Ensayos de restricción y corrimiento electoforético

en geles de agarosaEquipo 1

Objetivos de ensayos de restricción de plásmidos

1. Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa.

2. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos.

3. Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de agarosa.

4. Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología.

Enzimas que restringen la invasión de DNA viral.

Manipulan ácidos nucléicos proteínas recombinantes

Descritos tres tipos (I, II, III)

Endonucleasas o enzimas de restricción:

Endonucleasa tipo II Actividad: restricción

Cofactor:

NO MODIFICAN LA SECUENCIA BLANCO

Mg2

+

Endonucleasa tipo II secuencias palindrómicas

Extremos cohesivos Extremos romos

EcoRI SmaI

Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

Vector que se uso para introducir el DNA de interés

Sitio múltiple de clonación

Endonucleasas tipo II a usar en la práctica

NdeI

BamHI

Factores que afectan la restricción:

(-) por contaminantes

(+) adición policationes

Plásmido superenrrollado

Mapa de restricción:

Obtención patrones RFLP

Identificación de individuos a partir de muestras de fluidos

Usos de las enzimas de restricción

1. Método que utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

2. En el caso del DNA que es una molécula grande necesita una malla de gel con poros amplios para poder separarse.

3. Malla comúnmente usada AGAROSA

Electroforesis en geles de agarosa.

La agarosa es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50° C y formar un gel, semisólido al enfriarse.

Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos

Migración en gel de Agarosa

En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo.

Cuando la migración toma lugar en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, en donde las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes.

Ensayo de restricción

Etiquetar dos tubos de

microfuga

Añadir 10μL de plásmido y

1μL de Tango10X

Baño de hielo

100°C/5min

1→ +1μL BamHI o NdeI2→ +1μL BamHI y

NdeI

Mezclar suavemente

5min

Centrifugar por 5

segundos

+0.5 μL Rnasa (1μg/mL)

37°C1.5h

Baño de hielo

37°C/30min

CA’TATGGTAT‘AC

G’GATCCCCTAG’G

Preparación del Gel

Colocar bandeja de acrílico y el

peine dentro de la cámara.

Pesar 0.35g de agarosa

Añadir 35 mL de TAE 1X, tapar

con algodón.

Calentar 1 a 3 min.

Esperar a que la temp. baje.

Añadir 2µL de

Bromurode etidio o

SYBR Green

Depositar el gel en la bandeja,

evitando formación de burbujas.

Dejar enfriarhasta que

polimerice.

Quitar acrílicos y colocar gel en cámara

de electroforesis

.

TAELa cámara se llena con

aprox. 275mL

PREPARACIÓN Y CARGADO DE LAS MUESTRAS

Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el fondo.

Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo es de color negro.

Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados según la tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara.

Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA.

Tomar la foto del gel.

medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas.

Construir la curva de estándares de peso molecular

Analizar los resultados.