UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET · namirnica od mleka, mesa, povrća i žitarica. Ove bakterije prirodno nastanjuju pomenute namirnice ili se u njih namerno dodaju,

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Milica N. Lazarević

REZISTENCIJA BAKTERIJA MLEČNE KISELINE

IZOLOVANIH IZ KAJMAKA NA ANTIBIOTIKE

-MASTER RAD-

Niš, 2015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

-MASTER RAD-

REZISTENCIJA BAKTERIJA MLEČNE KISELINE

IZOLOVANIH IZ KAJMAKA NA ANTIBIOTIKE

Kandidat: Milica Lazarević 141

Mentor: Dr Nataša Joković

Niš, 2015.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY WITH ECOLOGY

-MASTER THESIS-

ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA

ISOLATED FROM KAJMAK

Candidate: Milica Lazarević 141

Mentor: PhD Nataša Joković

Niš, 2015.

Biografija kandidata

Ime i prezime: Milica Lazarević

Datum rođenja: 18.09.1991.

Mesto rođenja: Niš

Osnovna škola: „Ivan Goran Kovačić” u Niškoj Banji

(1998 - 2006. god.)

Srednja škola:

Gimnazija „Bora Stanković” u Nišu, društveno-jezički

smer

(2006 – 2010. god.)

Fakultet:

Prirodno matematički fakultet u Nišu, departman za

biologiju i ekologiju

(2010 – 2015. god.)

osnovne akademske studije: smer biologija (2010 – 2013. god.)

master akademske studije: smer biologija (2013 – 2015. god.)

Sažetak:

U ovom radu testirano je 49 izolata bakterija mlečne kiseline (BMK), izolovanih iz

kajmaka, za osetljivost na antibiotike, metodama disk difuzije, mikrodilucije i agar dilucije.

Testirani izolati pripdaju vrstama Lactococcus lactis ssp. lactis (4), Enterococcus faecalis (3),

Enterococcus faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (21),

Lactobacillus paracasei (2) i Lactobacillus plantarum (4). Za ispitivanje rezistencije BMK

sojeva na antibiotike disk difuzionom metodom korišćeni su komercijalni diskovi ampicilina,

eritromicina, klindamicina, eritromicina, vankomicina, tetraciklina i hloramfenikola. Za

mikrodilucionu metodu i agar dilucionu metodu korišćeni su rastvori antibiotika u prahu i to

eritromicina, gentamicina, ciprofloksacina i doksiciklina.

Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da su svi testirani izolati, koji

pripadaju vrstama Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp.

mesenteroides, Lb. paracasei i Lb. plantarum osetljivi na ampicilin, eritromicin, tetraciklin,

doksiciklin i hloramfenikol, dok je većina izolata osetljiva na antibiotike gentamicin,

klindamicin, vankomicin i ciprofloksacin. Rezistencija na gentamicin prisutna je kod ukupno

pet izolata, po jednog izolata vrste Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium i Lb. paracasei i kod dva

izolata vrste E. faecalis. Rezistencija na klindamicin takođe je prisutna kod pet izolata i to

jednog Lc. lactis ssp. lactis i E. faecalis izolata i tri E. faecium izolata. Dva izolata vrste Lb.

plantarum bila su rezistentna na vankomicin, dok je rezistencija na ciprofloksacin prisutna

kod jednog izolata vrste L. mesenteroides. Rezultati za rezistentnost na antibiotike veoma

variraju između različitih metoda koje su korišćene u ovom radu.

Ključne reči: bakterije mlečne kiseline, rezistencija, antibiotici

Abstract:

The aim of this study was to evaluate the susceptibility for 49 isolates of lactic acid

bacteria (LAB) isolated from kajmak, belonging to the species Lactococcus lactis ssp. lactis

(4), Enterococcus faecalis (3), Enterococcus faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides (21), Lactobacillus paracasei (2) and Lactobacillus plantarum (4), to seven

antibiotics (ampicillin, erythromycin, clindamycin, erythromycin, vancomycin, tetracycline and

chloramphenicol) with disk diffusion method. Additionally, four antibiotics (erythromycin,

gentamicin, ciprofloxacin and doxycycline) were used for susceptibility testing with

microdilution and agar dilution method.

According to the results, all tested isolates belonging to species Lc. lactis ssp. lactis,

E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei and Lb.

plantarum were susceptible to ampicillin, erythromycin, tetracycline, doxycycline and

chloramphenicol, while most of isolates were susceptible to gentamicin, clindamycin,

vancomycin and ciprofloxacin. Five gentamicin-resistant isolates were detected (one Lc. lactis

ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei and two E. faecalis isolates). Five clindamycin -resistant

isolates were also detected (one Lc. lactis ssp. lactis and E. faecalis and three E. faecium

isolates). Two Lb. plantarum isolates were resistant to vancomycin and one L. mesenteroides

isolate was resistant to ciprofloxacin. The results of susceptibility testing showed variation

between those three methods.

Key words: lactic acid bacteria, resistance, antibiotics

Sadržaj 1. Uvod ............................................................................................................................................................. 1

1.1. Bakterije mlečne kiseline.................................................................................................................. 2

1.1.1. Rod Lactococcus ................................................................................................................ 4

1.1.2. Rod Enterococcus .............................................................................................................. 4

1.1.3. Rod Leuconostoc ............................................................................................................... 5

1.1.4. Rod Lactobacillus ............................................................................................................... 5

1.2. Antibiotici ............................................................................................................................................ 7

1.2.1. Mehanizmi delovanja antibiotika ..................................................................................... 7

1.3. Rezistencija na antibiotike ............................................................................................................... 9

1.3.1. Mehanizmi rezistencije na antibiotike ........................................................................... 10

1.3.2. Mehanizmi horizontalnog transfera gena ..................................................................... 11

1.3.3. Rezistencija na antibiotike bakterija mlečne kiseline.................................................. 12

2. Ciljevi istraživanja ................................................................................................................................. 16

3. Materijal i metode ................................................................................................................................. 17

3.1. Materijal ............................................................................................................................................ 17

3.1.1. Bakterijski sojevi .............................................................................................................. 17

3.1.2. Bakterijske suspenzije ..................................................................................................... 17

3.1.3. Antibiotici .......................................................................................................................... 17

3.2. Metode .............................................................................................................................................. 18

3.2.1. Metoda disk difuzije......................................................................................................... 18

3.2.2. Mikrodiluciona metoda .................................................................................................... 18

3.2.3. Agar diluciona metoda .................................................................................................... 19

4. Rezultati .................................................................................................................................................... 20

4.1. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactococcus.............................................................. 21

4.2. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Enterococcus ........................................................... 23

4.3. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Leuconostoc ............................................................. 27

4.4. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactobacillus ............................................................ 31

4.5. Ukupna rezistencija BMK izolata određena metodom disk difuzije .......................................... 34

4.6. Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama određivanja rezistencije na

antibiotike ......................................................................................................................................... 36

5. Diskusija ................................................................................................................................................... 41

6. Zaključak .................................................................................................................................................. 45

7. Literatura .................................................................................................................................................. 46

Master rad

Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike

1

1. Uvod

Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju taksonomski raznovrsnu grupu

bakterija, koja obuhvata veliki broj rodova i vrsta. Zajednička karakteristika ovih bakterija

jeste sposobnost sinteze mlečne kiseline, kao krajnjeg produkta metabolizma. Značaj BMK

ogleda se u viševekovnoj upotrebi pri tradicionalnoj i industrijskoj proizvodnji fermentisanih

namirnica od mleka, mesa, povrća i žitarica. Ove bakterije prirodno nastanjuju pomenute

namirnice ili se u njih namerno dodaju, u vidu starter kulture. Pored toga, bakterije mlečne

kiseline se mogu naći i na brojnim drugim staništima, poput gastrointestinalnog i

urogenitalnog trakta čoveka i životinja.

Veliki broj BMK ima GRAS status (Generally Recognized As Safe), a mnoge od njih

svrstavaju se u grupu probiotika, zbog pozitivnog efekta na zdravstveno stanje čoveka.

Međutim, tokom poslednjih dekada, javila se zabrinutost da bakterije mlečne kiseline, koje se

u velikom broju unose u gastrointestinalni trakt, predstavljaju rezervoar gena za rezistenciju

na antibiotike. Geni se horizontalnim putem mogu preneti potencijalno pategenim i

patogenim bakterijama. Kada takve bakterije steknu rezistenciju na antibiotike, bolesti koje

one prouzrokuju ne mogu biti uspešno lečene datim antibiotikom. Ovo uzrokuje brojne

probleme, počevši od otežanog i veoma dugog lečenja, preko povećane stope morbiditeta i

mortaliteta, što na kraju ima negativan efekat na društvo, privredu, ekonomiju i td. Zbog

toga je potrebno ispitati rezistenciju na antibiotike onih sojeva koji se, putem hrane, direktno

unose u organizam čoveka.

Master rad


2

1.1. Bakterije mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju heterogenu grupu Gram-pozitivnih koka

i bacila, sa niskim sadržajem GC parova u genomu. Ne sintetišu enzim katalazu i nemaju

elektron- transportni sistem i citohrome, tako da se svrstavaju u grupu mikroaerofilnih i

fakultativno anaerobnih bakterija. BMK ne formiraju spore i nepokretne su. Grupa BMK

obuhvata oko 20 rodova, u okviru razdela Firmicutes. Iz praktičnih razloga, pojedini rodovi se

izdvajaju kao najvažniji predstavnici ove grupe i to su rodovi Aerococcus, Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella (Korhonen, 2010).

Na osnovu krajnjih produkata katabolizma glukoze, mogu se podeliti u dve grupe:

homofermentativne i heterofermentativne BMK (Korhonen, 2010). Kod homofementativnih

BMK, koje glukozu katabolišu glikolitičkim putem i mlečnom fermentacijom, krajni produkti su

dva mola laktata (mlečne kiseline) i ATP molekula. Kod heterofermentativnih BMK glukoza se

razlaže 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim (6-PG/PK) putem, pa su krajnji produkti po jedan

mol laktata, etanola i ATP (Slika 1).

Slika 1. Uopšteni put katalize glukoze kod

A: homofermentativnih BMK i B: heterofermentativnih BMK (Korhonen, 2010)

Master rad


3

BMK su u prirodi široko rasprostranjene i mogu se naći na staništima koja su bogata,

pre svega, ugljenim hidratima i proteinima. BMK imaju veoma složene nutritivne zahteve, pa

pored ugljenih hidrata i proteina, za njihov rast neophodno je i prisustvo brojnih

aminokiselina, derivata nukleinskih kiselina, soli, vitamin (riboflavina, pantotenske i folne

kiseline, biotina i tiamina) (Tannock, 2004). Ovako kompleksni nutritivni zahtevi rezultat su

nedostatka određenih gena, specifičnih regulatornih mehanizama ili kompletnih biosintetskih

puteva. Sa druge strane, BMK se mogu naći u okviru brojnih i veoma različitih ekoloških niša,

zbog velike sposobnosti prilagođavanja (Tannock, 2004). Predstavljaju epifitnu floru biljaka,

sastavni su deo gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta sisara, a prisutne su i u

namirnicama poput mleka, mesa, povrća i žitarica.

Vekovima unazad, širom sveta, BMK se upotrebljavaju za proizvodnju tradicionalnih i

industrijskih fermentisanih namirnica i napitaka. Do fermentacije može doći spontano, usled

prirodnog prisustva BMK, ili nakon namernog dodavanja BMK u namirnice, u vidu starter-

kultura. BMK produkuju antimikrobne supstance i upravo ta njihova osobina čini ih pogodnim

za konzerviranje hrane. Mali organski molekuli, koji su rezultat procesa fermentacije,

pokazuju antimikrobni efekat. Rezultat fermentacije šećera su organske kiseline (mlečna,

sirćetna i propionska kiselina) i one predstavljaju primarne metabolite. Ove kiseline dovode

do snižavanja pH vrednosti sredine. U takvim uslovima može da raste veoma mali broj

bakterija, pa ovo predstavlja primarnu inhibitornu aktivnost BMK. Pored primarnih

metabolita, BMK sintetišu i mnoga neorganska jedinjenja i sekundarne metabolite, koji

takođe imaju antimikrobno dejstvo. Tako, ugljen dioksid (CO2), koji nastaje u metabolizmu

heterofermentativnih BMK, stvara anaerobne uslove i inhibira rast aerobnih

mikroorganizama. Vodonik peroksid (H2O2) se nagomilava usled nedostatka enzima katalaze i

zbog jakog oksidativnog efekta na bakterijske ćelije, dovodi do destrukcije osnovnih ćelijskih

struktura. Diacetil, koji nastaje kao krajnji proizvod metabolizma citrata, pored

karakteristične arome koju daje fermentisanim proizvodima, ima i antimikrobnu aktivnost.

Etanol, koji nastaje kao produkt katabolizma ugljenih hidrata kod heterofermentativnih

bakterija, takođe ima inhibitorni efekat, koji je zasnovan na destrukciji ćelijskih membrane.

Sekundarni metaboliti, bakteriocini, se sintetišu u stacionarnoj fazi rasta i predstavljaju male

peptide i proteine, sa relativno uskim opsegom antimikrobne aktivnosti, koji je ograničen na

srodne sojeve i omogućava soju koji ih proizvodi kompetitivnu prednost. Bakteriocini BMK

podeljeni su u tri klase, a neki od karakterističnih predstavnika su nizin, pediocin i helveticin.

Zbog veoma duge istorije korišćenja, mnoge BMK su stekle GRAS-status, a neke od

njih spadaju i u grupu probiotika, zbog pozitivnog delovanja na zdravlje ljudi i životinja.

Master rad


4

Rodovi Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc i Lactobacillus su najznačajniji u industriji

mlečnih proizvoda.

1.1.1. Rod Lactococcus

Laktokoke su mezofilne homofermentativne BMK, kod kojih je L(+) oblik mlečne

kiseline glavni produkt metabolizma glukoze i mogu se naći u različitim ekološkim nišama,

poput kože životinja, površine biljaka, sirovog mleka, sireva i drugih mlečnih proizvoda.

Predstavljaju deo starter kultura za proizvodnju fermentisanih mlečnih proizvoda. Osnovna

uloga laktokoka je acidifikacija sredine, odnosno sinteza mlečne kiseline i smanjenje pH

početnog supstrata, što obezbeđuje antimikrobne uslove, zatim hidroliza proteina i sinteza

jedinjenja koja utiču na oraganoleptičke karakteristike proizvoda. Ćelije mogu biti

pojedinačne, u paru ili kraćim lancima (ćelije mogu biti izdužene u pravcu prostiranja lanca).

Rod Lactococcus obuhvata pet vrsta: Lactococcus garvieae, Lactococcus piscium,

Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis i Lactococcus lactis.

Vrsta Lactococcus lactis je karakterističan predstavnik ovog roda i predstavlja vrstu

koja je najčešće izolavana iz mleka i mlečnih proizvoda, i to podvrste Lc. lactis ssp. lactis i Lc.

lactis ssp. cremoris, a postoji i treća podvrsta, Lc. lactis ssp. hordniae. U okviru podvrste Lc.

lactis ssp. lactis nalazi se biovarijetet Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, koji ima

sposobnost metabolizma citrata i proizvodnje aromatičnih jedinjenja. Metabolizam citrata je

kodiran genima na plazmidima, pa je ova osobina nestabilna. Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis

ssp. lactis biovar. diacetylactis i Lc. lactis ssp. cremoris ulaze u sastav starter kultura za

proizvodnju mnogih mlečnih proizvoda.

1.1.2. Rod Enterococcus

Enterokoke su termofilne homofermentativne BMK, koje fermentacijom glukoze daju

samo L(+) oblik mlečne kiseline. Ćelije su okrugle, najčešće u parovima (diplokoke) ili kraćim

lancima. Mogu se naći u veoma različitim nišama, zbog toga što imaju sposobnost da prežive

u nepovoljnim uslovima, poput ekstremnih temperatura (5-65 °C), u baznim i u kiselim

sredinama (pH od 4,5 do 10,0), sredinama sa visokom koncentracijom NaCl (Fisher i Phillips,

2009). Izoluju se iz hrane, vode, zemlje, sa biljaka, a Enterococcus faecalis i Enterococcus

faecium predstavljaju normalnu mikrofloru gastrointestinalnog trakta čoveka i drugih sisara.

U okviru roda Enterococcus nalaze se 32 vrste, od kojih su neke oportunistički

patogeni čoveka. Postoje neslaganja o ulozi vrsta E. faecalis i E. faecium, koje su prisutne u

fermentisanim proizvodima. Sa jedne strane, smatra se da njihovo prisustvo doprinosi

Master rad


5

senzornim svojstvima proizvoda, zahvaljujući proteolitičkoj aktivnosti i produkciji jedinjenja

koja utiču na aromu. Sa druge strane, prisustvo ovih vrsta smatra se posledicom loših

higijenskih uslova tokom proizvodnje. Kod pojedinih sojeva enterokoka uočena je rezistencija

na antibiotike, kao i virulentni faktori (uglavnom kod kliničkih izolata), zbog čega upotreba

enterokoka kao komercijalnih startera ili probiotika, mora biti zanovana na detaljno

proučenim sojevima.

1.1.3. Rod Leuconostoc

Predstavnici roda Leuconostoc su heterofermentativne BMK, koje tokom katabolizma

glukoze, pored D(-) oblika mlečne kiseline, produkuju etanol i CO2. To su mezofilne bakterije,

kokoidnog oblika. U prirodi, vrste roda Leuconostoc mogu se naći kao epifitna flora biljaka,

ali i u drugim ekološkim nišama. Imaju značajnu ulogu u različitim procesima fermentacije

hrane, pa se pored mlečnih i biljnih fermentisanih proizvoda, mogu naći i u fermentisanim

mesnim proizvodima (kobasicama) i proizvodima od žitarica. Mogu biti prirodno prisutne u

supstratu ili se dodaju kao pomoćne starter kulture, zbog specifične arome i teksture finalnog

proizvoda, usled sinteze diacetila, acetata i dekstrana (Campedelli i sar., 2015).

Rod Leuconostoc obuhvata 11 vrsta i tri podvrste Leuconostoc mesenteroides- L.

mesenteroides ssp. mesenteroides, L. mesenteroides ssp. cremoris i L. mesenteroides ssp.

dextranicum (Säde, 2011). Ove podvrste su veoma značajne za industriju, kao starter

kulture. L. mesenteroides ssp. mesenteroides se koristi za prizvodnju dekstrana, koji se

upotrebljava za povećanje volumena krvne plazme, kao zamena za terapiju heparinom i u

kozmetici (Bhavani i Nisha, 2010). Vrste roda Leuconostoc mogu izazvati kvarenje

fermentisanih proizvoda (najčešće zamrznutih mesnatih proizvoda), u vidu prisustva

dekstranske sluzi (Säde, 2011).

1.1.4. Rod Lactobacillus

Rod Lactobacillus predstavlja veoma heterogenu grupu Gram-pozitivnih bacila, sa GC

sadržajem koji varira od 33% do 55% (Bernardeau i sar., 2008). Uključuje vrste sa različitim

fenotipskim, fiziološkim i biohemijskim svojstvima. Oblik ćelija varira od skoro kokoidnih

formi, koje često formiraju kratke ili dugačke lance, do veoma izduženih i tankih štapićastih

ćelija. Pripadnici ovog roda se mogu naći na najrazličitijim staništima bogatim ugljenim

hidratima, poput sluzokože čoveka i drugih sisara (u usnoj duplji, gastrointestinalnom i

urogenitalnom traktu), na biljkama i materijalima biljnog porekla, u đubrivu, veštačkim

ekosistemima poput kanalizacije... Pojedini predstavnici mogu biti uzročnici kvarenja voća,

Master rad


6

ribe, mesa i mesnih prerađevina, mleka i fermentisanih napitaka, poput vina i piva. Međutim,

laktobacili se već godinama koriste za proizvodnju fermentisanih proizvoda od povrća, mesa,

a posebno za dobijanje različitih mlečnih proizvoda. Laktobacili su acidotolerantni i acidofilni.

Tokom rasta smanjuju pH supstrata na 4,0, što ima antimikrobni efekat. U supstratu se

nalaze prirodno ili se dodaju kao starter i pomoćne kulture, kako zbog produkcije mlečne

kiseline, tako i zbog njihove proteolitičke i dipeptidazne aktivnosti, ali i zbog sposobnosti

sinteze aromatičnih jedinjenja poput diacetila i acetaldehida. Određeni sojevi laktobacila

imaju izražena probiotska svojstva, poput očuvanja lokalne mikroflore, antimikrobnog dejstva

na patogene organizme i modulacije imunog odgovora. Sa razvojem različitih tehnika, znanja

o ovom rodu rastu, što omogućava sve uspešniju kontrolu produkcije i povećava opseg

primene pri proizvodnji fermentisanih i probiotskih proizvoda (Bernardeau i sar., 2008).

Lactobacillus predstavlja rod sa najvećim brojem vrsta, u okviru grupe BMK, sa čak

215 vrsta i 29 podvrsta (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html oktobar, 2015), koje su

svrstane u tri grupe:

1) obligatni homofementativni laktobacili koji fermentišu samo heksoze do

mlečne kiseline, ne fermentišu pentoze i glukonat (najvažniji predstavnici su Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus i Lactobacillus acidophilus, koji ulaze u

sastav starter kultura za prizvodnju jogurta, sireva i kao probitska vrsta, za proizvodnju

napitaka i probiotskih preparata);

2) fakultativni heterofermentativni laktobacili koji fermentišu heksoze do

mlečne kiseline i pentoze do mlečne ili sirćetne kiseline; produkuju gas pri fermentaciji

glukonata, ali ne i iz glukoze (najznačajniji predstavnici ove grupe su Lactobacillus paracasei,

Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus

i Lactobacillus sakei, koriste se kao starter kulture za različite vrste sireva i kao probiotici u

fermentisanoj hrani ili preparatima, zatim kao starter kulture za kobasice i druge proizvode

od mesa);

3) obligatni heterofermentativni laktobacili koji fermentišu heksoze do

mlečne kiseline, sirćetne kiseline i/ili etanola i CO2 (Lactobacillus sanfranciscensis,

Lactobacillus kefiri i Lactobacillus reuteri su najvažniji predstavnici koji se koriste kao starter

kultura za proizvodnju kiselog testa, za proizvodnju alkoholnog mlečnog napitka kefira i u

proizvodnji komercijalnih probiotika).

http://www.bacterio.net/lactobacillus.html

Master rad


7

1.2. Antibiotici

Antibiotici su organska jedinjenja koja sintetišu bakterije (Escherichia coli, Bacillus

subtilis, Streptomyces griseus, Streptomyces erythreus i td.), plesni (Penicillium

chrysogenum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus clavatus i td.) ili alge (Chlorella

vulgaris) u vidu sekundarnih metabolita. Oni na druge mikroorganizme deluju tako što

inhibiraju rast i razmnožavanje (bakteriostatici) ili uzrokuju njihovu smrt (baktericidi)

(Varagić, 2012). Aleksandar Fleming je 1929. godine utvrdio da metabolitički produkt plesni

Penicillium notatum inhibira rast bakterije Staphylococcus aureus. Nakon njegovog otkrića,

počinje era antibiotika. Do danas je izolovano i opisano nekoliko hiljada antibiotika (Mihajilov-

Krstev, 2008). Hemijskim modifikacijama molekula prirodnih antibiotika, dobijaju se

polusintetski derivati, koji često pokazuju širi spektar antimikrobnog dejstva.

Antibiotici su svrstani u grupe (familije), a kao najbitnije grupe izdvajaju se β-

laktamski, aminoglikozidni antibiotici, glikopeptidi, hloramfenikoli, tetraciklini, streptogramini,

makrolidi, linkozamidi, sulfonamidi i kvinoloni (Korhonen, 2010).

1.2.1. Mehanizmi delovanja antibiotika

Razlikujemo četiri osnovna mehanizma delovanja antibiotika:

1) inhibicija sinteze ćelijskog zida,

2) promena permeabilnosti plazmaleme ili aktivnog transporta kroz membranu,

3) inhibicija sinteze proteina, na nivou transkripcije ili translacije i

4) inhibicija sinteze nukleinskih kiselina.

Inhibicija sinteze ćelijskog zida ili povreda ćelijskog zida uzrokuje smrt ćelije.

Ovim mehanizmom delovanja odlikuju se β-laktamski antibiotici (penicilini, cefalosporini,

monobaktami i karbapemi), glikopeptidi (vankomicin, teikoplanin i avoparicin), bacitracin,

cikloserin i fosfomicini (Mujezinović, 2011). Čak 70% svih antibakterijskih lekova čine β-

laktamski antibiotici, koji sadrže četvoročlani β-laktamski prsten (Petrović, 2007). Molekuli

ovih antibiotika se vezuju za specifične receptore na bakterijskim ćelijama- PBP receptore

(Penicilin Binding Protein). Efekat koji na ćeliju ima antibiotik zavisi od toga za koji se tip PBP

vezao molekul. Ovi receptori kodirani su genima na hromozomu. Nakon vezivanja antibiotika

za receptor, dolazi do inhibiranja reakcije transpeptidacije, zbog čega se zaustavlja sinteza

peptidoglikana koji predstavlja osnovnu komponentu ćelijskog zida. Dalje dolazi do

uklanjanja/inaktivacije jednog od inhibitora autolize, što pokreće proces lize ćelije i rezultira

njenom smrću (Varagić, 2012). Vankomicin i bacitracin inhibiraju rane faze sinteze ćelijskog

Master rad


8

zida unutar ćelije. Cikloserin predstavlja strukturni analog D-alanina i njegovo dejstvo je

zasnovano na kompetitivnoj inhibiciji enzima alanin-racemaze i alanin sintetaze (Mujezinović,

2011). Fosfomicini inhibiraju piruvil–transferazu koja učestvuje u prvoj etapi sinteze ćelijskog

zida.

Promena permeabilnosti plazmaleme ili aktivnog transporta kroz

membranu predstavlja mehanizam kojim deluju polimiksini. Ovi antibiotici menjaju osnovne

funkcije ćelijske membrane, tako što remete njen integritet, pa dolazi do nekontrolisane

razmene jona i makromolekula ćelije sa okolinom ili je razmena u potpunosti zaustavljena.

Ovo izaziva teška oštećenja, ali i smrt ćelije. Deluju na one Gram-negativne bakterije koje u

membrani imaju više fosfatidil-etanolamina (Varagić, 2012).

Inhibicija sinteze proteina, na nivou transkripcije ili translacije je mehanizam

karakterističan za aminoglikozide, tetracikline, hloramfenikol, makrolide (eritromicin,

klaritromicin, telitromicin, azitromicin…) i linkozamide (klindamicin i linkomicin). Inhibicija je

zasnovana na interakciji sa subjedinicama bakterijskih ribozoma, 30S ili 50S. Najbitniji

predstavnici aminoglikozidnih antibiotika su gentamicin, streptomicin, amikacin, tobramicin,

netilmicin i neomicin. Ovi antibiotici se vezuju za specifične receptore na 30S subjedinici i

tako blokiraju aktivnost inicijalnog kompleksa. Informacija sa iRNK se zbog toga pogrešno

prevodi, pa se neodgovarajuća amino kiselina uvodi u peptid. Dolazi do cepanja polizoma na

monozome, usled čega dolazi do smrti ćelije (Varagić, 2012). Tetraciklini (doksiciklin,

hlortetraciklin, oksitetraciklin, minociklin) se takođe vezuju za 30S subjedinicu ribozoma i

tako sprečavaju uvođenje novih amino kiselina u rastući peptidni lanac. Hloramfenikol se

vezuje za 50S subjedinicu, inhibira peptidil-transferazu, što sprečava vezivanje novih amino

kiselina. Makrolidi se vezuju za 50S subjedinicu i ometaju stvaranje inicijalnih kompleksa jer

ometaju reakcije aminoacil translokacije. Linkozamidi su veoma slični makrolidima, kako po

mehanizmu delovanja, tako i po antimikrobnom spektru (Varagić, 2012).

Inhibicija sinteze nukleinskih kiselina karakteristična je za sledeće grupe

antibiotika: hinolone, fluorohinolone, rifampicin, sulfonamide, trimetoprim. Hinoloni

(nalidiksinska i pipemidinska kiselina) i fluorohinoloni (ofloksacin, pefloksacin, norfloksacin i

ciprofloksacin) inhibiraju sintezu nuklinskih kiselina tako što blokiraju DNK-girazu. Rifampicin

se vezuje za DNK zavisnu RNK polimerazu i inhibira sintezu ribonukleinske kiseline.

Sulfonamidi i trimetoprim indirektno inhibiraju sintezu nukleinskih kiselina, preko inhibicije

metabolizma folne kiseline. Sulfonamidi (sulfafurazol, sulfaguanidin, sulfazosulfapiridin) su

strukturni analozi para-amino-benzoeve kiseline (PABA), koju mikroorganizmi koriste u sintezi

Master rad


9

folne kiseline. Kada se molekul sulfonamida veže za pteridin, umesto PABA, inhibira se

funkcija enzima dihidropteroat-sintetaze i stvaraju se nefunkcionalni analozi folne kiseline

(Varagić, 2012). Trimetoprim inhibira sintezu purina i DNK preko inhibicije enzima

dihidrofolat-reduktaze.

1.3. Rezistencija na antibiotike

Bakterije mogu biti osetljive na prisustvo antibiotika ili otporne (rezistentne).

Rezistencija bakterija može biti prirodna (konstitutivna) ili stečena (indukovana).

Konstitutivna rezistencija predstavlja taksonomsku karakteristiku određene vrste i ona se

javlja kod svih predstavnika, bez obzira da li su bakterije bile u kontaktu sa antibiotikom na

koji su rezistentne. Indikuvana rezistencija se uočava tek nakon kontakta sa

antibiotikom, odnosno predstavlja adaptaciju na novonastale, nepovoljne uslove spoljašnje

sredine. Ako u heterogenoj kulturi, inače osetljive vrste, određeni broj jedinki pokazuje

rezistenciju na prisutni antibiotik, u pitanju je indukovana rezistencija. Usled prisustva

antibiotika, osetljive jedinke će biti ubijene ili će se zaustaviti njihov rast, dok će rezistentne

jedinke nastaviti da se dele i postati dominantne.

Indukovana rezistencija može imati fenotipsku ili genetičku osnovu. Kod fenotipske

rezistencije, prisustvo antibiotika izaziva promenu metaboličkih i strukturnih svojstava, u

okviru datog genotipa. Na primer, neke bakterije mogu da pređu u L-oblik (protoplast),

odnosno da izgube ćelijski zid, i tako postaju otporne na delovanje antibiotika poput

penicilina (Varagić, 2012). Genotipska rezistencija je rezultat promena genetičkog

materijala, usled mutacija ili rekombinacija. Mutacije mogu biti spontane ili indukovane

prisustvom antibiotika. U prirodnim populacijama, usled spontanih mutacija, na svakih 105

deoba, nađe se jedna antibiotik-rezistentna jedinaka (Mihajilov-Krstev, 2008). Rekombinacije

se kod bakterija dešavaju na tri načina: konjugacijom, transdukcijom i transformacijom, koje

su opisane u poglavlju Mehanizmi horizontalnog transfera gena.

Geni za rezistenciju na antibiotike se nalaze na bakterijskom hromozomu

(hromozomska rezistencija) ili na plazmidima i transpozonima (ekstrahromozomska

rezistencija). Plazmidi predstavljaju ekstrahromozomalnu, cirkularnu DNK bakterija, koja se

replikuje nezavisno od hromozomske DNK. Broj plazmida u jednoj ćeliji varira i može ih biti

od jednog do nekoliko hiljada. Plazmidi koji nose gene za rezistenciju na jedan ili više

antibiotika nazivaju se R-faktori (resistance factors). Transpozoni su kratke DNK sekvence

koje nose do nekoliko gena i koje imaju sposobnost promene mesta u genomu, zahvaljujući

Master rad


10

„lepljivim krajevima“. Transpozoni se mogu ugraditi u plazmide ali i u hromozomsku DNK i

često nose gene za rezistenciju na antibiotike.

1.3.1. Mehanizmi rezistencije na antibiotike

Postoji nekoliko mehanizama rezistencije na antibiotike, pre svega, odsustvo

bakterijskih struktura na koje deluju antibiotici, a zatim i:

1) enzimska destrukcija ili inaktivacija antibiotika,

2) promena permeabilnosti,

3) promena u strukturi mesta vezivanja antibiotika,

4) promena metaboličkih puteva i

5) razvoj alternativnog enzima (Varagić, 2012).

Enzimska destrukcija ili inaktivacija antibiotika. Neke bakterije se odlikuju

sposobnošću da sintetišu jedan ili više enzima, koji vrše razaranje ili inaktivaciju molekula

antibiotika. Najčešće bakterije produkuju enzime β-laktamaze, koje otvaraju β-laktamski

prsten antibiotika. Postoji oko 60 različitih β-laktamaza i većina je kodirana genima na

plazmidima. Neke Gram negativne bakterije produkuju više različitih enzima koji vrše

adenilaciju, fosforilaciji ili acetilaciju molekula aminoglikozida, dok neke produkuju

hloramfenikol-acetiltransferazu, koja razara molekul hloramfenikola (Varagić, 2012).

Promena permeabilnosti ćelijskih omotača, dovodi do smanjenog ili potpuno

zaustavljenog ulaska molekula antibiotika u bakterijske ćelije. Ovo je mehanizam rezistencije

na one antibiotike koji se akumuliraju unutar ćelije, poput tetraciklina, polimiksina,

fluorohinolonima i penicilinima, posebno kod Gram-negativnih bakterija.

Promena u strukturi mesta vezivanja antibiotika odnosi se na receptore i

specifične proteine na subjedinicama ribozoma za koje se vezuju antibiotici. Usled ovih

promena afinitet molekula antibiotika za dato mesto je značajno smanjen, a samim tim i

delovanje antibiotika. Može doći i do gubitka određenih struktura, poput gubitka PBP, za koje

se vezuju penicilini i cefalosporini. Promenama na subjedinicama ribozoma, bakterija postaje

rezistentna na antibiotike iz grupe tetraciklina, aminoglikozida i makrolida (Varagić, 2012).

Promena metaboličkih puteva se odnosi na sposobnost bakterija da razviju

alternativni metabolički put i na taj način zaobiđu delovanje antibiotika. Ovakva rezistencija

sreće se prema sulfonamidima, jer bakterije prestaju da koriste PABA i da sintetišu folnu

kiselinu, već je usvajaju iz spoljašnje sredine.

Master rad


11

Razvoj alternativnog enzima koji obavlja istu funkciju kao i primarni enzim, pri

čemu molekuli antibiotika imaju manji afinitet ka tom alternativnom enzimu, što sprečava

delovanje datog antibiotika. Određene bakterije pokazuju rezistenciju prema hinolonima i

fluorohinolonima, koji se vezuju za DNK girazu, tako što dolazi do izmene domena proteina

za koju se oni inače vezuju. Takođe, ovaj mehanizam prisutan je i kod bakterija rezistentnih

na sulfonamide i trimetoprim jer dolazi do smanjenja afiniteta između dihidropteorat-

sintetaze, odnosno dihidrofolat-reduktaze, i molekula antibiotika.

1.3.2. Mehanizmi horizontalnog transfera gena

Genetske rekombinacije se kod bakterija dešavaju kada nasledni materijal jedinke,

označene kao donor, pređe u drugu jedinku, označenu kao recipijent. Na osnovu načina

transfera, razlikujemo tri mehanizma, odnosno tri tipa rekombinacija i to su konjugacija,

transformacija i transdukcija. Transfer gena se može odvijati u različitim sredinama, poput

vode, zemljišta, digestivnog trakta ljudi i životinja, pa i u hrani. Učestalost i intenzitet

transfera zavisi od prisustva mobilnih genetskih struktura (plazmida, transpozona),

karakteristika ćelija donora i recipijenta, kao i od sredine u kojoj se transfer odigrava.

Konjugacija se vrši direktnim kontaktom između dve žive bakterije, preko

proteinskih nastavaka, konjugativnih pila, čije je formiranje determinisano genima na F

faktoru (Fertility factor), koji može biti slobodan, u vidu plazmida, ili može se ugraditi u

glavni hromozom (Najman, 2002). S obzirom da se veliki broj gena za rezistenciju nalazi na

mobilnim genskim elementima, konjugacija se smatra najvažnijim mehaizmom horizontalnog

transfera gena. Međutim, postoje određena ograničenja. Prvo, sredina u kojoj se nalaze

bakterije mora da dozvoli kontakt između ćelija. Zatim, bakterije moraju da poseduju

određenu mobilnost, bila ona karakteristika date vrste ili rezultat spoljašnjih faktora. Dalje,

ukoliko dođe do transfera nekih ključnih gena, koji se mogu nalaziti na plazmidima, ćelija

donor može umreti. Takođe, da bi se transpozonski elementi, nakon konjugacije, mogli

integrisati u bakterijski hromozom, ćelija recipijent mora da poseduje dovoljno veliki

kapacitet za njihovu ugradnju (Verraes i sar., 2013). Pored ovog uobičajenog načina

konjugacije, kod nekih Gram-pozitivnih bakterija postoje i alternativni načini da se obezbedi

kontakt između ćelija. Na primer, kod enterokoka može doći do transfera plazmida koji je

indukovan prisustvom feromona (Clewell, 1993).

Transformacija je proces tokom kojeg fragmenti gole DNK, iz spoljašnje sredine,

bivaju usvojeni od strane bakterijske ćelije. Ovaj proces podrazumeva nekoliko koraka. Prvo,

DNK fragment mora da dospe u spoljašnju sredinu, bilo usled smrti i lize bakterisjke ćelije ili

Master rad


12

aktivnim izbacivanjem, što se dešava kod nekih bakterija, u određenom trenutku tokom

životnog ciklusa. Zatim se mali, dvolančani fragment nukleinske kiseline mora vezati za

receptore kompetentne bakterije, nakon čega se aktivnim transportom unosi u ćeliju. Tokom

transporta dolazi do hidrolize jednog lanca, pa u ćeliju dospeva jednolančani DNK fragment.

Ovaj fragment se nakon toga pripaja uz homologi deo bakterijskog hromozoma, formirajući

heterodupleks. Ovo hibridno stanje se može promeniti u normalno mehanizmima reparacije.

U slučaju da se to ne desi, deoba rezultira različitim bakterijskim ćelijama, jedna sa

nerekombinovanim a druga sa rekombinovanim hromozom (Najman, 2002). Da bi došlo do

uspešne transformacije, različiti uslovi moraju biti ispunjeni. Na primer, u digestivnom traktu

čoveka i životinja, slobodna DNK je izložena delovanju različiti enzima i želudačne kiseline.

Ako slobodna DNK i u takvim uslovima ostane neoštećena i ako se unese u bakterijsku ćeliju,

mora da postoji homologi region na hromozomu domaćina. Upravo je odsustvo homologih

sekvenci ili replikacionog početka, najveća prepreka za uspešnost transformacije (Verraes i

sar., 2013).

Transdukcija je proces rekombinacije posredovan bakteriofagama kao vektorima.

Razlikujemo dva tipa transdukcije, generalizovanu i specijalizovanu. Generalizovana

transdukcija je proces kojim se bilo koji segment bakterijskog hromozoma može preneti.

Vektori su bakteriofagi koji ulaze u litički ciklus, čiji se genom ne ugrađuje u genom

domaćina, već formira samoreplikujuće elemente, i koji tokom pakovanja genetskog

materijala u kapsid, greškom upakuju i fragment DNK domaćina. Takav bakteriofag dospeva

do sledećeg domaćina, nakon čega dolazi do rekombinacije između homologih sekvenci.

Kako kapsid faga može da primi samo određenu količinu DNK, to znači da nedostaje neki deo

genoma faga. Zbog toga, najčešće, ovakvi fagi ne izazivaju smrt bakterijske ćelije.

Specijalizovana transdukcija je posredovana lizogenim bakteriofagama, koji se ugrađuju u

hromozom domaćina i to uvek na isto mesto. Zbog toga se, kada se greškom povuče DNK

bakterijskog domaćina, uvek povuku isti geni, pa se zbog toga ovaj tip označava kao

specijalizovana transdukcija (Najman, 2002). Kako se bakteriofagi vezuju za tačno određene

receptore na bakterijskim ćelijama, transdukcija se generalno dešava između blisko srodnih

sojeva i vrsta (Verraes i sar., 2013).

1.3.3. Rezistencija na antibiotike bakterija mlečne kiseline

BMK se u velikom broju unose u gastrointestinalni trakt jer se nalaze u brojnim

namirnicama, pre svega u fermentisanim proizvodima od svežeg mleka i mesa i predstavljaju

rezultat prirodnog procesa proizvodnje (Bulajić i sar., 2008). Komensalne bakterije, kakve su

Master rad


13

BMK, mogu biti rezervoar gena za rezistenciju i veoma su bitne za razumevanje načina

održavanja i širenja ovih gena. Pri tome, važno je razlikovati urođenu od stečene rezistencije.

Kako se urođena rezistencija prenosi vertikalno, deobom, i ne može se preneti horizontalnim

putem, ovakva rezistencija ne može biti preneta na patogene bakterije i ne predstavlja

pretnju. Nasuprot tome, stečena rezistencija se može preneti horizontalno. Dokazano je da

se transfer gena intenzivno odvija in vivo u gastrointestinalnom traktu, između komensalnih i

patogenih bakterija. Identični geni izolovani su iz različitih bakterijskih vrsta koje potiču iz

različitih domaćina i sredina (Mathur i Singh, 2005). Konjugativna razmena gena za

rezistenciju veoma je česta kod enterokoka, koje su dobri recipijenti i donori konjugativnih

plazmida i transpozona, i dešava se u okviru roda, ali i sa drugim Gram-pozitivnim

(laktokokama, Bacillus subtilis, predstavnicima rodova Staphylococcus i Listeria), ali i sa

nekim Gram-negativnim bakterijama (Mathur i Singh, 2005). Kod ostalih BMK ova pojava nije

toliko česta. Iako su geni za rezistenciju nastali mnogo pre početka upotrebe antibiotika,

najverovatnije sa ciljem da se bakterije koje produkuju takva antimikrobna jedinjenja zaštite,

istraživanjima je utvrđeno da rezistencija ipak nije bila toliko rasprostranjena kao danas

(Cherkashin i sar., 2013). Kako stoji u revijalnom radu objavljenom od strane Mathura-a i

Sinhg-a (2008), ne postoje granice između patogenih (streptokoka), potencijalno patogenih

(enterokoka) i komensalnih BMK, u odnosu na sposobnost preuzimanja i sticanja

determinanti rezistencije na antimikrobne lekove. Oni dalje navode da postojeći podaci da su

identični geni za rezistenciju na tetraciklin (tet (M)), eritromicin (ermAM), hloramfenikol

(cat), streptomicin (str), streptogramin (sat) pronađeni u sve tri grupe BMK. Ovo podržava

pretpostavku da BMK, kao i sve ostale bakterije, u ekosistemima opterećinim antibioticima

(kakav je i gastrointestinalni trakt ljudi i životinja), učestvuju u komunikaciji i razmenjuju

gene za rezistenciju, kako između vrsta, tako i između rodova.

Iako najveći broj podataka postoji za BMK koje su potencijalni patogeni, sve više

istraživača bavi se problemom pojave i mogućnosti širenja rezistencije i kod ostalih

predstavnika BMK. Neophodno je da se starter i probiotski sojevi BMK ispituju na sposobnost

prenosive rezistencije na antimikrobne lekove, pored potrebe da se kompletno fiziološki i

tehnološki okarakterišu (Bulajić i sar., 2008). U velikom broju slučajeva, kod bakterija roda

Enterococcus uočeni su geni za rezistenciju na vankomicin, mada je registrovano i prisustvo

gena za rezistenciju na tetraciklin, eritromicin, gentamicin i hloramfenikol (Mathur i Singh,

2005). Kod nekih vrsta iz rodova Enterococcus, Lactococcus i Lactobacillus, izolovanih iz

mlečnih proizvoda, detektovano je prisustvo plazmida koji nose rezistenciju na više

antibiotika (multirezistencija). Među vrstama iz roda Lactobacillus uočena je visoka učestalost

Master rad


14

rezistencije na tetraciklin i eritromicin (Mathur i Singh, 2005). Istraživanje sprovedeno od

strane Bulajić i Mijačević (2011), vršeno je sa ciljem da se detektuju BMK rezistetentne na

antibiotike, i to iz rodova Lactococcus, Lactobacillus i Enterococcus, izolovanih iz različitih

linija proizvodnje autohtonog somborskog sira, tradicionalno proizvedenog bez dodatka

starter kulture. Rezultati su pokazali prisustvo rezistentnih bakterija, koje su bile u manjini u

odnosu na osetljive.

Što se tiče roda Enterococcus, najveća pažnja posvećena je vrstama E. faecalis i E.

faecium i to kliničkim izolatima i izolatima poreklom iz ljudskog gastrointestinalnog trakta koji

se odlikuju neobično visokom stopom urođene tolerancije na niske koncentracije nekoliko

grupa antibiotika, poput aminoglikozida, treću generaciju cefalosporina i hinolona (Serror i

Ogieri, 2008). Kod ovakvih izolata uočena je i stečena rezistencija na brojne antibiotike, a

posebno na glikopeptide, poput vankomicina, kao i na sinergističko delovanje β-laktama i

aminoglikozida (Serror i Ogieri, 2008). Što se tiče enterokoka izolovanih iz hrane, takođe je

uočeno povećanje rezistencije na različite antibiotike, uključujući vankomicin, gentamicin i

streptogramine (Huys i sar., 2004). Enterokoke se odlikuju urođenom rezistencijom na

cefalosporine i na male koncentracije aminoglikozida i klindamicina (Mathur i Singh, 2005).

Veliki broj istraživanja govori i o čestoj pojavi stečene rezistencije na tetraciklin, kao i da je

rezistencija kod izolata enterokoka iz evropskih sireva, kodirana skoro istim tet genima (

tet(M), tet(L), tet(S)), koji su prethodno identifikovani kod kliničkih i veterinarskih izolata

(Huys i sar., 2004). Iako je sve češća pojava detekcije rezistentnih enterokoka izolovanih iz

hrane, mali je broj onih koje su rezistentne na klinički važne antibiotike, poput ampicilina,

penicila, gentamicina i vankomicina (Ogier i Serror, 2008).

Rod Lactococcus, odnosno vrsta Lc. lactis pokazuje osetljivost na amikacin, ampicilin,

prvu generaciju cefalosporina, hloramfenikol, eritromicin, gentamicin, penicilin, tetraciklin i

vankomicin, nešto manja osetljivost uočena je prema karbenicilinu, ciprofloksacinu,

dikloksacilinu i norfloksacinu, dok je ova vrsta urođeno rezistentna na kolistin, fosfomicin,

pipemidinsku kiselinu i rifamicin (Mathur i Singh, 2005). Većina laktokoka odlikuje se

urođenom rezistencijom i prema metronidazolu, trimetoprimu, cefoksitinu i aminoglikozidima,

gentamicinu i kanamicinu (Devirgiliis i sar., 2013).

Neki laktobacili se odlikuju visokom urođenom rezistencijom na bacitracin, cefoksitin,

ciprofloksacin, kanamicin, streptomicin, trimetoprim, vankomicin i dr. (Mathur i Singh, 2005).

S obzirom na heterogenost ovog roda, logično je da postoje značajne razlike, čak i u okviru

jedne vrste. Generalno, iako je stečena rezistencija uočena u okviru roda, i to rezistencija na

Master rad


15

tetraciklin (tet(M) geni) i eritromici (erm(B) geni), većina laktobacila izolavana iz

fermentisanih proizvoda, osetljiva je na ove antibiotike (Devirgiliis i sar., 2013).

Predstavnici roda Leuconostoc pokazuju visok stepen urođene rezistencije na

vankomicin (Ogier i sar., 2008). Campedelli i saradnici (2015), su sekvencirali genom tri

podvrste L. mesenteroides, izolovane iz italijanskih mekih sireva. Njihove preliminarne analize

pokazale su prisustvo erm(B) i tet(S) gena, koji kodiraju rezistenciju na eritromicin i

tetraciklin i sugerisali da su neophodna dalja istraživanja ove atipične rezistencije, da bi se

moglo govoriti o njenom poreklu.

Kako je ranije napomenuto, neophodno je razlikovati urođenu od stečene rezistencije.

Zbog toga se prvo primenjuju fenotipske metode za određivanje ostljivosti/rezistencije, poput

disk-difuzije, E- testa, mikrodilucione i agar dilucione metode. Kada neki od proučavanih

sojeva pokaže rezistenciju na određeni antibiotik, pristupa se daljoj analizi genotipskim

metodama (lančana reakcija polimerizacije (PCR), southern-blot hibridizacija, DNK mikročip

hibridizacija i td.) (Korhonen, 2010).

Kada su fenotipske metode u pitanju, postoje brojni činioci koji utiču na konačne

rezultate. U istraživanju sprovedenom od strane Huys-a i saradnika (2002), navodi se da na

rezultate utiče sastav hranljive podloge, poput varijacija u sadržaju katjona ili koncentracije

sastojaka kao što su tiamin i folna kiselina. Veličina inokuluma, temperatura i period

inkubacije, takođe, mogu uticati na dobijene rezultate za rezistenciju na antibiotike.

Određene komponente hranljivih podloga mogu uticati na aktivnost antibiotika, na primer,

MRS podloga može inhibirati pojedine antibiotike, poput imipenema (Bulajić i sar., 2008).

Takođe, pojedini testovi nisu pouzdani za određivanje niskih nivoa rezistencije, poput disk

difuzionog testa za određivanje niskog nivoa rezistencije na vankomicin kod enterokoka

(Swenson i sar., 1992). Ako se u obzir uzme i činjenica da rezultati dobijeni različitim

metodama ne mogu biti upoređivani međusobno i da zbog velike heterogenosti BMK u okviru

rodova, pa čak i vrsta, ne postoje tačno definisane granične vrednosti za većinu antibiotika,

neophodno je da se u budućnosti utvrde kriterijumi i postave tačno određene vrednosti

minimalnih inhibitornih koncentracija, čime će se sprečiti dalje usložnjavanje ovog problema i

uniformisati interpretacija dobijenih rezultata.

Master rad


16

2. Ciljevi istraživanja

Imajući u vidu značaj BMK u proizvodnji fermentisanih proizvoda, dokaze o

postojanju horizontalnog transfera gena između bakterija i sve učestalije pojave rezistencije

na antibiotike, ciljevi ovog rada su:

1) Ispitivanje rezistencije BMK, izolovanih iz kajmaka, na različite vrste antibiotika;

2) Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) antibiotika za različite vrste

BMK;

3) Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama određivanja rezistencije na

antibiotike.

Master rad


17

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

3.1.1. Bakterijski sojevi

U ovom radu korišćeni su sojevi BMK izolovani iz kajmaka (49), koji su identifikovani

do nivoa vrste Lactococcus lactis ssp. lactis (4), Enterococcus faecalis (3), Enterococcus

faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (21), Lactobacillus paracasei

(2) i Lactobacillus plantarum (4) (Joković, 2010). Sojevi su aktivirani iz stokova čuvanih na -

20°C dvostrukim presejavanjem na odgovarajuću hranljivu podlogu.

Sojevi koji pripadaju laktokokama i enterokokama, gajeni su na čvrstoj M17 hranljivoj

podlozi (Merck, Nemačka), sa dodatkom 5% glukoze. Sojevi leukonostoka i laktobacila gajeni

su na čvrstoj MRS hranljivoj podlozi (Torlak, Srbija). Kao radne kulture datih bakterijskih

sojeva, za ispitivanje rezistencije na antibiotike upotrebljavane su prekonoćne kulture,

zasejane na odgovarajuće podloge. Sve Petri ploče inkubirane su na 30°C.

3.1.2. Bakterijske suspenzije

Suspenzije ćelija, gustine 0,5 McF, pravljene su u fiziološkom rastvoru (0,85% NaCl),

od prekonoćnih kultura izolata. Gustina suspenzije merena je dezintometrom (D-1, Biosan).

3.1.3. Antibiotici

Za ispitivanje rezistencije BMK sojeva na antibiotike disk difuzionom metodom

korišćeni su komercijalni diskovi proizvođača Bioanalyse (Turska). Količine antibiotika na

diskovima bile su sledeće: ampicilin 10 μg, gentamicin 10 μg, klindamicin 2 μg, eritromicin 15

μg, vankomicin 30 μg, tetraciklin 30 μg i hloramfenikol 30 μg.

Za mikrodilucionu metodu i agar dilucionu metodu korišćeni su antibiotici u prahu

proizvođača Sigma-Aldrich (SAD). Početni rastvori antibiotika bili su u koncentracijama 200

μg/ml eritromicina, 400 μg/ml gentamicina, 400 μg/ml ciprofloksacina i 400 μg/ml

doksiciklina.

Master rad


18

3.2. Metode

3.2.1. Metoda disk difuzije

Hranljive podloge (M17 i MRS) razlivene su u Petri ploče, koje su nakon provere

sterilnosti (24h, na temperaturi od 37°C) zasejavane čistim ćelijskim suspenzijama gustine

0,5 McF, sterilnim pamučnim štapićem. Nakon zasejavanja, ploče su ostavljene dvadesetak

minuta na sobnoj temperaturi, a zatim su antibiogram diskovi postavljani sterilnom pincetom

na površinu zasejanih hranljivih podloga. Petri ploče su inkubirane 24 časa, na 30°C, nakon

čega su lenjirom očitavane zone inhibicije. S obzirom da se koncentracija antibiotika

smanjuje sa udaljavanjem od ivica antibiogram diska, to znači da će bakterije koje su

osetljive (S) i na male koncentracije antibiotika imati veću zonu inhibicije. Kod bakterija koje

su rezistentne (R) na dati antibiotik nema zone inhibicije.

3.2.2. Mikrodiluciona metoda

Mikrodilucionom metodom određuju se minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)

antibiotika. MIK predstavlja onu koncentraciju antibiotika koja zaustavlja vidljiv rast

mikroorganizma nakon prekonoćne inkubacije (za anaerobne mikroorganizme neophodna je

duža inkubacija) (Andrews, 2001).

U ovom radu korišćene su mikrotitar ploče sa 96 bunarčića (8 redova i 12 kolona). U

prvu kolonu naliveno je 180 μl M17 ili MRS bujona i 20 μl antibiotika (početnog rastvora),

dok je u preostale kolone naliveno po 100 μl bujona. Nakon toga su pravljena razređenja

antibiotika, prebacivanjem po 100 μl iz prve u drugu kolonu, zatim iz druge u treću, sve do

poslednje kolone, iz koje je nakon prebacivanja iz jedanaeste kolone, izbačeno 100 μl

rastvora. Tako su u bunarčićima dobijene opadajuće koncentracije antibiotika koje su

predstavljene u Tabeli 1.

Tabela 1. Opadajuće koncentracije antibiotika u mikrotitar ploči

Antibiotik 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Eritromicin 20

μg/ml

10

μg/ml

5

μg/ml

2,5

μg/ml

1,25

μg/ml

0,625

μg/ml

0,313

μg/ml

0,156

μg/ml

0,078

μg/ml

0,039

μg/ml

0,0195

μg/ml

0,0098

μg/ml

Gentamicin Doksiciklin

Ciprofloksacin

40

μg/ml

20

μg/ml

10

μg/ml

5

μg/ml

2,5

μg/ml

1,25

μg/ml

0,625

μg/ml

0,313

μg/ml

0,156

μg/ml

0,078

μg/ml

0,039

μg/ml

0,0195

μg/ml

Master rad


19

Ovako pripremljeni bunarčići inokulirani su sa po 2 μl čiste bakterijske suspenzije (0,5

McF). Mikrotitar ploče su inkubirane 48h, na 30°C, nakon čega su MIK vrednosti očitavane su

golim okom, na prirodnom svetlu. Vrednost MIK antibiotika predstavlja koncentracija

antibiotika na kojoj nema vidljivog rasta bakterija.

3.2.3. Agar diluciona metoda

Ova metoda zasnovana je na zasejavanju bakterijskih sojeva na čvrste podloge sa

različitim koncentracijama antibiotika. Nakon pripreme M17 i MRS čvrste hranljive podloge,

po 9 ml vruće podloge prebačeno je u epruvete i sterilisano u autoklavu. Nakon delimičnog

hlađenja hranljivih podloga, u epruvete je dodat 1 ml antibiotika, koncentracije 10 puta veće

od željene, nakon čega je epruveta dugo vorteksovana, a onda razlivena u Petri ploču.

Nakon hlađenja podloge, po 20 μl čiste ćelijske suspenzije (0,5 McF), tehnikom kapljice,

naneto je na podlogu. Podloge su inkubirane 48h, na 30°C, nakon čega su brojane kolonije.

Konačne koncentracije antibiotika u podlogama prikazane su u Tabeli 2.

Tabela 2. Koncentracije antibiotika u čvrstim hranljivim podlogama

Antibiotik Koncentracija (μg/ml)

Eritromicin 1,25 0,02 0,01

Gentamicin 40 0,31 0,16

Doksiciklin 1,25 0,04 0,02

Ciprofloksacin 40 0,31 0,16

Master rad


20

4. Rezultati

Antibiotici se duže od pola veka upotrebljavaju za lečenje bakterijskih infekcija.

Međutim, zbog nepravilne upotrebe antibiotika u lečenju infekcija, bakterije su postale

rezistentne na delovanje mnogih antibiotika. Rezistencija je kod bakterija prirodna pojava i

kada predstavlja karakteristiku vrste, odnosno kada je urođena, ne postoji opasnost da će se

horizontalnim putem preneti na druge vrste bakterija. Do horizontalnog transfera gena za

rezistenciju na antibiotike dolazi u sredinama opterećenim antibioticama, u kojima, zbog

selektivnog pritiska, osetljive bakterije umiru ili je njihov rast zaustavljen, a rezistentne

bakterije postaju dominantne.

Kako se lanac ishrane smatra jednim od glavnih puteva širenja rezistencije na

antibiotike (Ammor i sar., 2008), u ovom radu je fenotipskim metodama proučavana

osetljivost na antibiotike BMK izolovanih iz kajmaka. BMK mogu predstavljati rezervoar gena

za rezistenciju jer stupaju u interakcije sa potencijalno patogenim i patogenim bakterijama u

fermentisanoj hrani i gastrointestinalnom traktu.

Za ispitivanje osetljivosti metodom disk difuzije korišćeni su antibiotici koji

inhibiraju sintezu ćelijskog zida i proteina. Kao inhibitori sinteze ćelijskog zida korišćeni su

ampicilin (β-laktamski antibiotik), koji se vezuje za PBP i inhibira reakciju transpeptidacije i

sintezu peptidoglikana i vankomicin (glikopeptid), koji inhibira ranu fazu sinteze ćelijskog

zida. Gentamicin (aminoglikozid) koji se vezuje za specifične receptore na 30S subjedinici,

blokira aktivnost inicijalnog kompleksa i dovodi do pogrešnog prevođenja genetskog koda sa

iRNK, dok tetraciklin (tetraciklini) sprečava uvođenje novih amino kiselina u rastući

polipeptidni lanac, vezujući se za 30S subjedinicu ribozoma. Klindamicin (linkozamid) koji se,

kao i eritromicin (makrolid), vezuje za 50S subjedinicu, ometa reakciju amino-acil

translokacije i hloramfenikol, koji inhibira peptidil-transferazu u 50S subjedinici, korišćeni su

kao inhibitori sinteze proteina.

Za ispitivanje osetljivosti metodama mikrodilucije i agar dilucije upotrebljeni su

eritromicin (makrolid), gentamicin (aminoglikozid) i doksiciklin (tetraciklini) koji ima isti

mehanizam delovanja kao i tetraciklin, kao inhibitori sinteze proteina, kao i ciprofloksacin

(fluorohinolon), koji inhibira sintezu nukleinskih kiselina tako što blokira DNK-girazu.

Master rad


21

4.1. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactococcus

Rod Lactococcus obuhvata pet vrsta, pri čemu se vrsta Lc. lactis najčešće izoluje iz

fermentisanih mlečnih proizvoda. U ovom radu, osetljivost na antibiotike ispitivana je za četiri

izolata vrste Lc. lactis ssp. lactis metodom disk difuzije, dva izolata metodom mikrodilucije i

jednog izolata metodom agar dilucije.

Metodom disk difuzije merene su zone inhibicije oko diskova sa različitim

antibioticima. Na osnovu izmerenih zona inhibicije (Tabela 3), određene su srednje vrednosti

zona inhibicije i standardne devijacije (SD), prikazane na Slici 2.

Slika 2. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast Lc. lactis ssp. lactis

izolata ± standardna devijacija

Na osnovu prikazanih rezultata, može se zaključiti da su testirani izolati osetljivi na

sve upotrebljene antibiotike, sa izuzetkom izolata MK2-9a, koji je pokazao rezistenciju na

gentamicin i klindamicin (Tabela 3). Laktokoke su pokazale najveću osetljivost na tetraciklin,

sa srednjom vrednošću zone inhibicije od 37,5 mm i relativno malom standardnom

devijacijom od 1,91 mm (Slika 2). Visok stepen osetljivosti laktokoke su imale na

hloramfenikol (33,5 mm), ampicilin (30,75 mm), klindamicin (29 mm) i eritromicin (28 mm),

dok je srednja vrednost zone inhibicije oko diskova sa vankomicinom bila nešto manja (23,5

mm). Svi izolati iz grupe MK1 (MK1-8a, MK1-9a i MK1-12a), osetljivi su na gentamicin, koji je

30,75

17,33

29,00 28,00 23,50

37,50 33,50

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

Ampicilin 10μg

Gentamicin 10μg

Klindamicin 2μg

Eritromicin 15μg

Vankomicin 30μg

Tetraciklin 30μg

Hloramfenikol 30μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

Master rad


22

na diskovima bio u količini od 10 μg (Tabela 3). Zone inhibicije oko diskova sa gentamicinom

bile su relativno male (17,33 mm), u odnosu na zone inhibicije ampicilina (30,75 mm), čija je

koncentracija jednaka koncentraciji gentamicina (Slika 2). Vrednosti standardnih devijacija za

eritromicin i ampicilin su velike jer su zone inhibicije rasta izolata MK2-9a mnogo manje u

odnosu na zone inhibicije rasta preostala tri izolata iz grupe MK1, za oba antibiotika (Tabela

3).

Tabela 3. Zone inhibicije rasta Lc. lactis ssp. lactis izolata u prisustvu antibiotika izražene u mm

Redni broj izolata

Antibiotik

AM 10μg CN 10μg DA 2μg E 15μg VA 30μg TE 30μg C 30μg

MK1-8a 31 17 30 28 24 36 34

MK1-9a 36 18 30 34 28 36 38

MK1-12a 32 17 27 32 24 38 32

MK2-9a 24 R R 18 18 40 30

AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-

hloramfenikol; R- rezistentno

Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK za dva izolata vrste Lc. lactis

ssp. lactis (MK1-9a i MK2-9a) za antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin,

gentamicin i doksiciklin) i za ciprofloksacin koji inhibira sintezu nukleinskih kiselina. Rezultati

su prikazani u Tabeli 4.

Izolat MK1-9a nije pokazao rast u prisustvu eritromicina, ciprofloksacina i doksiciklina

u korišćenim koncentracijama, što ukazuje na visok stepen osetljivosti na date antibiotike.

MIK vrednost za gentamicin je bila 0,313 μg/ml (Tabela 4).

Tabela 4. MIK vrednosti antibiotika za izolate Lc. lactis ssp. lactis

Antibiotik (μg/ml)

Oznaka izolata Eritromicin Gentamicin Ciprofloksacin Doksiciklin

MK1-9a < 0,0098 0,313 < 0,0195 < 0,0195

MK2-9a 0,156 > 40 1,25 < 0,0195

Izolat MK2-9a osetljiv je na doksiciklin, koji inhibira sintezu proteina. Dobijene MIK

vrednosti za ovaj izolat su 0,156 μg/ml za eritromicin, 1,25 μg/ml za ciprofloksacin, dok je u

prisustvu gentamicina uočen rast u svih 12 bunarčića mikrotitar ploče, što se poklapa sa

Master rad


23

rezultatima dobijenim disk difuzijom, gde je ovaj izolat pokazao rezistenciju na gentamicin

(Tabela 3).

Metodom agar dilucije testirana je osetljivost jednog izolata Lc. lactis spp. lactis

(MK1-9a) na iste antibiotike upotrebljene u mikrodilucionoj metodi. Dobijeni rezultati

predstavljeni su u Tabeli 5.

Tabela 5. Rast izolata MK1-9a Lc. lactis ssp. lactis na čvrstoj podlozi sa antibiotikom

Antibiotik (μg/ml)

Eritromicin Gentamicin Doksiciklin Ciprofloksacin

Oznaka izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40

MK1-9a + - - - - - + - - + + -

+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta)

Izolat MK1-9a nije pokazao rast na podlogama sa gentamicinom, dok je na

podlogama sa eritromicinom i doksicilinom imao rast samo kada je korišćena najmanja

koncentracija antibiotika (0,01 odnosno 0, 02 μg/ml). Na podlozi sa ciprofloksacinom koji

inhibira sintezu nukleinskih kiselina vezivanjem za DNK girazu, izolat MK1-9a pokazao je rast

na koncentraciji od 0,31 μg/ml.

4.2. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Enterococcus

Enterokoke se odlikuju sposobnošću da prežive u nepovoljnim uslovima, pa se

zahvaljujući tome mogu izolovati sa najrazličitijih staništa, a skoro uvek su prisutne u

fermentisaim proizvodima. Kako je poznato da je konjugativna razmena gena veoma česta

pojava kod enterokoka (Mathur i Sinhg, 2005) i da su pojedini predstavnici ovog roda

oportunistički patogeni, neophodno je detaljno proučavanje rezistencije onih sojeva koji se

unose u organizam.

U ovom radu, petnaest izolata vrste E. faecium i tri izolata vrste E. faecalis je

testirano za osteljivost na antibiotike metodom disk difuzije, četiri izolata vrste E. faecium i

dva izolata vrste E. faecalis metodom mikrodilucije i četiri izolata vrste E. faecium i jedan

izolat vrste E. faecalis metodom agar dilucije.

Ispitivanjem osetljivosti enterokoka metodom disk difuzije, dobijeni su rezultati

koji su prikazani na Slici 3 i u Tabeli 6. Na osnovu prikazanih srednjih vrednosti zona

inhibicija rasta testiranih izolata, uočava se da su enterokoke osetljive na antibiotike koji

Master rad


24

31,1

4

14,3

1

28,1

8

26,5

7

25,1

4

31,9

3

33,5

7

29,3

3

17,0

0

31,5

0

24,3

3

21,3

3

20,3

3

32,0

0

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

Ampicilin 10μg

Gentamicin 10μg

Klindamicin 2μg

Eritromicin 15μg

Vankomicin 30μg

Tetraciklin 30μg

Hloramfenikol 30μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

E. faecium E. faecalis

inhibiraju sintezu ćelijskog zida (ampicilin i vankomicin), kao i na one koji inhibiraju sintezu

proteina, sa izuzetkom pojedinačnih izolata koji pokazuju rezistenciju prema određenim

antibioticima.

Slika 3. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast E. faecium

i E. faecalis izolata ± standardna devijacija

Izolati JK1-7a vrste E. faecium i DK2-1 vrste E. faecalis pokazuju rezistenciju na

gentamicin i klindamicin, izolati MK2-5a i MK3-7 vrste E. faecium pokazuju rezistenciju na

klindamicin (Tabela 6), dok je izolat MK3-12 vrste E. faecalis rezistentan na gentamicin

(Tabela 6). Najveća osetljivost enterokoka uočena je na hloramfenikol (33,57 mm vrste E.

faecium i 32 mm vrste E. faecalis), a zatim na ampicilin (31,14 mm vrste E. faecium i 29,33

mm vrste E. faecalis). Značajna razlika između srednjih vrednosti zone inhibicije tetraciklina

je uočena između izolata vrste E. faecium (31,93 mm) i izolata vrtse E. faecalis (20,33 mm).

Velika standardna devijacija za ovaj antibiotik, za izolate obe vrste, govori i o velikom

variranju veličine zona inhibicija u okviru vrste. Enterokoke su bile osetljive i na klindamicin

(28,18 mm vrste E. faecium i 31,5 mm vrste E. faecalis), eritromicin (26,57 mm vrste E.

faecium i 24,33 mm vrste E. faecalis) i vankomicin (25,14 mm vrste E. faecium i 21,33 mm

vrste E. faecalis). Relativno male zone inhibicije karakteristične su za gentamicin (14,31 mm

vrste E. faecium i 17 mm vrste E. faecalis).

Master rad


25

Tabela 6. Zone inhibicije rasta E. faecalis i E. faecium izolata u prisustvu antibiotika izražene u mm

Vrsta

Antibiotik

Oznaka

izolata

AM

10μg

CN

10μg

DA

2μg

E

15μg

VA

30μg

TE

30μg

C

30μg

E.

faecalis

DK1-6 32 17 34 30 26 14 38

DK2-1 28 R R 23 19 34 30

MK3-12 28 R 29 20 19 13 28

E.

faecium

JK1-7a 28 R R 18 20 32 32

DK1-2a 30 16 33 34 24 15 35

DK1-10 32 15 35 31 25 17 34

DK1-26 37 16 40 33 29 40 40

DK2-8a 28 15 26 22 25 36 32

DK2-3 34 15 34 32 25 15 34

DK2-11 30 15 32 32 25 36 32

MK1-4a 30 17 11 32 28 38 33

MK2-5a 28 10 R 29 22 34 32

MK2-8 34 12 30 14 27 40 34

MK3-7 32 12 R 34 26 36 34

MK3-6a 24 16 36 20 26 36 34

MK3-15 * * * * * * *

JK1-26 36 14 9 12 28 42 36

JK1-9 33 13 24 29 22 30 28

AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-hloramfenikol; R- rezistentno; * - preklopljene zone inhibicije

Metodom mikrodilucije određene su vrednost MIK za četiri E. faecalis izolata i dva

E. faecalis izolata, za antibiotike iz grupe makrolida (eritromicin), aminoglikozida

(gentamicin), tetraciklina (doksiciklin) i fluorohinolona (ciprofloksacin). Dobijeni rezultati


Izolati E. faecalis imaju iste MIK vrednosti za eritromicin (0,156 μg/ml), gentamicin

(10 μg/ml) i ciprofloksacin (1,25 μg/ml). MIK vrednost doksiciklina za izolat DK2-1 je 0,039

μg/ml, a za izolat MK3-12 MIK vrednost iznosi 1,25 μg/ml.

Kada su u pitanju izolati E. faecium, dobijene MIK vrednosti za eritromicina variraju

(0,0195 μg/ml do 0,313 μg/ml), dok jedan soj nije pokazao rast, što govori o visokom nivou

osetljivosti na ovaj antibiotik iz grupe makrolida (Tabela 7). MIK vrednosti gentamicina

takođe variraju i relativno su visoke, od 10 μg/ml do 40 μg/ml (Tabela 7). Dobijene MIK

Master rad


26

vrednosti za ciprofloksacin su u opsegu od 0,313 μg/ml do 5 μg/ml (Tabela 7). Što se

doksiciklina tiče, izolati MK1-4a i MK3-7 nisu pokazali rast, a za preostala dva izolata

vrednosti MIK doksiciklina su 0,313 μg/ml i 0,156 μg/ml (Tabela 7).

Tabela 7. MIK vrednosti antibiotika za izolate roda Enterococcus

Vrsta

Antibiotik (μg/ml)


E. faecalis

DK2-1 0,156 10 1,25 0,039

MK3-12 0,156 10 1,25 1,25

E. faecium

JK1-7a 0,313 40 1,25 0,313

MK1-4a < 0,0098 10 1,25 < 0,0195

MK2-5a 0,0195 20 0,313 0,156

MK3-7 0,039 40 5 < 0,0195

Agar dilucionom metodom testirana je osetljivost jednog izolat E. faecalis i četiri

izolata E. faecium, na antibiotike za koje je u mikrodilucionoj metodi određivana MIK

vrednost. Dobijeni rezultati predstavljeni su u Tabeli 8.

Izolat MK3-12 E. faecalis pokazao je rast na svim podlogama sa gentamicinom, što

govori da je rezistentan na ovaj antibiotik (Tabela 8). Na preostala tri antibiotika ovaj izolat

je osetljiv, a rasta je bilo na podlogama sa najmanjim i srednjim koncentracijama

eritromicina (0,01 i 0,02 μg/ml) i doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml ) i na podlozi sa najmanjom

koncentracijom ciprofloksacina (0,16 μg/ml ). Na podlogama sa najvećim koncentracijama

ovih antibiotika nije bilo rasta (Tabela 8).

Što se tiče E. faecium izolata, jedino je izolat MK3-7 pokazao rast na podlozi sa

najvećom koncentracijom ciprofloksacina od 40 μg/ml (Tabela 8), što može ukazati na

rezistenciju na ovaj antibiotik koji sprečava sintezu nukleinskih kiselina. Preostali izolati

porasli su na podlogama sa najmanjom i srednjom koncentracijom (0,16 i 0,31 μg/ml) ovog

antibiotika iz grupe fluorohinolona. Izolati MK1-4a, MK2-5a i MK3-7 nisu porasli ni na jednoj

podlozi sa gentamicinom, dok je izolat JK1-7a imao rast na podlogama sa najmanjom (0,16

μg/ml) i srednjom (0,31 μg/ml) koncentracijom ovog antibiotika. Na podlogama sa

eritromicinom sva četiri izolata porasla su u prisustvu najmanje koncentracije (0,01 μg/ml), a

Master rad


27

tri izolata rasla su i na podlogama sa srednjom koncentracijom (0,02 μg/ml). Što se tiče

podloga sa doksiciklina, isti je slučaj kao i sa eritromicinom. Svi izolati porasli su na

najmanjoj koncentraciji od 0,02 μg/ml, a tri izolata porasla su i na srednjoj koncentraciji

(0,04 μg/ml). Na podlogama sa maksimalnim koncentracijama antibiotika ovi izolati nisu imali

rast (Tabela 8).

Tabela 8. Rast izolata roda Enterococcus na čvrstoj podlozi sa antibiotikom

Vrs

ta

Antibiotik (μg/ml)


Oznaka

izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40

E.

fae

ca

lis

MK3-12 + + - + 53 13 + + - + - -

E.

fae

ciu

m

JK1-7a + + - + 37 - + - - + ± -

MK1-4a + - - - - - + + - + + -

MK2-5a + ± - - - - + + - + + -

MK3-7 + + - - - - + 70 - + + +

+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta); ± (umeren rast)

4.3. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Leuconostoc

Najčešće prirodno stanište predstavnika roda Leuconostoc su biljke, odakle dospevaju

na druga staništa, pa i u mleko, gde tokom fermentacije imaju važnu ulogu. Za razliku od

većine BMK koje produkuju L(+) oblik mlečne kiseline, leukonostoci produkuju D(-) oblik.

Neki predstavnici ovog roda smatraju se oportunističkim patogenima, iako su takvi slučajevi

veoma retki (Ogier i sar., 2008). Kako se L. mesenteroides često izoluje iz mlečnih proizvoda,

neophodno je ispitivanje rezistencije na antibiotike. U ovom radu je 21 izolat vrste L.

mesenteroides ssp. mesenteroides ispitivan za osetljivost na antibiotike metodom disk

difuzije, tri izolata metodom mikrodilucije i tri izolata metodom agar dilucije.

Master rad


28

Za ispitivanje osetljivosti 21 izolata L. mesenteroides ssp. mesenteroides, metodom

disk difuzije, korišćeni su antibiotici koji inhibiraju sintezu ćelijskog zida iz grupe β-

laktamskih antibiotika i glikopeptida, kao i antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina iz grupa

aminoglikozida, linkozamida, makrolida, tetraciklina i hloramfenikol. Dobijeni rezultati

prikazani su na Slici 4 i u Tabeli 9.

Slika 4. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast L. mesenteroides ssp. mesenteroides izolata ± standardna devijacija

Svi izolati su rezistentni na vankomicin. Ova rezistencija je urođena i predstavlja

karakteristiku roda Leuconostoc (Ogier i sar., 2008). Na osnovu srednjih vrednosti prikazanih

na Slici 4, može se zaključiti da su svi testirani izolati, u manjoj ili većoj meri, osetljivi na

upotrebljene antibiotike. Najveću osetljivost izolati pokazuju prema tetraciklinu (33,95 mm),

klindamicinu (33,2 mm) i hloramfenikolu (31,86 mm), a zatim i na ampicilin (28,9 mm) i

eritromicin (27,35 mm). Relativno niska osetljivost može se uočiti za antibiotik iz grupe

aminoglikozida, gentamicin, sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 20 mm. Najveća

standardna devijacija uočava se za eritromicin i ona iznosi 5,48 mm (Slika 4), jer postoje

relativno velika variranja u veličinama zone inhibicije rasta između izolata (Tabela 9).

28,90

20,00

33,20

27,35

33,95 31,86

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

Ampicilin

10μg

Gentamicin

10μg

Klindamicin

2μg

Eritromicin

15μg

Tetraciklin

30μg

Hloramfenikol

30μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

Master rad


29

Tabela 9. Zone inhibicije rasta L. mesenteroides ssp. mesenteroides izolata u prisustvu

antibiotika izražene u mm

Antibiotik

Oznaka izolata

AM

10μg

CN

10μg

DA

2μg

E

15μg

VA

30μg

TE

30μg

C

30μg

DK1-13a 32 21 40 38 R 33 24

DK1-44 28 19 36 27 R 43 36

DK1-27 32 19 28 26 R 31 29

DK1-38 28 16 34 16 R 40 34

DK2-22 30 28 38 34 R 30 32

DK2-32 27 20 30 26 R 32 26

DK2-20a 30 21 34 18 R 32 36

MK1-27 27 20 28 28 R 32 34

MK1-15a 24 18 29 25 R 30 30

MK1-41 24 17 26 24 R 28 25

MK1-18a 28 18 36 30 R 36 36

MK2-48 30 22 36 32 R 36 27

MK2-32 28 21 35 32 R 34 32

MK2-30 28 22 32 30 R 36 34

MK2-25 32 24 38 34 R 36 36

MK2-39 34 16 36 30 R 36 34

MK2-35 * 14 * * R * 38

MK3-9a 26 15 28 24 R 28 26

MK3-20a 32 20 28 26 R 34 28

JK1-47 28 19 32 27 R 32 32

JK1-34 30 30 40 20 R 40 40

AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-hloramfenikol; R- rezistentno; * - preklopljene zone inhibicije

Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK za tri izolata L. mesenteroides

ssp. mesenteroides. Antibiotici za koje su određivane vrednosti MIK i dobijeni rezultati

prikazani su u Tabeli 10.

Izolat DK2-32 nije pokazao rast u prisustvu ni jednog od upotrebljenih antibiotika, u

datim koncentracijama, što ukazuje na visok stepen osetljivosti. S obzirom da je u svih 12

bunarčića bilo vidljivog rasta izolata DK1-44, može se pretpostaviti da je MIK vrednost

ciprofloksacina veća od 40 μg/ml ili da je ovaj izolat rezistentan na ciprofloksacin. MIK

vrednosti između izolata DK1-44 i MK1-18a za gentamicin se značajno razlikuju (5 i 0,625

Master rad


30

μg/ml), dok razlika između MIK vrednosti eritromicina (0,625 i 0,0195 μg/ml) i doksiciklina

(0,313 i 0,078 μg/ml) postoji, ali nije tako velika kao u slučaju gentamicina (Tabela 10).

Tabela 10. MIK vrednosti antibiotika za izolate L. mesenteroides ssp. mesenteroides

Antibiotik (μg/ml)


DK1-44 0,625 5 >40 0,078

DK2-32 < 0,0098 < 0,0195 < 0,0195 < 0,0195

MK1-18a 0,0195 0,625 0,625 0,313

Agar dilucionom metodom testirana je osetljivost tri izolata L. mesenteroides ssp.

mesenteroides na antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin, gentamicin i

doksiciklin) i nukleinskih kiselina (ciprofloksacin). Dobijeni rezultati predstavljeni su u Tabeli

11. Izolat DK1-44 pokazao je umeren rast na podlozi sa najvećom koncentracijom

ciprofloksacina (40 μg/ml), što se poklapa sa rezultatima dobijenim u mikrodilucionoj metodi.

Preostala dva izolata porasla su na podlogama sa koncentracijom od 0,31 μg/ml

ciprofloksacina. Sva tri izolata leukonostoka rasla su na podlogama sa najmanjom i srednjom

koncentracijom eritromicina (0,01 i 0,02 μg/ml) i doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml). Izolati

DK1-44 i DK2-32 nisu porasli ni na jednoj podlozi sa gentamicinom, dok je izolat MK1-18a

pokazao rast na podlozi sa najmanjom koncentracijom ovog antibiotika, koja iznosi 0,16

μg/ml. Na podlogama sa maksimalnim koncentracijama eritromicina, gentamicina i

doksiciklina nije bilo rasta ni jednog izolata leukonostoka (Tabela 11).

Tabela 11. Rast izolata L. mesenteroides ssp. mesenteroides na čvrstoj podlozi sa antibiotikom

Antibiotik (μg/ml)


Oznaka izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40

DK1-44 + + - - - - + + - + + ±

DK2-32 + + - - - - + + - + + -

MK1-18a + + - + - - + + - + + -

+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta); ± (umeren rast)

Master rad


31

31,0

0

13,0

0

35,0

0

26,0

0

51,0

0

44,0

0

35,0

0

13,7

5

31,0

0

32,2

5

29,5

0

29,2

5

35,5

0

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Ampicilin 10μg

Gentamicin 10μg

Klindamicin 2μg

Eritromicin 15μg

Vankomicin 30μg

Tetraciklin 30μg

Hloramfenikol 30μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

Lb. paracasei Lb. plantarum

4.4. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactobacillus

Rod Lactobacillus je veoma heterogen i njegovi predstavnici dele se u tri grupe:

obligatni homofermentativni laktobacili, obligatni i fakultativni heterofermentativni laktobacili.

Kao rezultat ove heterogenosti, predstavnici roda mogu se naći na najrazličitijim staništima.

Prisustvo laktobacila tokom fermentacije mleka vrlo je bitno, kako zbog produkcije mlečne

kiseline, tako i zbog produkcije jedinjenja koja utiču na organoleptičke karakteristike krajnjeg

proizvoda. Kako se u velikom broju unose u organizam, a pri tome neki od laktobacila

spadaju u grupu probiotika, neophodna je detaljna analiza i proučavanje njihove rezistencije

na antibiotike. U ovom radu, osetljivost na antibiotike ispitivana je za izolate iz grupe

fakultativnih heterofermentativnih laktobacila, odnosno za dva izolata vrste Lb. paracasei i

četiri izolata vrste Lb. plantarum metodom disk difuzije, dva izolata vrste Lb. paracasei i tri

izolata vrste Lb. plantarum metodom mikrodilucije i dva izolata vrste Lb. paracasei i tri izolata

vrste Lb. plantarum metodom agar dilucije.

Rezultati dobijeni metodom disk difuzije prikazani su na Slici 5 i u Tabeli 13. Izolati

Lb. paracasei rezistentni su na vankomicin (Tabela 13), što je karakteristika vrste. Izolat

MK3-24 vrste Lb. paracasei pokazuje rezistenciju i na gentamicin (Tabela 13).

Slika 5. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast Lb. paracasei i Lb. plantarum izolata ± standardna devijacija

Master rad


32

Rezistencija na vankomicin uočena je i kod dva izolata vrste Lb. plantarum i to MK3-

22 i JK1-40 (Tabela 13), dok je za preostale izolate ove vrste srednja vrednost inhibicije rasta

u prisustvu vankomicina 29,5 mm (Slika 5). Na osnovu srednjih vrednosti zona inhibicija

rasta, predstavljenih na Slici 5, uočavaju se određena variranja u osetljivosti između izolata

ove dve vrste. Izolati vrste Lb. paracasei pokazuju mnogo veću osetljivost na tetraciklin (51

mm) u odnosu na izolate vrste Lb. plantarum (29,25 mm). Nešto manja razlika, takođe u

većoj osetljivosti za Lb. paracasei izolate, uočava se za hloramfenikol (44 mm) i klindamicin

(35 mm). Sa druge strane, Lb. plantarum izolati pokazuju nešto veću osetljivost na ampicilin

(35 mm) i eritromicin (32,25 mm) u odnosu na Lb. paracasei izolate (Slika 5). Osetljivost

izolata obe vrste na gentamicin je relativno mala, sa srednjim vrednostima zone inhibicije

rasta od 13 mm za izolate vrste Lb. paracasei i 13,75 mm za izolate vrste Lb. plantarum.

Tabela 13. Zone inhibicije rasta Lb. paracasei i Lb. plantarum izolata u prisustvu antibiotika

izražene u mm

Vrsta

Antibiotik

Oznaka

izolata

AM

10μg

CN

10μg

DA

2μg

E

15μg

VA

30μg

TE

30μg

C

30μg

Lb.

paracasei

DK2-5a 30 13 30 20 R 60 48

MK3-24 32 R 40 32 R 42 40

Lb.

plantarum

MK3-22 36 16 12 32 R 25 32

JK1-15a 32 12 30 31 27 18 40

JK1-29 38 11 46 36 32 36 36

JK1-40 34 16 36 30 R 38 34

AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-

hloramfenikol; R- rezistentno

MIK vrednosti antibiotika koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin, gentamicin i

doksiciklin) i sintezu nukleinskih kiselina (ciprofloksacin), određene su za dva izolata Lb.

paracasei i tri izolata Lb. plantarum, metodom mikrodilucije. Dobijeni rezultati


Izolati Lb. paracasei nisu rasli u prisustvu gentamicina, iako je jedan od njih (MK3-24)

u metodi disk difuzije pokazao rezistenciju na gentamicin (Tabela 13). MIK vrednosti za

preostale antibiotike, za izolate Lb. paracasei, su 0,078 μg/ml i 1,25 μg/ml za eritromicin, 20

μg/ml i 40 μg/ml za ciprofloksacin i 0,78 μg/ml i 0,156 μg/ml za doksiciklin. Izolat MK3-22

koji pripada vrsti Lb. plantarum nije pokazao rast u prisustvu ni jednog od upotrebljenih

antibiotika, što govori o visokom stepenu osetljivosti. MIK vrednosti za preostala dva Lb.

Master rad


33

plantarum izolata, za eritromicin su 0,156 μg/ml i 1,25 μg/ml, za gentamicin 10 μg/ml i 20

μg/ml, zatim za ciprofloksacin 20 μg/ml i za doksiciklin 0,156 μg/ml.

Tabela 14. MIK vrednosti antibiotika za izolate roda Lactobacillus

Vrsta

Antibiotik (μg/ml)


Lb. paracasei

DK2-5a 1,25 < 0,0195 40 0,156

MK3-24 0,078 < 0,0195 20 0,078

Lb. plantarum

MK3-22 < 0,0098 < 0,0195 < 0,0195 < 0,0195

JK1-15a 0,156 20 20 0,156

JK1-40 1,25 10 20 0,156

Zasejavanjem dva izolata vrste Lb. paracasei i tri izolata vrste Lb. plantarum, na

čvrste podloge sa različitim koncentracijama eritromicina, gentamicina, doksiciklina i

ciprofloksacina, testirana je njihova osetljivost. Rezultati dobijeni ovom agar dilucionom

metodom prikazani su u Tabeli 15.

Tabela 15. Rast izolata Lb. paracasei i Lb. plantarum na čvrstoj podlozi sa antibiotikom

Vrsta

Antibiotik (μg/ml)


Oznaka

izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40

Lb.

paracasei

DK2-5a + - - - - - + + - + + -

MK3-24 - - - - - - + + - + + -

Lb.

plantarum

MK3-22 - - - - - - - - - - - -

JK1-15a + - - - - - + + - + + -

JK1-40 + + - + - - + + - + + -

+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta)

Master rad


34

Kada su u pitanju izolati vrste Lb. paracasei, rast je izostao na svim podlogama sa

gentamicinom. Zanimljivo je da izolat MK3-24 opet nije pokazao rast u prisustvu

gentamicina, čak ni na podlozi sa najnižom koncentracijom (Tabela 15), s obzirom da je u

disk difuzionoj metodi pokazao rezistenciju. Ovaj izolat nije pokazao rast ni na podlogama sa

eritromicinom, dok je DK2-5a porastao na podlozi sa najmanjom koncentracijom ovog

makrolidnog antibiotika (0,01 μg/ml). Oba izolata porasla su na podlogama sa najmanjom i

srednjom koncentracijom doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml) i ciprofloksacina (0,16 i 0,31

μg/ml). Ni na jednoj podlozi sa maksimalnom koncentracijom ova četiri antibiotika nije bilo

rasta. Izolat vrste Lb. plantarum MK3-22 je i u ovoj metodi pokazao visok stepen osetljivosti

na antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina i nukleinskih kiselina, jer nije bilo rasta ni na

jednoj podlozi, čak ni sa najnižim koncentracijama (Tabela 15). Na podlozi sa najmanjom

koncentracijom eritromicina (0,01 μg/ml) rasla su preostala dva izolata, pri čemu je izolat

JK1-40 porastao i na podlozi sa 0,02 μg/ml. Rast izolata JK1-15a izostao je sa svih podloga

sa gentamicinom, dok je izolat JK1-40 pokazao rast na podlozi sa 0,16 μg/ml gentamicina.

Oba izolata porasla su na podlogama sa najmanjom i srednjom koncentracijom doksiciklina

(0,02 i 0,04 μg/ml) i ciprofloksacina (0,16 i 0,31 μg/ml). Nije bilo rasta ni jednog Lb.

plantarum izolata na podlogama sa maksimalnim koncentracijama upotrebljenih antibiotika

(Tabela 15).

4.5. Ukupna rezistencija BMK izolata određena metodom disk

difuzije

Generalno gledano, na osnovu rezultata dobijenih disk difuzijom, možemo zaključiti

da je svih 49 izolata osetljivo na ampicilin, koji inhibira sintezu ćelijskog zida i na eritromicin,

tetraciklin i hloramfenikol, koji inhibiraju sintezu proteina. 89,8% izolata osetljivo je na

gentamicin, na koji se javlja rezistencija kod 5 izolata. Takođe, 89,8% izolata osetljivo je na

klindamicin. Kako su predstavnici roda Leuconostoc (Ogier i sar., 2008) i Lb. paracasei

(Delgado i sar., 2005) urođeno rezistentni na vankomicin, ovi izolati su izuzeti iz ukupne

rezistencije na vankomicin. Od preostalih 26 izolata, rezistencija na vankomicin se javlja kod

2 izolata Lb. plantarum, što znači da je 92,3% izolata osetljivo na vankomicin.

Master rad


35

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

Ampicilin 10μg

Gentamicin 10μg

Klindamicin 2μg

Eritromicin 15μg

Vankomicin 30μg

Tetraciklin 30μg

Hloramfenikol 30μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

Lc. lactis E. faecium E. faecalis L. mesenteroides Lb. plantarum Lb. paracasei

Na Slici 6 prikazane su srednje vrednosti zona inhibicije rasta svih testiranih izolata u

okviru vrsta. Jasno se uočava da su izolati vrste Lb. paracasei pokazali najveću osetljivost na

tetraciklin, a zatim na hloramfenikol i klindamicin. Izolati Lb. plantarum pokazuju najveću

osetljivost na ampicilin, eritromicin i vankomicin. U odnosu na ostale izolate, izolati L.

mesenteroides najosetljiviji su na gentamicin.

Slika 6. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast izolata laktokoka, enterokoka, leukonostoka i laktobacila

Kada se srednje vrednosti zona inhibicija enterokoka i laktokoka uporede, uočava se

da su vrednosti relativno ujednačene i da srednje vrednosti ne pokazuju značajna variranja

između ova dva roda, osim u slučaju tetraciklina i to između Lc. lactis i E. faecalis (Slika 6).

Poređenjem prosečnih vrednosti zona inhibicija rasta između izolata leukonostoka,

laktokoka i enterokoka (Slika 6), uočavaju se manje više ujednačene vrednosti, gde je

najveća razlika u rezistenciji na vankomicin kod leukonostoka. Izolati leukonostoka pokazuju

znatno veću osetljivost na tetraciklin u odnosu na E. faecalis izolate, malo veću osetljivost na

gentamicin i klindamicin u odnosu na sve laktokoke i enterokoke, dok je osetljivost

leukonostoka nešto manja na ampicilin (Slika 6).

U odnosu na laktokoke, enterokoke i leukonostoke, laktobacili, a posebno izolati vrste

Lb. paracasei, pokazuju najveću osetljivost na tetraciklin i hloramfenikol, dok je osetljivost na

ampicilin najveća kod Lb. plantarum izolata (Slika 6). Generalno, osetljivost na gentamicin

najmanja je kod Lb. paracasei izolata (Slika 6).

Master rad


36

30,57

17,28

31,40 27,34

24,74

32,91 33,10

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

Ampicilin 10 μg

Gentamicin 10 μg

Klindamicin 2 μg

Eritromicin 15 μg

Vankomicin 30 μg

Tetraciklin 30 μg

Hloramfenikol 30 μg

Zona inhib

icije (

mm

)

Antibiotik

Na osnovi izmerenih zona inhibicije svih testiranih izolata određene su srednje

vrednosti i standardne devijacije. Rezultati su prikazani na Slici 7. Na osnovu srednjih

vrednosti zona inhibicije, može se zaključiti da su testirani izolati BMK najosetljiviji na

hloramfenikol (33,1 mm) i tetraciklin (32,91 mm), mada je i osetljivost na klindamicin prilično

velika (31,4 mm), s obzirom da je koncentracija ovog antibiotika bila 2 μg. Izolati BMK

osetljivi su i na ampicilin (30,57 mm), eritromicin (27,34 mm) i na vankomicin (24,74 mm).

Ubedljivo najmanju osetljivost izolati BMK pokazuju na gentamicin (17,28 mm).

Slika 7. Srednje vrednosti zona inhibicije svih testiranih izolata ± standardna devijacija

Najveća standardna devijacija može se uočiti za tetraciklin, jer postoje velika variranja

između veličine zone inhibicije, pa je tako najmanja zona inhibicije rasta 13 mm (Tabela 6), a

najveća 60 mm (Tabela 13). Isti je slučaj i sa klindamicinom i eritromicinom. Standardne

devijacije za ostale antibiotike su relativno ujednačene i nisu veće od 4,5 mm (Slika 7).

4.6. Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama

određivanja rezistencije na antibiotike

Kako je ranije napomenuto, postoje brojni činioci koji utiču na krajnje rezultate, pri

testiranju osetljivosti bakterija na antibiotike, različitim fenotipskim metodama. Od sastava

hranljive podloge i njene pH vrednosti, preko dužine inkubacije i tempreture na kojoj se vrši,

pa do veličine inokuluma, ali i brojnih drugih faktora (Huys i sar., 2002). Pored toga,

rezultate dobijene različitim metodama veoma je teško upoređivati.

Master rad


37

U ovom radu primenjene su tri fenotipske metode za testiranje osetljivosti BMK

izolovanih iz kajmaka (metoda disk difuzije, mikrodiluciona i agar diluciona metoda). Jedino

su gentamicin i eritromicin, antibiotici koji zaustavljaju sintezu proteina, upotrebljeni u okviru

sve tri metode. U nastavku su prikazane zbirne tabele dobijenih rezultata za izolate koji su

testirani za osetljivost na ove antibiotike, kroz sve tri metode.

Na osnovu rezultata prikazanih u Tabeli 16, možemo zaključiti da je izolat MK1-9a

osetljiv na gentamicin. Kako je MIK gentamicina 0,313 μg/ml, a nije bilo rasta ni na jednoj

podlozi sa gentamicinom, pa ni na 0,16 μg/ml, možemo pretpostaviti da se minimalna

baktericidna koncentracija (MBK) nalazi negde između ove dve koncentracije. Što se tiče

eritromicina, koji takođe zaustavlja sintezu proteina, pojava da na podlozi sa znatno manjom

koncentracijom antibiotika, u odnosu na određenu MIK vrednost, nema rasta, može se

objasniti visokim stepenom osetljivosti izolata MK1-9a na eritromicin, ali nije isključena

mogućnost da je ova razlika rezultat različitih metoda.

Tabela 16. Rezistencija MK1-9a izolata Lc. lactis ssp. lactis testiranog u sve tri metode

Gentamicin Eritromicin

Oznaka

izolata

Disk difuzija

(10 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

Disk difuzija

(15 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

MK1-9a 18 mm 0,313 μg/ml > 40

μg/ml 34 mm 0,156 μg/ml

> 0,01

μg/ml

U Tabeli 17 prikazani su rezultati za sve izolate enterokoka koji su testirani u sve tri

metode. Na osnovu rezultata možemo zaključiti da je izolat MK3-12 vrste E. faecalis

rezistentan na gentamicin, jer se rezultati poklapaju za sve tri metode. Kada je eritromicin u

pitanju, izolat MK3-12 je osetljiv, i možemo pretpostaviti da se vrednost MBK eritromicina

nalazi između 0,156 μg/ml i 1,25 μg/ml.

Što se tiče E. faecium izolata, zanimljiva je pojava da je izolat JK1-7a, koji je pokazao

rezistenciju na gentamicin i u disk difuzionoj i u mikrodilucionoj metodi, nije pokazao rast na

podlozi sa 40 μg/ml gentamicina. Ovaj izolat je osetljiv na eritromicin, koji, kao i gentamicin,

zaustavlja sintezu proteina. S obzirom da se rezultati dobijeni disk difuzijom i mikrodilucijom

poklapaju za preostala tri izolata vrste E. faecium i potrvrđuju relativno nizak nivo osetljivosti

na gentamicin, čudno je što ni na podlogama sa najmanjom koncentracijom gentamicina

Master rad


38

(0,16 μg/ml) nije bilo rasta (Tabela 17). Osetljivost svih E. faecalis izolata na eritromicin je

znatno veća u odnosu na gentamicin, što se može zaključiti i na osnovu veličine zona

inhicicije rasta i određenih vrednosti MIK.

Tabela 17. Rezistencija izolata enterokoka testiranih u sve tri metode


Vrsta

Oznaka

izolata

Disk

difuzija

(10 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

Disk

difuzija

(15 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

E.

faecalis MK3-12 R 10 μg/ml

40

μg/ml 20 mm

0,156 μg/ml

>0,02

μg/ml

E.

faecium

JK1-7a R 40 μg/ml >0,31


>0,02

μg/ml

MK1-4a 17 mm 10 μg/ml >40

μg/ml 32 mm

< 0,0098

μg/ml

>0,01

μg/ml

MK2-5a 10 mm 20 μg/ml >40


>0,02

μg/ml

MK3-7 12 mm 40 μg/ml >40


>0,02

μg/ml

U Tabeli 18 predstavljeni su rezultati za sve izolate leukonostoka koji su testirani u

sve tri metode. Kada se ovako uporede rezultati, uočava se da vrednosti dobijene u različitim

metodama dosta variraju, iako se generalno može reći da su testirani izolati osetljivi na

gentamicin i eritromicin. Na primer, vrednost MIK gentamicina je znatno veća od

koncentracije u čvrstoj podlozi na kojoj nije bilo rasta (Tabela 18), dok je ta razlika za izolat

MK1-18a znatno manja. Što se tiče eritromicina, sva tri izolata se mogu smatrati osetljivim,

jer se rezultati sve tri metode podudaraju.

Master rad


39

Tabela 18. Rezistencija izolata leukonostoka testiranih u sve tri metode


Oznaka

izolata

Disk difuzija

(10 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

Disk difuzija

(15 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

DK1-44 19 mm 5 μg/ml >40


>0,02

μg/ml

DK2-32 20 mm < 0,0195

μg/ml

>40

μg/ml 26 mm

< 0,0098

μg/ml

>0,02

μg/ml

MK1-18a 18 mm 0,625 μg/ml >0,16


>0,02

μg/ml

U Tabeli 19 predstavljeni su rezultati za izolate laktobacila koji su testirani u sve tri

metode. Kao što je već istaknuto, izolat MK3-24 vrste Lb. paracasei pokazao je rezistenciju

na gentamicin u disk difuziji, dok je u mikrodilucionoj i agar dilucionoj metodi pokazao

osetljivost na ovaj antibiotik i nije pokazao rast u njegovom prisustvu. Kada se rezultati

ovako uporede, mogu se uočiti određena variranja između metoda, konkretno, kod izolata

JK1-15a i JK1-40 Lb. plantarum, vrednosti MIK gentamicina su 20 μg/ml i 10 μg/ml, što su

znatno veće koncentracije u odnosu na koncentracije gentamicina u čvrstim podlogama (0,16

i 0,31 μg/ml) na kojima ovi izolati nisu rasli. Ovo je slučaj i sa eritromicinom i izolatima Lb.

paracasei i izolatom JK1-15a Lb. plantarum, s tim da razlike u koncentracijama nisu ni

približno velike kao kod gentamicina.

Tabela 19. Rezistencija izolata laktobacila testiranih u sve tri metode


Vrsta

Oznaka

izolata

Disk

difuzija

(10 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

Disk

difuzija

(15 μg)

Mikrodilucija

(MIK)

Agar

dilucija

Lb.

paracasei DK2-5a 13 mm

< 0,0195

μg/ml

>40

μg/ml 20 mm

1,25 μg/ml >0,01

μg/ml

Master rad


40

Nastavak Tabela 19. Rezistencija izolata laktobacila testiranih u sve tri metode


Vrsta

Oznaka

izolata

Disk

difuzija

(10 μg)

Mikrodilucij

a (MIK)

Agar

dilucija

Disk

difuzija

(15 μg)

Mikrodilucij

a (MIK)

Agar

dilucija

Lb.

paracasei MK3-24 R

< 0,0195

μg/ml >40 μg/ml 32 mm

0,078 μg/ml

>1,25

μg/ml

Lb.

plantarum

MK3-22 16 mm < 0,0195

μg/ml >40 μg/ml 32 mm

< 0,0098

μg/ml

>1,25

μg/ml

JK1-15a 12 mm 20 μg/ml >40 μg/ml 31 mm 0,156

μg/ml

>0,01

μg/ml

JK1-40 16 mm 10 μg/ml >0,16


>0,02

μg/ml

Master rad


41

5. Diskusija

Sve češća pojava bakterija rezistentnih na antibiotike predstavlja globalni problem,

koji pored medicine i veterine, pogađa i proizvodnju hrane (Dušková i Karpíšková, 2013).

Kako je proizvodnja novih antibiotika poslednjih godina značajno smanjena, a sve je više

multirezistentnih bakterija, smatra se da je kraj ere antibiotika sve bliži (Huddleston, 2014).

S obzirom da gastrointestinalni trakt ljudi predstavlja sredinu koja obezbeđuje neke od

osnovnih uslova za horizontalni transfer gena (veliki broj bakterija koje međusobno

interaguju i prisustvo antibiotika), trebalo bi sprečiti unošenje u organizam onih bakterija

koje poseduju gene za rezistenciju na antibiotike na mobilnim genetskih elementima, koji se

mogu naći i kod BMK.

U ovom radu, kao i u istraživanju sprovedenom od strane Bulajić i Mijačević (2011),

rezistentnih izolata ima mnogo manje u odnosu na osetljive, naročito ukoliko u obzir ne

uzimamo izolate sa urođenim rezistencijama, koje ne predstavljaju potencijalnu pretnju.

Rezistencija laktokoka na gentamicin varira i bilo je slučajeva detekcije genatamicin–

rezistentnih sojeva (Hummel i sar., 2007; Bulajić i Mijačević, 2011). Vrsta Lc. lactis se

generalno smatra osetljivom na gentamicin (Mathur i Singh, 2005), a uzmajući u obzir i to da

je većina analiziranih izolata u ovom istraživanju pokazala osetljivost na ovaj antibiotik,

neophodno je dalje proučvanje izolata MK2-9a, kod kojeg je detektovana rezistencija na

gentamicin (MIK>40 μg/ml). Iako multirezistencija nije uočena kod izolata ove vrste (Florez i

sar., 2005), isti izolat MK2-9a pokazuje rezistenciju i na klindamicin, za razliku od preostala

tri izolata koja su osetljiva, te je dalja analiza ovog izolata neophodna, kako bi se utvrdilo

poreklo rezistencije. Što se tiče preostalih antibiotika (ampicilin, eritromicin, vankomicin,

tetraciklin, doksiciklin, hloramfenikol i ciprofloksacin), svi izolati Lc. lactis u ovom radu

pokazali su osetljivost. U revijalnom radu objavljenom od strane Devirgiliis i saradnika

(2013), navodi se da su svi izolati vrste Lc. lactis, iz tradicionalnih fermentisanih namirnica iz

Indije, osetljivi na antibiotike iz grupe linkozamida, aminoglikozida, β-laktama, cefalosporina,

hloramfenikola, makrolida i tetraciklina. Takođe, svi izolati Lc. lactis iz fermentisanih

namirnica iz Merilenda (SAD), osetljivi su na klindamicin, gentamicin, ampicilin, eritromicin,

tetraciklin, vankomicin i ciprofloksacin (Devirgiliis i sar., 2013). Iako su ovi izolati u većini

slučajeva osetljivi na navedene antibiotike, postoje i izolati koji pokazuju rezistenciju na neke

od njih. Na primer, u istraživanju sprovedenom od strane Bulajić i Mijačević (2011), od

ukupno 82 izolata, 22 pokazalo je rezistenciju na vankomicin, 64 izolata rezistentno je na

tetraciklin i 25 na eritromicin. Svih 17 izolata, kod kojih je detektovana rezistencija na

Master rad


42

eritromicin, pripadaju vrsti Lc. lactis (Devirgiliis i sar., 2010). Hummel i saradnici (2007)

pokazali su da su sojevi roda Lactococcus, iz starter kultura za jogurt i sireve, osetljivi na

eritromicin, ampicilin i tetraciklin, a rezistentni na ciprofloksacin i gentamicin. Rezistencija

laktokoka na vankomicin i hloramfenikol nije uočena, dok su neki izolati pokazali rezistenciju

na tetraciklin (Florez i sar., 2005; Ammor i sar., 2008). Na plazmidu jednog izolata Lc. lactis

detektovan je gen tet(M) (Ammor i sar., 2008).

Što se enterokoka tiče, pojava multirezistentnih izolata (JK1-7a vrste E. faecium i

DK2-1 vrtse E. faecalis) i to na gentamicin i klindamicin, nije karakteristična samo za ovaj

rad, jer je i ranije detektovano prisustvo takvih izolata. Na primer, u istraživanju Florez i

saradnika (2005), takođe je prijavljeno da se dva izolata E. faecium odlikuju

multirezistentnošću i to na čak pet antibiotika (klindamicin, tetraciklin, eritromicin,

vankomicin i hloramfenikol). Rezistencija na jedan antibiotik detektovana je kod izolata MK2-

5a i MK3-7 vrtse E. faecium na klindamicin i MK3-12 vrste E. faecalis na gentamicin. S

obzirom da je uočena pojava gentamicin-rezistentnih enterokoka (Huys i sar., 2004; Bulajić i

Mijačević, 2011), ne čudi što su takvi izolati detektovani i u ovom istraživanju, mada je

većina izolata (83,3%) osetljiva na ovaj antibiotik. Svi enterokokalni izolati u ovom radu

pokazali su osetljivost na tetraciklin i vankomicin, iako je pojava rezistencije na ove

antibiotike pokazana u nekoliko istraživanja. Prema Teuberu i saradnicima (1999), učestalost

detekcije vankomicin-rezistentnih enerokoka je niska i iznosi oko 4%. Samo jedan, od

petnaest izolata, pokazao je rezistenciju na vankomicin (Bulajić i Mijačević, 2011). Franz i

saradnici (2001) testirali su 47 sojeva E. faecalis, izolovanih uglavnom iz sireva, i svi su bili

osetljivi na vankomicin. Ni u istraživanju sprovedenom od strane Florez i saradnika (2005)

nije uočena rezistencija na vankomicin. Nasuprot tome, prilikom testiranja osetljivosti izolata

enterokoka iz belih turskih sireva, Citak i saradnici (2004), prijavili su da je 96,8% izolata E.

faecalis i 76% E. faecium rezistentno na vankomicin. Što se tiče tetraciklina, devet od

petnaest testiranih izolata, iz somborskog sira, bilo je rezistentno na ovaj antibiotik koji

inhibira sintezu proteina (Bulajić i Mijačević, 2011). Kod sojeva rezistentnih na tetraciklin,

najčešće se uočava tet(M) gen (Teuber i sar., 1999). Eritromicin-rezistentne enterokoke u

ovom istraživanju nisu detektovane, iako je u par drugih istraživanja ovakva rezistencija

detektovana (Teuber i sar., 1999; Florez i sar., 2005; Bulajić i Mijačević, 2011). Svi izolati

testirani u ovom radu osetljivi su i na ampicilin i na hloramfenikol. Jasno je da rezistencija

enterokoka veoma varira i često je soj- i region-zavisna, ili je to variranje rezultat različitih

metoda izolovanja (Ogier i Serror, 2008). Generalno, iako su antibiotik-rezistentne

enterokoke izolovane iz hrane, mali je udeo onih koje su rezistentne na klinički važne

Master rad


43

antibiotike, poput vankomicina, ampicilina, penicilina, gentamicina i td. (Ogier i Serror,

2008).

Već je navedeno da za rod Leuconostoc karakteristična urođena rezistencija na

vankomicin, zbog prisustva D-Ala-D-Lac u peptidoglikanu, umesto D-Ala- D-Ala, za koji se

molekul vankomicina vezuje, i tako sprečava sintezu ćelijskog zida (Ogier i sar., 2008). Osim

izolata DK1-44, koji je pokazao rezistenciju na ciprofloksacin (MIK>40 μg/ml), ostali izolati su

osetljivi na upotrebljene antibiotike iz grupe β-laktama, glikopeptida, aminoglikozida,

linkozamida, makrolida, tetraciklina, hloramfenikola i fluorohinolona. Za 72,2% izolata

leukonostoka, vrednost MIK ciprofloksacina je ≥4 μg/ml (Zarazaga i sar., 1999). Generalno,

predstavnici ovog roda veoma retko pokazuju rezistenciju na antibiotike od kliničkog značaja

(Ogier i sar., 2008). U istraživanju sprovedenom od strane Swensona i saradnika (1999), svi

izolati leukonostoka pokazali su osetljivost na eritromicin i gentamicin, 98% izolata bilo je

osetljivo na hloramfenikol, 77% na tetraciklin, 24% na ciprofloksacin i svega 2% na

ampicilin. Vrednosti MIK za eritromicin, dobijene u ovom istraživanju su u opsegu od

≤0,0098 μg/ml do 0,625 μg/ml, koji je nešto širi u odnosu na rezultate dobijene u

istraživanju sprovedenom od strane Zarazaga i saradnika (1999), koji je od 0,03 μg/ml do

0,5 μg/ml. Svi izolati leukonostoka osetljivi su na hloramfenikol, eritromicin, bacitracin i

penicillin, a rezistentni na sulfatiazol i trimetoprim (Holt i sar., 2001).

Kada su laktobacili u pitanju, s obzirom na njihovu heterogenost, nivoi rezistencije na

neki antibiotik mogu varirati čak i u okviru jedne vrste laktobacila (Mathur i Singh, 2005). U

ovom radu detektovani su vankomicin-rezistentni Lb. paracasei izolati, pri čemu se smatra da

je ova rezistencija urođena (Delgado i sar., 2005; Florez i sar., 2005). Rezistencija na

vankomicin detektovana je i kod dva Lb. plantarum izolata. U istraživanju sprovedenom od

strane Cherkashin i saradnika (2013), u kojem su uporedo proučavani izolati laktobacila iz

mlečnih proizvoda industrijske i domaće proizvodnje, uočena je rezistencija na vankomicin i

to kod svih izolata iz domaćih proizvoda i kod 87,5% izolata iz industrijskih proizvoda. Jedan

izolat vrste Lb. paracasei (MK3-24) pokazao je rezistenciju na gentamicin u disk difuzionoj

metodi, dok u mikrodilucionoj i agar dilucionoj metodi nije pokazao rast u prisustvu ovog

antibiotika. Generalno, testirani laktobacili pokazali su nizak nivo osetljivosti prema

gentamicinu. Anaerobni laktobacili odlikuju se urođenom rezistencijom na aminoglikozide, jer

je transport molekula antibiotika iz ove grupe kroz ćelijski membranu povezan sa elektron

transportnim sistemom, koji ne postoji kod anaeroba (Cherkashin i sar., 2013). Laktobacili

izolovani iz starter kultura za jogurt i sireve pokazali su rezistenciju na gentamicin i

ciprofloksacin, dok su na eritromicin, ampicilin i tetraciklin bili osetljivi (Hummel i sar., 2007).

Master rad


44

Na ostale antibiotike (ampicilin, klindamicin, eritromicin, tetraciklin, doksiciklin, hloramfenikol

i ciprofloksacin) laktobacili izolovani iz kajmaka, testirani u ovom radu, nisu pokazali

rezistenciju. Kao što je već navedeno, rezistencija laktobacila veoma varira. Izolati rezistentni

na eritromicin i/ili tetraciklin detektovani su od strane nekoliko istraživača (Swenson i sar.,

1990; Florez i sar., 2005; Ammor i sar., 2008; Bernardeau i sar., 2008; Comunian i sar.,

2010; Bulajić i Mijačević, 2011; Cherkashin i sar., 2013; Devirgiliis i sar., 2013). Svi izolati

laktobacila, u istraživanju Swenson i saradnika (1990), bili su osetljivi na eritromicin,

gentamicin i hloramfenikol. Osetljivost na hloramfenikol takođe varira. Na primer, svi izolati iz

domaćih mlečnih proizvoda osetljivi su na hloramfenikol, dok je 8,3% izolata iz industrijski

proizvedenih namirnica bilo rezistentno (Cherkashin i sar., 2013). U istraživanju Swensona i

saradnika (1990), svi izolati bili su osetljivi na hloramfenikol, a isti je slučaj i sa rezultatima

istraživanja sprovedenim od strane Ammor i saradnika (2008). Rezistencija na hloramfenikol

uočena je u par istraživanja (Florez i sar., 2005; Bernardeau i sar., 2008; Cherkashin i sar.,

2013). Ni jedan od 22 izolata Lb. plantarum nije pokazao rezistenciju na hloramfenikol,

tetraciklin, eritromicin, vankomicin i klindamicin (Devirgiliis i sar., 2013). Rezistencija na

ciprofloksacin nije učestala, iako ima podataka o rezistentnim izolatima (Swenson i sar.,

1990; Cherkashin i sar., 2013).

Master rad


45

6. Zaključak

Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:

1) Svi testirani izolati, koji pripadaju vrstama Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium,

L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei i Lb. plantarum su osetljivi na

ampicilin, eritromicin, tetraciklin, doksiciklin i hloramfenikol.

2) Većina izolata osetljiva je na antibiotike gentamicin, klindamicin, vankomicin i

ciprofloksacin.

3) Rezistencija na gentamicin prisutna je kod jednog izolata vrsta Lc. lactis ssp. lactis, E.

faecium i Lb. paracasei i kod dva izolata vrste E. faecalis

4) Rezistencija na klindamicin prisutna je kod pet izolata i to jednog Lc. lactis ssp. lactis i

E. faecalis izolata i tri E. faecium izolata.

5) Rezistencija na vankomicin prisutna je kod dva izolata vrste Lb. plantarum.

6) Rezistencija na ciprofloksacin prisutna je kod jednog izolata vrste L. mesenteroides.

7) Rezultati za rezistentnost na antibiotike veoma variraju između različitih metoda koje

su korišćene u ovom radu.

Master rad


46

7. Literatura

Ammor, M. S., Florez, A. B., van Hoek, A. H., de los Reyes-Gavilan, C. G., Aarts, H. J.,

Margolles, A., & Mayo, B., 2008: Molecular characterization of intrinsic and acquired

antibiotic resistance in lactic acid bacteria and bifidobacteria. - Journal of Molecular

Microbiology and Biotechnology 14: 6-15.

Andrews, J. M., 2001: Determination of minimum inhibitory concentrations. - Journal of

antimicrobial Chemotherapy 48 (suppl 1): 5-16.

Bernardeau, M., Vernoux, J. P., Henri-Dubernet, S., & Gueguen, M., 2008: Safety

assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. - International journal

of food microbiology 126: 278-285.

Bhavani, A. L., & Nisha, J., 2010: Dextran—the polysaccharide with versatile uses. - Int J

Pharm Biol Sci 1: 569-573.

Bulajić, S., Mijačević, Z., & Savić-Radovanović, R., 2008: Rezistencija bakterija mlečne

kiseline na antimikrobne lekove. - Veterinarski glasnik 62: 329-340.

Bulajić, S., & Mijačević, Z., 2011: Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated

from Sombor cheese. - Acta veterinaria 61: 247-258.

Campedelli, I., Flórez, A. B., Salvetti, E., Delgado, S., Orrù, L., Cattivelli, L., ... & Mayo, B.,

2015: Draft genome sequence of three antibiotic-resistant Leuconostoc

mesenteroides strains of dairy origin. - Genome announcements 3(5): e01018-15.

Cherkashin, A., Chobert, J. M., Efimochkina, N., Sheveleva, S., & Haertlé, T., 2013: Antibiotic

Resistance of lactic Acid Bacteria Used in Russian Dairy and Probiotic Products. -

European Researcher 44: 654-659.

Çitak, S., Yucel, N., & Orhan, S., 2004: Antibiotic resistance and incidence of Enterococcus

species in Turkish white cheese. - International journal of dairy technology 57(1):

27-31.

Master rad


47

Comunian, R., Daga, E., Dupré, I., Paba, A., Devirgiliis, C., Piccioni, V., ... & Giraffa, G.,

2010: Susceptibility to tetracycline and erythromycin of Lactobacillus paracasei strains

isolated from traditional Italian fermented foods. - International journal of food

microbiology 138: 151-156.

Clewell, D. B., 1993: Bacterial sex pheromone-induced plasmid transfer. – Cell 73(1): 9-12.

Delgado, S., Flórez, A. B., & Mayo, B., 2005: Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and

Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract. - Current microbiology

50(4): 202-207.

Devirgiliis, C., Barile, S., Caravelli, A., Coppola, D., & Perozzi, G., 2010: Identification of

tetracycline‐and erythromycin‐resistant Gram‐positive cocci within the fermenting

microflora of an Italian dairy food product. - Journal of applied microbiology 109(1):

313-323.

Devirgiliis, C., Zinno, P., & Perozzi, G., 2013: Update on antibiotic resistance in foodborne

Lactobacillus and Lactococcus species. - Frontiers in microbiology 4,

Dušková, M., i Karpíšková, R., 2013: Antimicrobial resistance of lactobacilli isolated from

food. - Czech J Food Sci 31: 27-32.

Fisher, K., & Phillips, C., 2009: The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. –

Microbiology 155(6): 1749-1757.

Flórez, A. B., Delgado, S., & Mayo, B., 2005: Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria

isolated from a cheese environment. - Canadian journal of microbiology 5: 51-58.

Franz, C. M., Muscholl-Silberhorn, A. B., Yousif, N. M., Vancanneyt, M., Swings, J., &

Holzapfel, W. H., 2001: Incidence of virulence factors and antibiotic resistance among

enterococci isolated from food. - Applied and Environmental Microbiology 67(9):

4385-4389.

Holt, S. M., Al‐Sheikh, H., & Shin, K. J., 2001: Characterization of dextran‐producing

Leuconostoc strains. - Letters in applied microbiology 32(3): 185-189.

Huddleston, J. R., 2014: Horizontal gene transfer in the human gastrointestinal tract:

Potential spread of antibiotic resistance genes. - Infection and drug resistance 7:

167-176.

Master rad


48

Hummel, A. S., Hertel, C., Holzapfel, W. H., & Franz, C. M., 2007: Antibiotic resistances of

starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. - Applied and environmental

microbiology 73: 730-739.

Huys, G., D'haene, K., & Swings, J., 2002: Influence of the culture medium on antibiotic

susceptibility testing of food‐associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc

diffusion method. - Letters in applied microbiology 34(6): 402-406.

Huys, G., D'Haene, K., Collard, J. M., & Swings, J., 2004: Prevalence and molecular

characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. -

Applied and Environmental Microbiology 70(3): 1555-1562.

Joković, N., 2010: Diverzitet mlečno kiselinskih bakterija izolovanih iz kajmaka, PhD thesis -

Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Korhonen, J., 2010: Antibiotic resistance of Lactic acid bacteria, PhD thesis - Faculty of

Science and Forestry, University of Eastern Finland.

Mathur, S., & Singh, R., 2005: Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria—a review. -

International Journal of Food Microbiology 105(3): 281-295.

Mihajlov-Krstev, T., 2008: Radna sveska iz mikrobiologije. - Univerzitet u Nišu, Prirodno-

matematički fakultet, Odsek za biologiju sa ekologijom, Niš.

Mujezinović, I., 2011: Mechanism of action of antibiotics which inhibit synthesis of bacterial

cell wall. – Veterinaria 60(1-2): 69-77.

Najman, S., 2002: Osnovi molekularne i humane genetike-3. dopunjeno izdanje.- Savez

studenata Medicinskog fakulteta, Niš.

Ogier, J. C., & Serror, P.,2008: Safety assessment of dairy microorganisms: the Enterococcus

genus. - International journal of food microbiology 126(3): 291-301.

Ogier, J. C., Casalta, E., Farrokh, C., & Saïhi, A., 2008: Safety assessment of dairy

microorganisms: The Leuconostoc genus. - International journal of food microbiology

126(3): 286-290.

Petrović, O., Knežević, P., & Simeunović, J., 2007: Mikrobiologija: skripta za studente

biologije. - Daniel Print, Novi Sad.

Master rad


49

Säde, E., 2011: Leuconostoc spoilage of refrigerated, packaged foods, PhD thesis - Faculty of

Veterinary Medicine, University of Helsinki, Finland.

Swenson, J. M., Facklam, R. R., & Thornsberry, C., 1990: Antimicrobial susceptibility of

vancomycin-resistant Leuconostoc, Pediococcus, and Lactobacillus species. -

Antimicrobial agents and chemotherapy 34(4): 543-549.

Swenson, J. M., Ferraro, M. J., Sahm, D. F., Charache, P., & Tenover, F. C., 1992: New

vancomycin disk diffusion breakpoints for enterococci. - Journal of clinical

microbiology 30(10): 2525-2528.

Tannock, G. W., 2004: A special fondness for lactobacilli. - Applied and environmental

microbiology, 70(6), 3189-3194.

Teuber, M., Meile, L., & Schwarz, F., 1999: Acquired antibiotic resistance in lactic acid

bacteria from food. Antonie van Leeuwenhoek 76(1-4):115-137.

Varagić, V., M., Milošević, P., M. 2012: Farmakologija-23. prerađeno i dopunjeno izdanje. –

Elit Medica, Beograd.

Verraes, C., Van Boxstael, S., Van Meervenne, E., Van Coillie, E., Butaye, P., Catry, B., ...&

Herman, L., 2013: Antimicrobial resistance in the food chain: a review. - International

journal of environmental research and public health 10: 2643-2669.

Zarazaga, M., Sáenz, Y., Portillo, A., Tenorio, C., Ruiz-Larrea, F., Del Campo, R., ... & Torres,

C. 1999: In Vitro Activities of Ketolide HMR3647, Macrolides, and Other Antibiotics

against Lactobacillus, Leuconostoc, and Pediococcus Isolates. - Antimicrobial agents

and chemotherapy 43(12): 3039-3041.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Милица Лазаревић

Ментор, МН: Наташа Јоковић Наслов рада, НР: РЕЗИСТЕНЦИЈА БАКТЕРИЈА МЛЕЧНЕ КИСЕЛИНЕ ИЗОЛОВАНИХ ИЗ

КАЈМАКА НА АНТИБИОТИКЕ Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 49 стр. ; 7 слика, 19 табела

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: микробиологија хране

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: бактерије млечне киселине, резистенција, антибиотици

УДК (637.1 + 547.472.3) : 577.181

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У овом раду тестирано је 49 изолата бактерија млечне киселине (БМК),

изолованих из кајмака, за осетљивост на антибиотике, методама диск дифузије, микродилуције и агар дилуције. На основу добијених резултата може се закључити да су сви тестирани изолати, који припадају врстама Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei и Lb. plantarum осетљиви на ампицилин, еритромицин, тетрациклин, доксициклин и хлорамфеникол, док је већина изолата осетљива на антибиотике гентамицин, клиндамицин, ванкомицин и ципрофлоксацин. Резистенција на гентамицин присутна је код укупно пет изолата, по једног изолата врсте Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei и код два изолата врсте E. faecalis. Резистенција на клиндамицин такође је присутна код пет изолата и то једног Lc. lactis ssp. lactis и E. faecalis изолата и три E. faecium изолата. Два изолата врсте Lb. plantarum била су резистентна на ванкомицин, док је резистенција на ципрофлоксацин присутна код једног изолата врсте L. mesenteroides ssp. mesenteroides. Резултати за резистентност на антибиотике веома варирају између различитих метода које су коришћене у овом раду.

Датум прихватања теме, ДП: 07.10.2015.

Датум одбране, ДО:

29.12.2015.

Чланови комисије, КО: Председник: Др Татјана Михајилов-Крстев

Члан: Др Зорица Стојановић-Радић

Члан, ментор: Др Наташа Јоковић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Milica Lazarević

Mentor, MN: Nataša Joković Title, TI: ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED

FROM KAJMAK Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 49 p. ; 7 pictures, 19 tables

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: food microbiology

Subject/Key words, S/KW: lactic acid bacteria, resistance, antibiotics

UC (637.1 + 547.472.3) : 577.181

Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: The aim of this study was to evaluate the antibiotic susceptibility for 49 isolates

of lactic acid bacteria (LAB) isolated from kajmak with disk diffusion, microdilution and agar dilution method.

According to the results, all tested isolates belonging to species Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei and Lb. plantarum were susceptible to ampicillin, erythromycin, tetracycline, doxycycline and chloramphenicol, while most of isolates were

susceptible to gentamicin, clindamycin, vancomycin and ciprofloxacin. Five gentamicin-resistant isolates were detected (one Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei and two E. faecalis isolates). Five clindamycin -resistant isolates were also detected (one Lc. lactis ssp. lactis and E. faecalis and three E. faecium isolates). Two Lb. plantarum isolates were resistant to vancomycin and

one L. mesenteroides isolate was resistant to ciprofloxacin. The results of susceptibility testing showed variation between those three methods.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 07.10.2015.

Defended on, DE:

29.12.2015.

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev

Member: PhD Zorica Stojanović-Radić

Member, Mentor: PhD Nataša Joković

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Documents

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET · namirnica od mleka, mesa, povrća i žitarica. Ove bakterije prirodno nastanjuju pomenute namirnice ili se u njih namerno dodaju,