SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

SVEUČILIŠNI PREDDIPLOMSKI STUDIJ EKOINŽENJERSTVO

Ana Folo

Usporedba antipjenila pri uzgoju Pseudomonas putida

Završni rad

Voditelj rada Dr sc Bruno Zelić red prof

Članovi ispitnog povjerenstva

Dr sc Bruno Zelić red prof

Dr sc Marija Vuković - Domanovac doc

Dr sc Vanja Kosar izv prof

Zagreb rujan 2012

Zahvaljujem se mentoru profesoru Bruni Zeliću na uloženom trudu idejama i pomoći

pri izradi ovog završnog rada

Veliko hvala asistentu Nikoli Panduriću na uloženom vremenu i strpljenju pri

realizaciji praktičnog dijela rada

Na kraju hvala mojoj obitelji na poticajima razumijevanju i omogućavanju

studiranja

Sažetak

Pseudomonas putida je Gram-negativna štapićasta bakterija koja ima sposobnost

uklanjanja raznih organskih toksičnih onečišćivala razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija izradu bioplastike te kao biljni

agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina

Pojava pjene je vrlo česta prilikom uzgoja mikroorganizama naročito u aerobnim

procesima a nastaje zbog prisutnosti proteina na granici faza plin-kapljevina Pjenjenje može

dovesti do smanjene proizvodnje biomase jer mjehurići mogu uništiti proteine a nastala pjena

može rezultirati i gubitkom sterilnosti ako se prelije izvan reaktora Dodatak kemijskih

antipjenila je česta metoda sprečavanja nastanka pjene pri uzgoju mikroorganizama Male

količine antipjenila su dovoljne i imaju nizak doprinos troškovima proizvodnje Antipjenila su

puzdana pri ekstremnim uvjetima pjenjenja i jednostavna za rukovanje

U ovom radu ispitan je utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj bakterije

P putida Ispitivanja su provedena u staklenoj menzuri sa zapjenjenim medijem nastalim

uzgojem P putida na sintetičkom mediju M9 Medij je bio konstantno miješan na magnetskoj

mješalici i aeriran pomoću zraka koji je dovođen s dna menzure pomoću porozne cjevčice

Visina pjene i koncentracija otopljenog kisika u mediju su praćeni prije i nakon dodatka

antipjenila

Uspješnost antipjenila je procjenjena po brzini uništavanja pjene i količini utrošenog

antipjenila Ponovo formiranje pjene ukazivalo je na nepouzdanost antipjenila Sva korištena

antipjenila su imala minimalan utjecaj na smanjenje koncentracije otopljenog kisika u mediju

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se najučinkovitijim u suzbijanju nastanka pjene

Ključne riječi Pseudomonas putida uzgoj mikroorganizama pjenjenje antipjenila

Abstract

Pseudomonas putida is a Gram-negative rod shaped bacterium which has the

capability to degrade numerous toxic organic compounds deconstructing aliphatic or aromatic

hydrocarbon chains These bacteria have a large number of potential applications and can be

used in various biotechnological processes including bioremediation of contaminated areas

quality improvement of fossil fuels biocatalytic production of fine chemicals production of

bioplastics and as agents of plant growth promotion and plant pest control

The appearance of the foam is very common especially in aerobic fermentations and

is due to the presence of protein at the gas-liquid interface Foaming can lead to reduced

yields since bubbles can damage proteins and can also result in loss of sterility if foam

escapes Addition of chemical antifoam agents is a common method for preventing the

formation of foam Small quantities of antifoam are needed and it has low contribution to

production costs It is reliable at extreme foaming conditions and easy to handle

This study was conducted to investigate the impact and effectiveness of 8 different

antifoam agents on the cultivation of P putida Tests were performed in a glass column with

foaming medium produced by cultivation of P putida on synthetic medium M9 Medium was

continuously stirred by magnetic stirrer and aerated by air supplied at the base of the column

with a porous diffuser Foam height and dissolved oxygen concentration were measured

before and after the addition of antifoam agents

The applicability of antifoam agents was assessed by the speed of foam destruction

and the amount of consumed antifoam The formation of new foam indicated unreliable

antifoam agent All used antifoam agents had almost no effect on the concentration of

dissolved oxygen Antifoam agent ASP ndash 664 proved to be the most successful in suppressing

foam formation

Key words Pseudomonas putida biomass growth foaming antifoam agents

Sadržaj

1 UVOD 1

2 OPĆI DIO 2

21 Pseudomonas putida 2

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru 2

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina 4

24 Pjenjenje 5

25 Antipjenila 6

3 EKSPERIMENTALNI DIO 8

31 Mikroorganizam 8

32 Kemikalije 8

33 Priprema otopina 9

34 Uređaji 9

341 Tresilica 9

342 Kisikova elektroda 10

343 UVVIS spektrofotometar 10

344 Autoklav 11

345Kompresor 12

35 Provedba pokusa 12

351 Uzgoj biomase 12

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila 13

4 REZULTATI I RASPRAVA 16

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji 16

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase 16

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju 23

5 ZAKLJUČAK 27

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

Zahvaljujem se mentoru profesoru Bruni Zeliću na uloženom trudu idejama i pomoći

pri izradi ovog završnog rada

Veliko hvala asistentu Nikoli Panduriću na uloženom vremenu i strpljenju pri

realizaciji praktičnog dijela rada

Na kraju hvala mojoj obitelji na poticajima razumijevanju i omogućavanju

studiranja

Sažetak

Pseudomonas putida je Gram-negativna štapićasta bakterija koja ima sposobnost

uklanjanja raznih organskih toksičnih onečišćivala razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija izradu bioplastike te kao biljni

agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina

Pojava pjene je vrlo česta prilikom uzgoja mikroorganizama naročito u aerobnim

procesima a nastaje zbog prisutnosti proteina na granici faza plin-kapljevina Pjenjenje može

dovesti do smanjene proizvodnje biomase jer mjehurići mogu uništiti proteine a nastala pjena

može rezultirati i gubitkom sterilnosti ako se prelije izvan reaktora Dodatak kemijskih

antipjenila je česta metoda sprečavanja nastanka pjene pri uzgoju mikroorganizama Male

količine antipjenila su dovoljne i imaju nizak doprinos troškovima proizvodnje Antipjenila su

puzdana pri ekstremnim uvjetima pjenjenja i jednostavna za rukovanje

U ovom radu ispitan je utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj bakterije

P putida Ispitivanja su provedena u staklenoj menzuri sa zapjenjenim medijem nastalim

uzgojem P putida na sintetičkom mediju M9 Medij je bio konstantno miješan na magnetskoj

mješalici i aeriran pomoću zraka koji je dovođen s dna menzure pomoću porozne cjevčice

Visina pjene i koncentracija otopljenog kisika u mediju su praćeni prije i nakon dodatka

antipjenila

Uspješnost antipjenila je procjenjena po brzini uništavanja pjene i količini utrošenog

antipjenila Ponovo formiranje pjene ukazivalo je na nepouzdanost antipjenila Sva korištena

antipjenila su imala minimalan utjecaj na smanjenje koncentracije otopljenog kisika u mediju

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se najučinkovitijim u suzbijanju nastanka pjene

Ključne riječi Pseudomonas putida uzgoj mikroorganizama pjenjenje antipjenila

Abstract

Pseudomonas putida is a Gram-negative rod shaped bacterium which has the

capability to degrade numerous toxic organic compounds deconstructing aliphatic or aromatic

hydrocarbon chains These bacteria have a large number of potential applications and can be

used in various biotechnological processes including bioremediation of contaminated areas

quality improvement of fossil fuels biocatalytic production of fine chemicals production of

bioplastics and as agents of plant growth promotion and plant pest control

The appearance of the foam is very common especially in aerobic fermentations and

is due to the presence of protein at the gas-liquid interface Foaming can lead to reduced

yields since bubbles can damage proteins and can also result in loss of sterility if foam

escapes Addition of chemical antifoam agents is a common method for preventing the

formation of foam Small quantities of antifoam are needed and it has low contribution to

production costs It is reliable at extreme foaming conditions and easy to handle

This study was conducted to investigate the impact and effectiveness of 8 different

antifoam agents on the cultivation of P putida Tests were performed in a glass column with

foaming medium produced by cultivation of P putida on synthetic medium M9 Medium was

continuously stirred by magnetic stirrer and aerated by air supplied at the base of the column

with a porous diffuser Foam height and dissolved oxygen concentration were measured

before and after the addition of antifoam agents

The applicability of antifoam agents was assessed by the speed of foam destruction

and the amount of consumed antifoam The formation of new foam indicated unreliable

antifoam agent All used antifoam agents had almost no effect on the concentration of

dissolved oxygen Antifoam agent ASP ndash 664 proved to be the most successful in suppressing

foam formation

Key words Pseudomonas putida biomass growth foaming antifoam agents

Sadržaj

1 UVOD 1

2 OPĆI DIO 2

21 Pseudomonas putida 2

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru 2

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina 4

24 Pjenjenje 5

25 Antipjenila 6

3 EKSPERIMENTALNI DIO 8

31 Mikroorganizam 8

32 Kemikalije 8

33 Priprema otopina 9

34 Uređaji 9

341 Tresilica 9

342 Kisikova elektroda 10

343 UVVIS spektrofotometar 10

344 Autoklav 11

345Kompresor 12

35 Provedba pokusa 12

351 Uzgoj biomase 12

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila 13

4 REZULTATI I RASPRAVA 16

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji 16

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase 16

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju 23

5 ZAKLJUČAK 27

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

Sažetak

Pseudomonas putida je Gram-negativna štapićasta bakterija koja ima sposobnost

uklanjanja raznih organskih toksičnih onečišćivala razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija izradu bioplastike te kao biljni

agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina

Pojava pjene je vrlo česta prilikom uzgoja mikroorganizama naročito u aerobnim

procesima a nastaje zbog prisutnosti proteina na granici faza plin-kapljevina Pjenjenje može

dovesti do smanjene proizvodnje biomase jer mjehurići mogu uništiti proteine a nastala pjena

može rezultirati i gubitkom sterilnosti ako se prelije izvan reaktora Dodatak kemijskih

antipjenila je česta metoda sprečavanja nastanka pjene pri uzgoju mikroorganizama Male

količine antipjenila su dovoljne i imaju nizak doprinos troškovima proizvodnje Antipjenila su

puzdana pri ekstremnim uvjetima pjenjenja i jednostavna za rukovanje

U ovom radu ispitan je utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj bakterije

P putida Ispitivanja su provedena u staklenoj menzuri sa zapjenjenim medijem nastalim

uzgojem P putida na sintetičkom mediju M9 Medij je bio konstantno miješan na magnetskoj

mješalici i aeriran pomoću zraka koji je dovođen s dna menzure pomoću porozne cjevčice

Visina pjene i koncentracija otopljenog kisika u mediju su praćeni prije i nakon dodatka

antipjenila

Uspješnost antipjenila je procjenjena po brzini uništavanja pjene i količini utrošenog

antipjenila Ponovo formiranje pjene ukazivalo je na nepouzdanost antipjenila Sva korištena

antipjenila su imala minimalan utjecaj na smanjenje koncentracije otopljenog kisika u mediju

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se najučinkovitijim u suzbijanju nastanka pjene

Ključne riječi Pseudomonas putida uzgoj mikroorganizama pjenjenje antipjenila

Abstract

Pseudomonas putida is a Gram-negative rod shaped bacterium which has the

capability to degrade numerous toxic organic compounds deconstructing aliphatic or aromatic

hydrocarbon chains These bacteria have a large number of potential applications and can be

used in various biotechnological processes including bioremediation of contaminated areas

quality improvement of fossil fuels biocatalytic production of fine chemicals production of

bioplastics and as agents of plant growth promotion and plant pest control

The appearance of the foam is very common especially in aerobic fermentations and

is due to the presence of protein at the gas-liquid interface Foaming can lead to reduced

yields since bubbles can damage proteins and can also result in loss of sterility if foam

escapes Addition of chemical antifoam agents is a common method for preventing the

formation of foam Small quantities of antifoam are needed and it has low contribution to

production costs It is reliable at extreme foaming conditions and easy to handle

This study was conducted to investigate the impact and effectiveness of 8 different

antifoam agents on the cultivation of P putida Tests were performed in a glass column with

foaming medium produced by cultivation of P putida on synthetic medium M9 Medium was

continuously stirred by magnetic stirrer and aerated by air supplied at the base of the column

with a porous diffuser Foam height and dissolved oxygen concentration were measured

before and after the addition of antifoam agents

The applicability of antifoam agents was assessed by the speed of foam destruction

and the amount of consumed antifoam The formation of new foam indicated unreliable

antifoam agent All used antifoam agents had almost no effect on the concentration of

dissolved oxygen Antifoam agent ASP ndash 664 proved to be the most successful in suppressing

foam formation

Key words Pseudomonas putida biomass growth foaming antifoam agents

Sadržaj

1 UVOD 1

2 OPĆI DIO 2

21 Pseudomonas putida 2

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru 2

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina 4

24 Pjenjenje 5

25 Antipjenila 6

3 EKSPERIMENTALNI DIO 8

31 Mikroorganizam 8

32 Kemikalije 8

33 Priprema otopina 9

34 Uređaji 9

341 Tresilica 9

342 Kisikova elektroda 10

343 UVVIS spektrofotometar 10

344 Autoklav 11

345Kompresor 12

35 Provedba pokusa 12

351 Uzgoj biomase 12

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila 13

4 REZULTATI I RASPRAVA 16

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji 16

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase 16

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju 23

5 ZAKLJUČAK 27

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

Abstract

Pseudomonas putida is a Gram-negative rod shaped bacterium which has the

capability to degrade numerous toxic organic compounds deconstructing aliphatic or aromatic

hydrocarbon chains These bacteria have a large number of potential applications and can be

used in various biotechnological processes including bioremediation of contaminated areas

quality improvement of fossil fuels biocatalytic production of fine chemicals production of

bioplastics and as agents of plant growth promotion and plant pest control

The appearance of the foam is very common especially in aerobic fermentations and

is due to the presence of protein at the gas-liquid interface Foaming can lead to reduced

yields since bubbles can damage proteins and can also result in loss of sterility if foam

escapes Addition of chemical antifoam agents is a common method for preventing the

formation of foam Small quantities of antifoam are needed and it has low contribution to

production costs It is reliable at extreme foaming conditions and easy to handle

This study was conducted to investigate the impact and effectiveness of 8 different

antifoam agents on the cultivation of P putida Tests were performed in a glass column with

foaming medium produced by cultivation of P putida on synthetic medium M9 Medium was

continuously stirred by magnetic stirrer and aerated by air supplied at the base of the column

with a porous diffuser Foam height and dissolved oxygen concentration were measured

before and after the addition of antifoam agents

The applicability of antifoam agents was assessed by the speed of foam destruction

and the amount of consumed antifoam The formation of new foam indicated unreliable

antifoam agent All used antifoam agents had almost no effect on the concentration of

dissolved oxygen Antifoam agent ASP ndash 664 proved to be the most successful in suppressing

foam formation

Key words Pseudomonas putida biomass growth foaming antifoam agents

Sadržaj

1 UVOD 1

2 OPĆI DIO 2

21 Pseudomonas putida 2

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru 2

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina 4

24 Pjenjenje 5

25 Antipjenila 6

3 EKSPERIMENTALNI DIO 8

31 Mikroorganizam 8

32 Kemikalije 8

33 Priprema otopina 9

34 Uređaji 9

341 Tresilica 9

342 Kisikova elektroda 10

343 UVVIS spektrofotometar 10

344 Autoklav 11

345Kompresor 12

35 Provedba pokusa 12

351 Uzgoj biomase 12

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila 13

4 REZULTATI I RASPRAVA 16

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji 16

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase 16

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju 23

5 ZAKLJUČAK 27

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

Sadržaj

1 UVOD 1

2 OPĆI DIO 2

21 Pseudomonas putida 2

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru 2

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina 4

24 Pjenjenje 5

25 Antipjenila 6

3 EKSPERIMENTALNI DIO 8

31 Mikroorganizam 8

32 Kemikalije 8

33 Priprema otopina 9

34 Uređaji 9

341 Tresilica 9

342 Kisikova elektroda 10

343 UVVIS spektrofotometar 10

344 Autoklav 11

345Kompresor 12

35 Provedba pokusa 12

351 Uzgoj biomase 12

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila 13

4 REZULTATI I RASPRAVA 16

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji 16

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase 16

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju 23

5 ZAKLJUČAK 27

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

6 LITERATURA 28

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA 30

71 SIMBOLI 30

72 SKRAĆENICE 30

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

1

1 UVOD

Pjena je karakteristična pojava kod dvofaznih sustava plin-kapljevina u kojima su

prisutne površinski aktivne tvari Pretjerano pjenjenje može stvoriti ozbiljne probleme u

mnogim industrijskim procesima U bioreaktorima zbog te pojave može doći do gubitka ili

kontaminacije reakcijske smjese što može umanjiti stupanj iskorištenja biomase na supstratu

proizvodnju primarnih sekundarnih i tercijarnih metabolita ali i utjecati na pouzdanost

mjernih podataka Također može doći i do operacijskih problema kod strojeva koji rade pri

velikim brzinama kao što su pumpe te u onim proizvodnim procesima koji imaju destilacijske

ili ekstrakcijske stupnjeve Tipični primjeri procesa u kojima dolazi do nastanka velike

količine pjene su mikrobiološki procesi koji se koriste u proizvodnji hrane i lijekova prerada

emulzija i suspenzija lijekova celuloze i papira pročišćavanje industrijskih otpadni voda i

komunalnih voda proizvodnja i pakiranje pića bojanje tekstila rafiniranje ulja te mnogi

drugi1

Kako bi se suzbilo stvaranje ili uništilo već formiranu pjenu koriste se razni aditivi ili

mehanički razbijači pjene

Postoje tisuće različitih antipjenila Njihova efikasnost ovisi o kemijskim svojstvima

otopine radnim uvijetima te površinski aktivnim tvarima koji pjenu stvaraju2 Prilikom

projektiranja i rada s bioreaktorima treba za određeni sustav odabrati i za njega najpogodnije

antipjenilo

Pseudomonas putida je idealan modelni mikroorganizam za ispitivanje utjecaja

različitih antipjenila tijekom provedbe njegova uzgoja jer mu je rast popraćen nastajanjem

veće količine pjene Ujedno je to i bakterija koja ima sve veći biotehnološki značajTo je

najšire rasprostranjen mikroorganizam i dominira u sustavima biološke obrade različitih vrsta

otpada3

U ovom radu je ispitivan utjecaj i djelotvornost 8 različitih antipjenila na uzgoj P

putida Pritom je promatrana promjena visine pjene te promjena koncentracije otopljenog

kisika u mediju

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

2

2 OPĆI DIO

21 Pseudomonas putida

Pseudomonas je rod koji broji preko 40 vrsta bakterija Zajednička obilježja tog roda

je da su to štapićaste Gram-negativne bakterije koje se pokreću pomoću jednog ili više

polarnih bičeva Iako se klasificiraju kao aerobni mikroorganizmi anaerobnom respiracijom

mogu proizvesti jednaku količinu energije kao i aerobnim procesom4 Bakterije ovog roda

imaju veliki medicinski industrijski i ekološki značaj Pojedine vrste mogu sintetizirati veliku

količinu specifičnih enizima i sudjelovati u razgradnji različitih kemijskih spojeva kao što su

atrazin benzen fenol ksilen toluen TNT simazin756

Pseudomonas putida je otkrivena sredinom 20-og stoljeća Njena prisutnost je zabilježena

u vodi i tlu naročito oko korjenja biljaka Optimalna temperatura za njen rast kreće se u

rasponu 25-35 degC što je čini mezofilnom bakterijom složenog metabolizma Ne prijeti

zdravlju čovjeka jer ne raste na temperaturi višoj od 35 degC te ne može ragrađivati stanične

membrane niti otpuštati za ljude štetne toksine P putida (slika 1) ima sposobnost uklanjanja

raznih organskih toksičnih onečišćenja razgrađujući lance alifatskih ili aromatskih

ugljikovodika Potencijali ove bakterije su veliki i može se koristiti u raznim biotehnološkim

procesima uključujući bioremedijaciju kontaminiranih područja poboljšanje kvalitete

fosilnih goriva (primjerice odsumporavanje) biokatalitičku proizvodnju finih kemikalija

izradu bioplastike te kao biljni agent za poboljšavanje rasta i suzbijanje štetočina7

Slika 18 Pseudomonas putida

22 Uzgoj biomase u bioreaktoru

Procesi fermentacije čovjeku su poznati od samih početaka čovječanstva iako su

mikroorganizmi koji su zaduženi za te procese otkriveni tek u 17 stoljeću Špiljski je čovjek

iskustveno naučio da je meso bolje ako odstoji nekoliko dana Egipćani su znali pripremati

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

3

dizano tijesto a Grci iz voća dobivati alkoholne napitke Tek je 1857 godine Pasteur dokazao

da se alkoholna fermentacija zbiva pomoću kvasaca koji su žive stanice Također je dokazao

da su mikroorganizmi uzročnici mnogih bolesti pa se razvila i nova znanost -

mikrobiologija9 Otkrivanjem većeg broja novih načina dobivanja korisnih kemikalija

korištenjem mikroorganizama stvoreni su temelji pokretanja industrijske proizvodnje

Širenjem prizvodnje iz laboratorija u industriju neophodna su postala kemijsko inženjerska

znanja koja su za mikrobiološke procese trebala osigurati adekvatnu opremu i uvjete Takve

potrebe razlog su razvitka biokemijskog inženjerstva koje je ujedinilo znanja iz kemijskog

inženjerstva i biologije

Funkcija bioreaktora je pružiti okruženje pogodno za kontrolirani rast čiste kulture ili

određene mješavine organizama Bioreaktor se može smatrati sustav koji se sastoji od tri faze

kapljevita faza sadrži otopljene hranjive tvari supstrat i metabolite čvrsta faza se sastoji od

pojedinačnih stanica netopljivih supstrata ili nataloženih metaboličkih produkata dok

plinovita faza sadrži pretežito kisik dušik i ugljični dioksid10

Materijal od kojeg je izgrađen

mora biti nepogodan za rast neželjenim mikroorganizmima nereaktivan u doticaju s

reakcijskim medijem bez utjecaja na željene mikrobiološke aktivnosti i otporan na utjecaje

samog procesa uzgoja biomase11

Operacije koje se provode u bioreaktorima su sljedeće

a Priprema podloge za rast organizama

b Sterilizacija medija

c Sterilizacija bioreaktora i sve potrebne opreme

d Prijenos čiste i aktivne kulture u bioreaktor

e Uzgoj mikroorganizama u optimalnim uvijetima radi dobivanja željenog produkta

f Ispuštanje smjese produkata iz bioreaktora

Mikroorganizmima je za rast potrebna voda izvor ugljika (npr šećerni sirup žitarice škrob

glukoza saharoza laktoza) energija izvor dušika (npr ekstrakt kukuruzne mlaćenice sojino

brašno brašno od sjemenki pamuka riblje brašno amonijak amonijeve soli) minerali i

vitamini10

Prisutnost neželjenih supstancija ili mikroorganizama može imati velike učinke na

produkte koji nastaju u fermentorima Sterilna tehnika rada neophodna je pri radu sa živim

organizmima - od sterilnosti kompletne opreme i medija za rast do sprečavanja kontaminacije

pri inokulaciji Mediji se steriliziraju zagrijavanjem do 120 degC pri tlaku od 15 do 22 bara po

minimalno 15 minuta Zrak koji se koristi u aerobnim bioreaktorima je također potrebno

sterilizirati kroz mrežicu od nehrđajućeg čelika ili kroz za to odgovarajuće filtre U svrhu

održavanja sterilnosti procesni uređaji su proizvedeni od najkvalitetnijeg nehrđajućeg čelika

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

4

s provjerenim brtvljenjem i testiranim ventilima Miješanje je također bitan faktor u

procesima uzgoja biomase Služi kako bi se smanjile lokalne razlike u koncentraciji i

temperaturi Miješanje se ostvaruje mehaničkim miješalima i dovođenjem energije vanjskim

pumpama i cirkulacijom medija ili pomoću komprimiranog zraka Zrak tj kisik je potrebno

konstantno uvoditi u aerobne bioreaktore kako bi biomasa mogla rasti Da bi se dobila što

veća produktivnost i iskorištenje procesa u bioreaktorima te što manja potrošnja energije

potrebno je kontrolirati sve varijable bitne za proces To se može provoditi putem računala i

odgovarajućih upravljačkih jedinica koje mjere temperaturu procesa pH koncentraciju

otopljenog kisika ugljičnog dioksida i šećera razinu pjene nastale u procesu i druge bitne

veličine Upravljačke jedinice osim mjerenja mogu i održavati željene uvjete u reaktoru

promjenom brzine miješanja variranjem protoka medija za hlađenje ili grijanje dodavajući

kiseline odnosno lužine ubrizgavajući antipjenila i slično

23 Prijenos kisika u dvofaznom sustavu plin-kapljevina

Svrha aeracije u bioreaktorima je opskrbiti stanice mikroorganizama kisikom koji je

potreban za održavanje stanica biomase staničnu respiraciju oksidaciju supstrata u krajnji

metabolički produkt te kao reaktant u biosintezi Teško topljivi kisik se iz izvora obično

zračnog mjehurića prenosi u kapljevitu fazu u kojoj se nalaze stanice Kisik mora pri tom

prijenosu savladati niz otpora čija veličina ovisi o hidrodinamičkim uvjetima temperaturi

aktivnosti i gustoći stanica sastavu otopine fenomenima na granici faza i drugim faktorima

Najšire prihvaćena teorija o prijenosu kisika u realnim sustavima plin-kapljevina-

mikroorganizmi je teorija bdquodva filmaldquo (Lewis Whitman 1924) Teorija se temelji na

pretpostavci da se tijekom molekularne difuzije kisika u kapljevinu stvaraju dva filma film

plina i film kapljevine koji su djelovi površinske granice (slika 2) Glavni otpor prijenosu

kisika predstavlja film kapljevine12

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

5

Slika 2 Shema teorije bdquodva filmaldquo

Ako je cl koncentracija kisika u kapljevini a c ravnotežna koncentracija na granici faza plin-

kapljevina tada je brzina prijenosa kisika

NO2l = kl (c-cl) (1)

Iz prvog Fickovog zakona kl je omjer difuzivnosti plina u kapljevini (D) i debljine filma δl

Ako a predstavlja međufaznu površinu plin-kapljevina tada dobivamo izraz koji daje

ovisnost protok kisika (zraka) kroz medij i koncentracije otopljenog kisika

QO2 = kla (c-cl) (2)

gdje je kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika kla ovisi o hidrodinamičkim

uvijetima u bioreaktorima miješanju i protoku plinske faze kroz reakcijski medij sastavu

kapljevite i plinske faze napetosti površine kapljevite faze temperaturi gustoći viskozitetu i

dr Topljivost kisika u otopini opada povišenjem temperature i pri povećanoj količini

otopljenih soli pa je neophodno postići što veći koeficijent prijenosa kisika za održavanje

broja mikroorganizama i njihov daljni rast

24 Pjenjenje

Pojava pjene je vrlo česta naročito u aerobnim bioreaktorima Postoji više teorija o

nastajanju pjene a najšire prihvaćena je da pjena nastaje zbog prisutnosti proteina na granici

faza plin-kapljevina odnosno da se stvara proteinski film Proteini su uvijek prisutni u

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

6

bioreakcijskom mediju uglavnom kao izvanstanični produkti mikroorganizama Kada dođu

do granice faza ponašaju se na sljedeće načine

a Adsorbiraju se pri vrlo malim koncentracijama

b Jednom adsorbirani na granicu faza vrlo teško desorbiraju

c Fleksibilne molekule proteina mijenjanju svoju konformaciju pri adsorpciji

d Moguća je adsorpcija više od jednog sloja proteina na granicu faza

e Površinski aktivne tvari male molekulske mase poboljšavaju desorpciju proteina13

Slika 3 a) shematski prikaz adsorpcije molekula protenina b) shematski prikaz molekula proteina u otopini

Adsorbirani proteini na granici faza se savijaju tako da dijelovi molekule koji su hidrofobni

formiraju lance a hidrofilni formiraju petlje i repove Takva konformacija proteina na granici

faza razlikuje se od konformacije unutar otopine kao što se vidi na slici 313

Površinska napetost pri adsorbiranju na granicu faza ne ovisi samo o broju

adsorbiranih proteina već i o načinu adsorpcije S termodinamičkog stajališta povećanjem

površinske napetosti raste i slobodna energija pa je pjena nestabilan sustav koji će se prije ili

kasnije i sam razoriti Negativan učinak pjene je da smanjuje efektivan volumen bioreaktora a

može doći i do prelijevanja što uzrokuje gubitak materijala i kontaminaciju Prilikom

spuštanja pjene osjetljive stanice mogu biti uništene Pozitivan efekt pjenjenja jest da su

mediji koji se pjene obično mješljivi i stajanjem se ne razdvajaju faze pa ih karakterizira i

veća brzina prijenosa tvari13

25 Antipjenila

Prilikom uzgoja biomase antipjenila se koriste za destabilizaciju pjene Mogu biti

sastavljena od ulja masnih kiselina estera poliglikola i siloksana Antipjenila se dijele na

Zrak

Otopina

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

7

dvije kategorije brza i spora antipjenila ovisno o načinu na koji razaraju pjenu Ulja su spora

antipjenila koja uništavaju pjenu kroz dulji vremenski period Brza antipjenila su mješovita

sredstva koja ulaze u film pjene i uništavaju ga premošćivanjem i istezanjem14

Većinu

antipjenila a naročito ulja je dovoljno dodavati u kapljicama Kapi djeluju na proteinski film

na sljedeće načine

a Mogu se ponašati kao hidrofobne čestice koje stvaraju rupe u filmu čim dodirnu obje

površine filma (slika 4)

b Mogu se proširiti površinom filma i zamijeniti adsorbirane proteine te tako smanjiti

stabilnost filma

c Šireći se po pjeni tjeraju film od sebe koji se pritom sužava (slika5)13

Slika 4 Hidrofobna čestica dodiruje obje površine filma i razbija ga

Slika 5 Širenje kapi antipjenila po proteinskom filmu

Antipjenila imaju utjecaj na volumni koeficijent prijenosa kisika u sustavu Dodatak

antipjenila uzrokuje veće srastanje mjehurića pjene što dovodi do smanjenja specifične

površine i posljedično smanjenja vrijednosti kla151617

Učinak je suprotan ako je antipjenilo

dodano u većoj koncentraciji Smanjenje specifične površine (a) odvija se do neke granice te

srastanje mjehurića umanjuje pokretljivost površine i njenu napetost To zatim dovodi do

smanjenja veličine mjehurića i kla ponovo raste Moguće je i da antipjenila na sebe

akumuliraju kisik pa ga otpuštaju u tekuću fazu jer je kisik lakše topljiv u antipjenilima18

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

8

3 EKSPERIMENTALNI DIO

U eksperimentalnom dijelu ovoga rada dan je prikaz materijala i metoda korištenih u

ispitivanju učinkovitosti dodatka antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash

664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja na uklanjanje pjene nastale tijekom uzgoja

P putida

31 Mikroorganizam

Pseudomonas putida KT 2440 (Centro Nacional de Biotecnologia Consejo Superior

de Investigaciones Cientiacuteficas (CSIC) Španjolska)

32 Kemikalije

Tijekom provedbe pokusa korištene su sljedeće kemikalije

ASP ndash 664 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash GH (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash HE (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash KA 55 (Aqua VMV Zagreb)

ASP ndash NPK (Aqua VMV Zagreb)

CaCl2 ∙7 H2O (Sigma-Aldrich Seelze)

CuCl2 middot2 H2O (Acros Organics Geel)

FeSO4 middot7 H2O (Acros Organics Geel)

Glukoza (Gram - mol Zagreb)

H3BO3 (Kemika Zagreb)

Jestivo ulje (Zvijezda Zagreb)

KH2PO4 (Sigma ndash Aldrich)

Kvaščev ekstrakt (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

MgSO4 sušeni (Acros Organics Geel)

MnCl2 ∙ 4H2O (Kemika Zagreb)

Na2EDTA ∙ 2H2O (Acros Organics Geel)

Na2HPO4 middot 12 H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

Na2MoO4 ∙ 2H2O (Carlo Erba Reagents SpA Rodano)

NaCl (Isocommerz Herzberg)

NH4Cl (Kemika Zagreb)

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

9

Span 80 (Aqua VMV Zagreb)

Span 85 (Aqua VMV Zagreb)

Tripton (Liofilchem srl Roseto degli Abruzzi)

ZnSO4 (Kemika Zagreb)

33 Priprema otopina

Sintetska podloga za uzgoj P putida sintetski medij M9 pripremljen je otapanjem

34194 g Na2HPO4 middot 12 H2O 60 g KH2PO4 10 g NaCl 20 g NH4Cl i 024 g MgSO4 u 2000

mL destilirane vode u koju je dodano 2 mL USFe otopine elemenata u tragovima

USFe otopina elemenata u tragovima pripremljena je otapanjem 487 g FeSO4 ∙ 7H2O

256 g CaCl2 ∙ 7H2O 15 g MnCl2 ∙ 4H2O 105 g ZnSO4 084 g Na2EDTA ∙ 2H2O 03 g

H3BO3 025 g Na2MoO4 ∙ 2H2O te 015 g CuCl2 ∙ 2H2O u 1 L destilirane vode

Kompleksna podloga za uzgoj P putida LB medij pripremljen je otapanjem 5 g

kvaščevog ekstrakta 10 g triptona i 10 g NaCl u 1 L destilirane vode

34 Uređaji

341 Tresilica

Proces uzgoja bakterije P putida proveden je na tresilici (Innova 4330 New

Brunswick Scientific slika 6)

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

10

Slika 6 Laboratorijska tresilica

342 Kisikova elektroda

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika tokom provedbe eksperimenta provedeno je

s ksikovom elektrodom (kisikova elektroda Metler Toledo Ingold slika 7) i sustava za

regulaciju (Biostatreg MD B Braun Biotech International)

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

11

Slika 7 Kisikova elektroda

343 UVVIS spektofotometar

Mjerenje optičke gustoće uzoraka provedeno je upotrebom spektrofotometrijskih

metoda na dvozračnom UVVIS spektrofotometru (UV ‐ 1800 SHIMADZU slika 8)

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

12

Slika 8 UVVIS dvozračni spektrofotometar

344 Autoklav

Za sterilizaciju tikvica potrebnog laboratorijskog posuđa i hranjivih podloga korišten je

autoklav (Sutjeska slika 9) Sterilizacija je provedena suhim vrućim zrakom pri temperaturi T

= 121 degC i pri tlaku p = 09 ndash 12 bara u trajanju od 25 minuta

Slika 9 Autoklav

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

13

345 Kompresor

Stalni protok zraka tijekom provedbe pokusa osiguran je korištenjem zračnog

kompresora (CH 25210 Airmec slika 10)

Slika 10 Kompresor

35 Provedba pokusa

351 Uzgoj biomase

U sterilnu hranjivu podlogu za preduzgoj bakterija (LB medij) sterilno su nacijepljene

spore bakterije (slika 11) pomoću mikrobiološke ušice te su tikvice stavljene u tresilicu na 30

degC i n = 250 1min na period od 8 sati Hranjiva podloga za rast bakterija pripremljena je

miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50 gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako

bi početna koncentracija glukoze u tikvici iznosila 5 gL a potom je inokulirana s 10 mL

prethodno pripremljene predkulture na LB mediju Tikvice su stavljene u tresilicu na 30 degC i n

= 250 1min kroz 8 sati Nakon 8 sati 10 mL kulture uzgojene na M9 mediju je dodano u

tikvice u kojima su bile pripremljene otopine za provedbu pokusa Otopine su pripremane na

isti način kao i u prethodnom koraku miješanjem 10 mL otopine glukoze koncentracije 50

gL i 80 mL mineralnog medija M9 kako bi krajnja početna koncentracija glukoze u tikvici

iznosila 5 gL a potom su tikvice inokulirane s 10 mL prethodno pripremljene kulture na M9

mediju

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

14

Slika 11 P putida uzgojena na čvrstoj hranjivoj podlozi

352 Određivanje učinkovitosti ispitivanih antipjenila

Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U tikvice s hranjivim medijem odmah po inokulaciji je dodano 10 μL ispitivanih

antipjenila te su tikvice stavljene u tresilicu na 30 degC i n = 250 1min Nakon isteka prethodno

određenog vremena potrebnog za rast biomase vizualno se određuje prisutnost odnosno

odsutnost pjene (slika 12)

Slika 12 Izgled reakcijske smjese u koju je ASP-NPK antipjenilo dodano pri inokulaciji po završetku procesa uzgoja

biomase

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

15

Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Pokus je proveden tako da je u staklenu menzuru od 500 mL dodano 150 mL biomase

kojoj je prethodno izmjerena optička gustoća Menzura sa biomasom je postavljena na

magnetsku miješalicu (MM-540 Tehtnica Železniki) kako bi se miješanjem osiguralo da je

biomasa cijelo vrijeme jednoliko raspoređena po mediju Brzina miješanja bila je konstantna

tijekom provedbe svih pokusa i iznosila je 300 1min Aeracija biomase provedena je pomoću

perforirane plastične cijevčice uronjene do dna menzure spojene na kompresor preko

rotametra koji je održavao stalan protok zraka od 5 Lmin Klema na kraju cijevčice uvijek je

bila postavljena 27 cm od dna menzure i služila je kao razbijač pjene (slika 13) Pokusom je

praćena visina proizvedene pjene u vremenskim intervalima od 30 sekundi 10 μL antipjenila

je dodavano kada bi pjena dostigla vrh menzure ili kada bi nakon nekog prethodno

definiranog vremenskog perioda dostigla konstantnu visinu Mjerenje je zaustavljeno kada bi

se pjena prestala proizvoditi Svi pokusi su provedeni na sobnoj temperaturi sa svježom

biomasom (od početka provedbe uzgoja biomase do pokusa nije prošlo više od 10 sati)

Slika 13 Aparatura za provedbu pokusa ispitivanja učinkovitosti dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon

stvaranja pjene

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

16

U dijelu pokusa praćena je i dinamička promjena relativne koncentracije otopljenog

kisika pO2 (slika 14) Mjerenja su provođena u vremenskim intervalima od 30 sekundi Za

mjerenje koncentracije otopljenog kisikja korištenja je prethodno opisana kisikova elektroda

spojena na sustav za regulaciju Prije svakog mjerenja kisikova elektroda je umjerena

aeriranjem zrakom (100 otopljenog kisika) i dušikom (0 otopljenog kisika)

Slika 124 Aparatura za ispitivanje učinkovitosti antipjenila s mjerenjem koncentracije otopljenog kisika

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

17

4 REZULTATI I RASPRAVA

U ovome radu ispitivan je utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 ASP ndash HE ASP ndash

GH ASP ndash 664 ASP ndash NPK Span 80 Span 85 i jestivog ulja metodom dodatka antipjenila

pri inokulaciji i metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase nakon stvaranja pjene

41 Metoda dodatka antipjenila pri inokulaciji

U pokusima u kojima je ispitivan utjecaj antipjenila metodom dodatka antipjenila pri

inokulaciji pokazalo se da antipjenila ASP ndash KA 55 ASP ndash HE ASP ndash GH ASP ndash 664 Span

80 i Span 85 uspješno spriječavaju nastanak antipjene odnosno reakcijska smjesa se prilikom

uzgoja biomase uopće nije pjenila Za razliku od ovih antipjenila dodatak antipjenila ASP ndash

NPK utjecao je na formiranje još postojanije pjene u odnosu na kontrolni pokus u kojemu se u

reakcijsku smjenu nije dodalo antipjenilo

42 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase

Utjecaj učinkovitosti antipjenila na nastajanje pjene tijekom uzgoja P putida pri

različitim optičkim gustoćama ispitivan je u pokusima provedenim dodatkom antipjenila ASP

ndash 664 (slika 15) ASP ndash GH (slike 16a i 16b) ASP ndash HE (slike 17a 17b i 17c) ASP ndash KA55

(slike 18a 18b i 18c) ASP ndash NPK (slika 19) Span 80 (slika 20) Span 85 (slika 21) i jestivo

ulje (slika 22) Strelica na grafičkim prikazima označava trenutka dodavanja alikvota

antipjenila Dobiveni rezultati su sumarizirani u tablici 1

U svim provedenim pokusima pjena se stvara i naglo počinje rasti čim se u menzuru s

reakcijskim medijem uvede cjevčica za aeraciju U većini pokusa bi pjena nakon prve dvije

minute provedbe pokusa došla do razbijača pjene i tu bila zaustavljena Općenito struktura

pjene ovisi o fazi rasta mikroorganizama ali i o protoku zraka kroz biomasu Pokazalo se da

je pri manjim protocima zraka pjena gušća s manjim mjehurićima ali da je i maksimalna

visina koju bi postigla u menzuri bila manja Kod većih protoka zraka dolazilo je do

nastajanja većih i neravnomjernih mjehura pjena je bila rijetka i bdquoprozračnaldquo te je brzo rasla

Brzina nastajanja pjene u provedenim pokusima bila je gotovo ista za pokuse provedene kod

sličnih optičkih gustoća razlika je bila vidljiva tek nakon dodatka antipjenila Probleme u

radu je izazivao kompresor jer je tijekom svakog punjenja spremnika kompresora zraka

dolazilo do manjeg pada protoka što se očitovalo u padu ukupne razine pjene Po završetku

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

18

punjena kompresora zrakom i uspostave konstantnog protoka razina pjene bi se opet

podignula na prijašnju razinu

Slika 15 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 15)

a) b)

Slika 16 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash GH na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

415 i b) OD = 533

Antipjenilo ASP ndash GH nije se pokazalo učinkovitim u procesu uklanjanja pjene i to

naročito u pokusu provedenom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 415)

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

19

gdje ga je bilo potrebno dodavati u više navrata isprva u alikvotima od po 10 μL a kasnije po

30 μL što nije rezultiralo većom učinkovitošću antipjenila (slika 16a) Crvene zvijezdice na

slici 16a predstavljaju udar pjene u razbijač koji bi uništavao pjenu Do neznatnih oscilacija u

visini pjene dolazilo je i zbog prethodno objašnjenog utjecaja punjenja spremnika

kompresora Pri pokusu provedenom pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD = 533)

pjena sporije raste ali kao i u pokusu provedeom pri manjoj optičkoj gustoći reakcijske

smjese nastavlja rasti i nakon dodavanja antipjenila (slika 16b)

a) b)

c)

Slika 17 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash HE na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD =

444 b) OD = 476 i c) OD = 547

Pri optičkim gustoćama reakcijske smjese manjima od 5 (slike 17a i 17b) antipjenilo

ASP ndash HE je bilo potrebno dodavati u više navrata jer bi pjena i nakon dodanih 10 μL

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

20

nastavila rasti Kod pokusa provedenog pri većoj optičkoj gustoći reakcijske smjese (OD =

547) mikroorganizmi ulaze u stacionarnu fazu rasta što se odražava na slabijoj proizvodnji

pjene te je dodatak jednog alikvota antipjenila ASP ndash HE bio dovoljan da više ne dođe do

porasta razine pjene (slika 17c)

a) b)

c)

Slika 18 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene u pokusima provedenim pri optičkoj gustoći a) OD

= 504 b) OD = 518 i c) OD = 545

Antipjenilo ASP ndash KA55 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega se pjena više nije formirala u pokusima provedenim

pri različitim optičkim gustoćama reakcijskog medija (slike 18a 18b i 18c)

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

21

Slika 19 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash NPK na visinu pjene

Antipjenilo ASP ndash NPK pokazalo se neučinkovitim u uklanjanju pjene nastale pri

uzgoju biomase što je pokazano i kod prve metode gdje je antipjenilo dodano pri inokulaciji

(slika 19) U ovoj metodi dodavanje antipjenila nema nikakvog utjecaja na smanjenje pjene

već ona dalje nastavlja rasti te izlazi iz ispitne posude što se nije moglo spriječiti niti

razbijačem pjene

Slika 20 Utjecaj dodatka antipjenila Span 80 na visinu pjene

Antipjenilo Span 80 pokazalo se djelomično učinkovitim u uništavanju pjene Za

potpuno zaustavljanje rasta pjene bilo je u reakcijsku smjesu potrebno dodati dva alikvota od

10 μL antipjenila (slika 20)

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

22

Slika 21 Utjecaj dodatka antipjenila Span 85 na visinu pjene

Antipjenilo Span 85 pokazalo se uspješnim u suzbijanju pjene već pri jednom

dodavanju alikvota od 10 μL nakon čega pjena više nije nastajala (slika 21)

Slika 22 Utjecaj dodatka jestivog ulja na visinu pjene

Dodatak običnog jestivog ulja kao antipjenila nije se pokazao uspješnim Pjena nije u

potpunosti uklonjena nakon jednog dodavanja alikvota od 10 μL dok je nakon drugog

dodavanja došlo do njenog sporog spuštanja U pokusu je opaženo da dolazi do razdvajanja

stupca pjene na bdquoaktivnuldquo i bdquoneaktivnuldquo te da veliki dio bdquoneaktivneldquo pjene zaostaje po čitavom

volumenu ispitne posude Kada se bdquoneaktivnaldquo pjena spustila do bdquoaktivneldquo sustav pjene se u

potpunosti uklonio (slika 22)

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

23

Tablica 1 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 507 24 10 1

ASP ndash GH 415 27 150 8

ASP ndash GH 533 28 50 3

ASP ndash HE 444 27 20 2

ASP ndash HE 476 29 40 4

ASP ndash HE 547 27 10 1

ASP ndash KA55 504 27 10 1

ASP ndash KA55 518 23 10 1

ASP ndash KA55 545 27 10 1

ASP ndash NPK 503 +34 20 2

Span 80 529 27 20 2

Span 85 543 27 10 1

Jestivo ulje 510 27 20 2

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

24

43 Metoda dodatka antipjenila tijekom uzgoja biomase uz praćenje koncentracije

otopljenog kisika u reakcijskom mediju

Pokusi u kojima se uz visinu pjene mjerila i koncentracija otopljenog kisika provedeni

su samo za tri antipjenila ASP ndash 664 (slika 23) ASP ndash KA55 (slika 24) i Span85 (slika 25)

koji su se pokazali najuspješnijima u prethodnim ispitivanjima Dobiveni rezultati su

sumarizirani u tablici 2

a) b)

c) d)

Slika 23 Utjecaj dodatka antipjenila ASP ndash 664 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima

provedenim pri optičkoj gustoći a) OD = 349 b) OD = 380 c) OD = 475 i d) OD = 525

Antipjenilo ASP ndash 664 pokazalo se izrazito učinkovitim pri uklanjanju pjene nastale

uzgojem P putida što je pokazano i u prethodnim pokusima Pad koncentracije kisika opažen

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

25

je u svim provedenim pokusima ubrzo nakon dodavanja antipjenila a manje oscilacije u

koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanih problema u radu kompresora

(slike 23a 23b 23c i 23d)

U pokusu čiji su rezultati prikazani na slici 23d antipjenilo je dodano iako nije bilo

porasta razine pjene kako bi se ispitao utjecaj dodatka antipjenila na promjenu koncentracije

otopljenog kisika Opaženi pad koncentracije otopljenog kisika je izrazito malen te se može

reći da utjecaja dodatka ovog antipjenila na koncentraciju otopljenog kisika gotovo i nema

a) b)

c) d)

Slika 24 Utjecaj antipjenila ASP ndash KA55 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim

pri optičkoj gustoći a) OD = 263 b) OD = 450 c) OD = 530 i d) OD = 576

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

26

U pokusu provedenom pri maloj optičkoj gustoći reakcijskog medija bilo je potrebno

tri puta dodati antipjenilo da bi se spriječilo stvaranje pjene jer su mikroorganizmi bili u

eksponencijalnoj fazi rasta (slika 24a) Kod svakog dodavanja antipjenila koncentracija

otopljenog kisika si se neznatno smanjila zbog smanjenja specifične površine za prijenos

kisika a onda bi opet nastavila rasti jer bi se konstantnim miješanjem smanjile lokalne razlike

u koncentraciji antipjenila U pokusima provedenim pri većim optičkim gustoćama

reakcijskog medija jedan alikvot antipjenila je bio dovoljan za uklanjanje pjene a manje

oscilacije u koncentraciji otopljenog kisika su posljedica prethodno opisanog punjenja

spremnika kompresora (slike 24b 24c i 24d) U svim pokusima dodatak antipjenila nije

značajnije utjecao na koncentraciju otopljenog kisika u reakcijskoj smjesi

a) b)

c)

Slika 25 Utjecaj antipjenila Span 85 na visinu pjene i koncentraciju otopljenog kisika u pokusima provedenim pri

optičkoj gustoći a) OD = 464 b) OD = 557 i c) OD = 580

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

27

U pokusima provedenim sa Span 85 antipjenilom bi ubrzo nakon dodavanja pjena ponovno

počela rasti što je bilo izraženije pri većim optičkim gustoćama (slike 25b i 25c) Zbog

navedenog antipjenilo Span 85 ne bi bio dobar odabir za uništavanje pjene u bioreaktoru pri

uzgoju P putida Na slici 25b dobro se vidi ovisnost pada koncentracije otopljenog kisika o

dodatku antipjenila te njegov rast s porastom razine pjene u ispitnom sustavu

Tablica 2 Učinkovitost različitih antipjenila ispitana metodom dodatka antipjenila tijekom uzgoja P putida

Antipjenilo OD [-] Maxvisina pjene

[cm]

Ukupni volumen

dodanog

antipjenila [μL]

Broj dodavanja

ASP ndash 664 349 30 20 2

ASP ndash 664 380 29 10 1

ASP ndash 664 475 32 10 1

ASP ndash 664 525 28 20 2

ASP ndash KA55 263 33 30 3

ASP ndash KA55 450 33 30 3

ASP ndash KA55 530 28 10 1

ASP ndash KA55 576 27 10 1

Span 85 464 34 20 2

Span 85 557 28 50 5

Span 85 580 28 10 1

Iz rezultata proveddenih pokusa vidljivo je da je utrošak antipjenila ASP ndash 664 bio najmanji u

usporedbi sa svim ostalim korištenim antipjenilima (tablica 2) Jedino je za pokus proveden

kod male optičke gustoće reakcijske smjesse trebalo dva puta dodati antipjenilo ali je i tada

pjena rasla sporije nego u slučaju dodatak ostalih ispitivanih antipjenila što je dodatan

pokazatelj pouzdanosti ovog antipjenila

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

28

5 ZAKLJUČAK

U pokusima je provedeno ispitivanje učinkovitosti različitih antipjenila na suzbijanje

pjene nastale prilikom uzgoja P putida Metoda u kojoj je ispitivan utjecaj antipjenila koje je

dodano odmah pri inokulaciji mikroorganizama pokazala je učinkovitost svih korištenih

antipjenila osim ASP ndash NPK koji nije uspio ukloniti nastalu pjenu

U metodi u kojoj je učinkovitost antipjenila ispitivana njihovim dodatakom tijekom

uzgoja kada se pjena formirala najboljima su se pokazala antipjenila ASP ndash 664 ASP ndash

KA55 te Span 85 koja su uz samo jedno dodavanje u potpunosti uklonila nastalu pjenu te se

ona nakon jednokratnog dodavanja antipjenila nije više proizvodila

Ova tri antipjenila su dalje testirana metodom dodakta antipjenila tijekom uzgoja

biomase uz istovremeno mjerenje koncentracije otopljenog kisika Antipjenilo ASP ndash 664 se

pokazalo najučinkovitijim u uklanjanju pjene tijekom uzgoja P putida jer je uz najmanju

potrebnu količinu dodatak ovog antipjenila imao najmanji utjecaj na promjenu koncentracije

otopljenog kisika

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

29

6 LITERATURA

1 Denkov N D Marinova K G Antifoam effects of solid particles oil drops and oil-

solid compounds in aqueous foams Cambridge University Press Cambridge 2006

str 383-444

2 Holmberg K ed Handbook of applied surface and colloid chemistry John Wiley amp

Sons Ltd New York 2001 11251-266

3 Jame S ARashidul Alam AKM Fakhruddin ANM Khorshed Alam Md

Degradation of Phenol by Mixed Culture of Locally Isolated Pseudomonas Species

Journal of Bioremediation amp Biodegradation 2010 1102-106

4 Duraković S Opća mikrobiologija Prehrambeno-tehnološki inženjering Zagreb

1996 str 172-174

5 Otenio MH Lopes da Silva MT Marques MLO Roseiro JC Bidoia ED

Benzene toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida Brazilian

Journal Of Microbiology Satildeo Paulo 2005 36258-261

6 Cho YS Lee BU Oh KH Simultaneous degradation of nitroaromatic compounds

TNT RDX atrazine and simazine by Pseudomonas putida HK-6 in bench-scale

bioreactors Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008 831211ndash

1217

7 Nogales J Palsson

B Thiele I A genome-scale metabolic reconstruction of

Pseudomonas putida KT2440 iJN746 as a cell factory BMC Systems Biology

2008 279-99

8 Harwood C Fosnaugh K Dispansa M Flagellation of Pseudomonas putida and

analysis of its motile behavior Journal Of Bacteriology 1989 1714063-4066

9 Aiba S Humphrey A E Millis NF Biochemical engineering Academic Press Inc

New York 1973 str 3-17

10 Doble M Kruthiventi AK Gajanan Gaikar V Biotransformations and

bioprocesses Marcel Dekker New York 2004 str 2-18

11 Blakebrough N Fundamentals of fermenter design Department of Chemical

Engineering University of Birmingham Birmingham 1973 str 305-315

12 Krumphanzl V Rehaček Z Modern biotechnology Institute of Microbiology

Czechoslovak Academy of Science Praha 1984 str 34-52

13 Klaas vant R Tramper J Basic bioreactor design Marcel Dekker New York 1991

str 274-292

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

30

14 Denkov ND Krastanka MG Christova C Hadjiiski A Cooper P Mechanisms of

action of mixed solid-liquid antifoams 3 Exhaustion and reactivation Langmuir

2000 218163-8619

15 Al-Masry W Effects of antifoam and scale-up on operation of bioreactors Chemical

Engineering and Processing 1999 38197-201

16 Kawase Y Moo-Young M The effect of antifoam agents on mass transfer in

bioreactors Bioprocess Engineering 1990 5169-173

17 Arjunwadkar SJ Sarvanan K Kulkarni PR Pandit AB Gas-liquid mass transfer

in dual impeller bioreactor Biochemical Engineering Journal 1998 199-106

18 Morao A Maia C Fonseca M Vasconcelos J Alves S Effect of antifoam addition

in gas-liquid mass transfer in stirred fermenters Bioprocess Engineering 1999

20165-172

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

31

7 POPIS SKRAĆENICA I SIMBOLA

71 Simboli

a međufazna površina plin-kapljevina cm2

c

ravnotežna koncentracija otopljenog kisika molcm3

pg parcijalni tlak kisika u plinu Pa

cl koncentracija kisika u kapljevini molcm3

D difuzivnost plina u kapljevini cm2s

kla ukupni volumni koeficijent prijenosa kisika 1s

NO2l fluks kiska u kapljevini molm2 s

n broj okretaja 1min

pO2 relativna koncentracija otopljenog kisika -

QO2 brzina prijenosa kiska molcm3 s

t vrijeme min

δg debljina filma plina cm

δl debljina filma kapljevine cm

72 Skraćenice

LB kompleksna hranjva podloga (Luria-Bertani)

M9 minimalni medij sintetska hranjiva podloga

OD optička gustoća (optical density)

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012

ŽIVOTOPIS

Ana Folo rođena je 19 prosinca 1989 godine u Puli Pohađala je Osnovnu školu

bdquoVladimir Gortanldquo u Žminju Nakon završene osnovne škole upisala je Opću gimnaziju Jurja

Dobrile u Pazinu koju završava 2009 godine Iste godine upisuje preddiplomski studij

Ekoinženjerstvo na Fakultetu kemijskog inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu

kojega završava u rujnu 2012