UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Tamara D. Jovanović

Poređenje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste

Micromeria cristata gajene in vitro i iz prirode

MASTER RAD

Niš, 2014.

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za biologiju i ekologiju

Poređenje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste

Micromeria cristata gajene in vitro i iz prirode

MASTER RAD

Student: Mentor:Tamara D. Jovanović prof dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, 2014.

University of Nis

Faculty of sciences and mathematic

Department of Biology and Ecology

The comparative analisis of antimicrobial activity of

Micromeria cristata extracts grown in vitro and in nature

MASTER THESIS

Student: Mentor:Tamara D. Jovanović prof dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, February 2014.

ZAHVALA

Zahvaljujem se svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov-Krstev na

izboru teme, nesebičnoj pomoći, i sugestijama tokom izrade ovog master

rada.

Zahvaljujem se i profesorki Svetlani Tošić na ukazanom poverenju

i mogućnosti da učestvujem u jednom eksperimentalnom delu izrade

njenog doktorata. Takođe, zahvaljujem se i na pomoći asistentkinji

Jovani Jović tokom izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Posebnu zahvalnost iskazala bih svojoj porodici na neizmernoj

podršci i razumevanju koje su mi pružili tokom studiranja.

SADRŽAJ

SADRŽAJ .................................................................................................................... 12

SAŽETAK .................................................................................................................... 14

ABSTRAKT ................................................................................................................. 15

1.UVOD ....................................................................................................................... 19

2. OPŠTI DEO .............................................................................................................. 20

2.1. Karakteristike familije Lamiaceae ..................................................................... 20

2.1.1. Rod Micromeria ......................................................................................... 20

2.2. Vegetativno razmnožavanje in vitro - mikropropagacija .................................. 21

2.3. Biljni ekstrakti .................................................................................................. 21

2.4.1. Bakterije ..................................................................................................... 21

3. CILJ RADA .............................................................................................................. 23

4. MATERIJAL I METODE ........................................................................................ 25

4.1. Biljni materijal ................................................................................................... 25

4.2. Dobijanje biljnog ekstrakata .......................................................................... 25

4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria cristata gajene in vitro i iz prirode ........................................................................................ 25

4.3.1. Bakterijske kulture ..................................................................................... 25

4.3.2. Mikrodiluciona metoda .............................................................................. 26

4.3.3. Statistička obrada podataka ............................................................................ 26

5. REZULTATI I DISKUSIJA ...................................................................................... 26

6. ZAKLJUČAK .......................................................................................................... 28

21.Panovska, T.K., Kulevanova, S. (2010): Evaluation of antioxidant capacity of Micromeria cristata extracts. Electronic Journal of Environmental, Agricultural & Food Chemistry, 9 (3), 627-635. ................................................................................. 29

SAŽETAK

Biljna vrsta Micromeria cristata je rasprostranjena u istočnim delovima

Evrope, u Bugarskoj, u Makedoniji, u Hrvatskoj, u Turskoj, u Palestini i u Iranu. U

Srbiji raste u istočnom i jugoistočnom delu zemlje.

U ovom radu je vršeno poređenje antimikrobne aktivnosti metanolnih

ekstrakata biljaka prikupljenih iz prirode i gajenih u in vitro kulturi. Antimikrobna

aktivnost je ispitivana uz pomoć mikrodilucione metode protiv šest bakterijskih

sojeva, a kao pozitivna kontrola su testirana tri antibiotika: hloramfenikol,

streptomicin i tetraciklin.

Metanolni ekstrakti biljne vrste M. cristata, su pokazali antimikrobnu

aktivnost protiv svih testiranih sojeva mikoroorganizama. Najosetljiviji je bio soj

Staphylococcus aureus, a najotporniji je bio soj Pseudomonas aeruginosa. Nije

zabeležena značajna razlika između aktivnosti ekstrakata biljaka prikupljenih iz

prirode i gajenih u in vitro kulturi.

Ključne reči: Micromeria cristata, mikropropagacija, antimikrobna aktivnost.

ABSTRAKT

Plant species Micromeria cristata is widespread in east parts Europe, in

Bulgaria, in Macedonia, in Croatia, in Turkush, in Palestinian and in Iran. In Serbia

grows in eastern and south eastern part of the country.

In this study, a comparison was made of antimicrobial activity of methanol

extracts of plants collected from the wild and grown in in vitro culture. Antimicrobial

activity was tested using the microdilution method against six bacterial strains, as a

positive control, were tested by three antibiotics: chloramphenicol, tetracycline and

streptomicin.

Methanolic extracts of the plant Micromeria cristata, showed antimicrobial

activity all tested strains of microorganisms. Was the most sensitive strain of

Staphylococcus enteritidas, but was the most resistant strain of Pseudomonas

aeruginosa. There was no significant difference between the activity of extracts of

plants collected from the wild and grown in in vitro culture.

Keywords:Micomeria cristata, antimicrobial activity, microdilution.

1. UVOD

Proučavanje lekovitih biljaka po

elo je krajem XVIII i početkom XIX veka. Danas se u narodnoj i zvaničnoj medicini

koristi oko 10.000 biljnih vrsta za lečenje bolesti ili za očuvnje zdravlja ljudi. U domaćim

uslovima, od lekovitih biljaka mogu se pripremati različiti ekstrakti: čajevi, macerati,

tinkture, praškovi i sokovi.

Nauka koja se bavi proučavanjem lekovitih biljaka, odnosno drogama biološkog

porekla je farmakognozija. Biljke su vrlo složenog hemijskog sastava, bogate su visokim

sadržajem različitih alkaloida, glikozida, smola, etarskih ulja. Mnoge farmakopeje u svetu se

koriste za dobijanje lekova iz lekovitog bilja. U novije vreme istraživačke metode se sve više

usavršavaju, otkrivaju se nove materije, od kojih neke predstavljaju prekretnicu u medicini i

farmaciji (Tucakov, 1990).

17

2. OPŠTI DEO

2.1. Karakteristike familije Lamiaceae

Familija Lamiaceae (Labiatae) tj familija usnatica su zeljaste biljke ili grmovi sa

četvrtastim stablom i dvousnatim cvetovima (po čemu su i dobile ime) sakupljenim u

cimozne cvasti. Listovi su naspramno postavljeni, prosti. Cvetovi su izrazito zigomorfni,

dvousnati. Čašica je zvonasta ili dvousnata izgradjena od 5 sraslih listića, krunicu gradi 5

sraslih listića, u donjem delu formiraju cev, na čijem se obodu nalaze dve usne. Prašnika ima

4, 2 duža, i 2 kraća, kod nekih postoje samo dva prašnika. Tučak je sa dugačkim stubićem,

na čijem se vrhu nalazi dvorežnjevit žig. Cvetovi su sakupljene u cimozne cvasti. Plod je

sitna orašica. Veliki broj sadži etarska ulja, koja imaju široku primenu u medicini (Josifović,

1974).

Poznato je oko 3000 vrsta, rasprostranjenih svuda u svetu. Među njima su

najpoznatije aromatične vrste: žalfija, lavanda, ruzmarin, nana, majčina dušica i dr.

2.1.1. Rod Micromeria

Rod Micromeria pripada familiji Lamiaceae. Obuhvata oko 130 vrsta rasprostranjenih

u Mediteranu (Josifović, 1974). U flori Srbije i Crne Gore ovaj rod je predstavljen sa 10 vrsta

od kojih su 7 endemske (Šilić, 1979). Na osnovu morfoloških karakteristika i filogenetskih

odnosa vrste roda Micromeria su grupisane u tri sekcije: Pseudomelissa, Eumicromeria i

Cymularia (Boisser, 1789). Vrste koje naseljavaju teritoriju Srbije i Crne Gore pripadaju

sekciji Pseudomelissa i Eumicromeria.

2.1.2. Biljna vrsta Micromeria cristata

Rod Micromeria pripada familiji Lamiaceae. Vrsta Micromeria cristata je

višegodišnja biljka, stabljike su mnogobrojne, skoro končaste, gusto busenasto zbijene,

pokrivene kratkim dlačicama.

Donji listovi su izduženi, ostali linearni, sedeći, duž oboda izrazito uvijeni, pokriveni

mekim dlakama, na naličju sa istaknutim srednjim nervom. Cvetovi su sa izraženom cvetnom

drškom, složeni, najčešće po 3 u dihazije na kratkoj zajedničkoj dršci. Plodići su šiljati.

18

Rasprostranjena je u istočnim delovima Evrope, u Bugarskoj, u Makedoniji, u Hrvatskoj, u

Turskoj, u Palestini, i u Iranu. U Srbiji je rasprostranjena u istočnom i jugoistočnom delu.

2.2. Vegetativno razmnožavanje in vitro - mikropropagacija

Mikropropagacija predstavlja metod vegetativnog razmnožavanja čijom primenom se

iz malih delova biljaka (embrioni, seme, pupoljci, apikalni meristem, kalus, pojedinačne

ćelije), na veštačkim hranljivim podlogama i u sterilnim uslovima, regenerišu nove biljke.

Ovaj način razmnožavanja biljaka je dobio naziv po tome što su biljni organi ili cele biljke u

odnosu na generativnu proizvodnju, minijaturnih dimenzija. Uticajima promenljivog sastava

hranljive podloge i drugih fizičkih faktora, razviće tkiva, koje se gaji u sterilnim uslovima,

može se usmeravati u željenom pravcu (Bonga, 1982). Većina vrsta koje se razmnožavaju

mikrpropagacijom mogu se gajiti na standranim sterilnim agarnim podlogama sa

makrometaboličkim i mikrometaboličkim elementima, najčešće je to MS rastvor mineralnih

soli (Murashige, Skoog, 1962), sa odgovarajućim bilansom fitohormona.

Mikropropagacija se primenjuje kod:

brzog razmnožavanja novih genotipova,

održavanja interesantnih genotipova,

ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka selekcija i oplemenjivanja

regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inžinjerstvu (Vinterhalter,

Vinterhalter 1996).

Sam postupak osigurava vrlo brz proces dobijanja velikog broja serija biljaka, koje su

istovetne po razvoju, rastu i genetičkom potencijalu. Bez sumnje, to je proces kloniranja, jer

sve proizvedene biljke predstavljaju matične kopije razmnoženog majčinskog uzorka

(Međedović 2003). Kultura in vitro predstavlja najmoćnije sredstvo moderne genetike i

molekularne biologije u cilju istraživanja rasta i razvoja biljaka (Međedović 2003).

Medjutim, ova metoda ima i nedostataka medju kojima su najznačajniji velika

početna ulaganja za opremanje laboratorije, i obzirom na slozenost celog postupka, potreba

za visoko kvalifikovanom radnom snagom (Vinterhalter and Vinterhalter, 1997).

19

2.3. Biljni ekstrakti

Biljni ekstrakti su koncentrovani pripravci koji mogu imati tečnu, polučvrstu i čvrstu

konzistenciju, a dobijaju se iz biljnih droga. Pre procesa ekstrakcije droga mora biti usitnjena

do konzistencije grubog praška i stabilizovana (enzimi moraju biti inaktivirani i

obezmašćeni). Uz pomoć različitih rastvarača (vode, alkohola različitih koncentracija, masnih

ili mineralnih ulja) iz droge se mogu ekstrahovati aktivni sastojci sa većom ili manjom

količinom balasnih materija (Tucakov, 1990).

2.4. Mikroorganizmi

Mikroorganizmi (micros-mali) su organizmi malih dimenzija, nevidljivi golim okom.

Oni su veoma široko rasprostranjeni u različitim sredinama tj to su kosmopolitski, odnosno

ubikvitarni organizmi. Njihova starost se procenjuje na skoro 4 milijarde godina (Knežević i

sar., 2007).

Pojam mikroorganizmi nije sistematska kategorija jer je to heterogena grupa koja

obuhvata organizme kao što su: virusi, bakterije, alge, gljive, lišaji i protozoe. Vrlo značajne

zajedničke osobine ovih organizama su pre svega mikroskopske razmere, brz metabolizam,

brzo razmnožavanje i raznolikost enzima i biohemijskih procesa.

2.4.1. Bakterije

Bakterije su najbrojnija grupa organizama, imaju veoma jednostavnu građu

(Malkovič, Stanojević, 2013). Žive u vazduhu, vodi, zemljištu, na drugim živim bićima, ili u

njima. Bakterije su najstariji i najbrojniji organizmi na našoj planeti. Smatra se da su nastale

pre oko 3 do 4 milijarde godina. Bile su nepoznate sve do 20. veka. Naučnici Luj Paster i

Robert Koh otkrili su ulogu koju bakterije imaju u kvarenju hrane i u mnogim bolestima ljudi

i životinja. Bakterije mogu biti različitog oblika, lotaste se nazivaju koke, štapićaste bacili, a

izuvijane spirili (Šegrt, Vukobratović, 2012).

Prema sastavu ćelijskog zida i bojenju postupkom po Gramu (metoda koju je

predložio naučnik Hans Christian Gram 1884. g.) bakterije se dele na: Gram-pozitivne i

Gram-negativne. Gram-negativne bakterije imaju jedan sloj lipopolisaharida koji pokriva

njihov ćelijski zid, dok Gram-pozitivne nemaju taj sloj, zbog čega se prve boje crveno, a

druge ljubičasto. Osim razlike u građi ćelijskog zida ove dve grupe bakterija se razlikuju i po

mnogim drugim osobinama a najvažnija je njihova različita osetljivost na antibiotike.

20

U ovom radu su testirane sledeće Gram-negativne bakterije:

Escherichia coli

Escherichia coli je Gram negativna bakterija, štapićastog oblika, fakultativni

anaerobni bacil. Naseljava creva čoveka i životinja. Predstavlja deo crevne flore i nepohodna

je za procese varenja i sinteze nekih supstanci. Indikator je zagadjenih voda hemikalijama.

Naziv rodu Ešerihija dat je u čast Teodora Ešeriha, koji je prvi otkrio i opisao. Poseduje

treplje, pomoću kojih se kreće. Razgradjuje laktozu. Prirodno stanište E.coli je crevni sistem.

Optimalna temperatura za razmnožavanje je 370 C. Izaziva infekcije gastroinestinalnog,

urogenitalnog trakta, sepsu, meningitis, zapaljenje pluća (Jovanović et al., 1999).

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa raste u aerobnim uslovima, na temperaturi od 35-37 0C.

Pripada grupi Gram negativnih štapića, sa jednom ili više polarnih flagela. Nema kapsulu i ne

stvara spore. Ova bakterija luči endotoksine, egzotoksine, enzime i druge biološki aktivne

materije koje povećavaju njenu patogenost. Izaziva meningitis, infekcije pluća, urinarnog i

gastrointestinalnog trakta, infekcije kože, oka i infekcije rana (Jovanović et al., 1999).

Salmonella enteritidis

Rod Salmonella pripada Gram-negativnim bakterijama. Pokretne su, fakultativno

anaerobni bacili, najčešće ne stvaraju kapsulu i spore. Salmonella enteritidis ne spada u

otporne bakterije. U spoljnoj sredini, na predmetima, mogu da prežive svega nekoliko sati, ali

se u vodama i namirnicama mogu održati znatno duže, naročito na niskim temperaturama.

Kada dospu u spoljnu sredinu ne mogu da se razmnožavaju (Jovanović et al., 1999).

Staphylococcus aureus

Rod Staphylococuus je dobio ime po žuto-zelenoj boji njegovih kolonija, patogen je i

izaziva mnoštvo različitih infekcija. Gram-pozitivna bakterija, široko rasprostranjena,

nepokretna, formiraju jata ili grozdove. Pripadaju grupi fakultativnih anaeroba (Petrović et

al., 2007). Ćelijski zid je izgrađen od debelog sloja mureina. Staphylococcus aureus je

producent ekstracelularnih, termostabilnih enterotoksina (Samardžija et al., 2007). Bolesti

koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne (prodorom bakterije u organizam),

21

intoksikacije (izlučuje toksine koji su odgovorni za crevne poremećaje usled konzumiranja

pokvarenih namirnica) ili kombinacija ove dve grupe (Jovanović et al. , 1999).

Bacillus cereus

Rod Bacillus pripada Gram-pozitivnim bakterijama, endogene su, patogene i

štapićastog oblika. Aerobi ili fakultativni anaerobi. Bakterije ovog roda su široko

rasprostranjenje u zemlji i vodi. Proizvodi termostabilan toksin koji uzrokuje dijareju i

povraćanje (Ryan and Ray, 2004).

Listeria monocytogenes

Gram-pozitivna bakterija, veoma pokretljiva, slabo patogena, bez kapsule i bez spora.

U dubokom polučvrstom agru stvara formaciju koja podseća na kišobran. Dobro raste u

aerobnim ili mikroaerofilnim uslovima. Izaziva oboljenja domaćih i divljih životinja, ređe

ljudi. (Jovanović et al., 1999).

22

3. CILJ RADA

Ciljevi ovoga rada su definisani u sledećem:

Prikupljanje nadzemnog dela biljne vrste Micromeria cristata na lokalitetu

opisanom literaturi;

Determinacija biljnog materijala klasičnim metodama za determinaciju;

Mikropropagacija vrste M. cristata u kulturi in vitro;

Pripremanje ekstrakata uz pomoć metanola kao rastvarača;

Ispitivanje antimikrobne aktivnosti metanolnih ekstrakata vrste M. cristata,

prikupljene iz prirode i gajene u in vitro kulturi, uz pomoć mikrodilucione metode;

Statistička obrada dobijenih rezultata i poređenje dobijenih aktivnosti;

Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom

u cilju promalaženja novih izvora antimikrobnih supstanci.

23

4. MATERIJAL I METODE

4.1. Biljni materijal

Nadzemni deo biljne vrste Micromeria cristata je prikupljan u vegetativnoj fazi u

klisuri Svrljiškog Timoka. Herbarski primerak je deponovan u herbarijumu na Prirodno-

matematičkom fakultetu u Nišu (broj vaučera 6913). Za mikropropagaciju su korišćeni

nodalni segmenti kao eksplanti a ostatak biljnog materijala je sušen u periodu od deset dana

na sobnoj temperaturi do konstantne mase.

Postupak mikropropagacije prikupljenih nodalnih segmenata biljne vrste Micromeria

cristata je izvršen od strane Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu. Tako dobijeni biljni materijal je takođe sušen u periodu od

deset dana na sobnoj temperaturi do konstantne mase.

4.2. Dobijanje biljnog ekstrakata

Za pripremu biljnog ekstrakta uzet je po 1 g osušenog i usitnjenog biljnog materijala

(iz prirode i iz kulture) i pomešan sa 10 ml metanola. Nakon 1h stajanja uzorci su filtrirani,

rastvarač je uklonjen na vakum uparivaču i dobijeni ekstrakti su čuvani zamrznuti (255 K) do

analize.

4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeriacristata gajene in vitro i iz prirode

4.3.1. Bakterijske kulture

Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sledeći sojevi bakterija: Gram

pozitivne bakterije (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes) i Gram

negativne bakterije (Escherichia coli, Pseudomonas aeruiginosa i Salmonella enteritidis)

(Tabela 1).

Tabela 1. Testirane bakterijske kulture

Bakterijski sojevi Izvor Bacillus cereus ATCC 11778 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Listeria monocytogenes ATCC 15313 Escerichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeuriginosa ATCC 9027 Salmonella enteritidis ATCC 13067

24

4.3.2. Mikrodiluciona metoda

Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne

koncentracije (MBC) biljnog ekstrakta M. cristata korišćena je mikrodiluciona metoda. Od

prekonoćnih kultura ispitivanih sojeva bakterija uzgajanih na hranljivoj podlozi, napravljena

su bakterijske suspenzije u sterilnom fiziološkom ratsvoru i turbidimetrijskom metodom je

broj mikroorganizama standardizovan na 0, 5 McFarlanda. Nakon toga je napravljena serija

duplih razređenja uzoraka (u 30% metanolu) u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića u kojima

su dodati inokulisani nutrijenti za rast (u svakom bunariću je bio finalni volumen – 100 µl i

finalna koncentracija bakterija 106 CFU/ml). Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane 24h na

37˚C.

Svi testovi su vršeni u triplikatu a korišćene su dve kontrole rasta koje sadrže

inokulisanu hranljivu podlogu kao i inokulisanu hranljivu podlogu sa serijom duplih

razblaženja rastvarača metanola. Kao pozitivna kontrola su korišćeni antibiotici:

hloramfenikol, streptomicin i tetraciklin. Mikrobni rast je određivan dodavanjem po 20 µl

0,5% vodenog rasvora TTC (2,3,5-trifenil tetrazolijum hlorida) u svakom bunariću.

Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) se definiše kao koncentracija ekstrakta pri kojoj

mikroorganizmi ne pokazuju vidljivi rast (nema crveno obojenih bakterija). Dа bi se utvrdila

minimalna baktericidna koncentracija (MBC), iz svakog bunarića je sadržaj prenošen na

Мueller Hinton agaru (MHA) u petri pločama koje su zatim inkubirane 24h на 37˚C. МBC se

definiše kao najniža koncentracija еkstrakata u kojoj je ubijeno 99,9% inokulisanih

mikroorganizama.

Slika 1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijomrazblaženja uzoraka

25

4.3.3. Statistička obrada podataka

Svi rezultati obrađeni su analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 95 %

(p≤0,05).

5. REZULTATI I DISKUSIJA

U ovom radu je ispitivana antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata biljne vrste

Micromeria cristata uz pomoć mikrodilucione metode protiv tri Gram-pozitivne i tri Gram-

negativne bakterije. Izvršeno je poređenje dobijenih aktivnosti metanolnih ekstrakata

dobijenih iz nadzemnih delova biljke koji su prikupljani u vegetativnoj fazi u klisuri

Svrljiškog Timoka i dobijenih postupkom mikropropagacije nodalnih segmenata koji je

izvršen od strane Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu. Dobijeni rezultati su statistički obrađeni i prikazani u tabeli 2.

Tabela 2. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata nadzemnog dela biljne vrste Micromeria cristata (iz prirode i iz kulture) i referentnih antibiotika (izražena kao MIC/MBC u mg/mL)

Metanolni ekstraktiM. cristata

Gram (-) bacterije Gram (+) bacterije

Escherichiacoli

Salmonellaenteritidis

Pseudomonasaeruginosa

Bacilluscereus

Staphylococcusaureus

Listeriamonocytogenes

M. cristata(priroda)

22,94/45,88 22,94/22,94 45,8/>45,8 11,47/>45,8 11,47/22,94 22,94/45,58

M. cristata(in vitro)

35,75/71,5 17,88/35,75 71,5/>71,5 8,94/>71,5 17,88/17,88 17,88/35,75

Streptomicin 0,16/0,16 0,04/0,04 0,08/0,08 0,01/0,01 0,01/0.01 0,01.0/0,01

Hloramfenikol 0,08/0,16 0,04/0,08 0,16/0,04 0,01/0,04 0,01/0,08 0,08/0,08

Tetraciklin 0,01/0,02 0,01/0,08 0,04/0,32 0,01/0.,01 0,01/0,01 0,01/0,02

S obzirom da su vrste roda Micromeria su aromatične biljke koje se tradicionalno

koriste kao začini i u lekovite svrhe, do sada su uglavnom ispitivana njihova etarska ulja. U

literature postoje podaci o hemijskom sastavu i antimikrobnoj aktivnosti biljnih vrsta M.

thymifolia, M. albanica i M. dalmatica (Marinković et al., 2002), M. fruticulosa (Gulluce at

al., 2004; Formisano et al., 2007), M. juliana (Stojanović et al., 2006), M. biflora (Adnan and

Al-Rehaily, 2006; Mishra et al., 2010) i M. barbata (Bakkour et al., 2012). Ulja ispitivanih

26

vrsta sadrže alkohole borneol i linalon, seskviterpene kariofilen i kariofilen-oksid, dok dve

vrste M. juliana (Stojanović et al., 2006), a naročito M. biflora sadrže u većem procentu timol

zbog čega je to ulje veoma dobro delovalo na patogene bakterije koje izazivaju stvaranje

karijesa (Mishra et al., 2010). Što se tiče ulja vrste M. cristata među 36 identifikovanih

komponenti u etarskom ulju dominantene komponente su bile izoborneol (11.3%), borneol

(8.5%), verbenon (8.2%), 10-epi-α-cadinol i thujan-3-ol. Antimikrobna aktivnost tog ulja je

ispitivana protiv šest mikroorganizama (Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis i Aspergillus niger)

i ustanovljeno je da je dilucija ulja 1:20 imala aktivnost protiv svih testiranih sojeva dok

dilucija ulja 1:40 bila neaktivna (Stojanović et al., 2006). Etarsko ulje Micromeria subsp.

phrygia sa tri lokaliteta u Turskoj je sadržalo u najvećem procentu borneol (27−39%), camfor

(9−15%), kariofilenoksid (4−6%) i trans-verbenol (4−6%). Ova ulja su pokazala inhibitornu

aktivnost protiv Gr (−) i Gr (+) patogenih mikoorganizama. (Tabanca et al., 2001).

U dostupnoj literaturi je pronađeno vrlo malo podataka o antimikronom delovanju

ekstrakata nadzemnog dela biljnih vrsta roda Micromeria. Do sada je ispitivana antimikrobna

aktivnost etanolnog, petroleum-etarskog i etilacetanog ekstrakta vrste M. nervosa (Ali-

Shtayeh et al., 1997; Khalil et al., 2009), metanolnog ekstrakta vrste M. fruticosa ssp

serpyllifolia (Güllüce et al., 2004), acetnoskog ekatrakta vrste M. fruticosa (Sagdic et al.,

2005), heksanskog, hloroformskog i etilacetatnog ekstrakta vrste M. cilicica (Duru et al.,

2004) i etanolnog akstrakta vrste M. juliana (Sarac and Ugur, 2007). U svim navedenim

radovima je korišćena disk-difuziona metoda koja daje samo kvalitativne i nereproduktivne

podatke (Janssen et al., 1987; Kolodera et al., 1997). To je razlog zbog koga ova metoda

može biti korišćena samo za preliminarni skrining antimikrobne aktivnosti (Smith-Palmer et

al., 1998). Ekstrakti vrsta M. nervosa, M. fruticosa ssp serpyllifolia i M. juliana nisu pokazali

nikakvu antimikrobnu aktivnost (izuzev u slučaju vrste M. juliana protiv S. epidermidis)

(Khalil et al., 2009; Güllüce et al., 2004; Sarac and Ugur, 2007). Ekstrakti vrsta M. fruticosa,

M. nervosa i M. cilicica su imali antimikrobnu aktivnost protiv širokog spektra

mikroorganizama zahvaljujući prisustvu karvakrola u ekstraktu M. nervosa (Ali-Shtayeh et

al., 1997) i pulegona u ekstraktu M. cilicica (Duru et al., 2004). Tokom pregleda dostupne

literature nije pronađen nijedan rad o antimikrobnoj aktivnosti etarskog ulja ili esktrakta vrste

M. cristata. Poznato je samo da ekstrakti ove vrste (dietill eterski, etil acetatni i n-butanolski)

u in vitro i u in vivo uslovima imaju dobru antioksidativnu aktivnost (Panovska et al., 2010)

što ih čini opravdanim za upotrebu u cilju poboljšanja opšteg zdravstvenog stanja.

27

U ovom radu je ispitivana aktivnost metanolnog ekstrakta M. cristata i dobijeni

rezultati pokazuju s jedne strane, slično delovanje metanolnih ekstrakata (dobijenih iz biljnog

materijala iz prirode i iz kulture) protiv svih testiranih sojeva, a s druge strane, nisku

aktivnost u poređenju sa referentnim antibioticima (MIC/MBC=0.01-0.16 mg/mL) (tabela

2). Inhibitorne i baktericidne koncentracije ekstrakata su bile u rangu od 22,94 – 45,8 mg/mL;

i 17,88 – 71,5 mg/mL (respektivno) protiv Gram (-) bacterije i od 11,47 – 45,8 mg/mL; 8,94 –

71,5 mg/mL (respektivno) za Gram (+) bacterije. S obzirom na podatak da se biljni ekstrakti

koji imaju MIC vrednosti manju od 100 μg/mL smatraju nedelotvornim (Cos et al., 2006),

dobijene vrednosti nisu značajni sa aspekta antimikrobog delovanja. Najviše testirane

koncentracije ekstrakta nisu imale baktericidno delovanje protiv sojeva P. aeruginosa

(MBC>45,8 mg/mL i MBC>71,5 mg/mL, za ekstrakt dobijen iz prirode i iz in vitro kulture) i

B. cereus (MBC>45,8 mg/mL i MBC>71,5 za ekstrakt dobijen iz prirode i iz in vitro kulture).

Najrezistentniji je bio soj P. aeruginosa (MIC/MBC=45,8/>45,8 mg/mL; 71,5/>71,5

mg/mL, respektivno), a najosetljiviji je bio soj S. enteritidas na koga su oba ekstrakta

delovala u najnižim koncentracijama (MIC/MBC=22,94/22,94 mg/mL; 17,88/35,75 mg/mL

respektivno). Nije zabeležena značajna razlika u antimikrobnom delovanju metanolnog

ekstrakta koji je dobijen iz biljke ubrane u prirodi i iz biljke odgajene in vitro u kulturi.

Moze se zaključiti da metanolni rastvarač deluje inhibitorno na Micromeria cristata

ubranu sa terena i gajenu u in-vitro uslovima.

28

6. ZAKLJUČAK

Nadzemni deo biljne vrste Micromeria cristata je prikupljan u vegetativnoj fazi u

klisuri Svrljiškog Timoka, nakon čega je od strane dr Bojana Zlatkovića izvšena

determinacija biljnog materijala i deponovanje herbarskog primerka u Herbaru PMF-a u

Nišu. Za mikropropagaciju su korišćeni nodalni segmenti kao eksplanti.Vrsta M. cristata je

prvi put uvedena u in vitro kulturu i njena mikropropagacija je uspešno izvršena od strane

Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka PMF-a u Nišu. Na taj način je dokazano da

se ova vrsta može uspešno gajiti i razmnožavati u laboratoriji.

Ostatak biljnog materijala iz prirode, kao i materijala dobijenog mikropropagacijom je

sušen i od njega su napravljeni metanolni ekstrakti. Antimikrobna aktivnost dobijenih

ekstrakata je ispitivana upotrebom mikro-dilucione metode. Kao test mikroorganizmi uzeti su

najčešći bakterijski patogeni sojevi, po tri iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija. Analiza

dobijenih rezultata ukazuje na to da su oba metanolna ekstrakta biljaka prikupljenih iz prirode

i odgajenih u in vitro kulturi delovala na sve testirane sojeve. Inhibitorne i baktericidne

koncentracije ekstrakata su bile u rangu od 22,94 – 45,8 mg/mL; i 17,88 – 71,5 mg/mL

(respektivno) protiv Gram (-) bacterije i od 11,47 – 45,8 mg/mL; 8,94 – 71,5 mg/mL

(respektivno) za Gram (+) bacterije. Dobijene aktivnosti su znatno slabije u odnosu na tri

referentna antibiotika.

Poređenjem dobijenih rezultata nije zabeležena značajna razlika u antimikrobnom

delovanju metanolnog ekstrakta koji je dobijen iz biljke ubrane u prirodi i iz biljke odgajene

in vitro u kulturi.

29

7. LITERATURA

1. Al-Rehaily, J.A. (2006): Composition of the Essential oil of M.biflora ssp. Arabica

K.Walsh Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(14), 2726-2728.

2. Ali-Shtayes, MS, Al-Nuri, MA, Yaghmour, RM, Faidi, YR. (1997): Antimicrobial

activity of Micromeria nervosa from the Palestinian area. Journal of

Ethnoharmacology, 58(3), 143-147.

3. Bakkour, Y., Alwan, S., Soufi, H., El-Ashi, N., Tabchei, M., El Omar, F.(2012):

Chemical composition of essential oil extracted from Micromeria Barbata growing

and their antimicrobial and antioxidant properties. Journal of Natural Products, 5,

116-120.

4. Boissier (1789): Flora Orientalis, vol. 4. Basel i Geneve, 568-575.

5. Bonga J.M. (1982): Tissue culture techniques. Chapter from book: Tissue culture in

Forestry (4-36), edited by Bonga J.M. and Durzan D.J.

6. Cos, P., Vlietinck, A.J., Berghe, D.V., Maes, L. (2006): Anti-infective Potential of

Natural Products: How to Develop a Stronger in vitro ’Proof-of-Concept’. Journal of

Ethnopharmacology, 106, 290-302.

7. Duru, M. E., Ozurk, M., Urug, A., Ceylon, O. (2004): The constituents of essential

oils and in-vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey. Journal

Ethemophormacology, 94(1), 43-8.

8. Formisano, C., Mignola, E., Rigano, D., Senatore, F., Bellone, G., Bruno, M., Rosella,

S. (2007): Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from

aerial parts Micromeria fruticulosa (Bertol.) Grande (Lamiaceae) growing wild in

southern Italy. Flavour frag J., 22(4)

30

9. Gulluce M., Sokmen M., Sahin F., Sokmen A., Adiguzel A., Ozer H. (2004):

Biological activities of Micromeria fruticosa (L) Druce serpylifolia (Bieb) PH Davis

plants from the eastern Anatolia region of Turkey. Journal of Biological Scinces,

84(7), 735-741.

10. Janssen, A.M., Scheffer, J.J.C., Baerheim Svendsen, A. (1987): Antimicrobial activity

of essential oils: a 1976– 1986 literature review. Aspects of the test methods. Planta

Medica, 53, 396–398.

11. Josifović, M., Stjepanović, L., Janković, M., Gajić, M., Kojić, M., Diklić, N., (1974):

Flora SR Srbije, I-VII. Beograd, 460.

12. Jovanović, M. (1999): Opšta bakteriologija. Beograd, 1-5.

13. Kalodera, Z., Pepeljnak, S., Blazevic, N., Petrak, T. (1997): Chemical composition

and antimicrobial activity of Tanacetum parthenium essential oil. Pharmazie, 52 (11),

885-856.

14. Knežević, P., Simeunović, J. (2007): Mikrobiologija: Skipta za studente biologije.

Novi Sad.

15. Khalil, A.., Dababneh, B.F., Al-Gabbiesh, A.H. (2009): Antimicrobial activity against

pathogenic microorganisms by extracts from herbal Jordanian plants. Journal of

Food, Agriculture & Environment, 7 (2), 103-106.

16. Malkovič-Surčinski, V., Stanojević, T. (2013): Biologija ya peti rayred osnovne škole.

Beograd, 24-27.

17. Marinković, B., Marin, P.D., Knežević-Vukčević J., Soković, M.D., Brkić, D. (2002):

Activity of essential oils of thee Micromeria spesies (Lamiaceae) againd

micromycetes and bacteria. Phytoterapy Research, 16(4), 336-339.

18. Međedović, S., Ferhatović, Dž. (2003): Klonska proizvodnja sadnica drveća i grmlja.

Bemust, Sarajevo.

19. Mishra, R. K., Kumar, A., Shukla, A. C., Tiwari, P., Dikshit, A. ( 2010): Quantitative

and Rapid Antibacterial Assay of Micromeria biflora Benth. Leaf Essential Oil

31

Against Dental Caries Causing Bacteria Using Phylogenetic Approach. Journal of

Ecobiotechnology, 2(4), 22-26.

20. Murashige T. And Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growht and bioassays

with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant 15: 473-497.

21. Panovska, T.K., Kulevanova, S. (2010): Evaluation of antioxidant capacity of

Micromeria cristata extracts. Electronic Journal of Environmental, Agricultural &

Food Chemistry, 9 (3), 627-635.

22. Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente

biologije.

23. Samardžija, D., Damjanović, S., Pogačić, T. (2007): Staphyloccocus aureus u siru.

Mljekarstvo/Dairy, 57, 31-48.

24. Sarac N., Ugur A. (2007): Antimicrobial activities and usage in folcloric medicine of

some Lamiaceae species growing in Mugla, Turkey. EuroAsian Journal of

BioScences, 4, 28-37.

25. Sagdic, O., Yasar, S., Kisioglu, A.N. (2005): Antibacterial effects of single or

combined plants extracts. Annals of Microbiology, 55 (1), 67-71.

26. Smith-Palmer, A., Stewart, J., Fyfe, L. (1998): Antimicrobial properties of plant

essential oils and essences against five important food-borne pathogens. Letters in

Food Microbiology, 26, 118–122.

27. Stojanović, G., Palić, I., Ursić-Janković, J. (2006): Composition and antimicrobial

activity of the essential oil of Micromeria cristata and Micromeria juliana. Elavour

and Fragrance Journal, 21, 77-79.

28. Šegrt, B., Vukobratović, B. (2012): Biologija za peti razred osnovne škole. Beograd,

22-24.

29. Šilić, A., (1979): Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria

Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej BiH,

Sarajevo. 172-262.

32

30. Tabanca, N., Kirimer, N., Demirci, F., Baser, KH. ( 2001): Composition and

antimicrobial activity of the essential oils of Micromeria cristata subsp. Phygia and

the enantiomeric distribution of borneol. J. Agric Food Chem. 49 (9), 4300- 3.

31. Tucakov, J. , (1990): Lečenje biljem. Rad, Beograd, 24 – 72.

32. Vinterhalter, D., Vinterhalter, B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.

Axial, P.O., Beograd (15-54).

33. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1997): Kultura in- vitro i mikropropagacija biljaka.

Axial, P.O., Beograd, 15-54.

Biografija kandidata

33

Tamara Jovanović rodjena je 18. avgusta 1989. u Surdulici. Osnovnu školu „Vuk

Stefanović Karadžić“ u Surdulici završila je 2008. godine i upisala Gimnaziju „Svetozar

Marković“ u Surdulici. Nakon završetka srednje škole, 2008. godine upisala je osnovne

akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, Departman za

biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završila je 2011. godine, sa zvanjem

biolog, i iste godine je upisala master studije na Departmanu za biologiju i ekologiju

Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, smer Ekologija i zaštita prirode. Master akademske

studije završila je 2014. godine sa zvanjem master ekolog.

Прилог 5/1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТНИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈАРедни број, РБР:Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: МонографскаТип записа, ТЗ: текстуални / графичкиВрста рада, ВР: мастер радАутор, АУ: Тамара Јовановић

Ментор, МН: Татјана Михајилов-Крстев

34

Наслов рада, НР: Поређење антимикробне активности биљних екстраката врсте in vitro и из природе

Језик публикације, ЈП: СрпскиЈезик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. СрбијаУже географско подручје, УГП: Р. СрбијаГодина, ГО: 2014.Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.Физички опис рада, ФО: 18 стр, 1 слика, 2 табелеНаучна област, НО: БиологијаНаучна дисциплина, НД: МикробиологијаПредметна одредница/Кључне речи, ПО: М.cristata, антимикробна активност, микродилуцијаУДК 579.222:581.135+582.929.4

Чува се, ЧУ: БиблиотекаВажна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Biljna vrsta Micromeria cristata je rasprostranjena u istočnim delovima Evrope, u Bugarskoj, u Makedoniji, u Hrvatskoj, u Turskoj, u Palestini i u Iranu. U Srbiji raste u istočnom ijugoistočnom delu zemlje. U ovom radu je vršeno poređenje antimikrobne aktivnosti metanolnih ekstrakata biljaka prikupljenih iz prirode i gajenih u aktivnost je ispitivana uz pomoć mikrodilucione metode protiv šest bakterijskih sojeva, a kao pozitivna kontrola su testirana tri antibiotika: Metanolni ekstrakti biljne vrste M. cristata, su pokazali antimikrobnu aktivnost protiv svih testiranih sojeva mikoroorganizama. Najosetljiviji je bio soj najotporniji je bio soj Pseudomonas aeruginosa. Nije zabeležena značajna razlika između aktivnosti ekstrakata biljaka prikupljenih iz prirode i gajenih u

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије,КО Др Драгана Стојичић

Др Бојан Златковић

Др Татјана Михајилов-Крстев

Образац Q4.09.13 - Издање 1Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТНИШ

KEY WORDS DOCUMENTATIONAccession number, ANO:

35

Identification number, INO:

Document type, DT:

MonographType of record, TR:

textual / graphicContents code, CC:

master thesisAuthor, AU:

Tamara Jovanovi

Mentor, MN:

Tatjana Mihajilov-KrstevTitle, TI:

The comparative analisis of antimicrobial activity of Micromeria cristata extracts grown in vitro

and in nature

Language of text, LT:

SerbianLanguage of abstract, LA:

EnglishCountry of publication, CP:

Republic of SerbiaLocality of publication, LP:

SerbiaPublication year, PY:

2014.Publisher, PB:

author’s reprintPublication place, PP:

Niš, Višegradska 33.Physical description, PD:

18 pages; 1 picture; 2 tablesScientific field, SF:

BioloogyScientific discipline, SD:

MicrobiologySubject/Key words, S/KW:

Micromeria cristata, antimicrobial activity, microdilutionUC

579.222:581.135+582.929.4

Holding data, HD:

LibraryNote, N:

36

Abstract, AB:

Plant species Micromeria cristata is widespread in east parts Europe, in Bulgaria, in Macedonia, in Croatia, in Turkush, in Palestinian and in Iran. In Serbiagrows in eastern and southeastern part of the country. In this study, a comparison was made of antimicrobial activity of methanol extracts of plants collectedfrom the wild and grown in in vitro culture. Antimicrobial activity was tested using the microdilution method against six bacterial strains, as a positive control,were tested by three antibiotics: chloramphenicol, tetracycline and streptomicin.Methanolic extracts of the plant Micromeria cristata, showed antimicrobialactivity all tested strains of microorganisms. Was the most sensitive strain of Staphylococcus enteritidas, but was the most resistant strain of Pseudomonasaeruginosa. There was no significant difference between the activity of extracts of plants collected from the wild and grown in in vitro culture.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB:

President:

Dr Dragana Stojičić

Member:

Dr Bojan Zlatković

Member, Mentor:

Dr Tatjana Mihajilov-KrstevОбразац Q4.09.13 - Издање 1

37