UNIDAD 3: Endonucleasas o Enzimas de Restricción

Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado

UNIVERSIDAD DE SONORA

POSGRADO EN BIOCIENCIAS

MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)

Introducción:

Endonucleasas de restricción (restrictasas)

Descubiertas simultáneamente entre 1968 y 1970 por Werner Arber y Hamilton Smith.

W. Arber

H. Smith

Las endonucleasas de restricción son un mecanismo de defensa de las bacterias frente a la entrada de ADN foráneo.

• Degradan el ADN extraño• No degradan el ADN propio de la bacteria

Arber&Linn,1969

Tipo I: Cortan en sitios cercanos al de reconocimiento.Tipo II: Cortan justo en el sitio de reconocimiento.

Las endonucleasas de restricción supusieron un enorme avance en el campo de la ingeniería genética. El uso de las enzimas restrictasas con estos fines fue propuesto y desarrollado por Nathans y Danna en 1971.

D. Nathans

K. Danna

Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:

1. Cohesivos (protuberantes)En 5’

En 3’

ATCGGTGGTACCTGC KpnI ATCGGTGGTAC CTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACCATGGACG TAGCCAC CATGGACG

ATCGGTGAATTCTGC EcoRI ATCGGTG AATTCTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACTTAAGACG TAGCCACTTAA GACG

5’

3’

3’

5’3’

5’3’

5’

3’

5’5’

3’

5’

3’

3’

5’3’

5’

5’

3’ 5’5’

3’

3’

Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:

2. Romos

ATCGGTGATATCTGC EcoRV ATCGGTGAT ATCTGC||||||||||||||| ||||||||| ||||||TAGCCACTATAGACG TAGCCACTA TAGACG

5’

3’

3’

5’3’

5’

3’

5’

5’

3’

Roberts,1976

Nucleasas

Endonucleasas Exonucleasas

Modificado deRoberts,1976

Cortesinternos Cortesexternos

ADN ADN

TipoI Mg2+

EcoKIModificado dePray,2008

cofactor

Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte

Endonucleasas de tipo II: Son enzimas endonucleasas, que cortan internamente el ADN de doble cadena, en sitios de reconocimiento específico (dianas de restricción).

La mayoría de las secuencias diana son simétricas en ambas

hebras del ADN(dianas palindrómicas)

LewinB.GenesIX(2009)

TipoIIMg2+

93%detodas lasenzimasconocidas

EcoRI BamHI HindIII

Modificado dePray,2008

Sitiodereconocimiento,en elmismo sitiodecorte

Las metilasas (o metil-transferasas) modifican el ADN bacteriano, añadiendo un grupo metilo a las bases A ó C del ADN recién sintetizado

La metilación en los sitios diana de las enzimas endonucleasas de restricción bloquean la acción de las mismas sobre el ADN propio

Permite a las bacterias defenderse contra el ataque de los bacteriófagos y hacen de barrera frente al ADN foráneo.

Metilasas

citosina 5-metil-citosina

grupo metilo

TipoIII

EcoPIModdePray,2008

Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte

• Isoesquizomeros:tienen lamisma secuencia dereconocimiento yelmismo sitio decorte.

SphI ->CGTA/CBbul ->CGTA/C

• Neoesquizomeros:tienen elmismo sitio dereconocmiento,perocortan elADNen diferente lugar.

SmaI ->CCC/GGGXmaI ->C/CCGGG

Chandrasegaran,2001

Tiposdecortes

• Cortes“pegajosos”

Tiposdecortes

• Cortes“romos”

Mecanismo deacción

• Unsolocorte en cada una delascadenas deazucar-fosfato deladoble helice,hidrolizando elenlacefosfodiester

Chandrasegaran,S.2001

Enzima Fuente Sitio de restricción

BamHI Bacillus amyloliquefaciens G G A T C C C C T A G G

EcoRI Escherichia coli G A A T T CC T T A A G

HindIII Haemophilus influenzaeA A G C T TT T C G A A

PstI Providencia stuartiiC T G C A GG A C G T C

BalI Brevibacterium albidumT G G C C AA C C G G T

SmaI Serratia marcescensC C C G G GG G G C C C

Ejemplos de endonucleasas de restricción comerciales y sus secuencias de reconocimiento

Extr

emos

coh

esiv

osE.

rom

os

LewinB.GenesIX(2009)

Usoenellaboratorio

• Estudiarlasdiferenciasentrelalongituddelosfragmentosdediferentesindividuos(RFLP)

• Clonacióndegenes• ConstruccióndelibreríasdeADNc• Secuenciación

RFLP• Distinguir individuos homocigotos yheterocigotos• Deteccion deenfermedades• Estudios dediversidad

Pray, L. (2008)

Clonación

Chandrasegaran,S.2001

Librerías genómicas

Pray, L. (2008)

Actividaddelasenzimasderestricción

• Seexpresaentérminosdeunidades• Unidad:cantidaddeenzimaqueseuniráatodossitiosespecíficosen1microgramsdeADNmuestraen1ha37ºC

Stephenson,2016

Stephenson,2016

CantidaddeHindIII

Stephenson,2016

DigestioninsilicoSepretende digerirvirtualmente elplasmidopGEM – 3Z

Sepuede buscar elvectoren NEBcutter,conelcodigo deGenBank

Obtenemos unmapa delasenzimas conlasquepodemos abrir elvector

Incluso podemos realizar unaelectroforesis insilicoyvercomo severia elvectordigeridoconlasenzimas elegidas

Digestión invitro

• Leerespecificaciones delaenzima

Digestióninvitro

Recetadedigestión

Incubar:37◦Cx1-16horas

Actividad ”estrella”

• Laenzima seune asitios similares pero noidenticos alsitio dereconocimiento correspondiente.

• Bajo condiciones extremas• Temperatura incorrecta• pHelevado• Bajafuerza ionica• Altas concentraciones deglicerol (>5%)

Ligación

• SielADNdeinterés yelvectorsoncortados conlamisma enzima,yesta crea cortes “pegajosos”,sepuede incubar conuna ADNligasa.

• Molécula deADNrecombinante.

Pray, L. (2008)

Resumen

• Conforman un“sistema inmune”primitivo en procariotas

• Clasificacion• Sitios deanclaje• Sitio decorte• Tipos decorte

• Importancia biotecnologica

• Es imprescindible conocer lasespecificaciones delaenzima queseesta utilizando

Bibliografía recomendada

• ArberW,LinnS(1969)."DNAmodificationandrestriction". AnnualReviewofBiochemistry. 38:467–500.

• RobertsRJ(Nov1976)."Restrictionendonucleases". CRCCriticalReviewsinBiochemistry. 4(2):123–64.

• Pray, L. (2008) Restrictionenzymes. NatureEducation• Chandrasegaran,S.2001.RestrictionEnzymes.eLS..• JohnW.Pelley,18- RecombinantDNAandBiotechnology,InElsevier'sIntegratedBiochemistry,Mosby,Philadelphia,2007,Pages159-167,ISBN9780323034104

• FrankH.Stephenson,Chapter10- RecombinantDNA,InCalculationsforMolecularBiologyandBiotechnology(ThirdEdition),AcademicPress,Boston,2016,Pages321-373,ISBN9780128022115