HERRAMIENTAS PARA LAS TÉCNICAS MOLECULARES

ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN

SONDAS DE ADN

ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN

DEFINICIÓN

• La denominación se debe a que las bacterias las emplean para destruir el ADN viral capaz de penetrar a la célula, y por lo tanto restringen el potencial de crecimiento de los virus.

• El propio ADN de la bacteria se encuentra protegido de ataques nucleolíticos por metilación de los sitios susceptibles sobre las bases (protegidas por Enzimas De Modificación).

• En otras palabras actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.

• Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.

• Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

• La mayor parte de secuencias de DNA, que son reconocidas por estas enzimas son PALÍNDROMOS (Es decir, ambas cadenas de DNA poseen la misma secuencia de bases en ambos sentidos)

• Estas enzimas de origen bacteriano, reconocen secuencias específicas en el ADN e hidrolizan el enlace pentosa-fosfato (fosfodiéster), produciendo así un corte en la molécula de ADN.

• El esqueleto pentosa-fosfato se rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases equivalentes en la otra hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en cada hebra y al cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes: Cohesivos o Romos.

• Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen una mezcla de fragmentos de distinto tamaño.

• Los fragmentos obtenidos se pueden separar por electroforesis.

• Después se tiñen con un colorante y se obtiene un patrón de bandas.

• Cada banda corresponde a un tamaño medido en pares de bases.

FACTORES DE IMPORTANCIA• Pureza del DNA (otros agentes inactivan a las

endonucleasas)• Temperatura y pH• DNAsas (degradan el ADN en presencia Mg2+)• Contaminantes con carga (-)• DNA contaminado con otro DNA• Grados de metilación• Tipo de molécula de DNA (debe tener accesible a

la secuencia reconocida por la enzima)• Buffer adecuado

NOMENCLATURA

Eco RI E = género Escherichiaco = especie coliR = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada

de esta cepa

CLASIFICACIÓNTIPO ILas actividades de modificación (ruptura de ADN no metilado)

y las de restricción están producidas por un complejo multiproteico.

• Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías

• La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento y en lugares inespecíficos

• La restricción requiere de ATP

• La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupo metilo

Tipo II•Poseen sólo actividad de restricción (ruptura)•Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no formas complejos multiproteicos.•No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg2+.•La metilasa usa SAM como donador de metilos.•Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.•La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G•La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente.

Tipo III•Poseen actividad de restricción (ruptura) y modificación (mutilación)

•Cortan fuera de la secuencia que reconocen.

•Son ATP-dependientes.

Las de más utilidad en los métodos de manipulación del ADN, son las del Tipo II, debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura, todas las enzimas de restricción comerciales son de esta categoría.

APLICACIONES• Diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas

con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o delecciones de fragmentos.

• Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte.

• Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

SONDAS DE ADN

• Las sondas de ADN se pueden utilizar de manera semejante a los anticuerpos, como herramientas sensibles y específicas para detectar, localizar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos específicos en muestras clínicas.

• La especificidad y la sensibilidad de las técnicas basadas en sondas de ADN permiten detectar especies o cepas de un agente infeccioso, incluso en ausencia de proliferación o replicación.

• Las sondas de ADN se sintetizan a través de métodos químicos o bien se obtienen por clonación de fragmentos genómicos específicos o de un genoma vírico completo en vectores bacterianos.

• Las copias de ADN de los virus de ARN se fabrican por medio de una transcriptasa inversa retro-vírica y luego se clonan en estos vectores.

• Tras llevar a cabo tratamientos químicos o térmicos para «fundir» (separar) las cadenas de ADN de la muestra, se agrega la sonda de ADN y se permite su hibridación (unión) a la secuencia idéntica o casi idéntica de la muestra

• La aplicación de una sonda de ADN marcada con biotina permite emplear un nucleótido fluorescente o una molécula de avidina o estreptavidina, marcada enzimáticamente para detectar ácidos nucleicos víricos en una célula de manera similar a la localización de un antígeno por inmuno-fluorescencia indirecta o enzimo-inmunoanálisis.

• Las sondas de ADN son capaces de detectar secuencias genéticas específicas en muestras tisulares de biopsia fijadas y permeabilizadas por hibridación in situ.

• Actualmente se dispone en los comercios de un gran número de sondas víricas y de equipos de reactivos para detectar partículas víricas.

• Se pueden detectar secuencias de ácidos nucleicos específicos en extractos de una muestra clínica aplicando un pequeño volumen del extracto en un filtro de nitrocelulosa (transferencia puntual) y después aplicando una sonda de ADN vírico específico marcado sobre el filtro.