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Aislamiento de plásmido
ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
M. en C. J. Abraham León Domínguez
Transformación
Transducción
Conjugación
La transformación bacteriana es un proceso muy útil en biología molecular.
Por este mecanismo es posible la introducción de plásmidos modificados para la expresión de
genes de interés biotecnológico.
Ingeniería genética: se enfoca en el uso de técnicas in vitro para modificar el material genético.
• Enzimas de restricción
• Secuenciación de DNA
• Clonación molecular
• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Clonación molecular
En la clonación molecular se aísla y se replica un fragmento de DNA.
Etapas:
• Aislamiento del gen o secuencia de interés
• Inserción del fragmento de DNA en un vector de clonación (plásmido)
• Introducción del DNA clonado en un organismo hospedador
Los plásmidos como vectores de clonación
Los plásmidos poseen diversas propiedades que los hacen útiles como vectores de clonación:
• Tamaño pequeño
• Replicación independiente del cromosoma del hospedador
• Pueden multiplicarse en gran número de copias
• Cuentan con la presencia de marcadores seleccionables
Vector clonación
Vector expresión
Entonces…. Un plásmido modificado (vector clonación) debe poseer:
1) Origen de replicación 2) Marcador de selección
3) Sitio de clonación
Vector de clonación
Gen β-lactamasa
+
Clonación de la secuencia génica de la enzima β-lactamasa
Sitio múltiple de clonación
Vector recombinante
Transformación en células DH5α para mantenimiento y
replicación.
Propiedad: cada método toma ventaja del tamaño pequeño, la conformación y, la propiedad de desnaturalización/re-naturalización de los plásmidos
Método de lisis alcalino
Purificación por CsCl-BrEt
Separación de ácidos nucleicos, en un gradiente de CsCl, en presencia de BrEt.Aprovecha la propiedad intercalante del
BrEt y la compactación del plásmido.
Separación de ácidos nucleicos a partir de la desnaturalización de las cadenas
de DNA en medio alcalino y, su precipitación en concentraciones altas
de sal. Aprovecha el estado de compactación del plásmido.
Métodos de aislamiento de plásmidos
Tamaño de un plásmido
El tamaño de los plásmidos naturales varía desde 1Kb hasta 0.5Mb
El tamaño del cromosoma bacteriano varía desde 4,5 y 5,5 Mb
El plásmido es una molécula de DNA circular que tiene menos del 5% del tamaño del cromosoma.
Conformación de un plásmido
Una de las conformaciones principales de un plásmido es que este se encuentre superenrrollado, que es la forma más compacta que existe del DNA.
Sin embargo, también puede encontrarse en otros estados (por ejemplo linealizado) o, en otras conformaciones en estado superenrrollado.
Conformaciones:
• Linealizado: es decir, cuando se han cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez
• Parcialmente linealizado: cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas
• DNA relajado circular: DNA que no se ha empacado
• Superenrrollado: covalentemente cerrado y muy empacado
• Superenrrollado relajado: parecido al anterior pero un poco menos empacado
Dependiendo de la conformación del plásmido, este puede migrar de manera diferente en un campo eléctrico, a pesar de tener el mismo peso molecular.
El DNA se puede desnaturalizar
• El calor, pH, la concentración de iones, influyen en la estabilidad de la doble hélice.
• En la desnaturalización se deshace su estructura nativa es decir, se rompen los puentes de hidrógeno (A-T, G-C).
• Dos hebras separadas que se pueden volver a unir.
DNA nativo
DNA desnaturalizado
Re-naturalización del DNA
• El DNA se puede volver a re-naturalizar
• Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea correcto
• De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables. Re-naturalización al azar
Correcto apareamiento. Se recupera la cadena de DNA nativa. Re-naturalización al azar.
La molécula de DNA no contiene los enlaces originales
Condiciones suaves
Extracción de plásmido por lisis alcalina
Fundamento:
• El tratamiento de un lisado celular con calentamiento o pH alcalino, resulta en la separación (desnaturalización) de las cadenas de DNA.
• Debido a que el plásmido está cerrado covalentemente, las cadenas de DNA no se separan completamente en las condiciones alcalinas.
• En contraste, el DNA cromosómico es grande y menos compactado. Además, en pasos iniciales de la purificación es usualmente degradado en fragmentos pequeños, así que las cadenas de DNA se separan completamente.
Extracción de plásmido por lisis alcalina
Finalmente…
• La re-naturalización de la doble hélice, ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro (incremento de concentración salina) causa la precipitación del DNA cromosómico.
• Debido al entrecruzamiento (superenrrollado) y desnaturalización parcial del plásmido, las dos cadenas de DNA encuentren rápidamente su secuencia complementaria y re-naturalizan, formando de nueva cuenta la doble cadena (nativa).
• En contraste, debido a que las cadenas del DNA cromosómico se encuentran completamente desnaturalizadas, la re-naturalización correcta toma tiempo. El cambio brusco de pH provoca entonces que se formen agregados que precipitan.
• El plásmido permanece en solución y puede ser precipitado después con alcohol, una vez removido el DNA cromosomal.
Protocolo purificación plásmido
1. Lisado celular: generalmente se hacen tratamientos con lisozima (para debilitar la pared) y con detergentes (SDS) para solubilizar la membrana.
2. Desnaturalización: la adición de NaOH y SDS permite desnaturalizar las cadenas de DNA.
3. Neutralización y precipitación: restauración de la doble hélice por adición de acetato de sodio o acetato de potasio = precipitación de DNA genómico
Pasos:
1. L
2. Ñ
3. L
4. Centrifugación: para separar el DNA cromosomal y otras biomoléculas (proteínas) del DNA plasmidico.
5. 2ª Precipitación: adición de etanol o isopropanol absoluto permite precipitar el DNA plasmidico.
6. Lavado: remanentes de biomoléculas y/o alcohol pueden ser lavados
7. Resuspensión: generalmente en buffer TE o agua libre de DNasas.
8. Cuantificación: estimar la concentración permite saber la pureza del plásmido extraído.
Pasos:
Kits de extracción de plásmidos
Existen diversos Kits comerciales que permiten la extracción y purificación de DNA plasmidico, en bajas o altas concentraciones, para distintos usos moleculares.
Se basan en empleo de columnas de intercambio iónico, de afinidad, de exclusión molecular.
Cuantificación por absorbancia a 260nm
Para determinar la concentración de DNA (plasmidico) o productos de PCR se realizan mediciones a 260 y 280 nm. En principio, una solución de dsDNA con una concentración
de 50 µg/mL (ε) debe tener una A260 igual a 1
El cociente de absorbancias a 260/280nm es usado para asegurar la pureza del DNA:
• Un cociente de 1.8 es generalmente aceptado como DNA puro (2.0 para RNA puro).
• Un cociente <1.8 indica presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes.
• Un cociente >1.8 indica presencia de RNA como contaminante
En la práctica experimental…
En la práctica experimental…
GTE: Glucosa, Tris/HCl, EDTA
Solución lisis: SDS, NaOH
Neutralización y Precipitación
Desnaturalización
Lisis celular
(300 µL)
(300 µL)
CH3CO2K: 3M pH 4.8(300 µL)
En la práctica experimental…
Centrifugación
pp DNA plasmídico
LavadoLavado
Resuspensión
Volumen igual al sobrenadante
30 µL H2O
30 µL H2O
1 mL
Dejar a T.A. 5-10 min
Ensayos de restricción
Enzimas de restricción
Las enzimas o endonucleasas de restricción reconocen y cortan secuencias de bases específicas en el DNA, usualmente de 4 a 6 pares de bases.
Se dividen en tres grandes grupos: I, II y III. Las de tipo II son las que se emplean en biología molecular debido a que cortan la secuencia que reconocen y, a que
han perdido su actividad de metilasas de DNA.
Las enzimas permiten reconocer secuencias palindrómicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual en ambas direcciones.
Las tres primeras letras indican el organismo de donde se aisló y se escribe en itálicas. La siguiente letra indica la cepa y, el número romano indica si hay más de una enzima aislada de la misma especie.
Extremos romos y cohesivos
Muchas enzimas hacen cortes escalonados, que dejan cadenas sencillas en un extremo, denominados extremos cohesivos.
Otras enzimas de restricción realizan los cortes en ambas cadenas exactamente sobre el eje de simetría, generando extremos romos.
¿cuáles se prefieren en biología molecular?
Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante
• Clonación: generación de fragmentos para ser insertados en vectores apropiados, permitiendo la producción de proteínas recombinantes.
• Mapas de restricción: un diagrama de una molécula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción.
• Desarrollo de técnicas: para el análisis y manipulación de los ácidos nucleicos, por ejemplo eliminar una secuencia genómica concreta, desde uno hasta cientos de bases o bien, detectar la presencia de un gen o una secuencia dada (Southern Blot).
Usos de las enzimas de restricción
Práctica: Ensayo de restricción
