SVEUČILIŠTE U ZAGREBU FAKULTET KEMIJSKOG …€¦ · biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi, formiranje neželjenih nusproizvoda

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ

Mia Ivanković

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, rujan 2012.

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSVA I TEHNOLOGIJE

SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ

Mia Ivanković

RAZVOJ POTPUNO INTEGRIRANOG PROCESA

PROIZVODNJE HEKSANALA U MIKROKANALU

DIPLOMSKI RAD

Voditelj rada: dr. sc. Bruno Zelić, red. prof.

Članovi ispitnog povjerenstva:

dr. sc. Bruno Zelić, red. prof. (mentor)

dr .sc. Aleksandra Sander, red. prof.

dr. sc. Zvjezdana Findrik Blažević, docent

Zagreb, rujan 2012.

i

SAŽETAK

Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatije kao green note.

Zbog svojih organoleptičkih svojstava heksanal je našao široku primjenu u prehrambenoj,

farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji, a zbog baktericidnih i fungicidnih svojstava primjenjuje

se i u agronomiji. Uobičajeno se proizvodi fermentacijom s cijelim stanicama, ekstrakcijom iz

biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi,

formiranje neželjenih nusproizvoda i nastanak velike količine otpada pa je i više nego očita

potreba za razvojem i primjenom novih tehnologija u proizvodnji heksanala. Kao jedna od novih

tehnologija koje se koriste u proizvodnji heksanala sve se više nameću mikroreaktorski sustavi

koji omogućuju bolji prijenos tvari i energije, manju potrošnju kemikalija i energije te druge

prednosti u odnosu na konvencionalne reaktore.

U ovom radu provedena je biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim alkohol

dehidrogenazu u mikroreaktoru volumena 6 μL. Alkohol dehidrogenaza je enzim koji se ubraja u

skupinu oksidoreduktaza kojima je zajednička karakteristika potreba za koenzimom. Kako je

cijena koenzima NAD+ izuzetno visoka, nužno je procesom regeneracije reducirani oblik

koenzima prevesti ponovno u oksidirani oblik. S tim ciljem razvijen je proces proizvodnje

heksanala s potpuno integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno

serijski povezana mikročipa. Ispitan je prijenos tvari između dvije faze paralelnog toka koji je

uspostavljen u mikrokanalima te je razvijen 2D matematički model strujanja. Postavljen je i

matematički model potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala s regeneracijom

koenzima u mikroreaktoru, te je provedena ocjena valjanosti modela na podatcima nezavisnih

pokusa. Pokazano je dobro slaganje matematičkog modela procesa i eksperimentalnih podataka,

a ovako razvijeni model pokazao se kao učinkovito sredstvo u daljnjem razvoju procesa.

Ključne riječi: ADH, heksanal, mikroreaktor, matematički model procesa, potpuno integrirani

proces

ii

SUMMARY

Hexanal is an essential part of the group of easily volatile components known as "green

notes". Because of its organoleptic properties hexanal has found wide application in food,

pharmaceutical and cosmetic industries, and due to its bactericidal and fungicidal properties is

applied in agriculture. Normally it is produced by fermentation with whole cells and enzyme-

catalyzed reactions or extracted from plants. The main disadvantages of these processes are low

yields, formation of undesired by-products and the formation of large amounts of waste, so the

need for development and application of new technologies in the production of hexanal is more

than obvious. As one of the new technologies used in the production of hexanal, microreactor

systems are increasingly being imposed as they allow better transfer of mass and energy, lower

consumption of chemicals and energy, and other advantages over conventional reactors.

In this work biocatalytic oxidation of hexanol with the enzyme alcohol dehydrogenase in

6 μL microreactor was carried out. Alcohol dehydrogenase is an enzyme that belongs to the

group of oxidoreductases, which share the characteristics of the need for coenzyme. As the price

of coenzyme NAD+ is extremely high, it is necessary to regenerate a reduced form of coenzyme

into the oxidized form. Therefore hexanal production process with fully integrated regeneration

and recirculation of coenzyme in two serially connected microchips was developed. Mass

transfer between the two phases established in microchannel was analysed and corresponding

mathematical model of 2D flow was developed. Additionaly, mathematical model of a fully

integrated hexanal production process with coenzyme regeneration in microreactor was

developed. Validation of the model was performed using data from independent experiments.

The good agreement between simulation and experimental results was observed.

Key words: ADH, hexanal, microreactor, mathematical model, fully integrated process

Sadržaj

iii

SADRŽAJ

1. UVOD ..................................................................................................................................... 1

2. TEORIJSKI DIO ................................................................................................................... 3

2.1. Heksanal ............................................................................................................................... 3

2.2. Enzimi .................................................................................................................................. 4

2.2.1. Oksidoreduktaze ............................................................................................................ 5

2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH) ...................................................................................... 5

2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ............................................................ 6

2.3. Kinetika enzimskih reakcija ................................................................................................. 8

2.4. Mikroreaktori ..................................................................................................................... 10

2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora .............................................................................. 10

2.4.2. Struktura mikroreaktora .............................................................................................. 11

2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH .......................................................... 14

3. MATERIJALI I METODE ................................................................................................ 15

3.1. Materijali ............................................................................................................................ 15

3.1.1. Kemikalije .................................................................................................................... 15

3.1.2. Priprema otopina ......................................................................................................... 15

3.1.3. Aparatura..................................................................................................................... 16

3.2. Analitičke metode .............................................................................................................. 19

3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH ................................................................................. 19

3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH .................................................................................... 20

3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala ........................................................... 20

3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola ................................................................................... 21

3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru...................................................................................... 21

3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola...................................................................... 21

3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+ ........................................................ 22

3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

serijski povezanim mikroreaktorima ..................................................................................... 23

3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala .................................. 24

3.4. Obrada podataka ................................................................................................................. 25

Sadržaj

iv

4. REZULTATI I RASPRAVA .............................................................................................. 27

4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu .......................................................................................... 27

4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom strujanju u

mikrokanalu ........................................................................................................................... 29

4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu .............................................................................................. 30

4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima ..................................... 30

4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola ........................................ 35

4.3. Reakcija oksidacije heksanola ............................................................................................ 37

4.4. Reakcija regeneracije koenzima ......................................................................................... 38

4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

povezanim mikroreaktorima ..................................................................................................... 39

4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala ............................................................. 40

5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 44

6. LITERATURA..................................................................................................................... 46

7. POPIS SIMBOLA................................................................................................................ 49

8. PRILOZI .............................................................................................................................. 51

8.1. Baždarni pravci .................................................................................................................. 51

8.2. Kromatogrami .................................................................................................................... 53

8.3. Jednodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

Scientist ..................................................................................................................................... 54

8.4. Dvodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

MATLAB .................................................................................................................................. 54

ŽIVOTOPIS

1. Uvod

1

1. UVOD

Green note spojevi su većinske komponente svježih, zelenih aroma povrća i voća poput

jabuka, višanja, kiwija, brusnica, jagoda i rajčica. Ove kemikalije se koriste u prehrambenoj

industriji kao dodatak za postizanje svježeg okusa u pićima i hrani. Procijenjena tržišna

vrijednost pred petnaestak godina im je bila otprilike 20 – 40 milijuna $ godišnje [Whitehead et

al. 1995]. Većinu tih spojeva čine aldehidi i alkoholi sa šest ugljikovih atoma. Jedan od takvih je

heksanal [Gargouri et al. 2004]. Heksanal se, osim u prehrambenoj industriji, koristi i u

farmaceutskoj i agrokemijskoj industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Santiago- Gómez

et al. 2009]. Heksanal je spoj koji se nalazi u prirodi u lipoksigenazi biljaka koja služi kao

preteča za proizvodnju alkohola i estera koji su često korišteni u proizvodnji aroma [Hildebrand

1989].

Opisano je nekoliko procesa proizvodnje heksanala koji su temeljeni na fermentaciji,

ekstrakciji iz biljaka i enzimski kataliziranim reakcijama [Whitehead et al. 1995, Márczy et al.

2002, Brunerie & Koziet 1997]. Zbog male količine dobivenog proizvoda, formacije velike

količine sporednih produkata i otpada, tradicionalni spojevi kao što su aromatski alkoholi ili

alkilni aromati, nisu prihvatljivi reaktanti za proizvodnju heksanala [Yokoyama & Yamagata

2001]. Jedan od prihvatljivijih načina proizvodnje heksanala je enzimski katalizirana reakcija uz

koenzim NAD+. Upotreba koenzima NAD

+ u organskim sintezama ograničena je činjenicom da

je koenzim prilično skup reagens, koji se mora dodati u stehiometrijskom omjeru. Kako se

njegovo oksidacijsko stanje tijekom reakcije mijenja, potrebno ga je regenerirati in situ

uporabom druge redoks reakcije. Regeneracijom koenzima redukcijom acetaldehida, osim što se

postiže znatna ušteda na koenzimu, može se utjecati i na pomicanje reakcijske ravnoteže u

željenom smjeru.

U današnje vrijeme ulažu se veliki napori u razvoj novih proizvodnih tehnika i procesa.

Primjena mikroreaktora u provedbi kemijskih i biokemijskih reakcija bi mogla predstavljati novu

generaciju proizvodnih procesa, a biotransformacije u mikroreaktorima mogu činiti dobru

alternativu procesima klasične kemijske sinteze [Šalić et al. 2010]. Mikroreaktori su našli široku

primjenu u različitim područjima počevši od klasičnih kemijskih sinteza pa sve do

biotehnoloških procesa i zaštite okoliša. Mikroreaktori se sve više primjenjuju i u industrijskim

procesima zahvaljujući svojim prednostima poput velike brzine prijenosa tvari i topline te

1. Uvod

2

mogućnosti provedbe egzotermnih ili eksplozivnih reakcija koje zahtjevaju intenzivan nadzor i

provode se pod strožim uvjetima [Jensen 2001]. Velika brzina prijenosa tvari i topline u

mikroreaktoru posljedica je smanjene difuzijske udaljenosti unutar reaktora i velike međufazne

površine po jedinici volumena reaktora u odnosu na konvencionalne makroreaktore. Zbog ovih

prednosti mikroreaktorske tehnologije se sve vise primjenjuju u farmaceutskoj industriji i

industriji finih kemikalija [Geyer et al. 2006]. Jedno od bitnih područja istraživanja je i primjena

enzimatskih mikroreaktora. Enzimatski mikroreaktori se uobičajeno dijele na dvije vrste, oni koji

se koriste u biotransformacijama i oni koji se koriste za ispitivanje kinetike, odnosno interakcija

različitih supstrata i produkata u enzimski kataliziranim reakcijama [Urban et al. 2006].

2. Teorijski dio

3

2. TEORIJSKI DIO

2.1. Heksanal

Heksanal ili kapronaldehid je aldehid molekulske formule C6H12O. Ima specifičan miris,

topljiv je u alkoholu i ulju, ali slabo topljiv u vodi. Važan je element mirisa cvijeta i lista biljaka

kao što su jabuka, avokado i borovnica. Nastaje tijekom ciklusa linoleinske kiseline (LOX). U

tom ciklusu, linoleinska kiselina uz enzim lipoksigenazu, te uz prisutstvo kisika, kao kosupstrata

prelazi u 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadiensku kiselinu (13-HPOD). U drugom koraku, ta se

kiselina uz hidroperoksid liazu raspada na 12-okso-9-dodekensku kiselinu i heksanal [Márczy et

al. 2002].

Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatijih kao green-

note. Ove komponente su kemikalije koje se upotrebljavaju u prehrambenoj i kozmetičkoj

industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Schade et al. 2003]. U današnje vrijeme postoji

povećano zanimanje da se kemijska proizvodnja green-note proizvoda zamijeni biološkom

prirodnom proizvodnjom. Potrošnja ovih proizvoda dobivenih prirodnim putem se procijenjuje

na 5- 10 tona godišnje [Muller et al. 1995].

Osim upotrebe u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji heksanal se koristi i kao

fungicid i baktericid. Dokazano je da kada se pri uzgoju jabuka koristi kao fungicid istovremeno

djeluje i na poboljšanje okusa ploda [Song et al. 1996].

Prirodnim putem heksanal se proizvodi fermentacijama, ekstrakcijom iz biljaka ili

enzimski kataliziranim reakcijama. Prilikom upotrebe enzima koriste se pročišćeni enzimi,

ekstrakti stanica, te cijele stanice. Primjer upotrebe izoliranog enzima je alkohol dehidrogenaza

koja je katalizira oksidaciju heksanola kojeg je u prirodi puno više nego heksanala [Karra-

Chaabouni et al. 2002]. Uz enzimske ekstrakte, heksanal se proizvodi iz linoleinske kiseline, pa

se za njegovu pripravu koriste stanice raznih biljaka (metvica, jagoda, rajčica, karanfil) koje

sadrže enzime LOX ciklusa. Uz cijele stanice, aldehidi se proizvode mikrobiološkom

oksidacijom primarnih alkohola uz korištenje bakterija Acetobacter i Gluconobacter u

dvofaznom mediju [Vrsalović Presečki 2006] .

2. Teorijski dio

4

Kemijskim putem heksanal se proizvodi oksidacijom heksanola uz katalizator

oksoaminijevu sol [Yamaguchi et al. 1990] ili uz metalne katalizatore (mangan, cink, bakar,

željezo) uz prisutstvo vodikovog peroksida [Guangdong et al. 2005]. Isto tako kemijski se može

proizvesti redukcijom estera, etil heksanoata, uz litij aluminij hidrid ili heksan kiseline uz

katalizator Cr2O3/TiO2 [Vrsalović Presečki 2006].

2.2. Enzimi

Naziv enzim prvi je upotrijebio Kuhne (1878. godine), a potječe od grčke riječi en ziyme

koja znači u kvascu. Još od vremena prije starog Egipta datira prva uporaba enzima za ljudske

potrebe (kvasac u proizvodnji kruha). Danas postoji čitav niz izoliranih enzima tako da je 1989.

izoliran 2461 enzim dok je 1947. bilo tek 200 izoliranih enzima [Vrsalović Presečki 2006].

Enzimi su organske makromolekule proteinskog sastava. To su biološki katalizatori, koji

ubrzavaju kemijske reakcije, a da se pri tome ne troše i ne mijenjaju. Vrlo su aktivni jer vrlo

mala količina enzima ubrzava reakciju 1020

puta. Aktivnost enzima izražava se kao količina

pretvorenog supstrata u mikromolovima u jedinici vremena.

Djelovanje enzima započinje tvorbom kompleksa sa supstratom koji ima manju energiju

aktivacije nego aktivirani intermedijer supstrata bez enzima (slika 1). U tom je kompleksu enzim

vezan uz supstrat Van der Waalsovim i elektrostatskim silama, vodikovim vezama ili rijeđe,

kovalentnom vezom. Kompleksiranje mora biti brzo i reverzibilno, tako da se produkt odvaja od

enzima odmah nakon reakcije i oslobađa enzim za daljnje katalitičko djelovanje. Dok su neki

enzimi strogo specifični i djeluju samo na jedan supstrat, drugi su manje ili grupno specifični.

Specifičnost enzima se očituje i prema djelovima molekule koji su udaljeni od mjesta djelovanja

enzima [Schmid et al. 2001].

Slika 1. Mehanizam enzimatske reakcije

2. Teorijski dio

5

Prednosti enzima pred klasičnim kemijskim katalizatorima su: selektivno i specifično

djelovanje, blagi uvjeti provedbe reakcija (pH, tlak, temperatura), potrebne male količine,

biorazgradljivost, obnovljivost izvora, provedba kompleksnih reakcija u jednom stupnju. Glavni

nedostatci enzima su visoka cijene pročišćavanja i izolacije, teško i skupo odvajanje od

reakcijske smjese, inaktivacija temperaturom, kiselošću, bazičnošću, podložnost ihibiciji

supstratom ili produktom, nestabilnost izvan prirodnog okruženja.

Upotreba enzima seže od primjene u industriji detergenata, prehrambenoj, naftnoj,

tekstilnoj te do najvažnije, organske sinteze u svrhu proizvodnje vrlo kompleksnih lijekova.

Enzimi se djele u nekoliko skupina: oksidoreduktaze (enzimi koji kataliziraju biološke

oksidacije i redukcije), transferaze (enzimi koji kataliziraju prijenos skupina), hidrolaze (enzimi

koji kataliziraju hidrolitička cjepanja), liaze (enzimi koji kataliziraju reakcije eliminacije),

izomeraze (enzimi koji kataliziraju pregradnju unutar molekula), ligaze (enzimi koji kataliziraju

stvaranje veze uz istovremeno cijepanje ATP-a) [Louglin 2000].

2.2.1. Oksidoreduktaze

Oksidoreduktaze su enzimi koji kataliziraju redoks reakcije prijenosom vodikovog ili

kisikovog atoma ili elektrona od jednog supstrata do drugog [Vrsalović Presečki 2006]. Dijelimo

ih na dehidrogenaze, oksigenaze i oksidaze. Imaju veliku važnost u organskim sintezama zbog

velikog broja supstrata s kojima reagiraju kao i zbog posjedovanja enantio-, regio- i

stereoselektivnih svojstava [Sariaslani & Rosazza 1984]. Karakteristika oksidoreduktaza je da

prilikom kataliziranja reakcija, zahtijevaju prisutnost koenzima. Oksidoreduktaze se primjenjuju

za sintezu lijekova, steroida, polimera, oksidativnu razgradnju zagađivača, te za konstrukciju

biosenzora za različite analitičke i kliničke primjene [May 1999].

2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH)

Alkohol dehidrogenaza (ADH) je oksidoreduktaza koja je široko rasprostranjena u

prirodi. Može se pronaći u mnogim životinjama, biljkama i mikroorganizmima. Ima važnu ulogu

2. Teorijski dio

6

u širokom rasponu fizioloških procesa [Reid & Fewson 1994]. Poznato je da je ADH tetramer

sastavljen od podjedinica molekulske mase približno 35.000, koje su vrlo slične, no nisu

identične [Harris 1964].

Slika 2. Pojednostavljeni prikaz molekule enzima ADH

Općenito se alkohol dehidrogenaze dijele u tri skupine, srednjočlana Zn-ovisna ADH kao

ADH iz konjske jetre i ADH iz Saccharomyces cerevisiae, kratkolančana Zn-neovisna ADH kao

ADH iz Lactobacillus brevis i dugolančana Fe-ovisna ADH kao ADH IV iz S. cerevisiae

[Jornvall et al. 1987]. ADH katalizira reverzibilnu oksidaciju alkohola u odgovarajući aldehid ili

keton. U različitim ogranizmima otkrivene su ADH koje kataliziraju stereospecifičnu redukciju

karbonilnih grupa. Alkohol dehidrogenaza komercijalno se proizvodi za određivanje alkohola u

procesima i u ljudskom tijelu, odnosno tjelesnim tekućinama [Vrsalović Presečki 2006].

2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+)

Osnovna zadaća koenzima je da djeluju kao transporteri kemijskih grupa od jednog do

drugog reaktanta. Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) uključen je u mnoge oksidacijske

procese katalizirane dehidrogenazama [Kane 2008]. Nikotinamidni prsten je redoks aktivan,

prima vodikov ion pri čemu se reducira u NADH. Reverzibilni transfer vodikovog iona iz

reduciranog supstrata u NAD+ i obrnuto je stereoselektivan i karakterističan za svaki pojedini

enzim [Bruiee & Benkovic 1965]. Nikotinamid koenzimi obično se ne vežu na enzime

2. Teorijski dio

7

kovalentnom vezom pa se lagano disociraju. Preskupi su da bi ih se koristilo kao reagense u

stehiometrijskom omjeru, stoga je potrebno pronaći način njihove regeneracije ukoliko enzim

zahtijeva prisutnost koenzima.

Slika 3. Struktura koenzima NAD(P)

Regeneracijom koenzima može se utjecati na pomicanje reakcijske ravnoteže.

Termodinamički nepovoljnu reakciju može se, spajanjem s reakcijom regeneracije koenzima,

pretvoriti u termodinamički povoljnu sprečavanjem akumulacije produkta koenzima koji bi

mogao inhibirati proces. U praksi se koristi reducirani oblik nikotinamid koenzima (NADH)

zbog niže cijene od njegovog oksidiranog oblika (NAD+). Postoje različite metode regeneracije

koenzima, ali sve moraju biti regioselektivne, kompatibilne s glavnom enzimskom reakcijom,

praktične, jeftine, te moraju regenerirati koenzim od 102 do 10

5 puta. Trenutno jedino enzimi

omogućavaju tako visoku selektivnost redukcije NAD+ u NADH i obrnuto. Proces regeneracije

enzimom može se provesti istim enzimom kao u glavnoj reakciji ili enzimom različitim od onog

koji se koristi u glavnoj reakciji. Druge metode koje se temelje na kemijskim, elektrokemijskim i

fotokemijskim strategijama nisu dovoljno selektivne [Yoon et al. 2005].

Za učinkovitu

regeneraciju koenzima nužno je da su potrebni enzimi, reagensi i oprema dostupni na tržištu,

jeftini i jednostavni za korištenje.

2. Teorijski dio

8

Slika 4. Mehanizam regeneracije koenzima drugim enzimom

Slika 5. Mehanizam elektrokemijske regeneracije koenzima

2.3. Kinetika enzimskih reakcija

Kinetički model reakcije je matematički izraz koji opisuje zavisnost brzine reakcije o

reakcijskim veličinama i parametrima [Gomzi 1998].

Brzina jednosupstratnih enzimskih reakcija opisuje se Michaelis-Menteničinom

kinetičkom jednadžbom [Dunn et al. 1992]. U navedenoj jednadžbi ovisnost početne brzine

reakcije o koncentraciji supstrata i enzima temelji se na mehanizmu prikazanom sljedećim

jednadžbama:

(1)

U prvom koraku dolazi do reverzibilne reakcije enzima (E) i supstrata (S) pri čemu

nastaje kompleks enzim-supstrat (ES). Taj kompleks se potom kemijski mijenja što rezultira

stvaranjem produkta (P) i njegovim odvajanjem od enzima. Jednadžba koja opisuje Michaelis-

Menteničinu kinetiku za jednosupstratne enzimske reakcije glasi (jednadžba 2):

S

S

m

Sm

cK

cVr

(2)

2. Teorijski dio

9

U navedenom izrazu cS označava koncentraciju supstrata, Vm maksimalnu brzinu reakcije,

KmS Michaelis-Menteničinu konstantu.

Dvosupstratna enzimska kinetika sačinjava glavninu svih enzimskih reakcija [Blanch &

Clark 1993], a drugi supstrat je najčešće koenzim. Michaelis-Menteničin kinetički model za

dvosupstratnu reakciju, prikazan je sljedećom jednadžbom (jednadžba 3):

2S

2S

m1S

1S

m

2S1Sm

cKcK

ccVr

(3)

U reakcijama biotransformacije vrlo često dolazi do inhibicije i deaktivacije enzima.

Inhibicija enzimski katalizirane reakcije javlja se kada se neki spoj, inhibitor, veže na aktivno

mjesto enzima te tako smanjuje brzinu reakcije. Inhibitor može biti supstrat ili produkt neke

kemijske reakcije. Tri su tipa reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna (jednadžba 4),

nekompetitivna (jednadžba 5) i antikompetitivna (jednadžba 6) [Laidler & Bunting 1973].

SP

i

PS

m

Sm

cK

c1K

cVr

(4)

P

i

PS

S

m

Sm

K

c1cK

cVr (5)

P

i

PS

S

m

Sm

K

c1cK

cVr (6)

Kod kompetitivne inhibicije, inhibitor se veže za aktivno mjesto na enzimu te se pritom

natječe sa supstratom za to mjesto. Inhibitor konkurira za aktivno mjesto i smanjuje na njemu

koncentraciju supstrata. To se očituje kao smanjenje brzine reakcije pri niskim koncentracijama

supstrata, a rezultat je povećanje vrijednosti Michaelis-Menteničine konstante. Kod

nekompetitivne inhibicije dolazi do ireverzibilnog vezanja inhibitora na mjesto različito od

aktivnog te se tako ometa vezanje supstrata na aktivno mjesto i inhibira brzina enzimske

reakcije. Antikompetitivna inhibicija je kombinacija dviju prethodno navedenih inhibicija.

Drugi razlog zbog kojeg može doći do smanjenja reakcijske brzine je deaktivacija

enzima. Uzrok smanjenja aktivnosti enzima se vrlo često ne može odrediti. Mogući razlozi

deakcivacije su temperatura, tlak, pH, brzina miješanja, denaturacija proteina, prisutnost ili

2. Teorijski dio

10

odsutnost neke komponente ili kombinacija navedenih faktora [Vrsalović Presečki 2006]. Brzina

deaktivacije enzima se najčešće opisuje kinetikom prvog (jednadžba 7) i drugog reda (jednadžba

8) [Laidler & Bunting 1973].

md

m Vkdt

dV (7)

2

md

m Vkdt

dV (8)

2.4. Mikroreaktori

2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora

Mikroreaktori su reaktorski sustavi izvedeni u mikroskopskom mjerilu koji su, u cijelosti

ili barem djelomično, proizvedeni korištenjem metodologije mikrotehnologije i

mikroinženjerstva. Sastoje se od mikrokanala izrazito malih dimenzija, karakterističnih veličina

od 10 - 500 μm, urezanih u pločice od stakla, silikona, silicija, polimera, i različitih drugih

materijala (slika 6) [Šalić et al. 2010]. Glavna karakteristika tih sustava je smanjenje volumena

procesne opreme na red veličine od desetak nanolitara do jednog mililitra. Zahvaljujući svojim

mikroskopskim dimenzijama mikroreaktori se odlikuju brojnim prednostima u odnosu na

konvencionalne/klasične makroreaktore. Tako mikroreaktori zauzimaju manje prostora, za

provedbu reakcija potrebna je manja količina kemikalija i energije, a značajno se smanjuje i

vrijeme provedbe reakcije [Nassar et al. 2007].

Slika 6. Mikroreaktori

2. Teorijski dio

11

S druge strane volumen mikroreaktora je još uvijek prevelik da bi njegove dimenzije

utjecale na tijek odvijanja reakcije na molekularnoj razini, ali njegove male karakteristične

dimenzije rezultiraju intenzivnijim prijenosom tvari i energije, i unaprjeđenjem režima strujanja.

U mikroreaktorima je tok fluida obično laminaran, dok u klasičnim reaktorima može biti

laminaran i turbulentan. Kada su prijenos tvari i topline ograničavajući čimbenici, mikroreaktori

su pogodniji za provedbu ovakvih procesa zbog intenzivnijeg prijenosa tvari i topline. Za

mikroreaktore je karakterističan i izrazito velik omjer površine prema ukupnom volumenu.

Odnos površine prema volumenu raste sa smanjenjem promjera reaktora. Za mikroreaktore je

omjer površine prema volumenu u rasponu veličina od 103 – 10

5 m

2 m

-3, dok je ta vrijednost za

makroskopske reaktore oko 102 m

2 m

-3 [Matsushita et al. 2007]. Primjerice, prenošenjem procesa

iz reaktora volumena 1 dm3 u reaktor volumena 30 m

3 (nisu geometrijski slični sustavi), omjer

površine prema volumenu smanjuje se 30 puta. U slučaju prenošenja procesa u mikroreaktor

volumena 30 cm3, taj omjer raste 3000 puta [Wörz et al. 2001]. Razlika mikroreaktora i

makroreaktora je i u tome što stjenka mikroreaktora ima mnogo veći utjecaj na strujanje fluida

nego stjenka konvencionalnih reaktora.

Većina današnjih istraživanja vezanih uz primjenu mikrokanala usmjerena je prema

razvoju mikrosustava za provedbu i analizu procesa (eng. micro-total-analysis-systems, μ-TAS).

U idealnim uvjetima takvi sustavi istovremeno obavljaju pripremu uzorka, miješanje, reakciju,

separaciju, detekciju i obradu podataka. Smatra se da će se zbog mogućnosti dobrog ugađanja

protoka i male koncentracije potrebnih reaktanata takvi sustavi moći ugraditi na teško dostupna

mjesta (ljudsko tijelo, dijelovi postrojenja, dna oceana, vrhovi planina, pustinje, polovi,

svemirske letjelice i slično) te kontinuirano pratiti kemijske i biokemijske procese koji se tamo

odvijaju. Trenutno je najviše pozornosti usmjereno prema istraživanju i razvoju μ-TAS koji se

primjenjuju u analizi DNA i ključnih metabolita vezanih uz različite bolesti [Šalić et al. 2010].

2.4.2. Struktura mikroreaktora

Karakteristične dimenzije unutrašnjih struktura mikroreaktora uglavnom se nalaze u mili-

, mikro- ili nanopodručju s užim ili širim rasponom veličina pojedinih dijelova uređaja koji su

prikazani na slici 7.

2. Teorijski dio

12

Slika 7. Osnovne strukturne jedinice mikroreaktora

Mikrokanali (slika 7a) su osnovne građevne jedinice mikroreaktora, a u većini slučajeva

su paralelni i nalaze se u nizu jedan do drugoga. Omeđeni su spojnicama za dovod reaktanata i

odvod produkata. Mogu biti pravokutnog ili kružnog poprečnog presjeka, površine od nekoliko

μm2 do nekoliko mm

2. Mikrokanali se urezuju u pločice od različitih materijala (npr. metal,

plastika, keramika) različitim tehnologijama urezivanja, što ima za posljedicu različita svojstva

površine mikrokanala, koja bitno utječu na karakteristike strujanja fluida i provedbu procesa.

Svaki kanal može sadržavati manje komore, odnosno može se sastojati od još sitnijih

mikrostruktura koje oblikom podsjećaju na pore [Šalić et al. 2010].

Pojedini protočni kanal ili nekoliko povezanih kanala određene geometrije čini jedan

mikroelement (slika 7b). Tipične dimenzije mikroelementa su 15 mm : 2 mm : 45 mm (širina :

debljina : duljina). S obzirom na izvedbu elementa mikroreaktora, postoje oni s više

2. Teorijski dio

13

ulaznih/izlaznih procesnih tokova koji se spajaju/razdvajaju u zajedničke/odvojene tokove

pomoću tzv. „Y“ ili „T“ spojnica (slika 8).

Slika 8. Prikaz „T“ i „Y“ spojnica

Kombinacija mikroelementa, povezanih linija toka fluida i nosača čini jedan čip (slika

7c.) koji omogućuje lakše povezivanje s vanjskim pumpama i detektorima te spajanje više

elemenata serijski ili paralelno. Mikroreaktorski čipovi se međusobno povezuju paralelno ili

serijski, kako bi se povećala protočnost i produktivnost sustava, s obzirom na protok reaktanata,

produkata ili katalizatora. Takav način povezivanja najčešće se primjenjuje kod mikroreaktora

koji se koriste za provođenje reakcija u plinskoj fazi. Nijedna elementarna ćelija ne može

funkcionirati samostalno jer su joj za neovisan rad potrebni periferni uređaji kao što su

odgovarajuće pumpe ili senzori.

Naziv mikrouređaj odnosi se na element ugrađen u kućište, povezan odgovarajućim

spojnicama s vanjskim pumpama za dovod reaktanata, katalizatora ili povratni tok reakcijske

smjese (slika 7d). Mikrouređaj može biti sastavljen od nekoliko povezanih mikrouređaja, koji u

tom slučaju čine njegove osnovne komponente. Paralelno ili serijski povezani mikrouređaji,

odnosno različite mikroprocesne jedinice za pripremu reaktanata i katalizatora, provedbu

reakcije i separaciju produkata predstavljaju tzv. mikropostrojenje. Građa i veličina

mikropostrojenja ovisi o tipu reaktora koji ga čine i o vrsti reakcija koje se u njemu odvijaju te, u

općenitom slučaju, o tome jesu li reaktori laboratorijskog ili industrijskog mjerila.

2. Teorijski dio

14

2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH

Biokatalitička oksidacija heksanola provodi se uz enzim alkohol dehidrogenazu pri čemu

kao produkt nastaje heksanal. Za provođenje ove reakcije potrebno je u stehiometrijskom omjeru

dodavati koenzim NAD+ u sustav. Reakcijom se koenzim NAD

+ reducira u NADH kojeg je

potrebno regenerirati natrag u NAD+. Regeneracija koenzima NAD

+ može se provesti reakcijom

redukcije acetaldehida uz koenzim NADH enzimom ADH. Reakcijski sustav prikazan je

kemijskim jednadžbama na slici 9.

Slika 9. Reakcijski sustav

U dvosupstratnoj reakciji regeneracije acetaldehid se reducira do etanola s koenzimom

NADH o kojem ovisi katalitičko djelovanje enzima alkohola dehidrogenaze. Ravnoteža ove

reakcije pomaknuta je ulijevo, pa se udesno pomiče dodavanjem NAD+ u suvišku, podešavanjem

povoljnog pH i dodatkom otopine semikarbazida za uklanjanje etanola.

3. Materijali i metode

15

3. MATERIJALI I METODE

U radu su provedeni pokusi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, regeneracije koenzima

NAD+ u mikroreaktoru, reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

povezanim mikroreaktorima, te potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala. Tijekom ovih

procesa određivane su koncentracija NADH i aktivnost enzima NADH spektrofotometrijski, te

koncentracije etanola, heksanola i heksanala plinskom kromatografijom.

3.1. Materijali

3.1.1. Kemikalije

U ovom radu korištene su sljedeće kemikalije: acetaldehid (Fluka, Švicarska), acetonitril

(J. T. Baker, Nizozemska), ADH (Sigma, Belgija), cikloheksanon (Carlo Erba Group,

Francuska), etanol (Carlo Erba Group, Francuska), glicin (Sigma, Belgija), HCl (Kemika,

Hrvatska), heksan (Merck, Njemačka), heksanal (Fluka, Švicarska), heksanol (Merck,

Njemačka), NAD+ (Jülich Fine Chemicals, Njemačka), NADH (Jülich Fine Chemicals,

Njemačka), pirofosfat (Kemika, Hrvatska).

3.1.2. Priprema otopina

Za pripremu glicin-pirofosfatnog pufera pH = 9 potrebno je otopiti 8,34 g Na4P2O7 10

H2O i 0,42 g glicina u 250 cm3 redestilirane vode te podesiti pH otopine dodatkom 1 mol/dm

3

otopine HCl.

1 mol/dm3 otopina HCl pripremljena je miješanjem 8,47 cm

3 36 % - tne HCl sa 100 cm

3

destilirane vode.

Otopina za određivanje baždarnog pravca za NADH c = 0,3 mmol/dm3 pripremljena je

otapanjem 1,49 mg NADH u 7 cm3 glicin-pirofosfatnog pufera.


16

Otopina za određivanje baždarnog pravca za etanol c = 25 mmol/dm3 pripremljena je

miješanjem 0,0146 cm3 etanola u 10 cm

3 glicin-pirofosfatnog pufera.

Otopina za određivanje baždarnog pravca za heksanol i heksanal pripremljena je

razrijeđivanjem standardnih otopina heksanola i heksanala 200 puta u heksanu, te miješanjem s

1%-tnom otopinom cikloheksanona u heksanu.

1 %-tni cikloheksanon pripravljen je miješanjem 1 cm3 cikloheksanona u 99 cm

3

destilirane vode.

Za određivanje aktivnosti enzima alkohol dehidrogenaze korištene su sljedeće otopine: 2

mmol/L otopina etanola (pripremljena je miješanjem 2,917 cm3 etanola s 250 cm

3 destilirane

vode), otopina NAD+ c = 25 mmol/dm

3 (0,89 g NAD

+ otopljeno u 50 cm

3 destilirane vode), 75

mmol/dm3 glicin-pirofosfatni pufer pH = 9, suspenzija enzima ADH γ = 0,2 mg/cm

3 (1 mg ADH

otopljen u 5 cm3 destilirane vode).

Sve otopine čuvane su u hladnjaku na + 4 ºC, a prije korištenja zagrijavane su u

termostatu na radnu temperaturu od 25 ºC.

3.1.3. Aparatura

3.1.3.1. Mikroreaktorski sustav

Mikroreaktorski sustav (slika 10) sastoji se od mikročipa s mikrokanalima od

borosilikatnog stakla (cijevni mikroreaktor, dužina : širina : visina = 330 : 250 : 50 μm s

unutarnjim volumenom 6 mm3). Srednja hrapavost mikrokanala je u području 0,8 – 2,5 μm

ovisno o načinu izrade. Mikroreaktor je opremljen s dva ulaza "Y"-oblika, za odvojeno uvođenje

različitih procesnih struja i dva izlaza istog oblika. Čipovi mikroreaktora smješteni su u nosač od

nehrđajućeg čelika, koji omogućuje spajanje bez gubitaka (Micronit Microfluidics BV,

Nizozemska). Dvije pumpe (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) opremljene špricama od

nehrđajućeg čelika (8 cm3, Harvard Apparatus, SAD) korištene su za dovođenje procesnih struja.

Mikroreaktorski čipovi su spojeni na pumpe silicijskim cijevčicama (375 μm O.D., 150 μm I.D.,

Micronit Microfluidics BV, Nizozemska). Protok fluida u mikroreaktoru promatran je pomoću


17

mikroskopa povezanog na računalo (Motic B1-220A, binokularni Weltzar, Njemačka) na

uvećanjima od 40 x i 100 x (uvećanje okulara = 10 x; uvećanje objektiva = 4 x, 10 x).

Slika 10. Mikroreaktorski sustav: a) injekcijske pumpe, b) mikroreaktorski čip na nosaču

promatran mikroskopom, c) komponente računala)

3.1.3.2. Plinski kromatograf

Koncenentracije etanola, heksanola i heksanala određivane su plinskom kromatografijom

(GC-2014, Shimadzu, Japan) s plameno-ionizacijskim detektorom uz korištenje helija kao plina

nosioca (slika 11).

Slika 11. Plinski kromatograf


18

3.1.3.3. Spektrofotometar

Dvozračni spektrofotometar (UV-1601, Shimadzu, Japan) korišten je za mjerenje

aktivnosti enzima ADH i za određivanje koncentracije NADH (slika 12).

Slika 12. UV spektrofotometar

3.1.3.4. Centrifuga

Uzorci su centrifugirani na stojećoj, horizontalnoj centrifugi (Universal 320R, Hettich,

Njemačka) na 9000 min-1

kroz 3 minute (slika 13).

Slika 13. Centrifuga


19

3.1.3.5. Ostala aparatura

o homogenizator (Vibrofix VF1, IKA-Werke, Njemačka)

o filter (Chromafil Xtra PA 20/25, 0.2 μm, 25 mm, a 100, proizvođač, zemlja)

o vaga (EW, max. 1500 g, min. 0.5 g, Kern, zemlja))

o vaga (AUW 120, max. 120 g, min. 10 mg, Shimadzu, Japan)

3.2. Analitičke metode

3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH

Aktivnost enzima ADH je određena spektrofotometrijskim testom koji se temelji na

reakciji oksidacije etanola u acetaldehid u glicin – pirofosfatnom puferu pH 9. Shematski se

reakcija može prikazati jednadžbom 9:

(9)

Spektrofotometrijski je mjerena promjena apsorbancije nastalog NADH pri λ = 340 nm

jer reducirani oblik nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) apsorbira maksimalnu količinu

svjetla te valne duljine, dok njegova oksidirana forma (NAD+) u valnom području 300 – 400 nm

ne apsorbira svjetlo.

Iz promjene apsorbancije u vremenu ΔABS/Δt izračunata je volumna aktivnost enzima

ADH prema izrazu (jednadžba 10):

AV

=DABS

Dt×

Vu

Vr×e

340×d

× f (10)

gdje su: f – faktor razrjeđenja; Vr – volumen uzorka (cm3); Vu – ukupni volumen (cm

3);

ε340 – ekstincijski koeficijent (cm2 μm

-1), iznosi 6,22 cm

2 μm

-1 za λ = 340 nm; d – promjer kivete

(cm). Volumna aktivnost je izražena u međunarodnoj jedinici enzimske aktivnosti U po jedinici

volumena pri čemu je 1 U = 1 μmol/min, odnosno ona aktivnost enzima koja je potrebna da se

oksidira 1 μmol/dm3 supstrata u minuti.


20

Za test je bilo potrebno u kivetu od 3 cm3 odpipetirati 0,500 cm

3 etanola (cEtOH = 2

mol/dm3), 1,000 cm

3 NAD

+ (cNAD+ = 25 mmol/dm

3), 1,490 cm

3 pufera (75 mmol/dm

3 glicin-

pirofosfatni pufer pH = 9), 0,010 cm3 enzima (γADH = 0,2 mg/cm

3).

3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH

1 cm3 uzorka iz mikroreaktora izmjerena je apsorbancija na spektrofotometru pri λ = 340

nm. Iz izmjerene apsorbancije izračunata je koncentracija NADH pomoću prethodno

konstruiranog baždarnog pravca (prilog 1). Baždarni pravac određen je mjerenjem apsorbancije

otopine različitih poznatih koncentracija NADH na istoj valnoj duljini.

3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala

100 mm3 uzorka iz mikroreaktora pomiješano je sa 100 mm

3 1%-tne otopine

cikloheksanona u heksanu koji je korišten kao unutarnji standard. Smjesa je prvo mješana na

vorteksu 30 – 60 s kako bi se heksanol i heksanal ekstrahirali, a potom centrifugirana 3 min na

9000 rpm pri 4 °C. Nakon centrifugiranja odvojen je i profiltriran gornji organski sloj. Ovaj sloj

je analiziran na plinskom kromatografu s plameno- ionizacijskim detektorom, korištenjem helija

kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB- WAX (l = 30 m; ID = 0,53 mm; df = 1 μm).

Temperatura injektora iznosila je 280 °C, dok je temperatura detektora bila 240 °C. Kolona se

grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 180 °C brzinom od 10 °C/min, te se

grijala na konačnoj temperaturi od 180 °C 2 min. Vrijeme zadržavanja heksana bilo je 2,1 min,

heksanala 5,9 min, cikloheksanona 9,2 min, a heksanola 9,7 min (prilog 6). Koncentracije

heksanola i heksanala izračunate su pomoću prethodno priređenih baždarnih pravaca (prilog 3 i

prilog 4).


21

3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola

Koncentracija etanola određivana je plinskom kromatografijom s plameno- ionizacijskim

detektorom, korištenjem plina helija kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB-WAX (l = 30 m;

ID = 0,53 mm; df = 1 μm). Temperatura injektora iznosila je 240 °C, kao i temperatura

detektora. Kolona se grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 125 °C kroz 6

minuta. Uzorci su pripremani miješanjem jednakog volumena uzorka i otopine 1%-tnog

acetonitrila, koji je služio kao unutarnji standard, na vorteksu tijekom jedne minute. Nakon

centrifugiranja (3 min, 9000 rpm, 4 °C) uzorci se injektiraju u plinski kromatograf. Vrijeme

zadržavanja etanola je 3,2 min, a vrijeme zadržavanja acetonitrila je 4,1 min (prilog 5).

Koncentracija etanola izračunata je pomoću prethodno priređenog baždarnog pravca (prilog 2).

3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru

3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola

Tijekom provedbe procesa oksidacije heksanola korišten je stakleni mikroreaktor

volumena 6 mm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika. Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5

mmol dm-3

) kao jedna procesna struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm

-3) kao druga

procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih pumpi (PHD 4400, Harvard

Apparatus, SAD) u mikroreaktor pri protocima od 5-200 mm3 min

-1.

Za usporedbu različitih sustava proces je proveden u mikroreaktorima s glatkim i

hrapavim stjenkama, te pri omjerima organske i vodene faze 1:1 te 3:1.

Uzorci izlaznih procesnih struja za određivanje koncentracije heksanola i heksanala

prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1 %-tnog cikloheksanona

bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Prije analize na plinskom

kromatografu uzorci su centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 um, 25

mm, Macherey-Nagel GmbH CoKG, Njemačka). Aparatura za provedbu procesa oksidacije

heksanola shematski je prikazana na slici 14.


22

Slika 14. Shematski prikaz sustava za provedu procesa oksidacije heksanola

3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+

Provedena su dva nezavisna pokusa s istom koncentracijom NADH, ali različitom

koncentracijom acetaldehida te su praćene konverzije pri različitim vremenima zadržavanja.

Korišten je mikroreaktor volumena 6 cm3, s dva ulaza „Y“-oblika i dva izlaza jednakog

oblika, pri čemu je jedan ulaz korišten za uvođenje procesne stuje acetaldehida i pufera, a drugi

za procesnu struju enzima, koenzima i pufera. Otopine su u mikroreaktor uvođene preciznim

injekcijskim pumpama uz konstantni protok (Harvard Apparatus PHD 4400 USA). Pokusi su

provedeni za različita vremena zadržavanja (0,9 – 9 s) pri čemu je protok dviju procesnih struja

uvijek bio jednak. Uzorci su prikupljani u ledu kako bi se zaustavila reakcija.

Koncentracija enzima ADH u oba pokusa je bila 0,2 mg/cm3, koncentracija NADH 5,5

mmol/dm3, a koncentracija acetaldehida u prvom pokusu je bila 5,5 mmol/dm

3, dok je u drugom

bila 44 mmol/dm3. Aparatura za provedbu procesa oksidacije heksanola shematski je prikazana

na slici 15.

Slika 15. Shematski prikaz sustava za provedbu procesa regeneracije koenzima NADH


23

3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

serijski povezanim mikroreaktorima

Na slici 16 prikazan je sustav serijski spojenih procesa oksidacije heksanola i

regeneracije koenzima. Reakcije su provođene u 75 mmol/dm3 glicin-pirofosfatnom puferu pH =

9 pri temperaturi 25 °C.

Korišteni su stakleni mikroreaktori volumena 6 cm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika.

Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5 mmol dm-3

) pri protoku 30 mm3 min

-1 kao jedna procesna

struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm

-3) i enzima ADH (γ = 0,2 mg cm

-3), pri

protoku 10 mm3 min

-1 kao druga procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih

pumpi (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) u prvi mikroreaktor. Ulaz u drugi mikroreaktor

jedna procesna struja bila je otopina izreagiranog koenzima NAD+ iz prvog mikroreaktora pri

protoku od 10 mm3 min

-1, dok je druga procesna struja otopina acetaldehida (c = 2 mmol dm

-3)

pri protoku od 10 mm3 min

-1.

Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije

heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1

%-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci

izlaznih procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola iz jedne

struje i za određivanje koncentracije NADH iz druge struje, prikupljani su u ledu kako bi se

zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu i spektrofotometru uzorci su

centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel

GmbH CoKG, Njemačka).


24

Slika 16. Shematski prikaz serijski spojenih sustava za za provedu oksidacije heksanola i

regeneraciju koenzima NADH

3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala

Za provedbu potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala korištena je aparatura

shematski prikazana na slici 17. Eksperiment je proveden na isti način kao i proces oksidacije

heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s tom razlikom

da je procesna struja koja sadrži vodenu otopinu enzima ADH i regeneriranog koenzima NAD+

pomoću protočne pumpe uvođena na ulaz prvog mikroreaktora protokom od 10 mm3 min

-1.

Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije

heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1

%-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci izlazne

procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola prikupljani su u

ledu kako bi se zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu uzorci su

centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel

GmbH CoKG, Njemačka). Aktivnost enzima je praćena nakon 1, 4, 22 i 43 sata na svim izlaznim

procesnim strujama, te je praćena aktivnost po broju prolaza reaktanata kroz sustav, gdje se jedan

prolaz odnosi na potrošenu početnu količinu reaktanata u injekcijskim pumpama.


25

Slika 17. Shematski prikaz potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala

3.4. Obrada podataka

Za simulacije matematičkog modela procesa korišteni su računalni programi Scientist

(Micromath®) i MATLAB® (MathWork).

Scientist je računalni program razvijen za primjenu u različitim područjima znanosti i

inženjerstva. Omogućava:

rješavanje sustava jednadžbi matematičkih modela koji mogu biti sastavljeni od

nelinearnih jednadžbi, diferencijalnih jednadžbi te Laplace-ovih transformacija

jednostavan unos jednadžbi modela

jednostavno upravljanje podacima

statističku analizu podataka i njihov grafički prikaz

izračunavanje optimalnih parametara modela.

Algoritmi koje upotrebljava Macromath Scientist prilagođeni su iz različitih izvora. Za

rješavanje diferencijalnih jednadžbi koriste se četiri standardne metode (Eulerova, Runge-Kuta,

Runge-Kuta metoda kontrole pogrešaka i Bulirsch-Stoer metoda) te metoda razvijena za

rješavanje sustava jednadžbi (Episode).


26

MATLAB® je programski jezik za tehničke proračune. Ime je dobio od riječi MATrični

LABoratorij (eng. Matrix Laboratory), pošto mu je osnovni element za obradu podataka matrica

(niz). MATLAB® služi za rješavanje različitih matematičkih problema, te čitavog niza problema

vezanih uz digitalnu obradu signala, upravljanje, regulaciju i identifikaciju sustava. Koristi se za

matematička izračunavanja, modeliranje i simulaciju, analizu i obradu podataka, grafičko

prikazivanje rezultata i razvoj algoritma.

Programski paket MATLAB® ima više funkcija:

omogućuje lako dodavanje novih funkcija izgrađenih pomoću ugrađenih naredbi,

podaci u MATLAB®-u se tretiraju kao matrice, odnosno retci i stupci,

obična varijabla se također predstavlja kao matrica s dimenzijom [11],

sadrži sve naredbe i operacije iz linearne algebre (zbrajanje, množenje, traženje vlastitih

vrijednosti itd.), svi su podaci u obliku pomičnog zareza dvostruke preciznosti (eng.

double float) što osigurava zadovoljavajuću dinamiku i točnost za gotovo sve primjene,

pored realnih varijabli odnosno matrica, program podržava i kompleksne brojeve.

4. Rezultati i rasprava

27

4. REZULTATI I RASPRAVA

U ovom radu istraživani su tipovi strujanja u mikrokanalima različite hrapavosti za

različite omjere protoka organske i vodene faze. Određene su međufazne površine pri paralelnom

i segmentiranom strujanju. Određen je prijenos tvari za komponenete reakcijskog sustava

oksidacije heksanola i regeneracije koenzima. Provedeni su pokusi u kojima su analizirani

različiti procesni sustavi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, sustavi s i bez regeneracije

koenzima, sustav s povratnim tokom regeneriranog enzima, a u svrhu određivanja najpovoljnije

procesne konfiguracije.

4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu

Ispitani su tipovi strujanja dvofaznog sustava kapljevina-kapljevina (organska-vodena

faza) u mikrokanalu. Praćena je promjena tipova strujanja pri protjecanju dvofaznog sustava kroz

mikrokanale hrapave površine i mikrokanale glatke površine, gdje se hrapavost površine odnosi

na mikrogeometrijsku nepravilnost površine koja nastaje tijekom postupaka obrade, te promjena

tipova strujanja kao funkcije omjera protoka organske i vodene faze. Na slici 18 prikazane su

fotografije hrapavog i glatkog mikrokanala.

a) b)

Slika 18. Fotografija a) hrapavog mikrokanala, b) glatkog mikrokanala

Različita hrapavost površine mikrokanala utječe na tipove strujanja. Na slici 19 prikazani

su tipovi strujanja u hrapavom i glatkom mikrokanalu pri omjeru protoka organske i vodene faze

30:10 mm3/min. Vidljivo je da je u mikrokanalu hrapave površine uspostavljeno segmentirano


28

strujanje, dok je u mikrokanalu glatke površine uspostavljeno paralelno strujanje dviju faza.

Također, u mikrokanalu glatke površine ne dolazi do mješanja, a uspostavljena međufazna

površina je postojana od ulaza do izlaza iz mikrokanala.

a) b)

Slika 19. Tipovi strujanja za omjer protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min u

mikrokanalima: a) hrapave površine, b) glatke površine

Promatrajući tipove strujanja u mikrokanalima glatke površine pri različitim omjerima

protoka organske i vodene faze, vidljiva je nestabilnost paralelnog toka pri manjim protocima.

Na slici 20 prikazani su tipovi strujanja za omjere protoka organske i vodene faze 3:1 (slika 20a),

6:2 (slika 20b) i 30:10 (slika 20c) mm3/min. Vidljivo je da je tek pri omjeru protoka 30:10

mm3/min uspostavljen stabilan laminaran tok te su stoga svi daljnji pokusi u ovom radu

provedeni za ovaj omjer protoka organske i vodene faze.

a) b) c)

Slika 20. Profili strujanja za različite omjere protoka organske i vodene faze, a) 3:1

mm3/min; b) 6:2 mm

3/min; c) 30:10 mm

3/min


29

4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom

strujanju u mikrokanalu

Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri paralelnom toku dviju kapljevina,

uspostavjena u mikrokanalu glatke površine, je jednaka umnošku širine i duljine mikrokanala

(jednadžba 11):

Apar = L W = 332 mm 50 μm (11)

i iznosi 1,66 10-5

m2.

Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri segmentiranom toku dviju kapljevina,

uspostavljena u mikrokanalu hrapave površine, ovisi o ukupnom protoku u mikrokanalu. Ova

međufazna površina se određuje zbrajanjem međufazne površine odvojeno za svaki segment

zasebno, te je reda veličine 10-6

m (slika 21). Kontaktna površina sa strane vodene faze je veća

od kontaktne površine sa strane organske faze, zbog načina određivanja. Aproksimirana je ravna

kontaktna površina između segmenata, unatoč njihovoj zaobljenosti, te je stoga kontaktna

površina sa strane vodene faze porasla zbog smanjenja kontaktne površine organske faze.

0 50 100

0,00000

0,00001

0,00002

0,00003

vodena faza

organska faza

A [

m2]

q [mm3/min]

Slika 21. Ovisnost kontaktne površine vodene i organske faze o ukupnom protoku prilikom

strujanja u mikrokanalu hrapave površine


30

S obzirom da je međufazna površina u mikrokanalu s glatkom površinom 10 puta veća od

međufazne površine mikrokanala s hrapavom površinom, moguće je očekivati veće reakcijske

brzine, te za mala vremena zadržavanja i povećanje konverzije.

4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu

4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima

Ukupna brzina reakcije određena je enzimskom aktivnošću i brzinom kojom se ostvaruje

veza enzim-supstrat. Zbog malih dimenzija mikrokanala, prijenos tvari i brzina difuzije ne

limitiraju ukupnu brzinu reakcije kao u klasičnim makroreaktorskim sustavima.

Utjecaj difuzije za reakciju regeneracije koenzima prethodno je eksperimentalno ispitivan

[Ferk & Ivanković 2011.]. Difuzijski koeficijent (D) za sve komponente koje sudjeluju u reakciji

regeneracije koenzima, a otopljene su u vodi procijenjen je prema Scheibelovoj empirijskoj

korelaciji (jednadžba 12):

2/38

/ 1/3

38.2 101 W

S W

W S S

VTD

V V

(12)

gdje je S ispitivana komponenta (ADH, NADH i etanol), a W otapalo (voda), T je temperatura

(K), VW i Vs su molarni volumeni pojedinih komponenata, a η viskoznost otapala (kg/ms).

Difuzijsko vrijeme (τD) pojedine komponente izračunato je prema jednadžbi 13:

2

/

( )D

S W

R

D

(13)

gdje R predstavlja polumjer mikrokanala. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 1.

Za NAD+ difuzijski koeficijent i difuzijsko vrijeme nisu određivani jer se molarni

volumen NAD+ ne razlikuje značajno od molarnog volumena NADH.


31

Tablica 1. Procjenjene vrijednosti difuzijskog koeficijenta i difuzijskog vremena pri 25 °C za

sve komponente koje sudjeluju u reakciji regeneracije koenzima

Komponenta Vs

[cm3/mol]

DS/W 109

[ m2/s]

τD

[s]

ADH 335 0,560 30,55

NADH 305 0,551 27,89

Etanol 55,2 1,563 9,99

Acetaldehid 58,9 1,504 10,39

Dobiveni difuzijski koeficijenti korišteni su u postavljenom 2D matematičkom modelu

koji uključuje konvekciju u aksijalnom smjeru () i difuziju u aksijalnom i radijalnom smjeru (,

, slika 22).

Slika 22. Shema mikrokanala s pripadajućim dimenzijama

(2W = 220 µm, H = 50 µm i L = 332 mm)

Bilanca tvari za pojedine komponente (S) u mikrokanalu u stacionarnim uvjetima za

sustav u kojemu se ne odvija kemijska reakcija može se prikazati sljedećim izrazom (jednadžba

14):

2 2

/

2 2( ) S S W S Sc D c c

W

(14)

s pripadajućim rubnim uvjetima (jednadžbe 15):


32

,(0, ) ; 0 1

(0, ) 0; 1 0

, 0 1 0

, 0 0

S i S

S

E

E

c c

c

c L

W

c L

W

(15)

Prvi član bilance tvari u mikrokanalu (jednadžba 15) predstavlja konvekciju, a drugi

difuziju. Iz prvog rubnog uvjeta (jednadžba 16) koji se odnosi na procesnu struju otopine s

otopljenom ispitivanom komponentom, slijedi da je koncentracija komponente na ulazu u

mikroreaktor, za interval od 0 do 1 (širina mikroreaktora) jednaka početnoj koncentraciji u

ulaznoj procesnoj struji. Za interval od -1 do 0 (širina mikroreaktora) iz rubnog uvjeta slijedi da

je koncentracija komponenti jednaka 0. Sljedeća dva rubna uvjeta podrazumijevaju da na cijelom

intervalu širine na izlazu iz mikroreaktora i na cijelom intervalu dužine na rubovima mikrokanala

nema promjene koncentracije.

cS u jednadžbama predstavljaju koncentracije otopljenih komponenti, DS/W predstavlja

difuzijske koeficijente različite komponente u vodi, ci označava ulaznu koncentraciju, vξ je

linearna brzina strujanja u smjeru .

Nakon što je postavljen matematički model procesa parcijalna diferencijalna jednadžba je

diskretizirana primjenom metode konačnih razlika. Dobivena linearna jednadžba (jednadžba 16)

riješena je u programskom paketu MATLAB

(Prilog 8.4).

, , , 1, , 1, , , , 1, , , 1 , , , , 1/

2 2

2 2( )

S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i jS Wc c c c c c c cD

W

(16)

Dobiveni rezultati simulacije matematičkog modela u mikroreaktoru za svaku pojedinu

komponentu reakcijskog sustava regeneracije koenzima prikazani su na slici 23.


33

a) b)

c)

Slika 23. Rezultati simulacije matematičkog modela difuzije u vodenom dvofaznom sustavu u

mikroreaktoru za: a) ADH, b) NADH, c) etanol

S obzirom na kompleksnost rješavanja parcijalnih diferencijalnih jednadžbi, također je

ispitana mogućnost upotrebe jednostavnih numeričkih aproksimacija za opis difuzije pojedinih

komponenti u mikrokanalu. Kako bi predvidjeli i opisali događaje korištena je metoda dvofaznog

idealnog cijevnog reaktora [Ptičar, 2010] gdje je svaka od dvije faze u mikroreaktoru

matematički opisana kao idealni cijevni reaktor u stacionarnom stanju. Prijenos tvari između faza

odvija se difuzijom koja je opisana jednostavnim kvocijentom razlika koncentracija između dvije

točke i udaljenosti između njih.

Ako je na poziciji x1 koncentracija tvari c1, a na poziciji x2 koncentracija c2

koncentracijski gradijent opisan je izrazom (jednadžba 17):

12

12

xx

cc

x

c

(17)


34

Model prijenosa tvari difuzijom između dvije vodene faze prikazan je jednadžbom 18

koja je riješena u programskom paketu Scientist (Prilog 8.3).

)(

)(

12

2

2

12

2

1

SSS

S

SSS

S

ccW

Dc

xv

ccW

Dc

xv

(18)

Na slici 24 prikazana je usporedba rezultata simulacija dobivenih rješavanjem

matematičkih modela procesa u programskim paketima Scientist (jednadžba 18) i MATLAB

(jednadžba 16) te je vidljivo da oba modela dobro opisuju eksperimentalne podatke. S obzirom

na jednostavnije i brže rješavanje matematičkog modela procesa koji je temeljen na dvofaznom

idealnom cijevnom reaktoru u ostatku rada korišten je samo ovaj model.

a)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

V.A

. [U

/cm

3]

[s]

b)

0 2 4 6 8 10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

c [m

mo

l/d

m3]

[s]


35

c)

0 2 4 6 8 10

0

1

2

3

4

5

c [m

mo

l/d

m3]

[s]

Slika 24. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog

modela procesa difuzije u mikrokanalu za: a) ADH, b) NADH, c) etanol (●: eksperimentalni

rezultati; - - - model rješavan u Scientistu, ― model rješavan u MATLABu]

4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola

Utjecaj prijenosa tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola eksperimentalno je

određivan u mikroreaktoru. S obzirom na netopivost heksanola i heksanala u vodi, za reakcijski

sustav oksidacije heksanola određivana je samo difuzija enzima i koenzima (c0,NADH = 7

mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

3). Difuzijski koeficijenti i difuzijska vremena jednaki su onima

procijenjenim u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima.

Iako model za difuziju NADH u organsku fazu nije jednak modelu za difuziju u sustavu

voda-voda koji je korišten za difuziju u procesu regeneracije koenzima, zbog pojednostavljenja

računa i simulacija pretpostavljeno je da slijede isti trend. Dobiveni rezultati prikazani su na slici

25. Vidljivo je odstupanje od matematičkog modela pri višim vremenima zadržavanja zbog

pojednostavljenja modela.


36

0 5 10 15 20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

c [m

mo

l/d

m3]

[s]

Slika 25. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog

modela procesa difuzije u mikrokanalu (metoda dvofaznog idealnog cijevnog reaktora) za

NADH

Kod pokusa u kojima je ispitivana difuzija enzima ADH uočena je njegova deaktivacija u

organskoj fazi te bi za opisivanje ovog sustava u matematički model procesa bilo potrebno

uključiti i koeficijent deaktivacije (slika 26).

0 2 4 6 8

0,00

0,04

5

10

15

20

25

30

V.A

. [U

/cm

3]

[s]

Slika 26. Eksperimentalni rezultati za ADH


37

4.3. Reakcija oksidacije heksanola

Napravljeni su pokusi pri različitim vremenima zadržavanja u kojima je reakcija

oksidacije heksanola katalizirana enzimom ADH provedena uz prisustvo ekvimolarne količine

koenzima NAD+ (c0,heksanol = 5,5 mmol/dm

3, c0,NAD+ = 5,5 mmol/dm

3, γ0,ADH = 0,092 μg/cm

3) pri

omjeru protoka organske i vodene faze 1:1. Konverzija postignuta u mikroreaktorskom sustavu

za vrijeme zadržavanja = 36 s u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama iznosila je 30 %, dok je u

mikroreaktoru s glatkim stjenkama iznosila 60 % (slika 27).

0 10 20 30 40

0

20

40

60

X [

%]

[s]

Slika 27. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s hrapavim () i

glatkim () stjenkama pri istim početnim uvjetima

Također, proveden je pokus u mikroreaktoru s glatkim stjenkama pri čemu je omjer

protoka organske i vodene faze bio 3:1, te je pri vremenu zadržavanja = 36 s dobivena

konverzija od 20 % (slika 28).


38

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

10

20

30

40

50

X [

%]

[s]

Slika 28. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s glatkim stjenkama

pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1

Može se zaključiti da je konverzija za iste uvjete u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama

manja od konverzije postignute u mikroreaktoru s glatkim stjenkama zbog manje međufazne

površine što je pokazano u poglavlju 4.1.1. Konverzija u mikroreaktoru s glatkim stjenkama

manja je u sustavu s omjerom faza 3:1 zbog deaktivacije enzima ADH organskom fazom.

Unatoč manjoj vrijednosti postignute konverzije sustav u kojemu je omjer protoka faza bio 3:1 je

bolji za provedbu integriranog procesa jer se faze u potpunosti razdvajaju na izlazu iz

mikroreaktora.

4.4. Reakcija regeneracije koenzima

Reakcija regeneracije koenzima (redukcija acetaldehida) provedena je u dva pokusa s

različitim početnim uvjetima. U pokusu 1 početne koncentracije komponenata reakcijske smjese

bile su c0,acetaldehid = 6,9 mmol/dm3, c0,NADH = 5,5 mmol/dm

3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

3. U pokusu 2

početne koncentracije komponenata reakcijske smjese bile su c0,acetaldehid = 44 mmol/dm3, c0,NADH =

5,5 mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm

3.


39

0 2 4 6 8 10

0

20

40

60

80

100

X [

%]

[s]

Slika 29. Ovisnost konverzije etanola o vremenu zadržavanja za pokus 1 () i pokus 2 () pri

različitim početnim uvjetima [—: model]

Postignuta konverzija u procesu regeneracije koenzima provedenom s ekvimolarnim

koncentracijama reaktanata iznosila je 80 %, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida (pokus 2)

konverzija iznosila 100 % (slika 29).

4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

serijski povezanim mikroreaktorima

Na slici 30. prikazan je shematski prikaz reakcije oksidacije heksanola i reakcije

regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s izlaznim koncentracijama i

postignutim konverzijama.


40

Slika 30. Shematski prikaz serijski spojenog glavnog i regeneracijskog sustava sa završnim

koncentracijama i dobivenim konverzijama

Postignuta konverzija heksanola pri ukupnom protoku od 40 mm3/min u mikroreaktoru

za provedbu glavne reakcije iznosila je 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju

ostvarena 100 %tna regeneracija koenzima NAD+ pri ukupnom protoku od 20 mm

3/min.

Vrijeme zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu glavne reakcije za heksanol je τ = 12 s,

dok je za NAD+ τ = 36 s. Vremena zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu regeneracije za

obje procesne struje τ = 36 s. Stoga je reakcija provođena tijekom četiri vremena zadržavanja

komponenti s većim vremenom zadržavanja, tj. reakcija je provođena 144 s.

4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala

Proces potpuno integrirane proizvodnje heksanala (slika 14) proveden je pod istim

početnim uvjetima kao i oksidacija heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski

povezanim mikroreaktorima. Na slici 31 prikazane su koncentracije heksanola i heksanala na

izlaznoj procesnoj struji iz provog mikroreaktora i koncentracije etanola na izlaznoj procesnoj

struji iz drugog mikroreaktora u ovisnosti o vremenu, dok je na slici 32 prikazana ovisnost

konverzije heksanola o vremenu provođenja eksperimenta.

cNADH

= 0,66 mmol/dm3

cNADH

= 0 mmol/dm3

cEtOH

= 0,654 mmol/dm3

cNADH

= 0 mmol/dm3

cheksanol

= 3,21 mmol/dm3

cheksanal

= 0,66 mmol/dm3

Xheksanol = 17, 22 %

XNADH

= 100 %


41

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

heksanol

heksanal

etanol

c [m

mo

l/dm

3]

t [h]

Slika 31. Ovisnost koncentracija heksanola, heksanala i etanola na izlazima o vremenu

0 10 20 30 40 50

0

5

10

15

20

X [

%]

t [h]

Slika 32. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu

U procesu proizvodnje heksanala u potpuno integriranom sustavu postignuta je

maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan unutar prva 4 h provedbe pokusa nakon

čega je došlo do postupnog pada konverzije uslijed deaktivacije enzima, što je također vidljivo iz

povećanja koncentracije heksanola nakon prva 4 h provedbe pokusa. Za postizanje boljih

rezultata potrebna je daljnja optimizacija sustava, prvenstveno u smislu povećanja stabilnosti

enzima u prisutnosti organskog otapala.

Praćena je i aktivnost enzima po prolazu što je prikazano na slici 33. S obzirom da su za

recirkulaciju potrebna dva klipa, od kojih se jedan neprestano prazni, a drugi puni, kraj prvog


42

prolaza je kada se prvi klip u potpunosti isprazni, a drugi napuni. Tada oni zamijene svoje

funkcije i onaj koji se do tada punio, sada se počinje prazniti, i obrnuto. Vrijeme jednog prolaza

je 27 h.

0 10 20 30 40 50 60

0

10

20

V.A

. [U

/cm

3]

t [h]

Slika 33. Ovisnost aktivnosti enzima o vremenu trajanja procesa

Također, praćena je aktivnost enzima u vremenu (slika 34), tj. dio enzima koji je korišten

za reakciju, sačuvan je u zasebnoj kiveti. Dakle praćena je aktivnost enzima koji nije sudjelovao

u reakciji kako bi se vidjelo kada prestaje djelovanje enzima bez obzira na reakciju.

0 10 20 30 40 50 60 70

0

5

10

15

20

25

V.A

. [U

/cm

3]

t [h]

Slika 34. Dinamička promjena aktivnosti enzima na sobnoj temperaturi u nezavisnom

pokusu


43

Prema slici 33 vidljivo je da je enzim prestao biti aktivan nakon drugog prolaza, što je u

našem slučaju bilo 54 h nakon početka procesa, dok je na slici 34 vidljivo da bi enzim trebao biti

aktivan 72 sata. Razlog što do opadanja aktivnosti enzima u procesu dolazi ranije je zbog

inhibicije organskih otapala (acetaldehida, heksana, heksanola i heksanala), te je moguće

zaključiti da proces zahtijeva daljnju optimizaciju.

5. Zaključak

44

5. ZAKLJUČAK

U ovom radu proveden je potpuno integriran proces proizvodnje heksanala s potpuno

integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno serijski povezana

mikročipa.

U mikrokanalu s hrapavom površinom ostvareno je segmentirano strujanje, dok je u

mikrokanalu s glatkom površinom uspostavljeno paralelno strujanje. Veća međufazna površina

postignuta je u mikrokanalu s glatkom površinom te je stoga i konverzija heksanola u ovakom

reaktoru veća. Također je uočeno da je pri omjeru protoka organske i vodene faze 30:10

mm3/min uspostavljen stabilan paralelan tok ovih faza. Stoga su svi daljnji pokusi

biotransformacije heksanola bili provođeni u mikrokanalu s glatkim stjenkama pri omjeru

protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min.

Analiziran je utjecaj difuzije komponenata reakcijske smjese na učinkovitost procesa u

svakom od serijski povezanih mikročipova, odnosno za reakciju oksidacije heksanola i reakciju

regeneracije koenzima. Za proces regeneracije koenzima NAD+ uočeno je da etanol izrazito

difundira iz jedne faze u drugu, za razliku od enzima i koenzima. Pokazano je da rezultati

simulacije matematičkog modela procesa dobro opisuju eksperimentalne podatke. U procesu

oksidacije heksanola uočena je izrazita difuzija NADH iz vodene u organsku fazu, kao i

postepena deaktivacija enzima djelovanjem organskog otapala.

Za sustav oksidacije heksanola u mikrokanalu s glatkim površinama pri omjeru protoka

organske i vodene faze 1:1 postignuta je konverzija od 60 % pri vremenu zadržavanja 36 s, dok

je pri istom vremenu zadržavanja uz omjer protoka organske i vodene faze 3:1 postignuta

konverzija od 20 %. Unatoč manjoj konverziji pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1, pri

tom omjeru protoka faza bolje je odvajanje faza na izlazu iz mikroreaktora te je ovaj omjer

protoka pogodniji za pri provedbi integriranog procesa proizvodnje heksanala. U sustavu

regeneracije koenzima postignuta je konverzija od 80 % pri vremenu zadržavanja od 9 s u

pokusu s ekvimolarnim koncentracijama reaktanata, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida

pri istom vremenu zadržavanja postignuta konverzija od 100 %. U procesu reakcije oksidacije

heksanola i regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima postignuta je

konverzija heksanola od 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju ostvarena 100 %tna

regeneracija koenzima NAD+. U potpuno integriranom procesu proizvodnje heksanala postignuta

5. Zaključak

45

je maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan prva 4 h provedbe pokusa nakon čega

dolazi do opadanja konverzije uslijed deaktivacije enzima.

Promatrani integrirani sustav može se koristiti kao proces za proizvodnju heksanola, ali je

nužna daljnja optimizacija procesnih uvjeta prvenstveno zbog nedovoljne stabilnosti korištenog

enzima. Kao sljedeći korak u daljnjem razvoju potpuno integriranog procesa proizvodnje

heksanala nužna je integracija ekstrakcije dobivenog heksanala i recirkulacija regeneriranog

heksanola.

6. Literatura

46

6. LITERATURA

1. Blanch H.W., Clark D.S., Biochemical Engineering, Marcel Dekker, New York, 1993,

str. 151-157

2. Bruiee T.C., Benkovic S.J., Biorganic Mechanisms, Benjamin, New York, 1965, str. 301

3. Brunerie P., Koziet Y., Process for producing natural cis-3-hexenol from unsaturated fatty

acids, US Patent 5,620,879, 1997

4. Doku G.N., Verboom W. , Reinhoudt D.N., van den Berg A., Tetrahedron 61 (2005) 2733

5. Dunn I.J., Heinzle E., Ingham J., Prenosil J.E., Biological Reaction Engineering, Wiley-

VCH, Weinheim, 1992, str. 25-31

6. Ehrfeld W., Hessel V., Löwe H., Microreactors: New Technology for Modern Chemistry.

Wiley-VCH, Weinheim, 2000, str. 1-34

7. Ferk E., Ivanković M., Regeneracija koenzima NAD+ u mikroreaktoru, kemijsko-

inženjerske vježbe, Zagreb, 2011.

8. Gargouri M., Akach N.B., Legoy M.D., Coupled hydroperoxide lyase and alcohol

dehydrogenase for selective synthesis of aldehyde or alcohol, Appl. Biochem.

Biotechnol. 119 (2004) 171-180

9. Geyer K., Codee J.D., Seeberger P.H., Microreactors as tools for synthetic chemist- the

chemists’ round bottomed flask of the 21st century?, Chem. Eur. J. 12 (2006) 8434-8442

10. Gomzi Z., Kemijski reaktori, HINUS, Zagreb, 1998, str. 36-55

11. Guangdong Z., Zhanlin X., Xiaohong G., Hong Z., Yanan L., Xueju L., Tiexin C.,

Wenxing L., Kaiji Z., Transition metal substitued tungstophosphoric compound catalyzed

oxidation of hexanol to hexanal with hydrogen peroxide, React. Kinet. Catal. Lett. 85

(2005) 57-64

12. Harris J.I., Structure and catalytic activity of alcohol dehydrogenase, Nature 203 (1964)

30-34

13. Hildebrand D.F., Lipoxygenases, Plant Physiol. 76 (1989) 249-253

14. Jensen K.F., Microreaction engineering- is small better?, Chem. Eng. Sci. 56 (2001) 293-

303

6. Literatura

47

15. Jornvall H., Persson B., Jeffery J., Characteristics of alcohol/polyol dehydrogenases, the

zinc- containing longchain alcohol dehydrogenases, Eur. J. Biochem. 167 (1987) 195-201

16. Kane C., Tzedakis T., AIChE Journal 54 (2008) 365

17. Karra- Chaabouni M., Pulvin S., Meziani A., Thomas D., Touraud D., Kunz W.,

Bioxidation of n-hexanol by alcohol oxidase and catalase in biphasic micelar systems

without solvent, Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 27-32

18. Laidler K.J., Bunting P.S., The chemical kinetics of enzyme action, Claredon Press,

Oxford, 1973, str. 93-97, 430-435

19. Louglin W.A., Biotransformation in organic synthesis, Bioresource Technol. 74 (2000)

49-62

20. Márczy J.S., Németh Á.S., Samu Z., Háger-Veress Á., Szajáni B., Production of hexanal

from hydrolized sunflower oil by lipoxygenase and hydroperoxid lyase enzymes,

Biotechnol. Lett. 24 (2002) 1673-1675

21. Matsushita Y., Ichimura T., Ohba N., Kumada S., Sakeda K., Suzuki T., Tanibata H.,

Murata T., Pure. Appl. Chem. 79 (2007) 1959

22. May S.W., Applications of oxidoreductase, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 370-375

23. Muller B.L., Dean C., Whitehead I.M., The industrial use of plant enzymes for the

production of natural “green note” flavour compounds, Bioflavour 95, Dijon (France)

(1995) 339-344

24. Nassar R. Hu J., Palmer J., Dai W., Catal. Today 120 (2007) 121

25. Ptičar A., Numeričke aproksimacije modela enzimske oksidacije L-DOPA u

mikroreaktoru, diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2010

26. Reid M.F., Fewson C.A., Molecular characterization of microbial alcohol

dehydrogenases, Crit. Rev. Microbiol. 20 (1994) 13-56

27. Santiago- Gómez M.P., Thanh H.T., Coninck J.D., Cachon R., Kermasha S., Belin J.M.,

Gervais P., Hisson F., Modelling hexanal production in oxido-reducing conditions by the

yeast, Yarrowia lipolytica, Proc. Biochem. 44 (2009) 1013-1018

28. Sariaslani F.S., Rosazza J.P.N., Biocatalysis in natural products chemistry, Enzyme

Microb. Technol. 6 (1984) 242-253

29. Schade F., Thompson J.E., Legge R.L., Use of a plant-derived enzyme template for the

production of the green-note volatile hexanal, Biotechnol. Bioeng. 84 (2003) 265-273

6. Literatura

48

30. Schmid A., Dordick J.S., Hauer B., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B., Industrial

biocatalysis today and tomorrow, Nature 409 (2001) 258-268

31. Song J., Leepipattwit R., Deng W., Beaudry R., Hexanal vapor acts as residueless

antifungal agent that enhances aroma biosynthesis in apple fruit, Acta Hort. 464 (1996)

219-224

32. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Kem. Ind. 59 (2010) 227-248

33. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Biotechnol. Bioproc. Eng. 16 (2011) 495-504

34. Urban P.L., Goodall D.M., Neil C., Bruce N.C., Enzymatic microreactors in chemical

analysis and kinetic studies, Biotechnol. Adv. 24 (2006) 42-57

35. Vrsalović Presečki A., Studij fumaraze i alkohol dehidrogenaze u biotransformacijama,

dizertacija, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2006

36. Whitehead I.M., Muller B.L., Dean C., Industrial use of soybean lipoxygenase forthe

production of natural green note flavor compounds, Cereal Foods World 40 (1995) 193-

197

37. Wörz O., Jäckel K.P., Richter T., Wolf A., Chem. Eng. Technol. 24 (2001) 138

38. Yamaguchi M., Miyazawa T., Takata T., Endo T., Application of redox system based on

nitroxides to organic synthesis, Pure Appl. Chem. 62 (1990) 217-222

39. Yokoyama T., Yamagata N., Hydrogenation of carboxylic acids to the corresponding

aldehydes, Appl. Catal. A. General 221 (2001) 227-239

40. Yoon S.K., Choban E.R., Kane C., Tzedakis T., Kenis P.J.A., J. Am. Chem. Soc. 127

(2005) 10466.

41. Yoshida J., Nagaki A., Iwasaki T., Suga S., Chem. Eng. Technol. 28 (2005) 259.

7. Popis simbola

49

7. POPIS SIMBOLA

Simboli

A - površina [m2]

ABS - aprosbancija [-]

c - množinska koncentracija [mol/dm3]

d - promjer kivete [cm]

D - difuzijski koeficijent [m2/s]

df - debljina filma [μm]

f - faktor razrjeđenja [-]

H - visina mikroreaktora [μm]

ID - unutarnji promjer kolone [mm]

Kd - deaktivacijska konstanta [min-1

]

Ki - inhibicijska konstanta [mmol/dm3]

Km - Michaelis-Menteničina konstanta [mmol/dm3]

l - duljina kolone [m]

L - duljina mikroreaktora [μm]

X - konverzija [%]

r - brzina reakcije [U/mg]

t - vrijeme [s]

T - temperatura [°C]

V - volumen [m3]

V.A. - volumna aktivnost [U/dm3]

Vm - maksimalna brzina reakcije [U/g]

W - širina mikroreaktora [μm]

7. Popis simbola

50

Grčki simboli

γ - masena koncentracija [mg/dm3]

ε - ekstinkcijski faktor [cm2/μm]

η - viskoznost [Pa s]

λ - valna duljina [nm]

τ - vrijeme zadržavanja [s]

Indeksi

P - produkt

r - uzorak

S - supstrat

u - ukupno

W - voda

8. Prilozi

51

8. PRILOZI

8.1. Baždarni pravci

0,0 0,1 0,2 0,3

0,0

0,5

1,0

1,5A

BS

cNADH

[mmol/dm3]

y = 5,0624x

R2 = 0,9998

Prilog 1. Baždarni pravac za određivanje koncentracije NADH

0 5 10 15 20 25

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

AB

S

cEtOH

[mmol/dm3]

y = 0,0054x

R2 = 0,9983

Prilog 2. Baždarni pravac za određivanje koncentracije etanola

8. Prilozi

52

0 1 2 3 4 5

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

AB

S

cheksanol

[mmol/dm3]

y = 0,0078x

R2 = 0,9915

Prilog 3. Baždarni pravac za određivanje koncentracije heksanola

0 1 2 3 4 5

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

AB

S

cheksanal

[mmol/dm3]

y = 0,0059x

R2 = 0,9958

Prilog 4. Baždarni pravac za određivanje koncentracije heksanala

8. Prilozi

53

8.2. Kromatogrami

Prilog 5. Tipični kromatogram za etanol

Prilog 6. Tipični kromatogram za heksanal

8. Prilozi

54

8.3. Jednodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

Scientist

// MicroMath Scientist Model File IndVars:z DepVars:ce1,ce2 Params:De,W v*ce1'=-(De/W^2)*(ce1-ce2) v*ce2'=(De/W^2)*(ce1-ce2) z=0 ce1=0 ce2=5 De=0.00156 W=0.125 v=213.33 ***

8.4. Dvodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

MATLAB

clear all clc close all % poèetni uvjeti % nadh-reg

k1=1328; k2=1; k3=0.00001512;

x=[1:50]; y=[1:9];

c(51,y)=0; c(1,1:5)=0; c(1,5:8)=7; i=[0:6]; c(2:3,7)=7; c(2:4,8)=7;

for x=1:50 for y=1:8 for i=0:50 if y>5 && x==2+i c(x,y)=7;

8. Prilozi

55

for y=8:-1:1 if y<5 && x==2+i c(x,y)=0;

for x=1:50 for y=1:7 for i=0:50 for z=2:50 c(4:50,8)=c(4:50,7); if y==5+i && x==z+i c(x,y)=c(x+1,y);

c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y-

1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2); fprintf('c1=%g\n',c(x,y)); for y=8:-1:2 for i=0:50 for z=1:50

c(4:50,1)=c(4:50,2); if y==5-i && x==z+i

c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y-

1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2);

fprintf('c2=%g\n',c(x,y)); end end end end end end end end end end end end end end end

ŽIVOTOPIS

Mia Ivanković je rođena 8. veljače 1989. godine u Koprivnici gdje je s izvrsnim

uspjehom završila Osnovnu školu i Prirodoslovno – matematičku gimnaziju. Školsku godinu

2000./2001. pohađala je na engleskom jeziku u Međunarodnoj osnovnoj školi u Ljubljani. 2007.

godine upisala je preddiplomski studij Kemijsko inženjerstvo na Fakultetu kemijskog

inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu. Demonstrator je na Zavodu za mehaničko i

toplinsko procesno inženjerstvo od 2009. godine te na Zavodu za reakcijsko inženjestvo i

katalizu od 2011. godine. 2009. godine sudjelovala je u pripremi provedbe znanstveno-

istraživačkog projekta EU FP6 - Javnozdravstveni utjecaj dugoročne izloženosti niskoj razini

mješavine elemenata na podložne skupine stanovništva (Public health impact of long-term, low-

level mixed element exposure in susceptible population strata (PHIME) www.phime.org).

Sudjelovala je na 6. susretu studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopćenjem

„Laccase based oxidation of phenol in microreactor“ 2010. godine u Zagrebu, te na 7. susretu

studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopćenjem „NAD+ coenzyme

regeneration in microchannel – kinetic parameters estimation and modelling“ 2011. godine u

Mariboru. Koautor je nagrađenog postera na 1st

European Congress of Applied Biotechnology u

Berlinu 2011. godine. Sudjelovala je na IX. Susretu mladih kemijskih inženjera s posterima

“Razvoj potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala u mikrokanalu” i “Nisko-

temperaturna razgradnja dušikovog monoksida na Au/Fe2O3 katalizatoru”. Dobitnica je

Dekanove nagrade u ak. god. 2009./2010. za zapaženi znanstveni rad. Preddiplomski studij je s

izvrsnim uspjehom završila 2010. godine i upisala diplomski studij Kemijsko procesno

inženjerstvo. Provela je pet mjeseci u 2012. godini na Katholieke Universiteit Leuven, u sklopu

programa razmjene studenata Erasmus. Aktivno se služi engleskim jezikom, a pasivno

njemačkim. Tokom studiranja završila je 3. stupanj francuskog jezika.

http://www.phime.org/

Documents

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU FAKULTET KEMIJSKOG …€¦ · biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi, formiranje neželjenih nusproizvoda