Dr. José A. Cardé-SerranoLaboratorio Biol 4019 – Biol CelularUniversidad de Puerto Rico - Aguadilla

 Luego de haber completado el ejercicio, el (la) estudiante estará capacitado para: 

Explicar las funciones de las endonucleasas de restricción.

Especificar las ventajas de las endonucleasas de restricción cuando son utilizadas para el estudio del DNA.

Enumerar las diversas aplicaciones en el uso de las endonucleasas de restricción.

Crear y analizar patrones polimórficos de endonucleasas de restricción. 

En los últimos años la biología molecular ha revolucionado el estudio de los ácidos nucleicos, en particular el DNA.

El conocimiento de la estructura del DNA y el desarrollo de la tecnología de DNA recombinante han permitido la manipulación del material genético en cualquier tipo de célula.

La tecnología de manipulación genética ha sido aplicada desde bacterias hasta organismos eucariota (e.j. tomate, maíz y peces).

La manipulación genética se ha logrado en gran parte por el uso de las endonucleasas de restricción.  

A. Endonucleasas de restricción. Enzimas que reconocen una secuencia

específica de nucleótidos y producen un corte en el lugar de reconocimiento o muy cerca del mismo.

Las bacterias poseen las endonucleasas de restricción como un sistema enzimático de defensa en contra de la invasión de DNA exógeno, como por ejemplo; el ataque de un bacteriófago.  

Descubiertas por Stewart Lynn y Werner Arber en 1960 en la bacteria Echerichia coli.

Se speraba que esta cortara cualquier DNA en una secuencia de nucleótido específico

No ocurrió como ellos esperaban, la enzima no cumplió con sus expectativas.

Más adelante, Hamilton Smith descubrió una endonucleasa de restricción en la bacteria Haemophilus influenza sepa Rd (figura 1), llamada HindII.

La primera letra del nombre de la enzima proviene del género

Las próximas dos letras de la especie

La cuarta letra de la sepa. El número romano hace referencia a la

cantidad de endonucleasas de restricción que han sido extraídas de la misma bacteria.

Ejs.  HindI, HindII y HindIII.   

La secuencia de reconocimiento para la mayoría de estas endonucleasas de restricción contiene de 4 a 6 y hasta 8 nucleótidos.

Esta secuencia de reconocimiento exhibe una simetría palindrómica, lo que quiere decir, aunque no implica eso, que lee lo mismo de” izquierda a derecha que de derecha a izquierda”.  

Ejemplo: 5’ GGGCCC 3’      3’ CCCGGG 5’ 

• Las enzimas que reconocen una secuencia de 4 bases, cortan con más frecuencias que las que reconocen una secuencia de 6 bases

• La frecuencia esta determinada por la probabilidad:

• Una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 256 pb (44 = 256)

• Una secuencia de 6 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 4,096 pb (46 = 4096).

• Una secuencia de 8 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma aproximadamente cada 65,000 pb (48 ≈ 65,000). 

Enzimas que reconocen la misma secuencia pero cortan en lugares distintos del mismo palindrome  

Ejemplo:      XmaI  C↓CCGGG                      SmaI  CCC↓GGG 

Endonucleasa de restricción

Secuencia de reconocimiento

AluI AG↓CTBamHI G↓GATCCEcoRI G↓AATTCHaeIII GG↓CCHindII GTPy↓PuACHindIII A↓AGCTTPstI CTGCA↓GHpaII C↓CGGNotI GC↓GGCCGC

Terminales truncados: enzimas cortan ambas hebras del DNA en el mismo punto (HaeIII)

Terminales pegajosos: enzimas que cortan las hebras de DNA en una forma escalonada, dejan fragmentos con cierta capacidad de complementaridad (EcoRI)

el fragmento sencillo de la hebra pueden parearse a través de enlaces de hidrógenos a las bases de otro fragmento sencillo generado por la misma enzima.

Estas ultimas son usadas para crear moléculas de DNA recombinante (ver aplicaciones de endonucleasas de restricción).     

B. Metilación y actividad de las endonucleasas de restricción Las bacterias poseen un sistema para proteger su propio DNA de la digestión por parte de sus endonucleasas de restricción, o sea reconocen su propio DNA del DNA exógeno. Las bacterias poseen en su DNA unas bases metiladas que no le permiten a la endonucleasa reconocer la secuencia donde corta.

• La presencia de bases metiladas no siempre protege al DNA de ser cortado; ciertas enzimas solo reconocen secuencias que contienen bases metiladas.

• Durante la replicación del DNA sola la hebra parental (que ha servido como molde) se encuentra metilada, lo que se conoce como hemimetilada. 

• Esta hemimetilación es suficiente para proteger la doble hélice del DNA de ser cortado por la endonucleasa de restricción

Antes del próximo ciclo de replicación la hebra nueva debe ser metilada por la enzima conocida como metilasa (figura 3).

C. Aplicaciones en el uso de las endonucleasas de restricción.

Entre estas se encuentran: ingeniería genética, pruebas de paternidad o maternidad y medicina forense, entre otras.

1) Ingeniería genética. A través de la tecnología de DNA recombinante

cualquier segmento de DNA puede ser separado de un genoma y ligado a un genoma de otro individuo.

Esta tecnología que se comenzó a utilizar con bacterias, les ha permitido a los investigadores estudiar con más precisión los genes de organismos procariota y eucariota.

Enzimas de Restriccion – animación

La clonación es la técnica central de la tecnología de DNA recombinante.

permite replicar (clonar) en grandes cantidades un pedazo específico de DNA.

El DNA de interés es cortado y ligado a un elemento genético, vector de clonación, que se puede replicar autónomamente cuando se introduce a una bacteria en crecimiento, en la mayoría de los casos E. coli.

El vector de clonación puede ser un plásmido o un bacteriófago.

Tanto el DNA de interés como el vector de clonación deben ser cortados con la misma enzima.

Las enzimas más utilizadas en

esta técnica son aquellas que producen terminales pegajosos. En esencia, dos fragmentos de DNA generados por la misma endonucleasa de restricción pueden unirse por el pareo de las bases complementarias en los fragmentos sencillos de cada terminal.

• Primero se corta el DNA de interés y el vector de clonación con la misma endonucleasa de restricción para generar terminales pegajosos.

• Luego se mezclan los fragmentos bajos las condiciones apropiadas para que las bases en los terminales se puedan unir.

• Ya unidos los fragmentos, se le añade DNA ligasa para que esta una covalentemente esos fragmentos.

2) “DNA fingerprinting”Los análisis de los patrones formados por los fragmentos que se producen cuando el DNA es cortado por las endonucleasas de restricción han sido utilizados, para estudiar en detalle los genomas de diversos organismos, diagnosticar enfermedades genéticas resolver crímenes violentos. Estos análisis tienen como base el hecho de que dos personas que no son gemelos idénticos poseen diferente secuencia de nucleótidos en el DNA.

Aunque la diferencia en la secuencia de bases en el DNA entre dos personas sea pequeña, los fragmentos producidos por las endonucleasas de restricción son de diferentes tamaños.

Esta diferencia en el tamaño de los fragmentos, conocido como patrones polimórficos de endonucleasas de restricción (restriction fragment length polymorphisms, RFLP’s), pueden ser analizados por electroforesis

Los resultados en los patrones son distintivos para cada persona, por lo que funcionan como huellas dactilares (“DNA fingerprinting”).

En la práctica solo una pequeña fracción de las bandas producidas por los fragmentos de restricción son examinadas.

La figura 3 ilustra el proceso de “DNA fingerprinting” para determinar un caso de paternidad.

En el primer paso se extrae DNA de la madre, del niño y del alegado padre.

El DNA de las tres personas se somete a digestión con endonucleasas de restricción.

Los fragmentos resultantes son separados utilizando electroforesis en geles de agarosa.

Como el genoma de cada persona es tan grande, miles de bandas son generadas y son muy difíciles de ver en el gel.

Para resolver este problema se utiliza la técnica principal del “DNA fingerprinting” conocida como “Southern blotting” (Figura 5 a).

En la misma, una membrana de nitrocelulosa es presionada sobre el gel permitiendo que el patrón de bandas de DNA transfiera del gel a la membrana.

Luego se le añaden sondas radioactivas a la membrana.

Las sondas son fragmentos radioactivos de DNA o RNA complementarios al DNA de interés.

Las sondas se unen al DNA complementario por medio del pareo de las bases.

Las bandas a las cuales las sondas se han unido se hacen visibles por medio de radiografía.

Los resultados observados en la figura 5 b indican que el alegado padre es el verdadero padre del niño.

El mismo procedimiento es utilizado en casos de asesinato y/o para determinar si un individuo es portador de una enfermedad genética.

Materiales Agua destilada Amortiguador 10 X (específico para cada

endonucleasa de restricción) Baño de agua Endonucleasas de restricción Hielo Micropipetas Microtubos de 0.5 ml Puntas para micropipetas RNAsa

Soluciones CantidadesAmortiguador 10 X* 2.5 µlRNAsa 10 mg/ml 0.5 µlDNA 10 µgEndonucleasa de restricción**

10 unidades

Agua destilada Añada para completar un volumen de 25µl*    Es específico para cada endonucleasa de restricción.

Asegúrese de mantener el       amortiguador 10 X todo el tiempo en hielo.  **  A cada grupo de trabajo se le asignará una endonucleasa de restricción distinta.     Asegúrese de mantener la endonucleasa de restricción todo el tiempo en hielo.

1) En un microtubo de 0.5 ml mezcle: 

2) Coloque el microtubo con la digestión preparada en el paso 1 en un baño de María a 37 ºC.  

3) Luego de una hora remueva el microtubo del baño de María y guárdelo a –20º C hasta el próximo laboratorio.

Explique como la metilación actúa para proteger el DNA de la acción de las endonucleasas de restricción.

Explique en términos biológicos porque la metilasa evolucionó en las bacterias.

Teniendo en cuenta la endonucleasa con la que usted trabajó, ¿espera usted que se complete todo el proceso de restricción del DNA de E. coli o Aedes aegypti? Explique su respuesta.

¿Por qué la digestión con las endonucleasas de restricción se lleva acabo a 37 ºC?

Mencione, explique y de ejemplo de una aplicación en el uso de las endonucleasas de restricción que no haya sido explicada en este módulo.