Endonucleasas de Restricción

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  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

  • Qu son?Una endonucleasa de restriccin es una enzima que se une a una molcula de DNA en una secuencia especifica y corta la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella

  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIONEn 1968 se purific la primera endonucleasa de restriccin, la K12 en E coli.

    Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que sepens que reconoca secuencias especficas del DNA.

    Se abandon porque aunque reconoca una zonadeterminada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.

    En 1970 se aisla otra endonucleasa de restriccin enHaemophilus influenzae, que reconoce una secuencia en unduplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.

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  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIONFenmeno de restriccin: reconocimiento por parte de unabacteria de un DNA extrao y lisis del mismo en pequeosfragmentos.El fenmeno de restriccin se descubri en E coli, cuandose hizo crecer el bacterifago lambda. Si la bacteria creceencontraremos varias colonias por placa. Si no crece, noencontaremos colonias.

    En la cepa C de E coli creca bien el bacterifago , pero si este se creca en la cepa K o la R, la eficiencia decrecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringidopor esta cepa.

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  • MODIFICACION- RESTRICCIONEjemplo de restriccin de crecimientodel bacterifago lamdaen una cepa determinadade E. coli

    La eficiencia con la que el fagocrece en una cepa depende de la ltima cepa donde fue propagado.

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  • Explicacin:

    El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la endonucleasa responsable de esta degradacin se le llama endonucleasa de restriccin o enzima de restriccin.

    El husped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la accin de las enzimas de restriccin y para ello modifica a su propio DNA.

    MODIFICACION- RESTRICCION

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  • Modificacin:

    Metilacin de ciertas bases en un nmero muy limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las enzimas de restriccin.

    El DNA del fago que sobrevive algn ciclo en el husped restrictivo se replica y tambin es metilado por las metilasas de la bacteria, y por tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva reinfeccin.

  • METILACION Y RESTRICCION

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  • SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACIONSe conocen cuatro tipos de sistemas de restriccin y modificacin:

    Tipo I:

    En la misma enzima tienen 2 subunidades parala restriccin, 2 subunidades para la modificacin (metilacin) y una subunidad para el reconocimiento.

    Tanto la metilacin como el corte requieren de ATP.

    El corte se da a alguna distancia del lugar de reconocimiento.

    Poco valor para manipulacin gentica.

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  • SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACIONTipo II:

    La restriccin (divisin) y modificacin las provocan diferentesenzimas de la bacteria, por lo que puede haber divisin delDNA en ausencia de modificacin.

    No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetioninapor lo que su uso es ms sencillo.

    El lugar de reconocimiento generalmente es simtrico y cortanal DNA en el lugar de reconocimiento.

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  • SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

  • SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACIONTipo IIs:

    Son parecidos a los del tipo II, pero la restriccin ocurre enLugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, porLo que su uso en ingeniera gentica tambin es reducido.

    Tipo III:

    Tienen lugares de reconocimiento simtricos, pero se parecen en lo dems a los sistemas del tipo I, por lo que son poco tiles.

    Algunas enzimas de restriccin no entra dentro de esta clasificacin.

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  • SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACIONNomenclatura:

    Tres letras:1a letra de gnero de la bacteria donde se encontr2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontr

    Letra de la cepa donde se produce la enzima de restriccin (si es algunacepa especial)

    Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restriccin, se especificapor nmeros romanos.

  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Ejemplos:

    HindIIHaemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restriccin

    HindIIIHaemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restriccin

    SmaISerratia marcescens, 1a enzima de restriccin

    BamHIBacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima

  • Endonucleasas de tipo II

    Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucletidos, que tienen un eje rotacional de simetra: Secuencias palndrome

    Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de restriccin

    Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por modificacin

    ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Cuando la enzima de restriccin actua deja dos extremos5que son complementarios entre s:

    5- G5- AATTC - 3

    3- CTTAA - 5 G - 5

    A estos extremos creados por las endonucleasas tipo IIse les denomina extremos coheisvos o pegajosos.

    No todas las enzimas de restriccin tipo II dejan as los extremos.

  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Extremos cohesivosExtremos romos

  • ENDONUCLEASAS DERESTRICCION

    Para reconocer el tamao delos fragmentos que se producen tras la accin de unaendonucleasa de restriccinse utiliza la electroforesisen gel de agarosa y latincin con bromurod deetidio.

  • ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Se han estudiado 10,000 bacterias paraEncontrar enzimas de restriccin.

    Se han encontrado 3,000 enzimas deRestriccin especficas para aproximadamente 200 secuencias de DNA.www.rebase.neb.comLas enzimas diferentes que tienenespecificidad por la misma secuenciade DNA y que cortan en el mismo sitiose les llama isoschizomeros.

    Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugaral DNA se les denomina neoeschizomeros.

  • RFLP

  • Fragmentos de Restriccin de Longitud Polimorfica.Es un mtodo utilizado por los bilogos moleculares para seguir una secuencia particular de DNA que se transmite a otras clulas.Es una tcnica en la cual los organismos pueden diferenciarse mediante el anlisis de los patrones derivados de la escisin de su DNA.

  • Mtodo 1. Extraccin de DNA.Puede ser de semen, saliva, sangre o alguna otra muestra biolgica.

  • 2. Produccin de fragmentos de restriccin.El DNA es cortado en fragmentos por enzimas de restriccin.

  • 3. Los fragmentos de DNA se colocan en gel de agarosa.Con el propsito de someterlos a una separacin en base a su diferente tamao.

  • 6. Southern blotting.Los fragmentos de DNA separados se transfieren por adhesin a una membrana de nylon.La membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas de DNA ( fragmentos sinteticos de DNA de secuencia conocida y que corresponden a zonas selectas de hipervariablidad)

  • Isotopos radioactivos Pelcula de Rayos XSustancias fluorescentes Pelcula fotogrfica

    http://biogenomica.com/RFLP.htmhttp://www.biology.buffalo.edu/courses/bio531/lecture14.htmlhttp://www.elsevier.es/es-revista-medicina-clinica-2-articulo-aplicacion-tecnica-pcr-rflp-identificacion-nematodos-13062165*

  • Aplicaciones de RFLPPruebas de paternidadDeterminar el estado de

    alguna enfermedadMedir tasas de recombinacin

    en un mapeo genticoCasos penales.

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    http://biogenomica.com/RFLP.htmhttp://www.biology.buffalo.edu/courses/bio531/lecture14.htmlhttp://www.elsevier.es/es-revista-medicina-clinica-2-articulo-aplicacion-tecnica-pcr-rflp-identificacion-nematodos-13062165*