of 63 /63
SVEUČILIŠTE U ZAGREBU FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ Mia Ivanković DIPLOMSKI RAD Zagreb, rujan 2012.

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU FAKULTET KEMIJSKOG …bib.irb.hr/datoteka/595726.MiaIvankovic_diplomski_rad_konacno.pdfsveuČiliŠte u zagrebu fakultet kemijskog inŽenjerstva i tehnologije

  • Author
    others

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of SVEUČILIŠTE U ZAGREBU FAKULTET KEMIJSKOG...

  • SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

    FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

    SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ

    Mia Ivanković

    DIPLOMSKI RAD

    Zagreb, rujan 2012.

  • SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

    FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSVA I TEHNOLOGIJE

    SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ

    Mia Ivanković

    RAZVOJ POTPUNO INTEGRIRANOG PROCESA

    PROIZVODNJE HEKSANALA U MIKROKANALU

    DIPLOMSKI RAD

    Voditelj rada: dr. sc. Bruno Zelić, red. prof.

    Članovi ispitnog povjerenstva:

    dr. sc. Bruno Zelić, red. prof. (mentor)

    dr .sc. Aleksandra Sander, red. prof.

    dr. sc. Zvjezdana Findrik Blažević, docent

    Zagreb, rujan 2012.

  • i

    SAŽETAK

    Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatije kao green note.

    Zbog svojih organoleptičkih svojstava heksanal je našao široku primjenu u prehrambenoj,

    farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji, a zbog baktericidnih i fungicidnih svojstava primjenjuje

    se i u agronomiji. Uobičajeno se proizvodi fermentacijom s cijelim stanicama, ekstrakcijom iz

    biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi,

    formiranje neželjenih nusproizvoda i nastanak velike količine otpada pa je i više nego očita

    potreba za razvojem i primjenom novih tehnologija u proizvodnji heksanala. Kao jedna od novih

    tehnologija koje se koriste u proizvodnji heksanala sve se više nameću mikroreaktorski sustavi

    koji omogućuju bolji prijenos tvari i energije, manju potrošnju kemikalija i energije te druge

    prednosti u odnosu na konvencionalne reaktore.

    U ovom radu provedena je biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim alkohol

    dehidrogenazu u mikroreaktoru volumena 6 μL. Alkohol dehidrogenaza je enzim koji se ubraja u

    skupinu oksidoreduktaza kojima je zajednička karakteristika potreba za koenzimom. Kako je

    cijena koenzima NAD+ izuzetno visoka, nužno je procesom regeneracije reducirani oblik

    koenzima prevesti ponovno u oksidirani oblik. S tim ciljem razvijen je proces proizvodnje

    heksanala s potpuno integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno

    serijski povezana mikročipa. Ispitan je prijenos tvari između dvije faze paralelnog toka koji je

    uspostavljen u mikrokanalima te je razvijen 2D matematički model strujanja. Postavljen je i

    matematički model potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala s regeneracijom

    koenzima u mikroreaktoru, te je provedena ocjena valjanosti modela na podatcima nezavisnih

    pokusa. Pokazano je dobro slaganje matematičkog modela procesa i eksperimentalnih podataka,

    a ovako razvijeni model pokazao se kao učinkovito sredstvo u daljnjem razvoju procesa.

    Ključne riječi: ADH, heksanal, mikroreaktor, matematički model procesa, potpuno integrirani

    proces

  • ii

    SUMMARY

    Hexanal is an essential part of the group of easily volatile components known as "green

    notes". Because of its organoleptic properties hexanal has found wide application in food,

    pharmaceutical and cosmetic industries, and due to its bactericidal and fungicidal properties is

    applied in agriculture. Normally it is produced by fermentation with whole cells and enzyme-

    catalyzed reactions or extracted from plants. The main disadvantages of these processes are low

    yields, formation of undesired by-products and the formation of large amounts of waste, so the

    need for development and application of new technologies in the production of hexanal is more

    than obvious. As one of the new technologies used in the production of hexanal, microreactor

    systems are increasingly being imposed as they allow better transfer of mass and energy, lower

    consumption of chemicals and energy, and other advantages over conventional reactors.

    In this work biocatalytic oxidation of hexanol with the enzyme alcohol dehydrogenase in

    6 μL microreactor was carried out. Alcohol dehydrogenase is an enzyme that belongs to the

    group of oxidoreductases, which share the characteristics of the need for coenzyme. As the price

    of coenzyme NAD+ is extremely high, it is necessary to regenerate a reduced form of coenzyme

    into the oxidized form. Therefore hexanal production process with fully integrated regeneration

    and recirculation of coenzyme in two serially connected microchips was developed. Mass

    transfer between the two phases established in microchannel was analysed and corresponding

    mathematical model of 2D flow was developed. Additionaly, mathematical model of a fully

    integrated hexanal production process with coenzyme regeneration in microreactor was

    developed. Validation of the model was performed using data from independent experiments.

    The good agreement between simulation and experimental results was observed.

    Key words: ADH, hexanal, microreactor, mathematical model, fully integrated process

  • Sadržaj

    iii

    SADRŽAJ

    1. UVOD ..................................................................................................................................... 1

    2. TEORIJSKI DIO ................................................................................................................... 3

    2.1. Heksanal ............................................................................................................................... 3

    2.2. Enzimi .................................................................................................................................. 4

    2.2.1. Oksidoreduktaze ............................................................................................................ 5

    2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH) ...................................................................................... 5

    2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ............................................................ 6

    2.3. Kinetika enzimskih reakcija ................................................................................................. 8

    2.4. Mikroreaktori ..................................................................................................................... 10

    2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora .............................................................................. 10

    2.4.2. Struktura mikroreaktora .............................................................................................. 11

    2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH .......................................................... 14

    3. MATERIJALI I METODE ................................................................................................ 15

    3.1. Materijali ............................................................................................................................ 15

    3.1.1. Kemikalije .................................................................................................................... 15

    3.1.2. Priprema otopina ......................................................................................................... 15

    3.1.3. Aparatura..................................................................................................................... 16

    3.2. Analitičke metode .............................................................................................................. 19

    3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH ................................................................................. 19

    3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH .................................................................................... 20

    3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala ........................................................... 20

    3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola ................................................................................... 21

    3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru...................................................................................... 21

    3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola...................................................................... 21

    3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+ ........................................................ 22

    3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

    serijski povezanim mikroreaktorima ..................................................................................... 23

    3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala .................................. 24

    3.4. Obrada podataka ................................................................................................................. 25

  • Sadržaj

    iv

    4. REZULTATI I RASPRAVA .............................................................................................. 27

    4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu .......................................................................................... 27

    4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom strujanju u

    mikrokanalu ........................................................................................................................... 29

    4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu .............................................................................................. 30

    4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima ..................................... 30

    4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola ........................................ 35

    4.3. Reakcija oksidacije heksanola ............................................................................................ 37

    4.4. Reakcija regeneracije koenzima ......................................................................................... 38

    4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

    povezanim mikroreaktorima ..................................................................................................... 39

    4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala ............................................................. 40

    5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 44

    6. LITERATURA..................................................................................................................... 46

    7. POPIS SIMBOLA................................................................................................................ 49

    8. PRILOZI .............................................................................................................................. 51

    8.1. Baždarni pravci .................................................................................................................. 51

    8.2. Kromatogrami .................................................................................................................... 53

    8.3. Jednodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

    Scientist ..................................................................................................................................... 54

    8.4. Dvodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

    MATLAB .................................................................................................................................. 54

    ŽIVOTOPIS

  • 1. Uvod

    1

    1. UVOD

    Green note spojevi su većinske komponente svježih, zelenih aroma povrća i voća poput

    jabuka, višanja, kiwija, brusnica, jagoda i rajčica. Ove kemikalije se koriste u prehrambenoj

    industriji kao dodatak za postizanje svježeg okusa u pićima i hrani. Procijenjena tržišna

    vrijednost pred petnaestak godina im je bila otprilike 20 – 40 milijuna $ godišnje [Whitehead et

    al. 1995]. Većinu tih spojeva čine aldehidi i alkoholi sa šest ugljikovih atoma. Jedan od takvih je

    heksanal [Gargouri et al. 2004]. Heksanal se, osim u prehrambenoj industriji, koristi i u

    farmaceutskoj i agrokemijskoj industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Santiago- Gómez

    et al. 2009]. Heksanal je spoj koji se nalazi u prirodi u lipoksigenazi biljaka koja služi kao

    preteča za proizvodnju alkohola i estera koji su često korišteni u proizvodnji aroma [Hildebrand

    1989].

    Opisano je nekoliko procesa proizvodnje heksanala koji su temeljeni na fermentaciji,

    ekstrakciji iz biljaka i enzimski kataliziranim reakcijama [Whitehead et al. 1995, Márczy et al.

    2002, Brunerie & Koziet 1997]. Zbog male količine dobivenog proizvoda, formacije velike

    količine sporednih produkata i otpada, tradicionalni spojevi kao što su aromatski alkoholi ili

    alkilni aromati, nisu prihvatljivi reaktanti za proizvodnju heksanala [Yokoyama & Yamagata

    2001]. Jedan od prihvatljivijih načina proizvodnje heksanala je enzimski katalizirana reakcija uz

    koenzim NAD+. Upotreba koenzima NAD

    + u organskim sintezama ograničena je činjenicom da

    je koenzim prilično skup reagens, koji se mora dodati u stehiometrijskom omjeru. Kako se

    njegovo oksidacijsko stanje tijekom reakcije mijenja, potrebno ga je regenerirati in situ

    uporabom druge redoks reakcije. Regeneracijom koenzima redukcijom acetaldehida, osim što se

    postiže znatna ušteda na koenzimu, može se utjecati i na pomicanje reakcijske ravnoteže u

    željenom smjeru.

    U današnje vrijeme ulažu se veliki napori u razvoj novih proizvodnih tehnika i procesa.

    Primjena mikroreaktora u provedbi kemijskih i biokemijskih reakcija bi mogla predstavljati novu

    generaciju proizvodnih procesa, a biotransformacije u mikroreaktorima mogu činiti dobru

    alternativu procesima klasične kemijske sinteze [Šalić et al. 2010]. Mikroreaktori su našli široku

    primjenu u različitim područjima počevši od klasičnih kemijskih sinteza pa sve do

    biotehnoloških procesa i zaštite okoliša. Mikroreaktori se sve više primjenjuju i u industrijskim

    procesima zahvaljujući svojim prednostima poput velike brzine prijenosa tvari i topline te

  • 1. Uvod

    2

    mogućnosti provedbe egzotermnih ili eksplozivnih reakcija koje zahtjevaju intenzivan nadzor i

    provode se pod strožim uvjetima [Jensen 2001]. Velika brzina prijenosa tvari i topline u

    mikroreaktoru posljedica je smanjene difuzijske udaljenosti unutar reaktora i velike međufazne

    površine po jedinici volumena reaktora u odnosu na konvencionalne makroreaktore. Zbog ovih

    prednosti mikroreaktorske tehnologije se sve vise primjenjuju u farmaceutskoj industriji i

    industriji finih kemikalija [Geyer et al. 2006]. Jedno od bitnih područja istraživanja je i primjena

    enzimatskih mikroreaktora. Enzimatski mikroreaktori se uobičajeno dijele na dvije vrste, oni koji

    se koriste u biotransformacijama i oni koji se koriste za ispitivanje kinetike, odnosno interakcija

    različitih supstrata i produkata u enzimski kataliziranim reakcijama [Urban et al. 2006].

  • 2. Teorijski dio

    3

    2. TEORIJSKI DIO

    2.1. Heksanal

    Heksanal ili kapronaldehid je aldehid molekulske formule C6H12O. Ima specifičan miris,

    topljiv je u alkoholu i ulju, ali slabo topljiv u vodi. Važan je element mirisa cvijeta i lista biljaka

    kao što su jabuka, avokado i borovnica. Nastaje tijekom ciklusa linoleinske kiseline (LOX). U

    tom ciklusu, linoleinska kiselina uz enzim lipoksigenazu, te uz prisutstvo kisika, kao kosupstrata

    prelazi u 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadiensku kiselinu (13-HPOD). U drugom koraku, ta se

    kiselina uz hidroperoksid liazu raspada na 12-okso-9-dodekensku kiselinu i heksanal [Márczy et

    al. 2002].

    Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatijih kao green-

    note. Ove komponente su kemikalije koje se upotrebljavaju u prehrambenoj i kozmetičkoj

    industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Schade et al. 2003]. U današnje vrijeme postoji

    povećano zanimanje da se kemijska proizvodnja green-note proizvoda zamijeni biološkom

    prirodnom proizvodnjom. Potrošnja ovih proizvoda dobivenih prirodnim putem se procijenjuje

    na 5- 10 tona godišnje [Muller et al. 1995].

    Osim upotrebe u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji heksanal se koristi i kao

    fungicid i baktericid. Dokazano je da kada se pri uzgoju jabuka koristi kao fungicid istovremeno

    djeluje i na poboljšanje okusa ploda [Song et al. 1996].

    Prirodnim putem heksanal se proizvodi fermentacijama, ekstrakcijom iz biljaka ili

    enzimski kataliziranim reakcijama. Prilikom upotrebe enzima koriste se pročišćeni enzimi,

    ekstrakti stanica, te cijele stanice. Primjer upotrebe izoliranog enzima je alkohol dehidrogenaza

    koja je katalizira oksidaciju heksanola kojeg je u prirodi puno više nego heksanala [Karra-

    Chaabouni et al. 2002]. Uz enzimske ekstrakte, heksanal se proizvodi iz linoleinske kiseline, pa

    se za njegovu pripravu koriste stanice raznih biljaka (metvica, jagoda, rajčica, karanfil) koje

    sadrže enzime LOX ciklusa. Uz cijele stanice, aldehidi se proizvode mikrobiološkom

    oksidacijom primarnih alkohola uz korištenje bakterija Acetobacter i Gluconobacter u

    dvofaznom mediju [Vrsalović Presečki 2006] .

  • 2. Teorijski dio

    4

    Kemijskim putem heksanal se proizvodi oksidacijom heksanola uz katalizator

    oksoaminijevu sol [Yamaguchi et al. 1990] ili uz metalne katalizatore (mangan, cink, bakar,

    željezo) uz prisutstvo vodikovog peroksida [Guangdong et al. 2005]. Isto tako kemijski se može

    proizvesti redukcijom estera, etil heksanoata, uz litij aluminij hidrid ili heksan kiseline uz

    katalizator Cr2O3/TiO2 [Vrsalović Presečki 2006].

    2.2. Enzimi

    Naziv enzim prvi je upotrijebio Kuhne (1878. godine), a potječe od grčke riječi en ziyme

    koja znači u kvascu. Još od vremena prije starog Egipta datira prva uporaba enzima za ljudske

    potrebe (kvasac u proizvodnji kruha). Danas postoji čitav niz izoliranih enzima tako da je 1989.

    izoliran 2461 enzim dok je 1947. bilo tek 200 izoliranih enzima [Vrsalović Presečki 2006].

    Enzimi su organske makromolekule proteinskog sastava. To su biološki katalizatori, koji

    ubrzavaju kemijske reakcije, a da se pri tome ne troše i ne mijenjaju. Vrlo su aktivni jer vrlo

    mala količina enzima ubrzava reakciju 1020

    puta. Aktivnost enzima izražava se kao količina

    pretvorenog supstrata u mikromolovima u jedinici vremena.

    Djelovanje enzima započinje tvorbom kompleksa sa supstratom koji ima manju energiju

    aktivacije nego aktivirani intermedijer supstrata bez enzima (slika 1). U tom je kompleksu enzim

    vezan uz supstrat Van der Waalsovim i elektrostatskim silama, vodikovim vezama ili rijeđe,

    kovalentnom vezom. Kompleksiranje mora biti brzo i reverzibilno, tako da se produkt odvaja od

    enzima odmah nakon reakcije i oslobađa enzim za daljnje katalitičko djelovanje. Dok su neki

    enzimi strogo specifični i djeluju samo na jedan supstrat, drugi su manje ili grupno specifični.

    Specifičnost enzima se očituje i prema djelovima molekule koji su udaljeni od mjesta djelovanja

    enzima [Schmid et al. 2001].

    Slika 1. Mehanizam enzimatske reakcije

  • 2. Teorijski dio

    5

    Prednosti enzima pred klasičnim kemijskim katalizatorima su: selektivno i specifično

    djelovanje, blagi uvjeti provedbe reakcija (pH, tlak, temperatura), potrebne male količine,

    biorazgradljivost, obnovljivost izvora, provedba kompleksnih reakcija u jednom stupnju. Glavni

    nedostatci enzima su visoka cijene pročišćavanja i izolacije, teško i skupo odvajanje od

    reakcijske smjese, inaktivacija temperaturom, kiselošću, bazičnošću, podložnost ihibiciji

    supstratom ili produktom, nestabilnost izvan prirodnog okruženja.

    Upotreba enzima seže od primjene u industriji detergenata, prehrambenoj, naftnoj,

    tekstilnoj te do najvažnije, organske sinteze u svrhu proizvodnje vrlo kompleksnih lijekova.

    Enzimi se djele u nekoliko skupina: oksidoreduktaze (enzimi koji kataliziraju biološke

    oksidacije i redukcije), transferaze (enzimi koji kataliziraju prijenos skupina), hidrolaze (enzimi

    koji kataliziraju hidrolitička cjepanja), liaze (enzimi koji kataliziraju reakcije eliminacije),

    izomeraze (enzimi koji kataliziraju pregradnju unutar molekula), ligaze (enzimi koji kataliziraju

    stvaranje veze uz istovremeno cijepanje ATP-a) [Louglin 2000].

    2.2.1. Oksidoreduktaze

    Oksidoreduktaze su enzimi koji kataliziraju redoks reakcije prijenosom vodikovog ili

    kisikovog atoma ili elektrona od jednog supstrata do drugog [Vrsalović Presečki 2006]. Dijelimo

    ih na dehidrogenaze, oksigenaze i oksidaze. Imaju veliku važnost u organskim sintezama zbog

    velikog broja supstrata s kojima reagiraju kao i zbog posjedovanja enantio-, regio- i

    stereoselektivnih svojstava [Sariaslani & Rosazza 1984]. Karakteristika oksidoreduktaza je da

    prilikom kataliziranja reakcija, zahtijevaju prisutnost koenzima. Oksidoreduktaze se primjenjuju

    za sintezu lijekova, steroida, polimera, oksidativnu razgradnju zagađivača, te za konstrukciju

    biosenzora za različite analitičke i kliničke primjene [May 1999].

    2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH)

    Alkohol dehidrogenaza (ADH) je oksidoreduktaza koja je široko rasprostranjena u

    prirodi. Može se pronaći u mnogim životinjama, biljkama i mikroorganizmima. Ima važnu ulogu

  • 2. Teorijski dio

    6

    u širokom rasponu fizioloških procesa [Reid & Fewson 1994]. Poznato je da je ADH tetramer

    sastavljen od podjedinica molekulske mase približno 35.000, koje su vrlo slične, no nisu

    identične [Harris 1964].

    Slika 2. Pojednostavljeni prikaz molekule enzima ADH

    Općenito se alkohol dehidrogenaze dijele u tri skupine, srednjočlana Zn-ovisna ADH kao

    ADH iz konjske jetre i ADH iz Saccharomyces cerevisiae, kratkolančana Zn-neovisna ADH kao

    ADH iz Lactobacillus brevis i dugolančana Fe-ovisna ADH kao ADH IV iz S. cerevisiae

    [Jornvall et al. 1987]. ADH katalizira reverzibilnu oksidaciju alkohola u odgovarajući aldehid ili

    keton. U različitim ogranizmima otkrivene su ADH koje kataliziraju stereospecifičnu redukciju

    karbonilnih grupa. Alkohol dehidrogenaza komercijalno se proizvodi za određivanje alkohola u

    procesima i u ljudskom tijelu, odnosno tjelesnim tekućinama [Vrsalović Presečki 2006].

    2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+)

    Osnovna zadaća koenzima je da djeluju kao transporteri kemijskih grupa od jednog do

    drugog reaktanta. Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) uključen je u mnoge oksidacijske

    procese katalizirane dehidrogenazama [Kane 2008]. Nikotinamidni prsten je redoks aktivan,

    prima vodikov ion pri čemu se reducira u NADH. Reverzibilni transfer vodikovog iona iz

    reduciranog supstrata u NAD+ i obrnuto je stereoselektivan i karakterističan za svaki pojedini

    enzim [Bruiee & Benkovic 1965]. Nikotinamid koenzimi obično se ne vežu na enzime

  • 2. Teorijski dio

    7

    kovalentnom vezom pa se lagano disociraju. Preskupi su da bi ih se koristilo kao reagense u

    stehiometrijskom omjeru, stoga je potrebno pronaći način njihove regeneracije ukoliko enzim

    zahtijeva prisutnost koenzima.

    Slika 3. Struktura koenzima NAD(P)

    Regeneracijom koenzima može se utjecati na pomicanje reakcijske ravnoteže.

    Termodinamički nepovoljnu reakciju može se, spajanjem s reakcijom regeneracije koenzima,

    pretvoriti u termodinamički povoljnu sprečavanjem akumulacije produkta koenzima koji bi

    mogao inhibirati proces. U praksi se koristi reducirani oblik nikotinamid koenzima (NADH)

    zbog niže cijene od njegovog oksidiranog oblika (NAD+). Postoje različite metode regeneracije

    koenzima, ali sve moraju biti regioselektivne, kompatibilne s glavnom enzimskom reakcijom,

    praktične, jeftine, te moraju regenerirati koenzim od 102 do 10

    5 puta. Trenutno jedino enzimi

    omogućavaju tako visoku selektivnost redukcije NAD+ u NADH i obrnuto. Proces regeneracije

    enzimom može se provesti istim enzimom kao u glavnoj reakciji ili enzimom različitim od onog

    koji se koristi u glavnoj reakciji. Druge metode koje se temelje na kemijskim, elektrokemijskim i

    fotokemijskim strategijama nisu dovoljno selektivne [Yoon et al. 2005].

    Za učinkovitu

    regeneraciju koenzima nužno je da su potrebni enzimi, reagensi i oprema dostupni na tržištu,

    jeftini i jednostavni za korištenje.

  • 2. Teorijski dio

    8

    Slika 4. Mehanizam regeneracije koenzima drugim enzimom

    Slika 5. Mehanizam elektrokemijske regeneracije koenzima

    2.3. Kinetika enzimskih reakcija

    Kinetički model reakcije je matematički izraz koji opisuje zavisnost brzine reakcije o

    reakcijskim veličinama i parametrima [Gomzi 1998].

    Brzina jednosupstratnih enzimskih reakcija opisuje se Michaelis-Menteničinom

    kinetičkom jednadžbom [Dunn et al. 1992]. U navedenoj jednadžbi ovisnost početne brzine

    reakcije o koncentraciji supstrata i enzima temelji se na mehanizmu prikazanom sljedećim

    jednadžbama:

    (1)

    U prvom koraku dolazi do reverzibilne reakcije enzima (E) i supstrata (S) pri čemu

    nastaje kompleks enzim-supstrat (ES). Taj kompleks se potom kemijski mijenja što rezultira

    stvaranjem produkta (P) i njegovim odvajanjem od enzima. Jednadžba koja opisuje Michaelis-

    Menteničinu kinetiku za jednosupstratne enzimske reakcije glasi (jednadžba 2):

    S

    S

    m

    Sm

    cK

    cVr

    (2)

  • 2. Teorijski dio

    9

    U navedenom izrazu cS označava koncentraciju supstrata, Vm maksimalnu brzinu reakcije,

    KmS Michaelis-Menteničinu konstantu.

    Dvosupstratna enzimska kinetika sačinjava glavninu svih enzimskih reakcija [Blanch &

    Clark 1993], a drugi supstrat je najčešće koenzim. Michaelis-Menteničin kinetički model za

    dvosupstratnu reakciju, prikazan je sljedećom jednadžbom (jednadžba 3):

    2S2Sm1S1Sm2S1Sm

    cKcK

    ccVr

    (3)

    U reakcijama biotransformacije vrlo često dolazi do inhibicije i deaktivacije enzima.

    Inhibicija enzimski katalizirane reakcije javlja se kada se neki spoj, inhibitor, veže na aktivno

    mjesto enzima te tako smanjuje brzinu reakcije. Inhibitor može biti supstrat ili produkt neke

    kemijske reakcije. Tri su tipa reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna (jednadžba 4),

    nekompetitivna (jednadžba 5) i antikompetitivna (jednadžba 6) [Laidler & Bunting 1973].

    SP

    i

    PS

    m

    Sm

    cK

    c1K

    cVr

    (4)

    P

    i

    PS

    S

    m

    Sm

    K

    c1cK

    cVr (5)

    P

    i

    PS

    S

    m

    Sm

    K

    c1cK

    cVr (6)

    Kod kompetitivne inhibicije, inhibitor se veže za aktivno mjesto na enzimu te se pritom

    natječe sa supstratom za to mjesto. Inhibitor konkurira za aktivno mjesto i smanjuje na njemu

    koncentraciju supstrata. To se očituje kao smanjenje brzine reakcije pri niskim koncentracijama

    supstrata, a rezultat je povećanje vrijednosti Michaelis-Menteničine konstante. Kod

    nekompetitivne inhibicije dolazi do ireverzibilnog vezanja inhibitora na mjesto različito od

    aktivnog te se tako ometa vezanje supstrata na aktivno mjesto i inhibira brzina enzimske

    reakcije. Antikompetitivna inhibicija je kombinacija dviju prethodno navedenih inhibicija.

    Drugi razlog zbog kojeg može doći do smanjenja reakcijske brzine je deaktivacija

    enzima. Uzrok smanjenja aktivnosti enzima se vrlo često ne može odrediti. Mogući razlozi

    deakcivacije su temperatura, tlak, pH, brzina miješanja, denaturacija proteina, prisutnost ili

  • 2. Teorijski dio

    10

    odsutnost neke komponente ili kombinacija navedenih faktora [Vrsalović Presečki 2006]. Brzina

    deaktivacije enzima se najčešće opisuje kinetikom prvog (jednadžba 7) i drugog reda (jednadžba

    8) [Laidler & Bunting 1973].

    md

    m Vkdt

    dV (7)

    2

    md

    m Vkdt

    dV (8)

    2.4. Mikroreaktori

    2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora

    Mikroreaktori su reaktorski sustavi izvedeni u mikroskopskom mjerilu koji su, u cijelosti

    ili barem djelomično, proizvedeni korištenjem metodologije mikrotehnologije i

    mikroinženjerstva. Sastoje se od mikrokanala izrazito malih dimenzija, karakterističnih veličina

    od 10 - 500 μm, urezanih u pločice od stakla, silikona, silicija, polimera, i različitih drugih

    materijala (slika 6) [Šalić et al. 2010]. Glavna karakteristika tih sustava je smanjenje volumena

    procesne opreme na red veličine od desetak nanolitara do jednog mililitra. Zahvaljujući svojim

    mikroskopskim dimenzijama mikroreaktori se odlikuju brojnim prednostima u odnosu na

    konvencionalne/klasične makroreaktore. Tako mikroreaktori zauzimaju manje prostora, za

    provedbu reakcija potrebna je manja količina kemikalija i energije, a značajno se smanjuje i

    vrijeme provedbe reakcije [Nassar et al. 2007].

    Slika 6. Mikroreaktori

  • 2. Teorijski dio

    11

    S druge strane volumen mikroreaktora je još uvijek prevelik da bi njegove dimenzije

    utjecale na tijek odvijanja reakcije na molekularnoj razini, ali njegove male karakteristične

    dimenzije rezultiraju intenzivnijim prijenosom tvari i energije, i unaprjeđenjem režima strujanja.

    U mikroreaktorima je tok fluida obično laminaran, dok u klasičnim reaktorima može biti

    laminaran i turbulentan. Kada su prijenos tvari i topline ograničavajući čimbenici, mikroreaktori

    su pogodniji za provedbu ovakvih procesa zbog intenzivnijeg prijenosa tvari i topline. Za

    mikroreaktore je karakterističan i izrazito velik omjer površine prema ukupnom volumenu.

    Odnos površine prema volumenu raste sa smanjenjem promjera reaktora. Za mikroreaktore je

    omjer površine prema volumenu u rasponu veličina od 103 – 10

    5 m

    2 m

    -3, dok je ta vrijednost za

    makroskopske reaktore oko 102 m

    2 m

    -3 [Matsushita et al. 2007]. Primjerice, prenošenjem procesa

    iz reaktora volumena 1 dm3 u reaktor volumena 30 m

    3 (nisu geometrijski slični sustavi), omjer

    površine prema volumenu smanjuje se 30 puta. U slučaju prenošenja procesa u mikroreaktor

    volumena 30 cm3, taj omjer raste 3000 puta [Wörz et al. 2001]. Razlika mikroreaktora i

    makroreaktora je i u tome što stjenka mikroreaktora ima mnogo veći utjecaj na strujanje fluida

    nego stjenka konvencionalnih reaktora.

    Većina današnjih istraživanja vezanih uz primjenu mikrokanala usmjerena je prema

    razvoju mikrosustava za provedbu i analizu procesa (eng. micro-total-analysis-systems, μ-TAS).

    U idealnim uvjetima takvi sustavi istovremeno obavljaju pripremu uzorka, miješanje, reakciju,

    separaciju, detekciju i obradu podataka. Smatra se da će se zbog mogućnosti dobrog ugađanja

    protoka i male koncentracije potrebnih reaktanata takvi sustavi moći ugraditi na teško dostupna

    mjesta (ljudsko tijelo, dijelovi postrojenja, dna oceana, vrhovi planina, pustinje, polovi,

    svemirske letjelice i slično) te kontinuirano pratiti kemijske i biokemijske procese koji se tamo

    odvijaju. Trenutno je najviše pozornosti usmjereno prema istraživanju i razvoju μ-TAS koji se

    primjenjuju u analizi DNA i ključnih metabolita vezanih uz različite bolesti [Šalić et al. 2010].

    2.4.2. Struktura mikroreaktora

    Karakteristične dimenzije unutrašnjih struktura mikroreaktora uglavnom se nalaze u mili-

    , mikro- ili nanopodručju s užim ili širim rasponom veličina pojedinih dijelova uređaja koji su

    prikazani na slici 7.

  • 2. Teorijski dio

    12

    Slika 7. Osnovne strukturne jedinice mikroreaktora

    Mikrokanali (slika 7a) su osnovne građevne jedinice mikroreaktora, a u većini slučajeva

    su paralelni i nalaze se u nizu jedan do drugoga. Omeđeni su spojnicama za dovod reaktanata i

    odvod produkata. Mogu biti pravokutnog ili kružnog poprečnog presjeka, površine od nekoliko

    μm2 do nekoliko mm

    2. Mikrokanali se urezuju u pločice od različitih materijala (npr. metal,

    plastika, keramika) različitim tehnologijama urezivanja, što ima za posljedicu različita svojstva

    površine mikrokanala, koja bitno utječu na karakteristike strujanja fluida i provedbu procesa.

    Svaki kanal može sadržavati manje komore, odnosno može se sastojati od još sitnijih

    mikrostruktura koje oblikom podsjećaju na pore [Šalić et al. 2010].

    Pojedini protočni kanal ili nekoliko povezanih kanala određene geometrije čini jedan

    mikroelement (slika 7b). Tipične dimenzije mikroelementa su 15 mm : 2 mm : 45 mm (širina :

    debljina : duljina). S obzirom na izvedbu elementa mikroreaktora, postoje oni s više

  • 2. Teorijski dio

    13

    ulaznih/izlaznih procesnih tokova koji se spajaju/razdvajaju u zajedničke/odvojene tokove

    pomoću tzv. „Y“ ili „T“ spojnica (slika 8).

    Slika 8. Prikaz „T“ i „Y“ spojnica

    Kombinacija mikroelementa, povezanih linija toka fluida i nosača čini jedan čip (slika

    7c.) koji omogućuje lakše povezivanje s vanjskim pumpama i detektorima te spajanje više

    elemenata serijski ili paralelno. Mikroreaktorski čipovi se međusobno povezuju paralelno ili

    serijski, kako bi se povećala protočnost i produktivnost sustava, s obzirom na protok reaktanata,

    produkata ili katalizatora. Takav način povezivanja najčešće se primjenjuje kod mikroreaktora

    koji se koriste za provođenje reakcija u plinskoj fazi. Nijedna elementarna ćelija ne može

    funkcionirati samostalno jer su joj za neovisan rad potrebni periferni uređaji kao što su

    odgovarajuće pumpe ili senzori.

    Naziv mikrouređaj odnosi se na element ugrađen u kućište, povezan odgovarajućim

    spojnicama s vanjskim pumpama za dovod reaktanata, katalizatora ili povratni tok reakcijske

    smjese (slika 7d). Mikrouređaj može biti sastavljen od nekoliko povezanih mikrouređaja, koji u

    tom slučaju čine njegove osnovne komponente. Paralelno ili serijski povezani mikrouređaji,

    odnosno različite mikroprocesne jedinice za pripremu reaktanata i katalizatora, provedbu

    reakcije i separaciju produkata predstavljaju tzv. mikropostrojenje. Građa i veličina

    mikropostrojenja ovisi o tipu reaktora koji ga čine i o vrsti reakcija koje se u njemu odvijaju te, u

    općenitom slučaju, o tome jesu li reaktori laboratorijskog ili industrijskog mjerila.

  • 2. Teorijski dio

    14

    2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH

    Biokatalitička oksidacija heksanola provodi se uz enzim alkohol dehidrogenazu pri čemu

    kao produkt nastaje heksanal. Za provođenje ove reakcije potrebno je u stehiometrijskom omjeru

    dodavati koenzim NAD+ u sustav. Reakcijom se koenzim NAD

    + reducira u NADH kojeg je

    potrebno regenerirati natrag u NAD+. Regeneracija koenzima NAD

    + može se provesti reakcijom

    redukcije acetaldehida uz koenzim NADH enzimom ADH. Reakcijski sustav prikazan je

    kemijskim jednadžbama na slici 9.

    Slika 9. Reakcijski sustav

    U dvosupstratnoj reakciji regeneracije acetaldehid se reducira do etanola s koenzimom

    NADH o kojem ovisi katalitičko djelovanje enzima alkohola dehidrogenaze. Ravnoteža ove

    reakcije pomaknuta je ulijevo, pa se udesno pomiče dodavanjem NAD+ u suvišku, podešavanjem

    povoljnog pH i dodatkom otopine semikarbazida za uklanjanje etanola.

  • 3. Materijali i metode

    15

    3. MATERIJALI I METODE

    U radu su provedeni pokusi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, regeneracije koenzima

    NAD+ u mikroreaktoru, reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

    povezanim mikroreaktorima, te potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala. Tijekom ovih

    procesa određivane su koncentracija NADH i aktivnost enzima NADH spektrofotometrijski, te

    koncentracije etanola, heksanola i heksanala plinskom kromatografijom.

    3.1. Materijali

    3.1.1. Kemikalije

    U ovom radu korištene su sljedeće kemikalije: acetaldehid (Fluka, Švicarska), acetonitril

    (J. T. Baker, Nizozemska), ADH (Sigma, Belgija), cikloheksanon (Carlo Erba Group,

    Francuska), etanol (Carlo Erba Group, Francuska), glicin (Sigma, Belgija), HCl (Kemika,

    Hrvatska), heksan (Merck, Njemačka), heksanal (Fluka, Švicarska), heksanol (Merck,

    Njemačka), NAD+ (Jülich Fine Chemicals, Njemačka), NADH (Jülich Fine Chemicals,

    Njemačka), pirofosfat (Kemika, Hrvatska).

    3.1.2. Priprema otopina

    Za pripremu glicin-pirofosfatnog pufera pH = 9 potrebno je otopiti 8,34 g Na4P2O7 10

    H2O i 0,42 g glicina u 250 cm3 redestilirane vode te podesiti pH otopine dodatkom 1 mol/dm

    3

    otopine HCl.

    1 mol/dm3 otopina HCl pripremljena je miješanjem 8,47 cm

    3 36 % - tne HCl sa 100 cm

    3

    destilirane vode.

    Otopina za određivanje baždarnog pravca za NADH c = 0,3 mmol/dm3 pripremljena je

    otapanjem 1,49 mg NADH u 7 cm3 glicin-pirofosfatnog pufera.

  • 3. Materijali i metode

    16

    Otopina za određivanje baždarnog pravca za etanol c = 25 mmol/dm3 pripremljena je

    miješanjem 0,0146 cm3 etanola u 10 cm

    3 glicin-pirofosfatnog pufera.

    Otopina za određivanje baždarnog pravca za heksanol i heksanal pripremljena je

    razrijeđivanjem standardnih otopina heksanola i heksanala 200 puta u heksanu, te miješanjem s

    1%-tnom otopinom cikloheksanona u heksanu.

    1 %-tni cikloheksanon pripravljen je miješanjem 1 cm3 cikloheksanona u 99 cm

    3

    destilirane vode.

    Za određivanje aktivnosti enzima alkohol dehidrogenaze korištene su sljedeće otopine: 2

    mmol/L otopina etanola (pripremljena je miješanjem 2,917 cm3 etanola s 250 cm

    3 destilirane

    vode), otopina NAD+ c = 25 mmol/dm

    3 (0,89 g NAD

    + otopljeno u 50 cm

    3 destilirane vode), 75

    mmol/dm3 glicin-pirofosfatni pufer pH = 9, suspenzija enzima ADH γ = 0,2 mg/cm

    3 (1 mg ADH

    otopljen u 5 cm3 destilirane vode).

    Sve otopine čuvane su u hladnjaku na + 4 ºC, a prije korištenja zagrijavane su u

    termostatu na radnu temperaturu od 25 ºC.

    3.1.3. Aparatura

    3.1.3.1. Mikroreaktorski sustav

    Mikroreaktorski sustav (slika 10) sastoji se od mikročipa s mikrokanalima od

    borosilikatnog stakla (cijevni mikroreaktor, dužina : širina : visina = 330 : 250 : 50 μm s

    unutarnjim volumenom 6 mm3). Srednja hrapavost mikrokanala je u području 0,8 – 2,5 μm

    ovisno o načinu izrade. Mikroreaktor je opremljen s dva ulaza "Y"-oblika, za odvojeno uvođenje

    različitih procesnih struja i dva izlaza istog oblika. Čipovi mikroreaktora smješteni su u nosač od

    nehrđajućeg čelika, koji omogućuje spajanje bez gubitaka (Micronit Microfluidics BV,

    Nizozemska). Dvije pumpe (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) opremljene špricama od

    nehrđajućeg čelika (8 cm3, Harvard Apparatus, SAD) korištene su za dovođenje procesnih struja.

    Mikroreaktorski čipovi su spojeni na pumpe silicijskim cijevčicama (375 μm O.D., 150 μm I.D.,

    Micronit Microfluidics BV, Nizozemska). Protok fluida u mikroreaktoru promatran je pomoću

  • 3. Materijali i metode

    17

    mikroskopa povezanog na računalo (Motic B1-220A, binokularni Weltzar, Njemačka) na

    uvećanjima od 40 x i 100 x (uvećanje okulara = 10 x; uvećanje objektiva = 4 x, 10 x).

    Slika 10. Mikroreaktorski sustav: a) injekcijske pumpe, b) mikroreaktorski čip na nosaču

    promatran mikroskopom, c) komponente računala)

    3.1.3.2. Plinski kromatograf

    Koncenentracije etanola, heksanola i heksanala određivane su plinskom kromatografijom

    (GC-2014, Shimadzu, Japan) s plameno-ionizacijskim detektorom uz korištenje helija kao plina

    nosioca (slika 11).

    Slika 11. Plinski kromatograf

  • 3. Materijali i metode

    18

    3.1.3.3. Spektrofotometar

    Dvozračni spektrofotometar (UV-1601, Shimadzu, Japan) korišten je za mjerenje

    aktivnosti enzima ADH i za određivanje koncentracije NADH (slika 12).

    Slika 12. UV spektrofotometar

    3.1.3.4. Centrifuga

    Uzorci su centrifugirani na stojećoj, horizontalnoj centrifugi (Universal 320R, Hettich,

    Njemačka) na 9000 min-1

    kroz 3 minute (slika 13).

    Slika 13. Centrifuga

  • 3. Materijali i metode

    19

    3.1.3.5. Ostala aparatura

    o homogenizator (Vibrofix VF1, IKA-Werke, Njemačka)

    o filter (Chromafil Xtra PA 20/25, 0.2 μm, 25 mm, a 100, proizvođač, zemlja)

    o vaga (EW, max. 1500 g, min. 0.5 g, Kern, zemlja))

    o vaga (AUW 120, max. 120 g, min. 10 mg, Shimadzu, Japan)

    3.2. Analitičke metode

    3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH

    Aktivnost enzima ADH je određena spektrofotometrijskim testom koji se temelji na

    reakciji oksidacije etanola u acetaldehid u glicin – pirofosfatnom puferu pH 9. Shematski se

    reakcija može prikazati jednadžbom 9:

    (9)

    Spektrofotometrijski je mjerena promjena apsorbancije nastalog NADH pri λ = 340 nm

    jer reducirani oblik nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) apsorbira maksimalnu količinu

    svjetla te valne duljine, dok njegova oksidirana forma (NAD+) u valnom području 300 – 400 nm

    ne apsorbira svjetlo.

    Iz promjene apsorbancije u vremenu ΔABS/Δt izračunata je volumna aktivnost enzima

    ADH prema izrazu (jednadžba 10):

    AV

    =DABS

    Dt×

    Vu

    Vr×e

    340×d

    × f (10)

    gdje su: f – faktor razrjeđenja; Vr – volumen uzorka (cm3); Vu – ukupni volumen (cm

    3);

    ε340 – ekstincijski koeficijent (cm2 μm

    -1), iznosi 6,22 cm

    2 μm

    -1 za λ = 340 nm; d – promjer kivete

    (cm). Volumna aktivnost je izražena u međunarodnoj jedinici enzimske aktivnosti U po jedinici

    volumena pri čemu je 1 U = 1 μmol/min, odnosno ona aktivnost enzima koja je potrebna da se

    oksidira 1 μmol/dm3 supstrata u minuti.

  • 3. Materijali i metode

    20

    Za test je bilo potrebno u kivetu od 3 cm3 odpipetirati 0,500 cm

    3 etanola (cEtOH = 2

    mol/dm3), 1,000 cm

    3 NAD

    + (cNAD+ = 25 mmol/dm

    3), 1,490 cm

    3 pufera (75 mmol/dm

    3 glicin-

    pirofosfatni pufer pH = 9), 0,010 cm3 enzima (γADH = 0,2 mg/cm

    3).

    3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH

    1 cm3 uzorka iz mikroreaktora izmjerena je apsorbancija na spektrofotometru pri λ = 340

    nm. Iz izmjerene apsorbancije izračunata je koncentracija NADH pomoću prethodno

    konstruiranog baždarnog pravca (prilog 1). Baždarni pravac određen je mjerenjem apsorbancije

    otopine različitih poznatih koncentracija NADH na istoj valnoj duljini.

    3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala

    100 mm3 uzorka iz mikroreaktora pomiješano je sa 100 mm

    3 1%-tne otopine

    cikloheksanona u heksanu koji je korišten kao unutarnji standard. Smjesa je prvo mješana na

    vorteksu 30 – 60 s kako bi se heksanol i heksanal ekstrahirali, a potom centrifugirana 3 min na

    9000 rpm pri 4 °C. Nakon centrifugiranja odvojen je i profiltriran gornji organski sloj. Ovaj sloj

    je analiziran na plinskom kromatografu s plameno- ionizacijskim detektorom, korištenjem helija

    kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB- WAX (l = 30 m; ID = 0,53 mm; df = 1 μm).

    Temperatura injektora iznosila je 280 °C, dok je temperatura detektora bila 240 °C. Kolona se

    grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 180 °C brzinom od 10 °C/min, te se

    grijala na konačnoj temperaturi od 180 °C 2 min. Vrijeme zadržavanja heksana bilo je 2,1 min,

    heksanala 5,9 min, cikloheksanona 9,2 min, a heksanola 9,7 min (prilog 6). Koncentracije

    heksanola i heksanala izračunate su pomoću prethodno priređenih baždarnih pravaca (prilog 3 i

    prilog 4).

  • 3. Materijali i metode

    21

    3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola

    Koncentracija etanola određivana je plinskom kromatografijom s plameno- ionizacijskim

    detektorom, korištenjem plina helija kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB-WAX (l = 30 m;

    ID = 0,53 mm; df = 1 μm). Temperatura injektora iznosila je 240 °C, kao i temperatura

    detektora. Kolona se grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 125 °C kroz 6

    minuta. Uzorci su pripremani miješanjem jednakog volumena uzorka i otopine 1%-tnog

    acetonitrila, koji je služio kao unutarnji standard, na vorteksu tijekom jedne minute. Nakon

    centrifugiranja (3 min, 9000 rpm, 4 °C) uzorci se injektiraju u plinski kromatograf. Vrijeme

    zadržavanja etanola je 3,2 min, a vrijeme zadržavanja acetonitrila je 4,1 min (prilog 5).

    Koncentracija etanola izračunata je pomoću prethodno priređenog baždarnog pravca (prilog 2).

    3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru

    3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola

    Tijekom provedbe procesa oksidacije heksanola korišten je stakleni mikroreaktor

    volumena 6 mm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika. Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5

    mmol dm-3

    ) kao jedna procesna struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm

    -3) kao druga

    procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih pumpi (PHD 4400, Harvard

    Apparatus, SAD) u mikroreaktor pri protocima od 5-200 mm3 min

    -1.

    Za usporedbu različitih sustava proces je proveden u mikroreaktorima s glatkim i

    hrapavim stjenkama, te pri omjerima organske i vodene faze 1:1 te 3:1.

    Uzorci izlaznih procesnih struja za određivanje koncentracije heksanola i heksanala

    prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1 %-tnog cikloheksanona

    bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Prije analize na plinskom

    kromatografu uzorci su centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 um, 25

    mm, Macherey-Nagel GmbH CoKG, Njemačka). Aparatura za provedbu procesa oksidacije

    heksanola shematski je prikazana na slici 14.

  • 3. Materijali i metode

    22

    Slika 14. Shematski prikaz sustava za provedu procesa oksidacije heksanola

    3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+

    Provedena su dva nezavisna pokusa s istom koncentracijom NADH, ali različitom

    koncentracijom acetaldehida te su praćene konverzije pri različitim vremenima zadržavanja.

    Korišten je mikroreaktor volumena 6 cm3, s dva ulaza „Y“-oblika i dva izlaza jednakog

    oblika, pri čemu je jedan ulaz korišten za uvođenje procesne stuje acetaldehida i pufera, a drugi

    za procesnu struju enzima, koenzima i pufera. Otopine su u mikroreaktor uvođene preciznim

    injekcijskim pumpama uz konstantni protok (Harvard Apparatus PHD 4400 USA). Pokusi su

    provedeni za različita vremena zadržavanja (0,9 – 9 s) pri čemu je protok dviju procesnih struja

    uvijek bio jednak. Uzorci su prikupljani u ledu kako bi se zaustavila reakcija.

    Koncentracija enzima ADH u oba pokusa je bila 0,2 mg/cm3, koncentracija NADH 5,5

    mmol/dm3, a koncentracija acetaldehida u prvom pokusu je bila 5,5 mmol/dm

    3, dok je u drugom

    bila 44 mmol/dm3. Aparatura za provedbu procesa oksidacije heksanola shematski je prikazana

    na slici 15.

    Slika 15. Shematski prikaz sustava za provedbu procesa regeneracije koenzima NADH

  • 3. Materijali i metode

    23

    3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

    serijski povezanim mikroreaktorima

    Na slici 16 prikazan je sustav serijski spojenih procesa oksidacije heksanola i

    regeneracije koenzima. Reakcije su provođene u 75 mmol/dm3 glicin-pirofosfatnom puferu pH =

    9 pri temperaturi 25 °C.

    Korišteni su stakleni mikroreaktori volumena 6 cm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika.

    Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5 mmol dm-3

    ) pri protoku 30 mm3 min

    -1 kao jedna procesna

    struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm

    -3) i enzima ADH (γ = 0,2 mg cm

    -3), pri

    protoku 10 mm3 min

    -1 kao druga procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih

    pumpi (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) u prvi mikroreaktor. Ulaz u drugi mikroreaktor

    jedna procesna struja bila je otopina izreagiranog koenzima NAD+ iz prvog mikroreaktora pri

    protoku od 10 mm3 min

    -1, dok je druga procesna struja otopina acetaldehida (c = 2 mmol dm

    -3)

    pri protoku od 10 mm3 min

    -1.

    Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije

    heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1

    %-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci

    izlaznih procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola iz jedne

    struje i za određivanje koncentracije NADH iz druge struje, prikupljani su u ledu kako bi se

    zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu i spektrofotometru uzorci su

    centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel

    GmbH CoKG, Njemačka).

  • 3. Materijali i metode

    24

    Slika 16. Shematski prikaz serijski spojenih sustava za za provedu oksidacije heksanola i

    regeneraciju koenzima NADH

    3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala

    Za provedbu potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala korištena je aparatura

    shematski prikazana na slici 17. Eksperiment je proveden na isti način kao i proces oksidacije

    heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s tom razlikom

    da je procesna struja koja sadrži vodenu otopinu enzima ADH i regeneriranog koenzima NAD+

    pomoću protočne pumpe uvođena na ulaz prvog mikroreaktora protokom od 10 mm3 min

    -1.

    Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije

    heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1

    %-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci izlazne

    procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola prikupljani su u

    ledu kako bi se zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu uzorci su

    centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel

    GmbH CoKG, Njemačka). Aktivnost enzima je praćena nakon 1, 4, 22 i 43 sata na svim izlaznim

    procesnim strujama, te je praćena aktivnost po broju prolaza reaktanata kroz sustav, gdje se jedan

    prolaz odnosi na potrošenu početnu količinu reaktanata u injekcijskim pumpama.

  • 3. Materijali i metode

    25

    Slika 17. Shematski prikaz potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala

    3.4. Obrada podataka

    Za simulacije matematičkog modela procesa korišteni su računalni programi Scientist

    (Micromath®) i MATLAB® (MathWork).

    Scientist je računalni program razvijen za primjenu u različitim područjima znanosti i

    inženjerstva. Omogućava:

    rješavanje sustava jednadžbi matematičkih modela koji mogu biti sastavljeni od

    nelinearnih jednadžbi, diferencijalnih jednadžbi te Laplace-ovih transformacija

    jednostavan unos jednadžbi modela

    jednostavno upravljanje podacima

    statističku analizu podataka i njihov grafički prikaz

    izračunavanje optimalnih parametara modela.

    Algoritmi koje upotrebljava Macromath Scientist prilagođeni su iz različitih izvora. Za

    rješavanje diferencijalnih jednadžbi koriste se četiri standardne metode (Eulerova, Runge-Kuta,

    Runge-Kuta metoda kontrole pogrešaka i Bulirsch-Stoer metoda) te metoda razvijena za

    rješavanje sustava jednadžbi (Episode).

  • 3. Materijali i metode

    26

    MATLAB® je programski jezik za tehničke proračune. Ime je dobio od riječi MATrični

    LABoratorij (eng. Matrix Laboratory), pošto mu je osnovni element za obradu podataka matrica

    (niz). MATLAB® služi za rješavanje različitih matematičkih problema, te čitavog niza problema

    vezanih uz digitalnu obradu signala, upravljanje, regulaciju i identifikaciju sustava. Koristi se za

    matematička izračunavanja, modeliranje i simulaciju, analizu i obradu podataka, grafičko

    prikazivanje rezultata i razvoj algoritma.

    Programski paket MATLAB® ima više funkcija:

    omogućuje lako dodavanje novih funkcija izgrađenih pomoću ugrađenih naredbi,

    podaci u MATLAB®-u se tretiraju kao matrice, odnosno retci i stupci,

    obična varijabla se također predstavlja kao matrica s dimenzijom [11],

    sadrži sve naredbe i operacije iz linearne algebre (zbrajanje, množenje, traženje vlastitih

    vrijednosti itd.), svi su podaci u obliku pomičnog zareza dvostruke preciznosti (eng.

    double float) što osigurava zadovoljavajuću dinamiku i točnost za gotovo sve primjene,

    pored realnih varijabli odnosno matrica, program podržava i kompleksne brojeve.

  • 4. Rezultati i rasprava

    27

    4. REZULTATI I RASPRAVA

    U ovom radu istraživani su tipovi strujanja u mikrokanalima različite hrapavosti za

    različite omjere protoka organske i vodene faze. Određene su međufazne površine pri paralelnom

    i segmentiranom strujanju. Određen je prijenos tvari za komponenete reakcijskog sustava

    oksidacije heksanola i regeneracije koenzima. Provedeni su pokusi u kojima su analizirani

    različiti procesni sustavi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, sustavi s i bez regeneracije

    koenzima, sustav s povratnim tokom regeneriranog enzima, a u svrhu određivanja najpovoljnije

    procesne konfiguracije.

    4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu

    Ispitani su tipovi strujanja dvofaznog sustava kapljevina-kapljevina (organska-vodena

    faza) u mikrokanalu. Praćena je promjena tipova strujanja pri protjecanju dvofaznog sustava kroz

    mikrokanale hrapave površine i mikrokanale glatke površine, gdje se hrapavost površine odnosi

    na mikrogeometrijsku nepravilnost površine koja nastaje tijekom postupaka obrade, te promjena

    tipova strujanja kao funkcije omjera protoka organske i vodene faze. Na slici 18 prikazane su

    fotografije hrapavog i glatkog mikrokanala.

    a) b)

    Slika 18. Fotografija a) hrapavog mikrokanala, b) glatkog mikrokanala

    Različita hrapavost površine mikrokanala utječe na tipove strujanja. Na slici 19 prikazani

    su tipovi strujanja u hrapavom i glatkom mikrokanalu pri omjeru protoka organske i vodene faze

    30:10 mm3/min. Vidljivo je da je u mikrokanalu hrapave površine uspostavljeno segmentirano

  • 4. Rezultati i rasprava

    28

    strujanje, dok je u mikrokanalu glatke površine uspostavljeno paralelno strujanje dviju faza.

    Također, u mikrokanalu glatke površine ne dolazi do mješanja, a uspostavljena međufazna

    površina je postojana od ulaza do izlaza iz mikrokanala.

    a) b)

    Slika 19. Tipovi strujanja za omjer protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min u

    mikrokanalima: a) hrapave površine, b) glatke površine

    Promatrajući tipove strujanja u mikrokanalima glatke površine pri različitim omjerima

    protoka organske i vodene faze, vidljiva je nestabilnost paralelnog toka pri manjim protocima.

    Na slici 20 prikazani su tipovi strujanja za omjere protoka organske i vodene faze 3:1 (slika 20a),

    6:2 (slika 20b) i 30:10 (slika 20c) mm3/min. Vidljivo je da je tek pri omjeru protoka 30:10

    mm3/min uspostavljen stabilan laminaran tok te su stoga svi daljnji pokusi u ovom radu

    provedeni za ovaj omjer protoka organske i vodene faze.

    a) b) c)

    Slika 20. Profili strujanja za različite omjere protoka organske i vodene faze, a) 3:1

    mm3/min; b) 6:2 mm

    3/min; c) 30:10 mm

    3/min

  • 4. Rezultati i rasprava

    29

    4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom

    strujanju u mikrokanalu

    Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri paralelnom toku dviju kapljevina,

    uspostavjena u mikrokanalu glatke površine, je jednaka umnošku širine i duljine mikrokanala

    (jednadžba 11):

    Apar = L W = 332 mm 50 μm (11)

    i iznosi 1,66 10-5

    m2.

    Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri segmentiranom toku dviju kapljevina,

    uspostavljena u mikrokanalu hrapave površine, ovisi o ukupnom protoku u mikrokanalu. Ova

    međufazna površina se određuje zbrajanjem međufazne površine odvojeno za svaki segment

    zasebno, te je reda veličine 10-6

    m (slika 21). Kontaktna površina sa strane vodene faze je veća

    od kontaktne površine sa strane organske faze, zbog načina određivanja. Aproksimirana je ravna

    kontaktna površina između segmenata, unatoč njihovoj zaobljenosti, te je stoga kontaktna

    površina sa strane vodene faze porasla zbog smanjenja kontaktne površine organske faze.

    0 50 100

    0,00000

    0,00001

    0,00002

    0,00003

    vodena faza

    organska faza

    A [

    m2]

    q [mm3/min]

    Slika 21. Ovisnost kontaktne površine vodene i organske faze o ukupnom protoku prilikom

    strujanja u mikrokanalu hrapave površine

  • 4. Rezultati i rasprava

    30

    S obzirom da je međufazna površina u mikrokanalu s glatkom površinom 10 puta veća od

    međufazne površine mikrokanala s hrapavom površinom, moguće je očekivati veće reakcijske

    brzine, te za mala vremena zadržavanja i povećanje konverzije.

    4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu

    4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima

    Ukupna brzina reakcije određena je enzimskom aktivnošću i brzinom kojom se ostvaruje

    veza enzim-supstrat. Zbog malih dimenzija mikrokanala, prijenos tvari i brzina difuzije ne

    limitiraju ukupnu brzinu reakcije kao u klasičnim makroreaktorskim sustavima.

    Utjecaj difuzije za reakciju regeneracije koenzima prethodno je eksperimentalno ispitivan

    [Ferk & Ivanković 2011.]. Difuzijski koeficijent (D) za sve komponente koje sudjeluju u reakciji

    regeneracije koenzima, a otopljene su u vodi procijenjen je prema Scheibelovoj empirijskoj

    korelaciji (jednadžba 12):

    2/38

    / 1/3

    38.2 101 WS W

    W S S

    VTD

    V V

    (12)

    gdje je S ispitivana komponenta (ADH, NADH i etanol), a W otapalo (voda), T je temperatura

    (K), VW i Vs su molarni volumeni pojedinih komponenata, a η viskoznost otapala (kg/ms).

    Difuzijsko vrijeme (τD) pojedine komponente izračunato je prema jednadžbi 13:

    2

    /

    ( )D

    S W

    R

    D

    (13)

    gdje R predstavlja polumjer mikrokanala. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 1.

    Za NAD+ difuzijski koeficijent i difuzijsko vrijeme nisu određivani jer se molarni

    volumen NAD+ ne razlikuje značajno od molarnog volumena NADH.

  • 4. Rezultati i rasprava

    31

    Tablica 1. Procjenjene vrijednosti difuzijskog koeficijenta i difuzijskog vremena pri 25 °C za

    sve komponente koje sudjeluju u reakciji regeneracije koenzima

    Komponenta Vs

    [cm3/mol]

    DS/W 109

    [ m2/s]

    τD

    [s]

    ADH 335 0,560 30,55

    NADH 305 0,551 27,89

    Etanol 55,2 1,563 9,99

    Acetaldehid 58,9 1,504 10,39

    Dobiveni difuzijski koeficijenti korišteni su u postavljenom 2D matematičkom modelu

    koji uključuje konvekciju u aksijalnom smjeru () i difuziju u aksijalnom i radijalnom smjeru (,

    , slika 22).

    Slika 22. Shema mikrokanala s pripadajućim dimenzijama

    (2W = 220 µm, H = 50 µm i L = 332 mm)

    Bilanca tvari za pojedine komponente (S) u mikrokanalu u stacionarnim uvjetima za

    sustav u kojemu se ne odvija kemijska reakcija može se prikazati sljedećim izrazom (jednadžba

    14):

    2 2

    /

    2 2( ) S S W S S

    c D c c

    W

    (14)

    s pripadajućim rubnim uvjetima (jednadžbe 15):

  • 4. Rezultati i rasprava

    32

    ,(0, ) ; 0 1

    (0, ) 0; 1 0

    , 0 1 0

    , 0 0

    S i S

    S

    E

    E

    c c

    c

    c L

    W

    c L

    W

    (15)

    Prvi član bilance tvari u mikrokanalu (jednadžba 15) predstavlja konvekciju, a drugi

    difuziju. Iz prvog rubnog uvjeta (jednadžba 16) koji se odnosi na procesnu struju otopine s

    otopljenom ispitivanom komponentom, slijedi da je koncentracija komponente na ulazu u

    mikroreaktor, za interval od 0 do 1 (širina mikroreaktora) jednaka početnoj koncentraciji u

    ulaznoj procesnoj struji. Za interval od -1 do 0 (širina mikroreaktora) iz rubnog uvjeta slijedi da

    je koncentracija komponenti jednaka 0. Sljedeća dva rubna uvjeta podrazumijevaju da na cijelom

    intervalu širine na izlazu iz mikroreaktora i na cijelom intervalu dužine na rubovima mikrokanala

    nema promjene koncentracije.

    cS u jednadžbama predstavljaju koncentracije otopljenih komponenti, DS/W predstavlja

    difuzijske koeficijente različite komponente u vodi, ci označava ulaznu koncentraciju, vξ je

    linearna brzina strujanja u smjeru .

    Nakon što je postavljen matematički model procesa parcijalna diferencijalna jednadžba je

    diskretizirana primjenom metode konačnih razlika. Dobivena linearna jednadžba (jednadžba 16)

    riješena je u programskom paketu MATLAB

    (Prilog 8.4).

    , , , 1, , 1, , , , 1, , , 1 , , , , 1/

    2 2

    2 2( )

    S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i jS Wc c c c c c c cD

    W

    (16)

    Dobiveni rezultati simulacije matematičkog modela u mikroreaktoru za svaku pojedinu

    komponentu reakcijskog sustava regeneracije koenzima prikazani su na slici 23.

  • 4. Rezultati i rasprava

    33

    a) b)

    c)

    Slika 23. Rezultati simulacije matematičkog modela difuzije u vodenom dvofaznom sustavu u

    mikroreaktoru za: a) ADH, b) NADH, c) etanol

    S obzirom na kompleksnost rješavanja parcijalnih diferencijalnih jednadžbi, također je

    ispitana mogućnost upotrebe jednostavnih numeričkih aproksimacija za opis difuzije pojedinih

    komponenti u mikrokanalu. Kako bi predvidjeli i opisali događaje korištena je metoda dvofaznog

    idealnog cijevnog reaktora [Ptičar, 2010] gdje je svaka od dvije faze u mikroreaktoru

    matematički opisana kao idealni cijevni reaktor u stacionarnom stanju. Prijenos tvari između faza

    odvija se difuzijom koja je opisana jednostavnim kvocijentom razlika koncentracija između dvije

    točke i udaljenosti između njih.

    Ako je na poziciji x1 koncentracija tvari c1, a na poziciji x2 koncentracija c2

    koncentracijski gradijent opisan je izrazom (jednadžba 17):

    12

    12

    xx

    cc

    x

    c

    (17)

  • 4. Rezultati i rasprava

    34

    Model prijenosa tvari difuzijom između dvije vodene faze prikazan je jednadžbom 18

    koja je riješena u programskom paketu Scientist (Prilog 8.3).

    )(

    )(

    12

    2

    2

    12

    2

    1

    SSS

    S

    SSS

    S

    ccW

    Dc

    xv

    ccW

    Dc

    xv

    (18)

    Na slici 24 prikazana je usporedba rezultata simulacija dobivenih rješavanjem

    matematičkih modela procesa u programskim paketima Scientist (jednadžba 18) i MATLAB

    (jednadžba 16) te je vidljivo da oba modela dobro opisuju eksperimentalne podatke. S obzirom

    na jednostavnije i brže rješavanje matematičkog modela procesa koji je temeljen na dvofaznom

    idealnom cijevnom reaktoru u ostatku rada korišten je samo ovaj model.

    a)

    0 2 4 6 8 10

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    V.A

    . [U

    /cm

    3]

    [s]

    b)

    0 2 4 6 8 10

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    c [m

    mo

    l/d

    m3]

    [s]

  • 4. Rezultati i rasprava

    35

    c)

    0 2 4 6 8 10

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    c [m

    mo

    l/d

    m3]

    [s]

    Slika 24. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog

    modela procesa difuzije u mikrokanalu za: a) ADH, b) NADH, c) etanol (●: eksperimentalni

    rezultati; - - - model rješavan u Scientistu, ― model rješavan u MATLABu]

    4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola

    Utjecaj prijenosa tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola eksperimentalno je

    određivan u mikroreaktoru. S obzirom na netopivost heksanola i heksanala u vodi, za reakcijski

    sustav oksidacije heksanola određivana je samo difuzija enzima i koenzima (c0,NADH = 7

    mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

    3). Difuzijski koeficijenti i difuzijska vremena jednaki su onima

    procijenjenim u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima.

    Iako model za difuziju NADH u organsku fazu nije jednak modelu za difuziju u sustavu

    voda-voda koji je korišten za difuziju u procesu regeneracije koenzima, zbog pojednostavljenja

    računa i simulacija pretpostavljeno je da slijede isti trend. Dobiveni rezultati prikazani su na slici

    25. Vidljivo je odstupanje od matematičkog modela pri višim vremenima zadržavanja zbog

    pojednostavljenja modela.

  • 4. Rezultati i rasprava

    36

    0 5 10 15 20

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    c [m

    mo

    l/d

    m3]

    [s]

    Slika 25. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog

    modela procesa difuzije u mikrokanalu (metoda dvofaznog idealnog cijevnog reaktora) za

    NADH

    Kod pokusa u kojima je ispitivana difuzija enzima ADH uočena je njegova deaktivacija u

    organskoj fazi te bi za opisivanje ovog sustava u matematički model procesa bilo potrebno

    uključiti i koeficijent deaktivacije (slika 26).

    0 2 4 6 8

    0,00

    0,04

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    V.A

    . [U

    /cm

    3]

    [s]

    Slika 26. Eksperimentalni rezultati za ADH

  • 4. Rezultati i rasprava

    37

    4.3. Reakcija oksidacije heksanola

    Napravljeni su pokusi pri različitim vremenima zadržavanja u kojima je reakcija

    oksidacije heksanola katalizirana enzimom ADH provedena uz prisustvo ekvimolarne količine

    koenzima NAD+ (c0,heksanol = 5,5 mmol/dm

    3, c0,NAD+ = 5,5 mmol/dm

    3, γ0,ADH = 0,092 μg/cm

    3) pri

    omjeru protoka organske i vodene faze 1:1. Konverzija postignuta u mikroreaktorskom sustavu

    za vrijeme zadržavanja = 36 s u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama iznosila je 30 %, dok je u

    mikroreaktoru s glatkim stjenkama iznosila 60 % (slika 27).

    0 10 20 30 40

    0

    20

    40

    60

    X [

    %]

    [s]

    Slika 27. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s hrapavim () i

    glatkim () stjenkama pri istim početnim uvjetima

    Također, proveden je pokus u mikroreaktoru s glatkim stjenkama pri čemu je omjer

    protoka organske i vodene faze bio 3:1, te je pri vremenu zadržavanja = 36 s dobivena

    konverzija od 20 % (slika 28).

  • 4. Rezultati i rasprava

    38

    0 5 10 15 20 25 30 35 40

    0

    10

    20

    30

    40

    50

    X [

    %]

    [s]

    Slika 28. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s glatkim stjenkama

    pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1

    Može se zaključiti da je konverzija za iste uvjete u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama

    manja od konverzije postignute u mikroreaktoru s glatkim stjenkama zbog manje međufazne

    površine što je pokazano u poglavlju 4.1.1. Konverzija u mikroreaktoru s glatkim stjenkama

    manja je u sustavu s omjerom faza 3:1 zbog deaktivacije enzima ADH organskom fazom.

    Unatoč manjoj vrijednosti postignute konverzije sustav u kojemu je omjer protoka faza bio 3:1 je

    bolji za provedbu integriranog procesa jer se faze u potpunosti razdvajaju na izlazu iz

    mikroreaktora.

    4.4. Reakcija regeneracije koenzima

    Reakcija regeneracije koenzima (redukcija acetaldehida) provedena je u dva pokusa s

    različitim početnim uvjetima. U pokusu 1 početne koncentracije komponenata reakcijske smjese

    bile su c0,acetaldehid = 6,9 mmol/dm3, c0,NADH = 5,5 mmol/dm

    3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

    3. U pokusu 2

    početne koncentracije komponenata reakcijske smjese bile su c0,acetaldehid = 44 mmol/dm3, c0,NADH =

    5,5 mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

    3.

  • 4. Rezultati i rasprava

    39

    0 2 4 6 8 10

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    X [

    %]

    [s]

    Slika 29. Ovisnost konverzije etanola o vremenu zadržavanja za pokus 1 () i pokus 2 () pri

    različitim početnim uvjetima [—: model]

    Postignuta konverzija u procesu regeneracije koenzima provedenom s ekvimolarnim

    koncentracijama reaktanata iznosila je 80 %, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida (pokus 2)

    konverzija iznosila 100 % (slika 29).

    4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

    serijski povezanim mikroreaktorima

    Na slici 30. prikazan je shematski prikaz reakcije oksidacije heksanola i reakcije

    regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s izlaznim koncentracijama i

    postignutim konverzijama.

  • 4. Rezultati i rasprava

    40

    Slika 30. Shematski prikaz serijski spojenog glavnog i regeneracijskog sustava sa završnim

    koncentracijama i dobivenim konverzijama

    Postignuta konverzija heksanola pri ukupnom protoku od 40 mm3/min u mikroreaktoru

    za provedbu glavne reakcije iznosila je 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju

    ostvarena 100 %tna regeneracija koenzima NAD+ pri ukupnom protoku od 20 mm

    3/min.

    Vrijeme zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu glavne reakcije za heksanol je τ = 12 s,

    dok je za NAD+ τ = 36 s. Vremena zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu regeneracije za

    obje procesne struje τ = 36 s. Stoga je reakcija provođena tijekom četiri vremena zadržavanja

    komponenti s većim vremenom zadržavanja, tj. reakcija je provođena 144 s.

    4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala

    Proces potpuno integrirane proizvodnje heksanala (slika 14) proveden je pod istim

    početnim uvjetima kao i oksidacija heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

    povezanim mikroreaktorima. Na slici 31 prikazane su koncentracije heksanola i heksanala na

    izlaznoj procesnoj struji iz provog mikroreaktora i koncentracije etanola na izlaznoj procesnoj

    struji iz drugog mikroreaktora u ovisnosti o vremenu, dok je na slici 32 prikazana ovisnost

    konverzije heksanola o vremenu provođenja eksperimenta.

    cNADH

    = 0,66 mmol/dm3

    cNADH

    = 0 mmol/dm3

    cEtOH

    = 0,654 mmol/dm3

    cNADH

    = 0 mmol/dm3

    cheksanol

    = 3,21 mmol/dm3

    cheksanal

    = 0,66 mmol/dm3

    Xheksanol = 17, 22 %

    XNADH

    = 100 %

  • 4. Rezultati i rasprava

    41

    0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

    0,0

    0,5

    1,0

    1,5

    2,0

    2,5

    3,0

    3,5

    4,0

    heksanol

    heksanal

    etanol

    c [m

    mo

    l/dm

    3]

    t [h]

    Slika 31. Ovisnost koncentracija heksanola, heksanala i etanola na izlazima o vremenu

    0 10 20 30 40 50

    0

    5

    10

    15

    20

    X [

    %]

    t [h]

    Slika 32. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu

    U procesu proizvodnje heksanala u potpuno integriranom sustavu postignuta je

    maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan unutar prva 4 h provedbe pokusa nakon

    čega je došlo do postupnog pada konverzije uslijed deaktivacije enzima, što je također vidljivo iz

    povećanja koncentracije heksanola nakon prva 4 h provedbe pokusa. Za postizanje boljih

    rezultata potrebna je daljnja optimizacija sustava, prvenstveno u smislu povećanja stabilnosti

    enzima u prisutnosti organskog otapala.

    Praćena je i aktivnost enzima po prolazu što je prikazano na slici 33. S obzirom da su za

    recirkulaciju potrebna dva klipa, od kojih se jedan neprestano prazni, a drugi puni, kraj prvog

  • 4. Rezultati i rasprava

    42

    prolaza je kada se prvi klip u potpunosti isprazni, a drugi napuni. Tada oni zamijene svoje

    funkcije i onaj koji se do tada punio, sada se počinje prazniti, i obrnuto. Vrijeme jednog prolaza

    je 27 h.

    0 10 20 30 40 50 60

    0

    10

    20

    V.A

    . [U

    /cm

    3]

    t [h]

    Slika 33. Ovisnost aktivnosti enzima o vremenu trajanja procesa

    Također, praćena je aktivnost enzima u vremenu (slika 34), tj. dio enzima koji je korišten

    za reakciju, sačuvan je u zasebnoj kiveti. Dakle praćena je aktivnost enzima koji nije sudjelovao

    u reakciji kako bi se vidjelo kada prestaje djelovanje enzima bez obzira na reakciju.

    0 10 20 30 40 50 60 70

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    V.A

    . [U

    /cm

    3]

    t [h]

    Slika 34. Dinamička promjena aktivnosti enzima na sobnoj temperaturi u nezavisnom

    pokusu

  • 4. Rezultati i rasprava

    43

    Prema slici 33 vidljivo je da je enzim prestao biti aktivan nakon drugog prolaza, što je u

    našem slučaju bilo 54 h nakon početka procesa, dok je na slici 34 vidljivo da bi enzim trebao biti

    aktivan 72 sata. Razlog što do opadanja aktivnosti enzima u procesu dolazi ranije je zbog

    inhibicije organskih otapala (acetaldehida, heksana, heksanola i heksanala), te je moguće

    zaključiti da proces zahtijeva daljnju optimizaciju.

  • 5. Zaključak

    44

    5. ZAKLJUČAK

    U ovom radu proveden je potpuno integriran proces proizvodnje heksanala s potpuno

    integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno serijski povezana

    mikročipa.

    U mikrokanalu s hrapavom površinom ostvareno je segmentirano strujanje, dok je u

    mikrokanalu s glatkom površinom uspostavljeno paralelno strujanje. Veća međufazna površina

    postignuta je u mikrokanalu s glatkom površinom te je stoga i konverzija heksanola u ovakom

    reaktoru veća. Također je uočeno da je pri omjeru protoka organske i vodene faze 30:10

    mm3/min uspostavljen stabilan paralelan tok ovih faza. Stoga su svi daljnji pokusi

    biotransformacije heksanola bili provođeni u mikrokanalu s glatkim stjenkama pri omjeru

    protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min.

    Analiziran je utjecaj difuzije komponenata reakcijske smjese na učinkovitost procesa u

    svakom od serijski povezanih mikročipova, odnosno za reakciju oksidacije heksanola i reakciju

    regeneracije koenzima. Za proces regeneracije koenzima NAD+ uočeno je da etanol izrazito

    difundira iz jedne faze u drugu, za razliku od enzima i koenzima. Pokazano je da rezultati

    simulacije matematičkog modela procesa dobro opisuju eksperimentalne podatke. U procesu

    oksidacije heksanola uočena je izrazita difuzija NADH iz vodene u organsku fazu, kao i

    postepena deaktivacija enzima djelovanjem organskog otapala.

    Za sustav oksidacije heksanola u mikrokanalu s glatkim površinama pri omjeru protoka

    organske i vodene faze 1:1 postignuta je konverzija od 60 % pri vremenu zadržavanja 36 s, dok

    je pri istom vremenu zadržavanja uz omjer protoka organske i vodene faze 3:1 postignuta

    konverzija od 20 %. Unatoč manjoj konverziji pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1, pri

    tom omjeru protoka faza bolje je odvajanje faza na izlazu iz mikroreaktora te je ovaj omjer

    protoka pogodniji za pri provedbi integriranog procesa proizvodnje heksanala. U sustavu

    regeneracije koenzima postignuta je konverzija od 80 % pri vremenu zadržavanja od 9 s u

    pokusu s ekvimolarnim koncentracijama reaktanata, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida

    pri istom vremenu zadržavanja postignuta konverzija od 100 %. U procesu reakcije oksidacije

    heksanola i regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima postignuta je

    konverzija heksanola od 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju ostvarena 100 %tna

    regeneracija koenzima NAD+. U potpuno integriranom procesu proizvodnje heksanala postignuta

  • 5. Zaključak

    45

    je maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan prva 4 h provedbe pokusa nakon čega

    dolazi do opadanja konverzije uslijed deaktivacije enzima.

    Promatrani integrirani sustav može se koristiti kao proces za proizvodnju heksanola, ali je

    nužna daljnja optimizacija procesnih uvjeta prvenstveno zbog nedovoljne stabilnosti korištenog

    enzima. Kao sljedeći korak u daljnjem razvoju potpuno integriranog procesa proizvodnje

    heksanala nužna je integracija ekstrakcije dobivenog heksanala i recirkulacija regeneriranog

    heksanola.

  • 6. Literatura

    46

    6. LITERATURA

    1. Blanch H.W., Clark D.S., Biochemical Engineering, Marcel Dekker, New York, 1993,

    str. 151-157

    2. Bruiee T.C., Benkovic S.J., Biorganic Mechanisms, Benjamin, New York, 1965, str. 301

    3. Brunerie P., Koziet Y., Process for producing natural cis-3-hexenol from unsaturated fatty

    acids, US Patent 5,620,879, 1997

    4. Doku G.N., Verboom W. , Reinhoudt D.N., van den Berg A., Tetrahedron 61 (2005) 2733

    5. Dunn I.J., Heinzle E., Ingham J., Prenosil J.E., Biological Reaction Engineering, Wiley-

    VCH, Weinheim, 1992, str. 25-31

    6. Ehrfeld W., Hessel V., Löwe H., Microreactors: New Technology for Modern Chemistry.

    Wiley-VCH, Weinheim, 2000, str. 1-34

    7. Ferk E., Ivanković M., Regeneracija koenzima NAD+ u mikroreaktoru, kemijsko-

    inženjerske vježbe, Zagreb, 2011.

    8. Gargouri M., Akach N.B., Legoy M.D., Coupled hydroperoxide lyase and alcohol

    dehydrogenase for selective synthesis of aldehyde or alcohol, Appl. Biochem.

    Biotechnol. 119 (2004) 171-180

    9. Geyer K., Codee J.D., Seeberger P.H., Microreactors as tools for synthetic chemist- the

    chemists’ round bottomed flask of the 21st century?, Chem. Eur. J. 12 (2006) 8434-8442

    10. Gomzi Z., Kemijski reaktori, HINUS, Zagreb, 1998, str. 36-55

    11. Guangdong Z., Zhanlin X., Xiaohong G., Hong Z., Yanan L., Xueju L., Tiexin C.,

    Wenxing L., Kaiji Z., Transition metal substitued tungstophosphoric compound catalyzed

    oxidation of hexanol to hexanal with hydrogen peroxide, React. Kinet. Catal. Lett. 85

    (2005) 57-64

    12. Harris J.I., Structure and catalytic activity of alcohol dehydrogenase, Nature 203 (1964)

    30-34

    13. Hildebrand D.F., Lipoxygenases, Plant Physiol. 76 (1989) 249-253

    14. Jensen K.F., Microreaction engineering- is small better?, Chem. Eng. Sci. 56 (2001) 293-

    303

  • 6. Literatura

    47

    15. Jornvall H., Persson B., Jeffery J., Characteristics of alcohol/polyol dehydrogenases, the

    zinc- containing longchain alcohol dehydrogenases, Eur. J. Biochem. 167 (1987) 195-201

    16. Kane C., Tzedakis T., AIChE Journal 54 (2008) 365

    17. Karra- Chaabouni M., Pulvin S., Meziani A., Thomas D., Touraud D., Kunz W.,

    Bioxidation of n-hexanol by alcohol oxidase and catalase in biphasic micelar systems

    without solvent, Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 27-32

    18. Laidler K.J., Bunting P.S., The chemical kinetics of enzyme action, Claredon Press,

    Oxford, 1973, str. 93-97, 430-435

    19. Louglin W.A., Biotransformation in organic synthesis, Bioresource Technol. 74 (2000)

    49-62

    20. Márczy J.S., Németh Á.S., Samu Z., Háger-Veress Á., Szajáni B., Production of hexanal

    from hydrolized sunflower oil by lipoxygenase and hydroperoxid lyase enzymes,

    Biotechnol. Lett. 24 (2002) 1673-1675

    21. Matsushita Y., Ichimura T., Ohba N., Kumada S., Sakeda K., Suzuki T., Tanibata H.,

    Murata T., Pure. Appl. Chem. 79 (2007) 1959

    22. May S.W., Applications of oxidoreductase, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 370-375

    23. Muller B.L., Dean C., Whitehead I.M., The industrial use of plant enzymes for the

    production of natural “green note” flavour compounds, Bioflavour 95, Dijon (France)

    (1995) 339-344

    24. Nassar R. Hu J., Palmer J., Dai W., Catal. Today 120 (2007) 121

    25. Ptičar A., Numeričke aproksimacije modela enzimske oksidacije L-DOPA u

    mikroreaktoru, diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2010

    26. Reid M.F., Fewson C.A., Molecular characterization of microbial alcohol

    dehydrogenases, Crit. Rev. Microbiol. 20 (1994) 13-56

    27. Santiago- Gómez M.P., Thanh H.T., Coninck J.D., Cachon R., Kermasha S., Belin J.M.,

    Gervais P., Hisson F., Modelling hexanal production in oxido-reducing conditions by the

    yeast, Yarrowia lipolytica, Proc. Biochem. 44 (2009) 1013-1018

    28. Sariaslani F.S., Rosazza J.P.N., Biocatalysis in natural products chemistry, Enzyme

    Microb. Technol. 6 (1984) 242-253

    29. Schade F., Thompson J.E., Legge R.L., Use of a plant-derived enzyme template for the

    production of the green-note volatile hexanal, Biotechnol. Bioeng. 84 (2003) 265-273

  • 6. Literatura

    48

    30. Schmid A., Dordick J.S., Hauer B., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B., Industrial

    biocatalysis today and tomorrow, Nature 409 (2001) 258-268

    31. Song J., Leepipattwit R., Deng W., Beaudry R., Hexanal vapor acts as residueless

    antifungal agent that enhances aroma biosynthesis in apple fruit, Acta Hort. 464 (1996)

    219-224

    32. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Kem. Ind. 59 (2010) 227-248

    33. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Biotechnol. Bioproc. Eng. 16 (2011) 495-504

    34. Urban P.L., Goodall D.M., Neil C., Bruce N.C., Enzymatic microreactors in chemical

    analysis and kinetic studies, Biotechnol. Adv. 24 (2006) 42-57

    35. Vrsalović Presečki A., Studij fumaraze i alkohol dehidrogenaze u biotransformacijama,

    dizertacija, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2006

    36. Whitehead I.M., Muller B.L., Dean C., Industrial use of soybean lipoxygenase forthe

    production of natural green note flavor compounds, Cereal Foods World 40 (1995) 193-

    197

    37. Wörz O., Jäckel K.P., Richter T., Wolf A., Chem. Eng. Technol. 24 (2001) 138

    38. Yamaguchi M., Miyazawa T., Takata T., Endo T., Application of redox system based on

    nitroxides to organic synthesis, Pure Appl. Chem. 62 (1990) 217-222

    39. Yokoyama T., Yamagata N., Hydrogenation of carboxylic acids to the corresponding

    aldehydes, Appl. Catal. A. General 221 (2001) 227-239

    40. Yoon S.K., Choban E.R., Kane C., Tzedakis T., Kenis P.J.A., J. Am. Chem. Soc. 127

    (2005) 10466.

    41. Yoshida J., Nagaki A., Iwasaki T., Suga S., Chem. Eng. Technol. 28 (2005) 259.

  • 7. Popis simbola

    49

    7. POPIS SIMBOLA

    Simboli

    A - površina [m2]

    ABS - aprosbancija [-]

    c - množinska koncentracija [mol/dm3]

    d - promjer kivete [cm]

    D - difuzijski koeficijent [m2/s]

    df - debljina filma [μm]

    f - faktor razrjeđenja [-]

    H - visina mikroreaktora [μm]

    ID - unutarnji promjer kolone [mm]

    Kd - deaktivacijska konstanta [min-1

    ]

    Ki - inhibicijska konstanta [mmol/dm3]

    Km - Michaelis-Menteničina konstanta [mmol/dm3]

    l - duljina kolone [m]

    L - duljina mikroreaktora [μm]

    X - konverzija [%]

    r - brzina reakcije [U/mg]

    t - vrijeme [s]

    T - temperatura [°C]

    V - volumen [m3]

    V.A. - volumna aktivnost [U/dm3]

    Vm - maksimalna brzina reakcije [U/g]

    W - širina mikroreaktora [μm]

  • 7. Popis simbola

    50

    Grčki simboli

    γ - masena koncentracija [mg/dm3]

    ε - ekstinkcijski faktor [cm2/μm]

    η - viskoznost [Pa s]

    λ - valna duljina [nm]

    τ - vrijeme zadržavanja [s]

    Indeksi

    P - produkt

    r - uzorak

    S - supstrat

    u - ukupno

    W - voda

  • 8. Prilozi

    51

    8. PRILOZI

    8.1. Baždarni pravci

    0,0 0,1 0,2 0,3

    0,0

    0,5

    1,0

    1,5A

    BS

    cNADH

    [mmol/dm3]

    y = 5,0624x

    R2 = 0,9998

    Prilog 1. Baždarni pravac za određivanje koncentracije NADH

    0 5 10 15 20 25

    0,00

    0,02

    0,04

    0,06

    0,08

    0,10

    0,12

    0,14

    AB

    S

    cEtOH

    [mmol/dm3]

    y = 0,0054x

    R2 = 0,9983

    Prilog 2. Baždarni pravac za određivanje koncentracije etanola

  • 8. Prilozi

    52

    0 1 2 3 4 5

    0,000

    0,005

    0,010

    0,015

    0,020

    0,025

    0,030

    0,035

    0,040

    AB

    S

    cheksanol

    [mmol/dm3]

    y = 0,0078x

    R2 = 0,9915

    Prilog 3. Baždarni pravac za određivanje koncentracije heksanola

    0 1 2 3 4 5

    0,000

    0,005

    0,010

    0,015

    0,020

    0,025

    0,030