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Ensayos de restriccin
Vector con inserto= Vector recombinante
6500pb
Objetivos de ensayos de
restriccin de plsmidos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la biotecnologa.
Enzimas de restriccin
Las endonucleasas se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la molcula de DNA.
Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA.
Las enzimas de restriccin reconocen
secuencias palindrmicas
Palndromo. segmentos de DNA que se
leen igual de derecha a izquierda que de
izquierda a derecha.
ANITA LAVA LA TINA
Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre cientfico
de la bacteria de donde se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se
refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.
Extremos romos o cohesivos
Algunas enzimas de restriccin rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos.
Mientras que otras enzimas cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos romos
Para qu extremos romos o
cohesivos?
Las enzimas de restriccin son una
herramienta experimental muy importante
Desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos.
Han sido utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas desde un nucletido hasta cientos de bases,
En la introduccin de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas recombinantes.
Mapas de restriccin
Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restriccin.
Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin se denomina mapa de restriccin.
Usos de los mapas de restriccin
El anlisis de los mapas de restriccin
constituyen una importante
herramienta para localizar secuencias
de bases especficas en un
cromosoma y para estimar el grado de
diferencias entre cromosomas
relacionados.
Vector
Sitio
mltiple
de
clonacin
Usos de las enzimas de restriccin
Identificacin de muestra
Ensayo de restriccin
1.5 h incubacin
de DNA con 2
enzimas: NdeI y
BamHI.
Ensayo de restriccin
Enzima de
restriccin
E1 E2
1 uL NdeI + +
1 uL BamHI +
Contina..
Incubar a 37C por 1.5 h.
Aadir 0,5 l de RNasa (1 g/ml)
Incubar 30 min a 37C.
Guardar muestra a -20C
Fase A
1. Preparacin de un gel de agarosa
2. Preparacin de muestras
3. Corrimiento electrofortico: Gel de agarosa con bromuro de etidio (aprox 45 min).
4. Visualizacin del gel en UV.
5. Fotografa del gel.
6. Comparacin con las bandas del marcador de peso molecular
Corrimiento electrofortico de
cidos nucleicos Topoisomeros
Geles de agarosa
Bromuro de etidio
Sobeida
1. Topoisomeros.
2. Mismo DNA
pero su estructura
a cambiado debido
a su enrollamiento
o
superenrollamient
o
3. Hay enzimas que
pueden llevar a
cabo cambios en
est estructura, se
denominan
topoisomerasas
Kato y Kikuchi, 1998
Pez globo
COMO SE SEPARAN LAS DIFERENTES
FORMAS DEL PLSMIDO EN UN GEL?
Un mismo DNA pero pesos
moleculares aparentemente
diferentes, topoisomeros!
http://www.topogen.com/topoisomerase-
assay-kits/dna-intercalatorunwinding-kit-
.html
Importante funcin celular la de
relajar el DNA!
Los geles de Agarosa se
colocan en recipientes
horizontales
Usualmente se disuelve la
agarosa en agua y se pone
a ebullicin
Se deja que la
temperatura baje cerca
de 45-50C
Se aade el reactivo que
nos permitir visualizar a
los cidos nucleicos
generalmente el
bromuro de etidio
Se vaca el gel en un
recipiente y se le coloca
el peine
Preparacin de un gel de agarosa
El cido nucleico se mezcla con amortiguador
de muestra: glicerol (para que por densidad
entre la muestra en el pozo) y 1 o 2 colorantes
para seguir el corrimiento electrofortico:
Migracin en gel de Agarosa
En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucletidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el electrodo positivo o nodo.
Cuando la migracin toma lugar en un gel, las molculas de DNA se separan de acuerdo a su tamao, en donde las molculas pequeas se mueven ms rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes.
Cargar std de peso molecular, las
muestras
Cuidado!!! Es un agente mutagnico
Compues
to no
mutagni
co
Mecanismo de accin del bromuro de etidio
