Rekayasa Genetika (Kelompok 4).pptx

Anissa Permatadietha ArdiellaputriFransiska Milaniati Pratiwi Khairu Nuzula Yunita Florensia

Untuk memudahkan dalam pemisahan DNA dengan sekuen-sekuentertentu. DNA yang sudah dipotong dapat digunakan untuk produksi, kloning, dan identifikasi dalam rekombinasi molekul DNA (Nicholl 1994)

Secara mekanis 2 cara pemotongan Secara enzimatis

Pengocokan (sonikasi)

Enzim restriksi

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/soni cation.php

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA dengan sekuen yang didefinisikan Enzim restriksi yang mengikat DNA pada sekuen yang spesifik dinamakan regnition sites (Sofer 1991). Enzim ini ditemukan pada sel bakteri yang berfungsi sebagai bagian dari mekanisme protektif yang disebut restriction mechanism system.

Adalah situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi

tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotonganpada sekuen tersebut

Sekuen Pengenal Ecori

P A L I N D R O M I K

Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa, diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida.

Asumsi : setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi:

(1/4)6 = 1/4096.

Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs pengenalan

yang sama, isoschizomers

Contoh :

Beberapa enzim yang berbeda dapat membentuk akhiran yang

sama. Contoh Sau3AI menghasilkan akhiran GATC- begitu jugadengan BamHI

Pemotongan dipengaruhi oleh :Metilasi Buffer Struktur sekunder dalam substrat

Aktivitas Enzim diukur dalam sebuah unit Preparasi restriksi endonuklease digunakan untuk kloning

seharusnya terbebas dari nukleases yang lainnyaDigesti parsial mungkin berguna Cleavage sites dapat diketahui menggunakan molekul standard

Enzim yang secara hidrolitik membuang gugus phosphate darimolekul DNA, menggantinya dengan gugus hidroksil

DNA-dependent DNA polymerases RNA-dependent DNA polymerases DNA-dependent RNA polymerases

RNA-dependent RNA polymerases

Memendekkan rantai dobel DNA dengan 2 jalan :

Memindahkan strands secara terpisah Memindahkan kedua strands dengan bersamaan

INTERMOLEKULAR ujung dari molekul diligasikan dengan ujung dari molekul yang lainnya

INTRAMOLEKULAR ujung dari molekul diligasikan dengan ujung dari molekul itu sendiri

1. T4 DNA ligase dikodekan oleh bakteriofage T4 dan diproduksi pada infeksi sel E.Coli, dapat digunakan untuk ligasi sticky ends dan blunt ends, butuh ATP, butuh 3-hydroxyl dan 5-gugus fosfat pada molekul untuk disatukan 2. E.coli DNA ligase Tidak dapat digunakan untuk ligasi blunt-ended butuh 3-hydroxyl dan 5-gugus fosfat pada molekul untuk disatukan NAD+ sebagai kofaktor

3. Topoisomerase Mengubah derajat supercoiling dari molekul DNA. Dengan membelah satu atau dua strands, rotasi duplex dan menyegelnya.

Diberikan DNA molekuler linier dengan topoisomerasi terlampirdiakhir dan merupakan target molekul yang sesuai, enzim akan meligasi keduany, oleh karena itu enzim ini cepat

4. Transposase Mampu memindahkan DNA satu sama lain Dapat digunakan sebagai jalan untuk menyisipkan features seperti replikasi asli atau gen antibiotik resistansi kedalam molekul 5. Recombinase

t

r

a

n

s

f

o

r

m

a

s

i

g

e

n

e

t

i

k

Transformasi genetik termasuk salah satu cara terjadinyaperubahan sel akibat adanya sel dari luar. Transformasi jarang terjadi alami Transformasi pada bakteri digunakan untuk rekayasa genetika

Dalam rekayasa genetika, transformasi berperan penting untuk kloning molekuler Gen yang ingin digandakan, disisipkan ke dalam vektor. Vektor mengganda dan gen yang diinginkan pun bereplikasi

Vektor adalah materi genetik yang bersifat Replicon atau mudah mengganda. Sifat ini yang menjadikan gen dapat mengganda dengan cepat Contoh vektor yang sering digunakan adalah plasmid

Plasmid biasanya memiliki gen yang mengekspreksikan resistansi terhadap antibiotik tertentu

Plasmid sangat mudah untuk mengganda

Untuk berperan sebagai vektor, plasmid pertama-tama di isolasi sehingga dapat disispkan dengan gene of interest

Gen ini adalah gen yang ingin disisipkan untuk mendapatkan sel baru dengan sifat yang diinginkan Misalnya : gen antihama untuk sel tumbuhan ; gen pengurai logam untuk bakteri sebagai penanggulangan limbah ; dll Gen itu diisolasi dari gen asal setelah dilakukan sekuensing dgn cr

elektroforesis

Host adalah sel yang akan dimasukan plasmid rekombinan. Atau dengan kata lain host adalah sel yang akan bertransformasi Host yang biasa digunakan adalah E. Coli Untuk transformasi yang bertujuan untuk menghasilkan suatu produk, host kemudian dipecah dengan metode lisis alkali

Agar Plasmid bisa masuk kedalam sel, maka perlu rekayasa terhadap Permeabilitas sel host. Karena faktor ini menyebabkan transormasi alami jarang terjadi Caranya dengan menginkubasikan sel dalam larutan kalsium klorida kemudian mengaplikasikan gelombang panas

Untuk dapat menyisipkan gene of interest kedalam plasmid dan membuat plasmid rekombinan, sebelumnya plasmid yang ingin digunakan sebagai vektor perlu diisolasi

Teknik isolasi dari plasmid ada bermacam-macam.

p

e

m

u

r

n

i

a

n

p

l

a

s

m

i

d

Pada prinsipnya, yang pertama dilakukan adalah melisis sel bakteri

yang plasmidnya ingin dijadikan vektorKemudian komponen sel yang terlisis tersebut disentrifugasi sehingga akan terpisah berdasarkan berat molekulnya. Setelah itu dengan menggunakan membran dilakukan pemisahan antara DNA sirkuler dan DNA kromosomal dengan Membrane Binding atau penambahan reagent seperti EtBr.p e m u r n i a n p l a s m i d

p

e

m

u

r

n

i

a

n

p

l

a

s

m

i

d

Gene of Interest atau Insert didapatkan dengan melakukanpemotongan DNA tepat pada basa nitrogen yang mengkodekan protein yang diinginkan

Untuk dapat memisahkan DNA yang akan disisipkan dari keseluruhan DNA digunakan metode Gel elektroforesis

p

e

m

u

r

n

i

a

n

p

l

a

s

m

i

d

Gel elektroforesis adalah teknik analitik untuk memisahkan proteinberdasarkan ukuran molekulnya. Karena medium gel yang digunakan berpori dengan diameter tertentu.

maka molekul yang lebih besar akan membutuhkan waktu yang lebihlama untuk melewati medium. Karena itu fragmen-fragmen DNA akan terpisahkan berdasarkan ukuran

fragmenya

Molekul asam nukleat di atur didalam media yang memiliki viskositas tinggi yaitu gel. Kemudian medan listrik diinduksikan sehingga asam nukleat akan

bergerak ke arah anoda karena muatan negatif yang dimiliki gulafosfat. Karena perbedaan ukuran maka molekul yang lebih besar akan kesulitan melewati gel sementara molekul yang lebih kecil akan lebih mendekati anoda dibanding molekul yang lebih besar. Gel yang biasa digunakan untuk elektroforesis DNA adalah Agarosa atau Poliakrilamida.

Untuk dapat menyisipkan Gen kedalam plasmid, sebelumnya perlu diketahui fragmen yang mengandung gen yang diinginkan. Maka perlu diketahui urutan atau sekuens dari basa nitrogen dalam DNA Ada 2 metode yang umum dilakukan untuk menentukan sekuens DNA

Ditemukan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert Prinsipnya adalah menambahkan bahan kimia sehingga memutus rantai DNA Basa nitrogen Purin diputus dengan Asam Format Guanin direaksikan dengan Dimetil Sulfat Pirimidin direaksikan dengan hydrazine Basa nitrogen Cytosin diputus dengan hydrazine yang ditambah dengan garam dapur

s

e

k

u

e

n

s

i

n

g

Salah satu metode untuk melakukan Sekuensing adalah Metode Sanger atau Chain Termination Methods.

s

e

k

u

e

n

s

i

n

g

ddNTP

dNTP DNA PRIMER

Setelah terjadi pemutusan basa nitrogen akibat pengikatan ddNTP, fragmen tersebut akan dibaca oleh gel elektroforesis.s e k u e n s i n g

hasil pembacaanelektroforesis untuk metode sanger

s

e

k

u

e

n

s

i

n

g

Untuk mendapatkan Sekuens DNA dengan metode Sanger dibutuhkan Primer DNA

Bagaimana cara mengetahui sekuens DNA Primer agar dapat menempel di template DNA?

s

e

k

u

e

n

s

i

n

g

Menggunakan metode Maxam-GilbertMemutasi secara terkontrol Gen-gen yang paling ujung sehingga diketahui Gennya Menyisipkan DNA pada plasmid bakteri yang sudah diketahui sekuensnya. Menggunaan DNA spesies yang mirip

s

e

k

u

e

n

s

i

n

g

1983Kary Mullis

adalah sebuah teknik ilmiah dalam biologi molekular untuk memperkuat satu atau beberapa salinan sepotong DNAdi beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan tertentu urutan DNA

komponen

P

C

R

sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama

komponen

P

C

R

merusak dinding sel tanpa harus merusak