expressie van vele genen waaronder VEGF, Haem oxygenase, induceerbaar NOS en verschillende glycolyse-enzymen. HIF-1 is belangrijk voor tumorangiogenese en groei. HIF-1 wordt bij normoxie gehydroxyleerd door prolyl hydroxylasen waardoor het gebonden wordt met het Von Hipple Lindau (VHL) protene. Dit zorgt voor snelle degradatie door het ubiquitine-proteasoom systeem. Bij hypoxie kan de hydroxylatie niet Fig. 14: PI-3K en Ras in inductie van tumor angiogenese. Let op de autocriene loop van VEGF(R). (Jiang and Liu, 2008a) doorgaan (zuurstof is co-substraat en hypoxie veroorzaakt

accumulatie van succinaat die een reactie-eindproduct is) waardoor HIF-1 niet wordt afgebroken en accumuleert. Daarnaast blijkt acetylatie van HIF-1 door Arrest-defective 1 protein (ARD1) noodzakelijk voor VHL binding. Akt activatie is noodzakelijk voor HIF-1-expressie. Akt reguleert HIF-1 via HDM2 en p70S6K1. Akt fosforyleert HDM2 waardoor translocatie van cytoplasma naar kern mogelijk wordt. De Ras-cascade (ook bekend als de MAPKsignaalweg) en zijn componenten zijn ook frequent gemuteerd (20% van alle) in carcinoom. Vnl. K-Ras is de frequentste mutatie (36% van de CRC). Deze cascade: RasRafMEKERK (MAPK) is een majeure regulator van proliferatie, adhesie en motiliteit (Ma and Adjei, 2009), maar via NF-B ook van tumor angiogenese. VEGF en NF-B hebben een synergistisch effect in inductie van tumor

angiogenese. (Fig. 14) (Jiang and Liu, 2008a) Rapamycine (sirolimus, een mTOR inhibitor) vermindert tumorgroei en angiogenese door verminderde Akt-fosforylering in tumorEC. Het eiwit mTOR is deel van 2 verschillende complexen: mTORC-1 en -2. Rapamycine inhibeert normaal enkel mTORC-1, maar in EC wordt ook mTORC-2 genhibeerd. Deze kan Akt fosforyleren en hierdoor stimuleren. Voor een volledig overzicht van de rol van mTOR in tumorigenese verwijs ik naar Guertin and Sabatini (2007). Zo bestaat er een negatieve feedback waardoor mTORC-1 activatie PI-3K/Akt onderdrukt via S6K1. Samen met het feit dat mTORC-2 Akt kan fosforyleren, kan men stellen dat mTOR zowel upstream als downstream de functie van Akt benvloedt. De mTOR inhibitoren zoals rapamycine (bekend als

immunosuppressivum) en afgeleiden (temsirolimus, everolimus (fase II trial voor CRC) en deforolimus) zijn verst in ontwikkeling van de farmacologische inhibitie van de as PI-3K/Akt/mTOR. PI-3K-, Akt- en mTOR-inhibitoren onderdrukken tumorgroei en angiogenese. Velen worden preklinisch getest (bijlage?): bijv. PX-316 (specifieke Akt-inhibitor) inhibeert groei van colonkankercellen in muizen. (Ma and Adjei, 2009) Bepaalde natuurlijke producten die gebruikt worden in voedingssupplementen blijken hun bewezen weliswaar milde anti-tumorale eigenschappen uit te oefenen via inhibitie van Akt. Deze producten (o.a. resveratrol (druiven, noten,), apigenin

20


(flavonod in groenten en fruit), capsacine (rode pepers)) inhiberen tumor angiogenese in vivo in een CCAMA door inhibitie van VEGF en HIF-1 expressie via de PI-3K/Akt-signaalweg. (Jiang and Liu, 2008b; Mojzis et al., 2008)

3.6 De groeifactorenAchtereenvolgens bespreken we de rol van verscheidene groeifactoren: TGF-, PDGF, HGF, FGF, HGF, CTGF, EGF en PDECGF met uitzondering van de reeds besproken VEGF.

Ten eerste wordt de TGF- superfamilie besproken. Deze bestaat uit TGF- (1-3), activines en Bot Morfogenetische Protenen (BMPs) en is betrokken bij embryonale ontwikkeling, wondherstel, fibrose, vasculaire en immunologische ziekten, maar ook bij kanker. Het signaal verloopt via type I en Fig. 15: TGF- superfamilie signaalwegen in EC. SolEndo= oplosbaar endoglin, Sol-Betagl= oplosbaar betaglican, TF= transcriptiefactor. (ten Dijke et al., 2008) type II receptoren kinase ligand die beide activiteit heeft een

serine/threonine bezitten. Elk

specifieke set van type I en type II receptoren waarmee het interageert. Voor TGF- worden ze resp. TRI en TRII genoemd. TGF- van binding een

induceert

vorming

heterodimeer complex die meestal bestaat uit TRI (ook activin receptorlike kinase 5 (ALK5) genoemd) samen met TRII. In EC kan TGF- ook signaleren via TRII-ALK1

complex. Activines binden activine type II receptoren (ActRIIs) en ALK4. BMPs signaleren via BMP type II receptor (BMPRII) en ActRIIs en ALK1, 2, 3 en 6. Na ligand-genduceerde heterodimerisatie zal de constitutief geactiveerde kinase van de type II receptor de type I receptor fosforyleren op serine en threonine residus t.g.v. de juxta-membranaire positie. De geactiveerde type I receptor fosforyleert Smads. I.t.t. TGF- en activines die vnl. Smad2 en 3, zullen BMPs vnl. Smad1, 5 en 8 activeren. Deze geactiveerde Smads complexeren met een gemeenschappelijke mediator, Smad4. Dit complex bindt DNA en benvloedt gen-expressie als transcriptiefactor al dan niet samen met andere co-activatoren en co-repressoren. In EC kan TGF- op 2 manieren signaleren: enerzijds via ALK1 waardoor EC proliferatie en migratie en anderzijds via ALK5 waardoor inhibitie van deze functies. De signaalweg-interactie verloopt als volgt: de ALK5Smad2/3 signaalweg inhibeert de ALK1Smad1/5 signaalweg en vice versa. Endoglin (CD105) is, net als betaglican, een TGF- type III auxiliaire receptor die zelf niet direct signaleert, maar de cellulaire respons op deze superfamilie moduleert. Endoglin en betaglican op zich bestaan uit een membraangebonden homodimeer. Beide type III receptoren complexeren met TRII, maar endoglin heeft TRII nodig voor binding met TGF-

21


1 en 3 terwijl betaglican in se alle 3 de isovormen kan binden. Op microvasculaire EC werden ook endoglin-betaglican complexen geobserveerd. Beide kunnen, naast de membraangebonden, na proteolytisch knippen ook in oplosbare vorm voorkomen. Deze zal d.m.v. ligand sekwestratie receptorbinding inhiberen. (ten Dijke et al., 2008) (Fig. 15) Verhoogde concentratie oplosbaar endoglin (sol-endo) werd gedetecteeerd bij kanker en pre-eclampsie. Zo stelde Mysliwiec et al. (2008) vast dat in CRC de VEGF-A, maar niet de sol-endo spiegel verhoogd was. Indien het CRC echter gemetastaseerd was, was sol-endo wel verhoogd. Zo kan sol-endo helpen bij de selectie van gemetastaseerd CRC. Het intracellulair domein van endoglin heeft geen enzymatische activiteit, maar bevat serine en threonine residus die gefosforyleerd kunnen worden door TRII, ALK1 en 5. Endoglin interageert intracellulair, naast met TRs, met zyxin en ZRP-1 (2 focale adhesie protenen waardoor endoglin EC migratie kan controleren onafhankelijk van TGF-), -arrestin2 (waardoor endoglin internalisatie optreedt wat leidt tot inhibitie van TGF--genduceerde ERK activatie en EC migratie) en ten slotte met Tctex2 (betrokken in retrograad eiwittransport). Naast de TGF-afhankelijke interactie van endoglin met TRII, kan endoglin ook ligand onafhankelijk binden met TRII en ALK1/5. Endoglin kan bovendien binden met activines en BMPs. Er bestaan 2 spliceisovormen: Long (L-) en Short (S-) endoglin. Op EC is de L-vorm overwegend aanwezig, in lever en long daarentegen vnl. de S-vorm. Het belang hiervan uit zich in de differentile modulatie van de TGF- signalering. L-endoglin versterkt de TGF-/ALK1 signaalweg; S-endoglin bevordert de TGF/ALK5 signaalweg. Geforceerde expressie van S-endoglin in muis EC resulteerde in minder neovascularisatie en tumorgroei. Hetgeen suggereert dat S-endoglin, in contrast met L-endoglin, antiangiogene eigenschappen heeft. Samengenomen kan men stellen dat het endoglin in EC de ALK5signaalweg inhibeert en hierdoor de TGF--genduceerde groeionderdrukking inhibeert. M.a.w. endoglin promoot EC proliferatie. Dwel et al. (2006) bevestigde dit door het aantonen van gereduceerde tumorgroei en -angiogenese in endoglin+/-

muizen. Verder is er bewezen dat endoglin

MAPK kan activeren. Endoglin zou ook TGF- onafhankelijke functies hebben (zoals de vastgestelde apoptose-inhibitie door endoglin tijdens hypoxie). (ten Dijke et al., 2008) Samengevat kan men stellen dat endoglin de TGF-1 gemedieerde onderdrukking van EC groei en migratie antagoneert en daarbij anti-apoptotisch is. TGF- zelf speelt een rol in de functie van PC. PC stabiliseren en onderdrukken de groei van nieuwgevormde bloedvaten. TGF-1 wordt geproduceerd na het maken van contact tussen EC en PC voorloper. Hierdoor ontstaat EC proliferatie/migratie onderdrukking, verminderde VEGFR2 expressie en differentiatie tot een mature PC. (Karamysheva, 2008) Hereditaire hemorrhagische telangiectasien (HHT, ook bekend als de ziekte van Rendu-OslerWeber) toont het belang van het TGF- systeem in de bloedvatontwikkeling. De klinische kenmerken zijn telangiectasien (waardoor recurrente neusbloedingen) en AV malformaties. De 2 varianten HTT1 en HTT2 zijn verbonden met mutaties in resp. endoglin en ALK1. Studies suggereren dat defectieve paracriene TGF- signalering van EC naar PC/vGSC leidt tot inefficinte maturatie van deze waardoor ruptuur snel optreedt.

22


Belangrijk te vermelden is dat endoglin in rustende EC niet of slechts zeer weinig geproduceerd wordt, maar in EC bij actieve angiogenese (zoals tumoren, na ischemie, bij embryogenese en inflammatie) zeer sterk tot uiting komt. Naast hypoxie, TGF- en BMP9 kan ook constitutief actief ALK1 endoglin expressie stimuleren. TNF zal in EC deze inhiberen. Endoglin komt, naast op EC, ook voor op monocyten, placenta, vGSC t.h.v. atherosclerose, hematopoietische stamcellen in beenmerg, maar ook op TC. Endoglin is sterk aanwezig in tumor EC waaronder CRC. Vasculaire densiteit bepaling met anti-endoglin kleuring of de spiegel van circulerend endoglin is prognostisch relevant. Antilichamen tegen endoglin zijn gebruikt voor tumor beeldvorming en kunnen gekoppeld worden aan toxines of radioactieve elementen zodat het effect van deze juist wordt gelocaliseerd. Deze antilichamen kunnen angiogenese inhiberen door inhibitie van EC proliferatie. (ten Dijke et al., 2008) Ze bleken in primaten veilig te zijn, hetgeen wellicht te verklaren is door de tumorEC-specifieke distributie. Daarnaast werd een bispecifiek CD3/CD105-antilichaam ontwikkelt waardoor cytotoxische T-lymfocyten (CD3+) zorgen voor lysis van tumorEC (CD105+) in vitro. (Hofmeister et al., 2008) Ook de anti-angiogene effecten van sol-endo zouden therapeutisch kunnen aangewend worden. Daarnaast bleek dat een ALK5-inhibitor leidde tot gedaalde PC bedekking van EC vnl. t.h.v. tumorEC. (ten Dijke et al., 2008) BMP activiteit wordt gemoduleerd door extracellulaire bindingseiwitten zoals BMPER (BMP ECafgeleide regulator) en noggin (endogene BMP antagonist). BMPs werden eerst beschreven wegens hun rol in botvorming en organogenese, maar recent bleek dat BMPs ook een rol hebben in de vasculaire ontwikkeling. Vnl. BMP2 en 4 zouden hier belangrijk zijn. Zo is BMP4 noodzakelijk voor EPC differentiatie. Maar ook invloed op postnatale neovascularisatie werd vastgesteld. BMP4, via BMPER interactie, induceert in vitro EC migratie en verhoogt vasculaire densiteit in vivo bij CCAMA. BMP4-genduceerde angiogenese is gemedieerd via ERK1 en 2. BMP9 en 10 kunnen FGF- en VEGFgenduceerde angiogenese onderdrukken. BMP9 bleek niet alleen de sprouting angiogenese te onderdrukken, maar destabiliseerde ook de reeds aangelegde vaten. (Cristofaro and Emanueli, 2009) Kodach et al. (2008) meldde dat de BMP-signaalweg is genactiveerd in de meerderheid van het sporadisch CRC. Eerder werd juveniele polyposis (CRC predispositie) reeds gekoppeld aan BMP receptor 1a mutaties.

Ten tweede wordt de rol van PDGF verduidelijkt. Angiogenese bestaat niet enkel uit groeiende EC, maar tevens uit murale cellen. De interactie EC-murale cel blijkt belangrijk te zijn voor bloedvatvorming. De PC staat in voor regulatie van bloedvatdiameter en permeabiliteit, mechanische stabilisatie, stimulatie (paracrien of via cel-cel contact) van EC overleving en inhibitie van EC groei. De PDGF-familie bestaat uit homo- en heterodimeren van PDGF-A tot D die d.m.v. zwavelbruggen verbonden worden tot PDGF-AA, -BB, -CC, -DD en -AB (gevonden in plaatjes, onduidelijke rol). De receptoren bestaan uit 2 RTKs (PDGFR en ) die bij activatie door ligandbinding dimeriseren tot PDGFR, en . Van alle familieleden is PDGF-BB de enige die alle 3 de receptordimeren kan binden. PDGF-CC en DD zijn minder voorkomend. Interacties worden weergegeven in fig. 16.

23


PDGFR is dominant op murale cellen. PDGF-BB wordt vnl. geproduceerd in EC, megakaryocyten en neuronen; PDGF-AA en -CC in voorlopers van epitheel-, spier- en Fig. 16: PDGF(R) interacties. TK= tyrosine kinase (Cao et al., 2008) zenuwcellen; PDGF-DD in fibroblasten en bepaalde GSC. De VEGFfamilie en de PDGF-familie hebben gebaseerd op genoomanalyse een gemeenschappelijke voorloper. Ze werden verdeeld o.b.v. binding met hun resp. receptor, maar recent bleek dat VEGF-A PDGFR kan binden en activeren. Dit doet afbreuk aan de algemene visie van resp. doelwitcel m.n. voor VEGF de EC en voor PDGF de mesenchymale cel. (Karamysheva, 2008; Cao et al., 2008) PDGFs hebben een cruciale rol tijdens de embryonale ontwikkeling van bijna alle stelsels waaronder de vasculatuur, maar in volwassen fysiologische omstandigheden zijn de functies beperkt. PDGF werkt primair als paracriene factor (in casu: ECPC/vGSC), maar in bepaalde tumoren (glioma, sarcoma en leukemie) werd een autocriene loop t.h.v. de TC vastgesteld. Fysiologische autocriene loops zoals bij VEGF-A in EC werden niet gevonden. PDGF expressie wordt gestimuleerd door hypoxie, trombine, cytokines en groeifactoren waaronder PDGF zelf. Mesenchymale PDGFR expressie is in vivo laag, maar neemt sterk toe o.i.v. enerzijds TNF, Il1, lipopolysaccharide (inflammatie) en anderzijds FGF2, TGF- en oestrogeen. Bij angiogenese zal de PDGF-BB uit EC zorgen voor rekrutering van PDGFR+ PC. De productie is het hoogst t.h.v. de tip-cel waardoor er een functioneel belangrijk gradint ontstaat. PDGF bindt, net als VEGF, heparine en HSPGs. Deze interactie is afhankelijk van de sulfaatgroepen op HSPG. Zijn deze verminderd, dan treedt PC loslating en vertraagde PC migratie op. Onderzoek suggereert dat PDGF-BB interageert met HSPG in de peri-endotheliale matrix waardoor locale opstapeling ontstaat. Deze zou kritisch zijn voor een juiste PC incorporatie. PDGF signaaltransductie verloopt via verscheidene wegen zoals PI-3K (activatie Akt, PKC, p70S6 Fig. 17: Overzicht intracellulaire signaalwegen van PDGFR. Uitleg: zie tekst. (Andrae et al., 2008) kinase, GTPasen van de Rho familie en Jun N-terminal Kinase (JNK, ook bekend als Stress Activated Protein Kinase (SAPK)), Ras-MAPK (vnl. via Grb2, bindt SOS die Ras activeert, en Shc) en PLC (leidt tot intracellulaire Ca2+-mobilisatie en PKC activatie). Verschillende additionele wegen werden vastgesteld. Zo leidt Src activatie tot Myc transcriptie waardoor mitose optreedt en zal de adaptor Nck de PDGFR binden waardoor JNK wordt geactiveerd. PDGFRs kunnen interageren met integrines waardoor PDGFRs en zn effectoren zich localiseren t.h.v. focale adhesies waar verschillende signaalwegen initiren en communiceren. Deze interactie komt tot stand door binding met Na+/H+ exchanger regulatoire factoren (NHERFs). Deze NHERFs verbinden PDGFR met FAK, het actine cytoskelet, N-cadherine en PTEN. Maar ook negatieve regulatie is aanwezig. Zo zullen RasGAP (inactiveert RAS) en SHP2 (defosforyleert receptor en substraten) de PDGFR binden. Ook

24


endocytotische receptor internalisatie gevolgd door lysosomale degradatie is belangrijk in de negatieve regulatie. Alix bindt PDGFR en bevordert ubiquitinatie en Cbl afbraak waardoor receptorafbraak wordt tegengegaan. (Fig. 17) (Andrae et al., 2008) Het tumorstroma bestaat uit een vasculair (EC en PC) en een fibreus (tumor fibroblasten) compartement. PDGF expressie wordt frequent gezien in TC, maar ook in het tumorstroma van verscheidene carcinomen waaronder CRC. Zowel PC als fibroblasten kunnen gerekruteerd worden door TC-afkomstig PDGF. Vasculair hebben vnl. PC PDGFR expressie. Belangrijk is dat zowel de kwantiteit als de kwaliteit van de PC een rol speelt. Tumor vasculatuur is meestal gekenmerkt door verlaagde PC bedekking (normaal: 75%, CRC: 65%, prostaatcarcinoom: 38%). Het aantal gerekruteerde PC benvloedt tumorbloedvatfunctie en tumorgroei. In een muismodel bleek PDGFRinhibitie in PC een synergistisch effect te hebben met VEGFR-inhibitie in EC t.a.v. tumorgroei onderdrukking. Qua PC kwaliteit blijkt PC loslating te leiden tot toegenomen metastasering. Tumor fibroblasten werden lang als een passieve component van de tumor aanzien, maar onderzoek toont effect op tumorprogressie. PDGF-gedreven rekrutering van fibroblasten versnelt progressie, waarschijnlijk via TGF-. Daarnaast kunnen deze de angiogenese direct benvloeden en onderhouden door bewezen productie van angiogene factoren zoals VEGF die dus niet enkel door de TC zelf wordt geproduceerd. In een muismodel bleken fibroblasten FGF2 en 7 te produceren waardoor TC proliferatie wordt gestimuleerd. Ook Stromal cell-derived factor 1 (SDF1), die door binding van CXCR4 op de TC tumorgroei bevordert, en CCL5/RANTES, die tumor metastase kan bevorderen, worden door fibroblasten gesecreteerd. (Cfr. infra) (Andrae et al., 2008) Imatinib (Glivec) is via binding in de ATP-pocket een orale RTK inhibitor die c-Kit, bcr-abl (t(9,22) fusie-protene), maar ook PDGFR inhibeert. Het is erkend in de behandeling van CML en GIST waar het gebruikt wordt zonder veel bijwerkingen. Momenteel wordt deze ook preklinisch getest bij solide tumoren. Een studie met CDP860 (selectieve PDGFR inhibitor) bij CRC patinten werd vroegtijdig stopgezet wegens optreden van ascites en pleurale effusies terwijl er geen effect werd vastgesteld op tumorgroei. (Homsi and Daud, 2007) Klinische toepassing van PDGF inhibitie moet goed onderzocht worden gezien de tegenstrijdige resultaten. Enerzijds meldt Nakamura et al. (2008) dat CRC patinten met hoge PDGF-BB expressie meer vasculaire invasie en slechtere overleving vertonen dan met lage expressie. Anderzijds meldt McCarty et al. (2007) dat PDGF-BB overexpressie in CRC leidt tot PC toename en verrassend een afgenomen tumorgroei. Samen met een PC-afname, nam de tumorgroei terug toe bij PDGFR-inhibitie door imatinib. Hetgeen het in vitro vastgesteld inhiberend effect van de murale cellen op EC proliferatie illustreert. PDGFR inhibitie, indien niet op TC zelf, kan dus leiden tot toename van de tumor. Veel is reeds gekend over de invloed van individuele factoren op de tumor angiogenese. Weinig is gekend over de interactie tussen deze factoren onderling alhoewel experimenten wijzen op de aanwezigheid ervan en het belang in de spatiotemporele angiogenese regulatie. Zo stelde men een

25


angiogeen synergisme vast tussen PDGF-BB en FGF2. De coperatieve rol in tumorangiogenese verloopt als volgt: activatie van de FGF-receptor (FGFR) door TC-afkomstige FGF2 stimuleert de expressie van PDGFR en op de EC. Normaal wordt PDGFR niet op EC gexpresseerd, maar FGF2 sensitiseert de EC voor PDGF-genduceerde motiliteit. TCFig. 18: Reciproke interactie afkomstige PDGF-BB op zijn beurt verhoogt de gevoeligheid van tussen TC-afkomstig FGF en PDGF in tumor angiogenese. vGSC voor FGF2 door FGFR1 opregulatie. Deze reciproke (Cao et al., 2008) interactie versnelt bloedvatgroei. (Fig. 18) Deze interacties, samen met het feit dat anti-VEGF therapie leidt tot een verschuiving naar een andere angiogene factor zoals FGF2, vormen de rationale van farmaceutische blokkering van verschillende wegen zoals PDGF, FGF en VEGF. Verrassend is het feit dat de vasculatuur die ontstaat na FGF2/PDGF-BB stimulatie in tumoren lekkend en chaotisch is, terwijl deze in ischemisch weefsel (bijv. na infarct) normaal en functioneel is. Men zou PDGF-BBgemedieerd muraal cel rekrutering verwachten waardoor normalisatie optreedt. Een mogelijke verklaring is dat VEGF, die erg hoog is in tumoren, de rekrutering tegenwerkt. Greenberg et al. (2008) melden dat VEGF de bloedvatmaturatie negatief benvloedt door onderdrukking van de PDGFRsignaalweg in vGSC via vorming van het complex VEGFR-2/PDGFR. VEGF inhibitie leidt tot uiteenvallen van het complex en zorgt, indien PDGF aanwezig is, voor tumorbloedvat maturatie. Dit toont dat VEGF enerzijds zorgt voor EC proliferatie en migratie, maar anderzijds een negatieve regulator is van vGSC en bloedvatmaturatie. Het antagonisme tussen VEGF en PDGF leidde tot de vaststelling dat indien elk apart toegepast ze de angiogenese stimuleren, maar indien samen inhiberen. (Cao et al., 2008) Ten derde wordt de rol van FGF verduidelijkt. De FGF-familie bestaat uit 23 leden waarvan FGF1 (zuur), 2 (alkalisch, FGF prototype), 4, 5 en 8 een bewezen angiogene invloed hebben. De angiogene activiteit van FGF2 is reeds meermaals vastgesteld in een CCAMA. Deze binden FGFR1-4. FGFR1 wordt gexpresseerd door EC; FGFR2 ook, maar minder frequent. FGFR3 en 4 zijn nooit op EC gevonden. Algemeen komen de FGFRs voor op bijna alle celtypen en vertegenwoordigen ze diverse biologische functies. Zo wordt via FGFR EC migratie en proliferatie gestimuleerd, wordt urokinase Plasminogeen Activator(uPA), MMPs en collagenasen losgelaten waardoor ECM remodelling, maar wordt ook tijdens de embryonale ontwikkeling de differentiatie van een pluripotente mesodermale cel naar een EPC gestimuleerd waardoor bloedeilandjes ontstaan. Dit verloopt via verschillende wegen (Src, FGFR substraat 2 (FRS2) en PLC). Voor overzicht: zie fig. 19. FGF bindt, naast FGFRs, ook op integrines, HSPGs en gangliosiden. Enerzijds wordt FGF losgelaten door stromale, leukocytaire of TC en werkt deze paracrien in op EC. Anderzijds zullen cytokines de EC stimuleren tot FGF productie waardoor autocriene en intracriene stimulatie in EC ontstaat. HSPGs zijn geassocieerd met de PM. De FGF/HSPG interactie moduleert angiogenese in vitro en in vivo door directe activatie van PIP2

26


waardoor PKC en uiteindelijk de MAPK-cascade wordt geactiveerd. Ook kunnen HSPGs (coreceptor) na FGF binding complexeren met FGFR waardoor FGF beter wordt gepresenteerd aan FGFR. Ten slotte zullen HSPGs een FGF-reservoir vormen Fig. 19: FGF2-signaaltransductie in waardoor accumulatie in de EC micro-omgeving en EC. (Rusnati and Presta, 2007) langdurige stimulatie optreedt. Zo zal het anti-angiogeen anti-trombine EC proliferatie inhiberen door downregulatie van het HSPG perlecan. Belangrijk is dat FGF2 HSPG afbraak reguleert via proteasen en glycosidasen. Net zoals bij VEGF, leidt ECM afbraak tot vrijstelling van het gebonden FGF2. Integrines zijn TM receptor heterodimeren bestaande uit een en keten. Ze benvloeden celadhesie via binding met een ECM-component. Ook kunnen integrines de EC respons op groeifactoren waaronder FGF2 reguleren. Integrine V3 wordt gexpresseerd op EC en speelt een centrale rol in angiogenese waardoor het een antiangiogenese target is (cfr. infra). FGF2 bindt V3. Integrines hebben geen intrinsieke tyrosine kinase activiteit, maar toch geeft deze signaalweg aanleiding tot FAK fosforylering. Hierdoor wordt RhoA GTPase en Src geactiveerd. Deze weg leidt tot MAPK activatie en nucleaire translocatie van NF-B. Er bestaat een directe V3/FGFR1 interactie die samen met FGF2 leidt tot focale adhesie vorming waarin deze receptoren worden geconcentreerd. Men stelt vast dat antilichamen tegen V3 de expressie van FGFR op de EC inhiberen. Gangliosiden zijn glycosfingolipiden die op de endotheliale PM worden gevonden. Ze binden FGF1, 2 en 4 waardoor FGF signaaltransductie wordt gemoduleerd. Hoe is onbekend, maar het ligand voor deze receptor fungeert als FGF2 antagonist in EC. (Fig. 19) Er zijn tal van endogene FGF-inhibitoren gevonden in bloed (bijv. 2-macroglobuline, maar ook de oplosbare vorm van het extracellulair deel van FGFR1), ECM (bijv. Trombospondine 1 (TSP1)) en intracellulair (bijv. Sprouty protenen). TSP1 wordt als glycoprotene gesecreteerd door EC en is een potente endogene angiogenese-inhibitor. Het bindt HSPG, integrines en vooral FGF2 waardoor TSP1 de mitogene en chemotactische activiteit van FGF2 in EC inhibeert. TSP1 sekwestreert FGF2 in een inactief complex. Belangrijk te vermelden is dat FGF-antagonisten de tumorgroei kunnen onderdrukken zowel via anti-angiogenese als via inhibitie van de FGF-gedreven TC proliferatie. Combinatie met chemotherapie die ook zon duale werkwijze vertoont lijkt aangewezen. Toch zijn gezien het pleiotroop karakter van FGF bijwerkingen te verwachten. (Rusnati and Presta, 2007; Eichhorn et al., 2007)

Ten vierde wordt de rol van HGF verduidelijkt. HGF bestaat uit een heterodimeer (ketenzwavelbrug-keten) en bindt zijn receptor c-Met (Mesenchymale-epitheliale transitie, RTK). Het wordt enkel gexpresseerd door mesenchymale cellen. Met wordt vnl. door epitheliale cellen

27


gexpresseerd, maar ook EC (vasculair en lymfatisch), PC, hepatocyten, neuronen en hematopoietische cellen bevatten Met. In verschillende TC (borst, long, lever, ) wordt Metexpressie gestimuleerd door HGF in een autocriene loop. Opregulatie van zowel HGF als Met is een Fig. 20: Intracellulaire interactie tussen Met en adaptors. Tyr= tyrosine autofosforylering site. (You and McDonald, 2008) negatieve prognostische indicator. Deze signaalweg speelt een belangrijke rol niet alleen in embryogenese en ontwikkeling, maar ook in angiogenese en tumorgroei. HGF-genduceerde Met activatie leidt intracellulair tot binding met Src, p85 van PI-3K, Grb2 en Grb2-associated binder-1 (Gab1). Dit activeert verschillende wegen (met belang in de angiogenese-regulatie): de PI-3K/Akt, Ras/ERK, Src/FAK (celadhesie en migratie) en de p120/Signaal Transducer en Activator van Transcriptie 3 (STAT3) signaalweg. (Fig. 20) Deze laatste is pleiotroop, maar heeft vnl. een rol in proliferatie en overleving. Kusaba et al. (2006) registreert constitutief geactiveerd Stat3 in 60% van de CRC-specimens wat gepaard gaat met slechtere prognose. Samen leiden deze wegen tot EC stimulatie op een directe (motogeen en mitogeen effect) en indirecte (opregulatie angiogene factoren: HGF stimuleert VEGF(R)-expressie in EC) manier. Doordat de HGF/Metsignaalweg geactiveerd is bij angiogenese en tumorgroei werden reeds vele inhibitoren (zie bijlage) ontwikkeld die momenteel nog vnl. in preklinsche fase zitten. (You and McDonald, 2008) Recent meldt Boardman (2009) dat Metastase-geassocieerd in Colon Carcinoom 1 (MACC1) de HGF/Metcascade reguleert en dat MACC1 overexpressie in CRC significant correleert met het risico op metastase. MACC1 mRNA is een onafhankelijke prognostische indicator van ziektevrije overleving (indien laag: 5jaarsoverleving=80%, hoog: 15%). MACC1 stimuleert Met-expressie en kan een nieuw therapeutisch target worden.

Ten vijfde wordt de rol van de Connective tissue growth factor (CTGF) verduidelijkt. De CTGF is lid van de CNN-familie bestaande uit gesecreteerde ECM-gebonden protenen die diverse functies in angiogenese en tumorgroei hebben. De CNN-familie omvat Cystene-rijk 61, CTGF, Nov en Wisp-1 tot -3. Ze mediren mitose, apoptose, chemotaxis, adhesie, angiogenese, iontransport, tumorprogressie en metastase. CTGF komt vnl. voor in EC, fibroblasten, GSC, chondrocyten en TC. CTGF is mitogeen en chemotactisch voor fibroblasten en stimuleert hun functie. In EC medieert CTGF proliferatie, migratie, overleving, maar ook differentiatie. Een hoofdfunctie van CTGF is promotie van celadhesie via een integrine- en HSPG-afhankelijk mechanisme. Het integrine waarmee CTGF de adhesie bevordert varieert naargelang het celtype (in EC bijv. is dit V3). Het feit dat TGF- de CTGF synthese verhoogt en dat beide vele functies gemeenschappelijk hebben wijst erop dat CTGF een downstream mediator van TGF- is. Er zijn 21 verschillende types kanker die bleken CTGF expressie te hebben, wat het belang voor TC illustreert. Het effect hiervan varieert i.f.v. het type. Zo is CTGF een positieve progressie regulator in cervix-, slokdarm-, pancreas-, maag- en leverkanker, maar een

28


negatieve in long-, colorectaal-, mond- en larynxcarcinoom. Verklaring voor dit weefselspecifiek effect eist verder onderzoek. (Chu et al., 2008) In CRC stelde Lin et al. (2005) vast dat gedaalde CTGF expressie gepaard gaat met meer metastase en kortere overleving. CTGF wordt een onafhankelijke prognostische merker in CRC genoemd. CTGF onderdrukt hier de -catenin/T-cel factor (Tcf) signaalweg en downstream ervan MMP-7 wat de inhibitie door CTGF op metastase kan verklaren. CTGF bindt direct met integrine V3 wat leidt tot EC adhesie, migratie, overleving en ten slotte angiogenese in vivo. Toch is gerapporteerd dat CTGF angiogenese in vitro kan inhiberen door complexering met VEGF. Dit complex werd afgebroken door MMP-3 en -7 met herstel van de angiogene activiteit. Concluderend kan men stellen dat alhoewel CTGF in se een angiogene factor is, kan interactie met andere moleculen zoals VEGF zijn functie veranderen. In borstkankercellen bleek hypoxie-genduceerde loslating van CTGF de angiogenese te benvloeden via secretie van MMPs door EC als respons op CTGF. Daarentegen is vastgesteld in een longkanker-muismodel dat CTGF d.m.v. versnelde HIF-1 degradatie de VEGF-A expressie kan onderdrukken en dus hier een angiogenese-inhibitor is. (Chu et al., 2008)

Ten zesde wordt de rol van de Epidermale groeifactor (EGF) verduidelijkt. Deze bindt de humane EGF receptor (HER, ook bekend als erythroblastosis B (erbB)) familie die bestaat uit EGFR (erbB1), HER2/neu (erbB2), HER3 (erbB3) en HER4 (erbB4). Allen, uitgezonderd HER3, bevatten tyrosine kinase activiteit. Allen, uitgezonderd HER2, binden extracellulaire liganden (vnl. EGF, maar ook TGF-, amphiregulin, epiregulin, -cellulin en heparine-bindend EGF). EGFR activatie leidt tot proliferatie, overleving, motiliteit, adhesie, vnl. (naast STAT) via 2 parallelle signaalwegen: de (Grb2/SOSRasRafMEK)MAPK- en de PI-3K/Akt-cascades. Voor CRC therapie zijn cetuximab en panitumumab (EGFR antilichamen) in staat deze cascades te onderdrukken. Interessant is dat activerende mutaties downstream van deze inhibitie leiden tot wegvallen van respons op deze inhibitoren. Meer specifiek kan men stellen dat KRAS (humaan homoloog van Kirsten rat sarcomaoncogen, een GTP-bindend eiwit) mutaties en EGFR mutaties/amplificatie de respons op deze antilichamen kan voorspellen. Raponi et al. (2008) meldt dat 36% CRC KRAS mutaties draagt. De prospectieve studie van Amado et al. (2008) waarin wordt aangetoond dat de werkzaamheid van panitumumab afhankelijk is van de KRAS mutatie status leidde tot de erkenning van panitumumab in behandeling van EGFR+, wildtype KRAS CRC. (Raponi et al., 2008; Ma and Adjei, 2009) I.v.m. angiogenese regulatie is het belangrijk te vermelden dat er een duidelijke link tussen EGFR en VEGF bestaat. EGF is een van de groeifactoren die VEGF expressie stimuleren. EGFR moduleert angiogenese primair via opregulatie van VEGF en andere angiogene factoren. De VEGF- en EGFsignaalwegen hebben veel dezelfde downstream mediatoren. Er is bewezen dat tumor EC EGFR kunnen expresseren. Preklinisch bleek cetuximab de productie van verschillende pro-angiogene moleculen (VEGF, FGF2 en Il8) te inhiberen en te leiden tot gedaalde vasculaire densiteit. Men suggereert dat een deel van het anti-tumoraal effect (vnl. door inhibitie EGFR-gedreven TC

29


proliferatie) van cetuximab is gemedieerd door angiogenese inhibitie. Toch blokkeert EGFR-inhibitie VEGF niet gezien deze door vele andere factoren (cfr. supra, maar wellicht HIF1 als voornaamste) wordt gestimuleerd waardoor tumorangiogenese wordt toegestaan. In een studie bij muizen met ingeplante CRC-cellen zag men dat verworven resistentie van TC voor EGFR-antilichamen geassocieerd was met verhoogd VEGF. Gecombineerde VEGF/EGF inhibitie in een CRC-model leidde tot een sterkere afname van angiogenese in vergelijking met elk alleen. In gemetastaseerd CRC tonen de BOND I, II, III-studies aan dat toevoegen van bevacizumab aan cetuximab/irinotecan een significant betere tijd tot progressie en respons percentage oplevert. (Tabernero, 2007)

Fig. 21: Rol van TP in regulatie angiogenese. (Liekens et al., 2007)

van

Ten slotte wordt de rol van de platelet derivedEC growth factor (PD-ECGF), ook bekend als thymidine phosphorylase (TP), verduidelijkt. TP, die reeds 50 jaar gekend is, katalyseert de fosforolysis van thymidine en deoxyuridine tot hun resp. ba

Documents

scriptie angiogenese nieuw