Práctica Enzimas de Restricción

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    13-Jan-2016

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Prctica Enzimas de Restriccin. Enzimas de restriccin. Destruyen ADN de bacterifagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio ADN bacteriano protegido por metilacin. La enzima de restriccin corta el ADN no metilado: no propio. - PowerPoint PPT Presentation

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<ul><li><p>Prctica Enzimas de Restriccin</p></li><li><p>Enzimas de restriccin Destruyen ADN de bacterifagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio ADN bacteriano protegido por metilacin. La enzima de restriccin corta el ADN no metilado: no propio</p></li><li><p>Enzimas de restriccinSe han identificado cientos La mayora reconocen y cortan secuencias palindrmicasMuchas dejan puntas pegajosasSe pueden hacer cortes muy precisos del ADN al escoger la enzimaImportante en biologa molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria</p></li><li><p>Palndromeosoradar reconocerrotor salasseres somos sometemos oroala ojo </p></li><li><p>Secuencia palindrmica en biologa5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5' Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idntica en ambas hebras</p></li><li><p>Algunas enzimas usadas comnmente</p><p>Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGGXma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G </p></li><li><p>Uso de enzimas de restriccinLa actividad depende de condiciones precisas:</p><p>pHTemperaturaConcentracin de salesIones</p><p>Unidad enzimtica (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones ptimas:</p><p>3-5 u/ug de ADN genmico1 u/ug ADN de plsmido Stocks tpicamente 10 u/ul</p></li><li><p>Tipos corte</p></li><li><p>Utilidad para ADN recombinante</p></li><li><p>Marcador de peso molecularPermite identificar tamao (peso) aproximado de molculas en un gelA menudo es cido nucleico digerido con enzima de restriccinComn: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandasO la escalera de 1kb</p></li><li><p>Plsmidos en gel</p></li><li><p>Electroforesis de plsmidos Plsmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones</p><p> No se puede determinar el tamao de un plsmido no cortado.</p><p> Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza</p></li><li><p>Digestin plsmidosNmero bandas= nmero de sitios de restriccinpGEM-T pGEM-T/EcoRI pUWL201 pUWL201/EcoRI</p></li><li><p>Digestin ADN genmico</p></li><li><p>Diagnstico deleciones/inserciones por electroforesis</p></li><li><p>Delecin en FQFibrosis qusticaRecesivaDelecin 3pb en gen CFTR, 70% de casosDegradada en RE, no llega a membrana celular</p></li><li><p>Diagnstico por sitios de restriccin</p></li><li><p>Mutacin: Cys282TyrMutacin Hemocromatosis</p></li><li><p>Mutacin: His63AspMutacin Hemocromatosis</p></li><li><p>http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html</p></li><li><p>Lambda cortado con EcoRI5 cortes</p></li><li><p>Lambda cortado con Eco RI6 fragmentos</p></li><li><p>PrcticaDigestin del fago Lambda con tres enzimas de restriccin</p></li></ul>