Rekayasa genetika

Rekayasa genetika adalah adanya manipulasi materi genetik dengan cara menambah atau

menghilangkan gen tertentu yang diakibatkan oleh pemutusan, penyambungan, serta

perpindahan berbagai materi genetik. Dengan demikian tanpa manipulasi atas materi genetic

dengan cara seperti tersebut, sesuatu macam bioteknologi seperti kultur jaringan, bahkan kultur

sel, tidak layak dikategorikan sebagai teknologi rekayasa genetika. Fenomena alami dari

rekayasa genetika adalah crossing over, gene pick up, transduksi-insersi, delesi, translokasi

(transposisi), fusi dan fisi.

Proses Rekayasa Genetika

Teknik-teknik Rekayasa Genetika

Menurut Smith daan Byars (1990) ada beberapa teknik yang digunakan dalam rekayasa

genetika seperti transfer vector,injeksi mikro, fusiprotoplas, dan elektroporasi.

1) Transfer Vektor

Transfer vektor merupakan cara memasukkan suatu gen ke dalam sel baru dengan

menggunakan pembawa khusus (carrier), biasanya memanfaatkan proses alami seperti yang

terjadi pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektor molekul DNA yang digunakan adalah

plasmid, bakteriofag, kosmid (cosmid), shuttle vektors (vektor ulang-alik). Sebagai vektor suatu

molekul DNA harus memiliki sifat-sifat sebagai berikut:

a. Mampu melakukan replikasi sendiri maupun replikasi kromosom sel inang dengan cara

membawa suatu “ori”.

b. Mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi yang bermanfaat untuk insersi

segmen-segmen DNA.

c. Membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan untuk identifikasi sel-sel inang yang

mengandungnya.

d. Mudah terbebas kembali dari sel inang.

Selain sifat-sifat diatas ada pula sifat lain yang diharapkan yaitu:

a. Berat molekul rendah

b. Memiliki kemampuan untuk memberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada

sel inang.

(1) Plasmid

Contoh plasmid misalnya pSC101 (58 M dal), ColE1 (4,2 M dal), dan RSF2124 (7,4 M

dal).

Tabel. Rincian sifat dari 3 vektor yang terbentuk secara in vivo pada E.coli

Plasmid Ukuran (M dal) Tapak tunggal endonuklease

Penanda seleksi transforman

Inaktivasi insersi dari

pSC 101 5,8 Xho L, Eco RI, Pvu II, Hpa I, Hind III, Bam HI, Sal I

Resisten tetrasiklin

Resistensi tetrasiklin

Col El 4,2 Eco RI Imunitas terhadap colcisin S 1

Produksi colcisin E 1

RsF 2124 7,4 Eco RI, Bam HI Resistensi ampisilin

Produksi colcisin E1

(2) Bakteriofag

Bakteriofage yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E. coli

adalah fag λ. Seluruh gen fag λ sudah diidentifikasi dan dipetakan. Gambar 3

memperlihatkan genom fag λ dalam kondisi tidak sirkuler. Seluruh derivate fag λyang

digunakan sebagai vector transfer sudah direkayasa sehingga hanya siklus titik saja yang

mungkin.

Contoh lainnya yang juga digunakan sebagai vektor adalah bakteriofag M 13 yang

merupakan DNA unting tunggal. M 13 (DNA unting tunggal) akan bereplikasi

menghasilkan suatu molekul DNA unting ganda yang disebut sebagai RF jika menginfeksi

suatu sel bakteri.molekul RF serupa dengan plasmid dan DNA aing yang dapat diinsersikan

ke tapak-tapak pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom.

(3) Kosmid (Cosmid)

Kosmid adalah vektor yang dibangun/dibuat di laboratorium dengan memanfaatkan

urutan cos dan fag λ yang berguna untuk pemasukkan/pengumpulan kromosom ke dalam

kepala fag dan memanfaatkan juga urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi resistensi

terhadap antibiotik serta replikasi.

(4) Vector ulang-alik (Shuttle vector)

Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakteriofage λ dan kosmid yang

digunakan untuk pengklonan DNA di dalam sel E. coli, sudah dikembangkan juga vector lain

yang dimanfaatkan untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel

mahluk prokariotik lain maupun yang eukariotik. Contohnya adalah vector ulang-alik yEp

24 pada khamir dan E.coli.

2) Injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasikalsium fosfat dan endositosis,

serta proyeksi mikro

a. Injeksi mikro

menggunakan jarum miroskopis untuk memasukkan DNA melalui membrane sel

sasaran, termasuk kedalam inti sel.

b. Fusi protoplas

Terjadi pelarutan dua membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat

digabung menjadi satu. Misal hasilnya berupa protoplas sel yang memperoleh DNA eksogen.

Contoh lainnya adalah lipofeksi (lipojeksion) yang dapat mentransformai atau mentransfeksi

sel melalui fusi dengan membrane plasma. Hal ini memanfaatkan liposom yang tersusun dari

suatu lipida kationik.

c. Elektroporasi

Menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan

dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Teknik ini efektif diterapkan pada sel

hewan.

d. Kopresipitasi kalsium fosfat dan Endositosis

Butir-butir kopresipitasi kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui

endositosis fagositosis. Merupakan cara yang umum diterapkan pada mamalia.

e. Proyeksi mikro

DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel. Teknik tersebut merupakan cara

memasukkan asam nukleat ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi.

Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan

Prosedur dasar teknologi DNA rekombinan yang akan dikemukakan pada bagian ini

dibatasi lebih pada teknik yang diperantai oleh vector. Urutan proses yang menjadi prosedur

dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantai vector.

1) Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan

memotong molekul DNA urutan nukleotida spesifik.

2) Segmen-segmen tersebut digabungkan ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor.

Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan

identifikasi molekul DNA yang baru terbentuk.

3) Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang.

4) Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan dan

dianalisis.

5) Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskannya kepada seluruh sel

turunan, menghasilkan suatu populasi yang identic yang membawahi urut-urutan yang

diklon.

6) Secara potensial, DNA yang diklon dapat ditranskripsikan , RNAd nya ditranslasikan

serta produk gennya diisolasi dan dikaji.

Peran Enzim Endonuklease Retriksi

Pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur dasar teknik DNA rekombinan yang

diperantai oleh vector enzim endonuclease digunakan untuk memotong molekul DNA dalam

rangka pembuatan fragmen DNA. Penamaan enzim endonuclease restriksi diberi nama

berdasarkan macam mahluk hidup dalam posisi miring yang diikuti dengan suatu angka

romawi.huruf-huruf tambahan kadang-kadang disertakan untuk menandai suatu strain tertentu.

Enzim endonuclease dibagi menjadi tipe I dan tipe II.

Enzim endonukleaseTipe I Tipe II

Mengenali suatu urutan pasang basa nukleotida yang spesifik pada DNA

Mengenali suatu urutan pasang basa nukleotida yang spesifik pada DNA

Selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan tadi

Selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak spesifik dalam urutan tadi

Pemotongan tidak spesifik Pemotongan spesifik (pada urutan yang sama)Kurang bermanfaat dalam pembentukan molekul rekombinan

Bermanfaat untuk pembentukan molekul rekombinan

Urutan pengenalan enzim endonuclease retriksi tipe II memiliki suatu sumbu simetri

yang melewati titik tengah urutan pengenalan. Dalam hal ini urutan basa 5’→3’ pada unting

DNA sama dengan urutan basa 5’→3’ pada komplementernya, sehingga disebut sebagai twofold

rotational symmetry.

Enzim endonuklease restriksi sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang

berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan

nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim

pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan

ditemukan pada DNA.

Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki

nilai khusus pada pengklonal fragmen-fragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan

bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna (ikatan kimia antar

gula dan asam fosfat akan terbentuk di bawah pengaruh enzim DNA ligase).

Tabel 3 contoh pemutusan molekul DNA oleh enzim endonuclease tipe II yang menghasilkan ujung tumpul dan ujung lancip

Pasangan nukleotida pada tapak restriksi

Probabilitas kejadian

4 (1/4)4 = 1 dalam 256 bp

5 (1/4)5 = 1 dalam 1024 bp

6 (1/4)6 = 1 dalam 4096 bp

8 (1/4)8 = 1 dalam 65, 476 bp

11 (1/4)11

Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu DNA oleh enzim endonuklease restriksi II

dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan pengenal,

sepanjang keberadaan tiap pasangan nukleotida bersifak acak. Peluang jumlah tersebut

ditunjukkan pada tabel 3.

Pertanyaan:

1. Apa yang membedakan antara enzim endonuclease tipe I dan tipe II?

Jawab:

1. Enzim endonuclease tipe I: Mengenali suatu urutan pasang basa nukleotida yang

spesifik pada DNA, selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh

dari urutan tadi dan kurang bermanfaat dalam pembentukan molekul rekombinan.

Enzim endonuclease II: Mengenali suatu urutan pasang basa nukleotida yang spesifik

pada DNA, selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak spesifik dalam urutan tadi

dan bermanfaat untuk pembentukan molekul rekombinan.