Práctica Enzimas de Restricción

Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propioSistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio

ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio

Enzimas de restricción

Se han identificado cientos La mayoría reconocen y cortan

secuencias palindrómicas Muchas dejan “puntas

pegajosas” Se pueden hacer cortes muy

precisos del ADN al escoger la enzima

Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria

Palíndrome

• oso• radar • reconocer• rotor • salas• seres • somos • sometemos • oro• ala • ojo

Secuencia palindrómica en biología

5'- G A A T T C -3'

3'- C T T A A G -5'

• Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras

Algunas enzimas usadas comúnmente

Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG

Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G

Uso de enzimas de restricción

• La actividad depende de condiciones precisas:

pHTemperaturaConcentración de salesIones

• Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas:

3-5 u/ug de ADN genómico1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul

Tipos corte

Utilidad para ADN recombinante

Marcador de peso molecular

• Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel

• A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción

• Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas

• O la escalera de 1kb

Plásmidos en gel

Electroforesis de plásmidos

• Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones

• No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado.

• Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza

Digestión plásmidos

Número bandas= número de sitios de restricción

pG

EM

-T

pG

EM

-T/E

co

RI

pU

WL

201

pU

WL

201

/Ec

oR

I

Digestión ADN genómico

Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis

Deleción en FQ

Fibrosis quística

Recesiva

Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos

Degradada en RE, no llega a membrana celular

Diagnóstico por sitios de restricción

Mutación: Cys282Tyr

Mutación Hemocromatosis

Mutación: His63Asp

Mutación Hemocromatosis

• http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html

Lambda cortado con EcoRI

5 cortes

Lambda cortado con Eco RI

6 fragmentos

Práctica

• Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción