Enzimas de Restricción

  • View
    149

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Enzimas de Restricción. Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé , phd UPR – Aguadilla. Objetivos. Al completar esta presentación los estudiantes podrán : Definir lo que son las enzimas de restricción Describir los criterios para su nomenclatura - PowerPoint PPT Presentation

Text of Enzimas de Restricción

Enzimas de Restriccin

Enzimas de RestriccinBiol 3306 Lab de GenticaJA Card, phdUPR Aguadilla

ObjetivosAl completar esta presentacin los estudiantes podrn:Definir lo que son las enzimas de restriccinDescribir los criterios para su nomenclaturaExplicar los factores que afectan la actividad de estas.Mencionar algunas aplicaciones de importancia de estas.Preparar una reaccin de digestin de DNA con enzimas de restriccin

Introduccin:Vectores70s: se crean exitosamente las primeras molculas recombinantesSe ligan fragmentos de DNA de orgenes distintosSe logra introducir molculas recombinantes dentro de clulasUna vez en clula husped, se replica produce varias copias idnticas del genese expresaesto se le llama clonacin.

Introduccin: vectoresPara clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosmico del organismo que lo tiene.Para hacerlo llegar al interior de la nueva clula hay que usar un vehculo o vectorLos vectores comnmente usados en experimentos de clonacin derivan de plsmidos o de virusLa mayora son plsmidos, pequeos, circulares, naturales en algunas clulas, confieren fenotipos observablesOriSecuencias marcadorMCS

(molcula pequea de DNA que es capaz de replicarse independiente del cromosoma del hospedero, y de producir varias copias idnticas del gen insertado4Vector

EnzimasProtenasAceleran reacciones qumicasReducen la E de activacinE + S ES E + PEjemplosProteasasLipasasamilasasDehidrogenasasGirasasLigasasPeptidasasNUCLEASAS

Enzimas de restriccinDescubiertas 1970, Daniel NathansCortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenasAisladas de bacterias, cientosFuncin: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extrao (fagos)Sistema de restriccin/modificacinRestriccin/Metilacin Nombre, quien la produceEcoRI Escherichia coli (cepa RY13)Hind II Haemophilus influenzaeXhoI Xanthomonas holcicola

Enzimas de restriccin: Palindrome?Reconocen palndrome, especficasSecuencia que lee lo mismo en ambas cadenas, en orientacin opuesta53354, 6, 8 bp1/256bp, 1/4096bpIsoesquisomeros ambiguos-(Py-Pu)DNA learning center

Enzimas de restriccin:Cortan el enlace fosfodiesterBlunts ends

Enzima corta simtricamente, en sitios opuestos en ambas cadenasSticky or cohesive ends- enzima corta asimtricamente, un pedacito SS se extiende desde el 5 o desde el 3

5 overhangs

3 overhangs

Enzimas de restriccin:Cuidados:Caras, se venden por unidadesUnidad: cantidad de enzima necesaria para digerir 1g de DNA segn las condiciones del fabricanteSensitivas al calor-20oC o hielo siempreContaminacin cruzadaPipeteo: punta nueva siempre!!!Enzimas de restriccin:Reaccin, mezclar y sedimentar bien.DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales1g/l de volumen (no mas)Amortiguador: iones, sales, pH, distintos para cada enzima10X 1X: dilucin 1:10 con el volumenEnzima: de acuerdo al palndrome o para averiguar si esta presente1U/g de DNAAgua para completar volumenIncubadora a 37oC por 30-60 minutosEnzimas de restriccin:Factores que afectan la reaccin:Composicin del amortiguadorFuerza inica: [sales] y Na o K, pH (8)Temperatura de incubacin37C, termoflicas a 50-65oCTermolbiles, 25oCMetilacinCepa de E coli, asegurarse de su actividad de metilasasEnzimas de restriccin:AplicacionesClonar- introducir un pedazo de DNA en un vectorCortar vector y cortar insertoMapas de restriccinDeterminar lugares de restriccion para enzimas en algun vector o en una secuencia a clonarSouthern BlotDetectar la presencia de un gen o una secuencia dada en una mezcla de fragmentos de DNA cromosomalEnzimas de restriccin:AplicacionesClonar- introducir un pedazo de DNA en un vector- cortar el vector- cortar DNA fuente del inserto de inters- mezclar y ligar- transformar- cultivar en medio de seleccin por el antibitico

Enzimas de restriccin:AplicacionesMapas de restriccin- aislar el vector- incubar muestras de este con la enzima de inters o con combinaciones de estas- analizar la reaccin por electroforesis (fragmentos se separan por tamaos)- comparar estos con un marcador y determinar sus tamaos- deducir (lgica) el mapa del vectorTutorial

Enzimas de restriccin:AplicacionesSouthern BlotAislar genomaCortar con enzimasElectroforesisTransferenciaIncubar con sonda radioactivaAutoradiografaCuantas copias hay en un genoma?Hay deleciones?Se parecen estos genesZoo blot (parecido entre especies)

Enzimas de restriccin:AplicacionesSouthern BlotEdward Southern -1975cuantas copias de un gen hay en un genoma? deteccin de deleciones pequeas (diagnostico clnico)identificacin de familias de genes (varios genes derivados de uno comn.identificar genes homlogos en distintas especiesel gen de inters estar clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad

Enzimas de restriccin:MaterialesMicrotubosMicropipetas y puntasIncubadora Agua ultrapuraDNA a cortar (x ugs)Buffer de la enzima de restriccinEnzima de restriccin Hielo

Enzimas de restriccin:Protocolo1. Analizar la reaccin a realizar2. Calcular los volmenes a servir en la reaccin de cada uno de los reactivos3. Rotular 2 microtubos de 500l o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, segn aplique.4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reaccin5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo6. Aadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden:AguaBufferDNAEnzima

Enzimas de restriccin:Protocolo7. Mezclar con finger-vortex8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg9. Incubar por 1 hora a 37oC10. Guardar a -20oC11. Analizar por electroforesis de agarosa.Ejemplo de Reaccin

ReactivoConc InicialConc FinalVol (l)Buffer10X1X4DNA4g/l0.5Enzima10U/l0.5Agua35Total40Enzima, Minimo 1U/gDNA. Maximo 1g/l 20PreguntasComo es mas especfico para clonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencione ventajas o desventajas de cada forma.

Si una enzima viene a 22000 U/ml, cuantos l necesito para digerir 4 g de DNA?

Porque las bacterias no digieren su propio DNA con sus enzimas de restriccin?

Derive una formula para calcular cuantos fragmentos de DNA salen de una molcula de DNA cortada con una enzima de restriccin, si la molcula es lineal vs si es circular?

ReferenciasBrooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edicin). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.

Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York.

http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html

http://www.restrictionmapper.org/

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html