Ensayos de restricción - Bioquimexperimental .Objetivos de ensayos de restricción de plásmidos

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  • Ensayos de restriccin

  • Vector con inserto= Vector recombinante

    6500pb

  • Objetivos de ensayos de

    restriccin de plsmidos

    Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de agarosa.

    Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.

    Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de agarosa.

    Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la biotecnologa.

  • Enzimas de restriccin

    Las endonucleasas se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la molcula de DNA.

    Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA.

  • Las enzimas de restriccin reconocen

    secuencias palindrmicas

    Palndromo. segmentos de DNA que se

    leen igual de derecha a izquierda que de

    izquierda a derecha.

    ANITA LAVA LA TINA

    Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre cientfico

    de la bacteria de donde se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se

    refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

  • Extremos romos o cohesivos

    Algunas enzimas de restriccin rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos.

    Mientras que otras enzimas cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos romos

  • Para qu extremos romos o

    cohesivos?

  • Las enzimas de restriccin son una

    herramienta experimental muy importante

    Desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos.

    Han sido utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas desde un nucletido hasta cientos de bases,

    En la introduccin de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas recombinantes.

  • Mapas de restriccin

    Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restriccin.

    Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin se denomina mapa de restriccin.

  • Usos de los mapas de restriccin

    El anlisis de los mapas de restriccin

    constituyen una importante

    herramienta para localizar secuencias

    de bases especficas en un

    cromosoma y para estimar el grado de

    diferencias entre cromosomas

    relacionados.

  • Vector

    Sitio

    mltiple

    de

    clonacin

  • Usos de las enzimas de restriccin

  • Identificacin de muestra

  • Ensayo de restriccin

    1.5 h incubacin

    de DNA con 2

    enzimas: NdeI y

    BamHI.

  • Ensayo de restriccin

    Enzima de

    restriccin

    E1 E2

    1 uL NdeI + +

    1 uL BamHI +

  • Contina..

    Incubar a 37C por 1.5 h.

    Aadir 0,5 l de RNasa (1 g/ml)

    Incubar 30 min a 37C.

    Guardar muestra a -20C

  • Fase A

    1. Preparacin de un gel de agarosa

    2. Preparacin de muestras

    3. Corrimiento electrofortico: Gel de agarosa con bromuro de etidio (aprox 45 min).

    4. Visualizacin del gel en UV.

    5. Fotografa del gel.

    6. Comparacin con las bandas del marcador de peso molecular

  • Corrimiento electrofortico de

    cidos nucleicos Topoisomeros

    Geles de agarosa

    Bromuro de etidio

    Sobeida

  • 1. Topoisomeros.

    2. Mismo DNA

    pero su estructura

    a cambiado debido

    a su enrollamiento

    o

    superenrollamient

    o

    3. Hay enzimas que

    pueden llevar a

    cabo cambios en

    est estructura, se

    denominan

    topoisomerasas

    Kato y Kikuchi, 1998

  • Pez globo

  • COMO SE SEPARAN LAS DIFERENTES

    FORMAS DEL PLSMIDO EN UN GEL?

  • Un mismo DNA pero pesos

    moleculares aparentemente

    diferentes, topoisomeros!

    http://www.topogen.com/topoisomerase-

    assay-kits/dna-intercalatorunwinding-kit-

    .html

  • Importante funcin celular la de

    relajar el DNA!

  • Los geles de Agarosa se

    colocan en recipientes

    horizontales

  • Usualmente se disuelve la

    agarosa en agua y se pone

    a ebullicin

    Se deja que la

    temperatura baje cerca

    de 45-50C

    Se aade el reactivo que

    nos permitir visualizar a

    los cidos nucleicos

    generalmente el

    bromuro de etidio

    Se vaca el gel en un

    recipiente y se le coloca

    el peine

  • Preparacin de un gel de agarosa

  • El cido nucleico se mezcla con amortiguador

    de muestra: glicerol (para que por densidad

    entre la muestra en el pozo) y 1 o 2 colorantes

    para seguir el corrimiento electrofortico:

  • Migracin en gel de Agarosa

    En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucletidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el electrodo positivo o nodo.

    Cuando la migracin toma lugar en un gel, las molculas de DNA se separan de acuerdo a su tamao, en donde las molculas pequeas se mueven ms rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes.

  • Cargar std de peso molecular, las

    muestras

    Cuidado!!! Es un agente mutagnico

    Compues

    to no

    mutagni

    co

    Mecanismo de accin del bromuro de etidio