Análisis de Restricción, Mapa de restricción

Análisis

• Depende de:– Tamaño de los fragmentos– Grado de resolución• Los pasos a seguir• Digestión con la enzima en un tampón a T° y Temperatura,

detección de la digestión con EDTA y T° de almacenamiento.

• Carga en un gel de concentración adecuada al tamaño de fragmento, comparación con marcador de peso

• Electroforesis, estudio de bandas resultantes.

La longitud del sitio de reconocimiento y corte varia (4-8 nt)

Diferentes ER pueden tener el mismo sitio de Reconocimiento. Se conocen como Isoesquisomeros. (Sac I y Sst I)

Sitios de reconocimiento puede ser ambiguo o no ambiguo. (Bam HI / Hinf I)

El sitio de reconocimiento para una enzima puede contener el sitio de restricción para otra. (Bam HI y Sau3A I)

La mayoria de los sitios de reconocimiento y corte son palindromicos

Características de las Secuencias de Reconocimiento de las ER

Bases Teóricas de enzimas de restricción

La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :

pH Temperatura Concentración de sal Iones

Una unidad enzimática (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas:

3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug de ADN plasmico

Reacción enzimática

• Buffer (10X) 2 μL• DNA (1 μg) 1 μL• Enzimas 2 unidades• H2O _________

20 μL Volumen total

Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I,

Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción

Mar

cad

or

λ D

NA

un

cut

λ D

NA

/BA

M H

I

λ D

NA

/EC

O R

I

λ D

NA

/HIN

DII

I

λ D

NA

/KP

N I

A B C D E FMarcador λ DNA/Eco RI

Mapeo con enzimas de restricción

• Un mapa de restricción es una descripción de los sitios de corte de una

ER en un fragmento de DNA

– Caracterizar un DNA desconocido

– Prerrequisito para su posterior manipulación

• Como se puede hacer un mapa de restricción?

– Digestión de DNA con varias enzimas de restricción

– Digestión parcial de un DNA marcada en un extremo.

Identificación molecular

2) Cortes con 2 enzimas de restricción permitieron discriminar entre varias especies del género Penicillium :

Penicillium expansum, Penicillium solitum, Penicillium viridicatum, Penicillium brevicompactum

Fragmentos de restricción con Taq I

M1 M2 7 8 9 Ps Pb Pv Pc 2 4 10 12 M2 Pv

Fragmentos de restricción con Hind III

M1 M2 Pc Pb Ps P7 PC AN P12 P13 P14 P15 P16 P17 Pv M1

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción

Mar

cado

rM

arca

dor

Mar

cado

rM

arca

dor

Mar

cado

rM

arca

dor

Mar

cado

rM

arca

dor

Mad

reM

adre

Mad

reM

adre

HijoHijo

HijoHijo

Padr

e al

egad

oPa

dre

aleg

ado

Padr

e al

egad

oPa

dre

aleg

ado

Mix

Mix

Mix

Mix

Tests sencillosTests sencillosde paternidadde paternidad

Digestión doble

Mapeo con enzimas de restricción

Mapeo con enzimas de restricción

Mapeo con enzimas de restricción

Digestión parcial de un DNA marcada en un extremo

Hay tres ingredientes obligatorios en el mismo tubo:

1. DNA: Libre de contaminantes tales como fenol o etanol. Sal en exceso interfiere con la digestión de muchas enzimas, aunque algunas son mas tolerantes a la sal.

2. Un buffer apropiado: Diferentes enzimas cortan óptimamente en diferentes buffers, debido a las diferentes preferencias en fuerza iónica..

3. La enzima de restricción:

Otros: BSA, DTT.

Vectores y enzimas de restricción. En un plásmido (P) de 3 Kbp se quiere clonar un fragmento de DNA (D) de ratón de 1,5 Kbp. Tanto P como D se tratan con los enzimas de restricción EcoRI y HindIII y posteriormente se añade DNA ligasa. Para determinar el tamaño de las moléculas circulares resultantes después de la ligación se dispone de dos enzimas de restricción:

- PvuII: Es capaz de cortar una vez en P y ninguna en D - DdeII: No corta en P y tiene una única diana en D

P (3Kbp)

MCSEcoRI(30) HindIII (50)

PvuII (2200)

D (1.5Kbp)

EcoRI HindIIIDdeII

(1 Kbp) (0.5 Kbp)Representa gráficamente la movilidad electroforética que presentarían en un gel de agarosa: A. El plásmido sin cortar B. El inserto sin cortar C. El plásmido cortado por EcoRI + HindIII D. El plásmido resultante de la ligación cortado por Dde + PvuII

Vectores y enzimas de restricción. Deducir el mapa de restricción de un bacteriófago de DNA lineal, a partir de los siguientes datos:

Enzima de restricción Fragmentos obtenidos (Kb)

Bam HI 5 10

Hind III 5 10

Sma I 2 13

Bam HI + Hind III 5 *

Bam HI + Sma I 2 5 8

Hind III + Sma I 2 3 10

* Intensidad de banda mayor de la esperada para su peso molecular (al ser observada bajo luz UV)

En una población de centeno se ha aislado un gen de secuencia única. Se extrae el ADN genómico de 10 plantas diferentes de la población, se digiere con EcoRI, los fragmentos producidos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfieren mediante un Southern (transferencia en condiciones desnaturalizantes) a una membrana de nilón. Posteriormente, se hibrida esta membrana empleando como sonda radiactiva el gen de secuencia única de centeno clonado en un vector bacteriano. Por último, se realiza una autorradiografía colocando una película fotográfica junto a la membrana y se revela obteniéndose los resultados indicados en el siguiente esquema :