Las enzimas de restricción cortan el DNA en sitios de secuencia específica

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Las enzimas de restricción cortan el DNA en sitios de secuencia específica ,haciendo posible la unión de moléculas de DNA no homólogas de origen distinto.En este caso se corta el vector con E.corI y la secuencia que queremos añadir secorta también con Ecor I después se une al vector gracias a la acción de la ligasa ,se produce una hibridación y así obtenemos nuestra molécula de DNArecombinante.

De este modo podemos aislar fragmentos concretos de DNA de cualquier organismoe introducirlos en un genomio más pequeño , que es mucho más fácil de analizar .Estas moléculas de ADN recombinantes pueden construirse mediante la unión demoléculas de DNA no homólogas de prácticamente cualquier orígen ,incluyendomoléculas de DNA de especies muy diferenes entre sí.

Normalmente el vector en el que se introduce el DNA es capaz de replicarseselectivamente en algún momento del proceso , permitiendo de esta forma laamplificación de dicho fragmento especifico de DNA .Disponer de un gran número de copias del segmento del DNA en estudio facilitasobremanera su análisis molecular detallado.Con frecuencia las bacterias son los organismos hospedadores para elmantenimiento y amplificación de moléculas de DNA recombinante derivadas de

bacterias u organismos superiores .



Los plásmidos y el DNA se corta con las mismas enzimas de restricción , medianteligasa se unen generando las moléculas recombinantes .Estos plásmidos se introducen en una célula hospedadora en este caso una bacteriaa este procedimiento le llamamos transformación .Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de DNA que se introducen en lascélulas mediante transformación .Los plásmidos se pueden considerarminicromosomas que se replican autónomamente dentro de la célula.Dentro de la bacteria los plámidos permiten la amplificación del DNA clonado,durante el crecimiento celular ,algunos plásmidos estan presentes de 20 a 50copias por célula.En la placa de petri obtenemos una genoteca es decir varias copias de nuestro DNArecombinante.La clonación de genes implica la unión del fragmento de DNA deseado a unamolécula vector y la propagación luego de la molécula recombinante en unhospedador adecuado.



Vector de clonación

Molécula de DNA que permite el transporte a unacélula hospedadora, la replicación y la purificaciónde fragmentos individuales de DNA

Requisitos de un vector de clonación• Moléculas relativamente pequeñas, fáciles de manipular.• Replicación autónoma y fácil introducción en la célula hospedadora.

• Puntos de cortes únicos para una o varias enzimas de restricción.

• Fácilmente seleccionables.• Fácil distinción entre vector no modificado y vector quimérico.

• Molécula de DNA que permite el transporte a una célula hospedadora,lareplicacióny la purificación de fragmentos individuales de DNA.



Las cápsidas del fago lambda empaquetan de una forma rutinaria unamolécula de DNA de unas 45 kb de longitud . Esta propiedad se aprovechapara insertos de DNA que remplazan la porción central del genomio del fago,innecesaria para la replicación de lambda en E.coli.

Se han creado vectores híbridos entre plásmidos y fagos que permitenincrementar la longitud del fragmento de DNA que puede clonarse hasta 44Kb .Estos cósmidos se aprovechan del desarrollo de un sistema in Vitro paraempaquetar DNA en cápsidas del fago.

Una gran ventaja es su capacidad de conferir resistencia a antibióticos a la célula

hospedadora.



Ello permite la selección directa de las células que incorporan y mantienen losplásmidos de DNA recombinante.Para facilitar esta selcción , pueden introducirse en los plásmidos genes deresistencia a diferentes antibióticos .

pUC8

Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muybeneficiosas:

• Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADNrelativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases).

• Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de losfragmentos de ADN insertado por célula.

• Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimientopara enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominadapolylinker o multiple cloning site.

• Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que

contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias decolor azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactivaeste gen, y da lugar a colonias de color blanco.

http://es.wikipedia.org/wiki/Par_de_bases

http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_cloning_site

http://es.wikipedia.org/wiki/Par_de_bases

http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_cloning_site



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Las enzimas de restricción cortan el DNA en sitios de secuencia específica