Rekayasa Genetika HG 3

REKAYASA GENETIKA

HOME GROUP 3

Dwini Normayulisa P. (1206238482)Ghilandy Ramadhan (1206242012)Kasandika Ganiarsa (1206250304)Lucia Purwanti (1206212496)Sandra Monica (1206212432)

OUTLINE

DEFINISI REKAYASA GENETIKA

• Rekayasa genetika merupakan pembentukan baru materi genetik yang dapat dilakukan dengan menyisipkan molekul-molekul asam nukleat ke virus atau plasmid bakteri atau organisme pembawa lainnya, yang memungkinkan terjadinya penggabungan dan mampu mengadakan penggandaan. (Sumastri, 2005)

TAHAP REKAYASA GENETIKA

• Pemotongan

• Modifikasi

• Penggabungan

• Transformasi

PEMOTONGAN DNA

Pemotongan

• Pemotongan molekul DNA dilakukan menggunakan bantuan enzim restriksi endonuklease.

• Enzim restriksi endonuklease akan memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiesfer yang menghubungkan nukleotida satu dengan yang lainnya (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

Enzim Restriksi Endonuklease

• Enzim restriksi endonuklease akan mengenali sekuens DNA yang spesifik dan memotongnya menjadi fragmen-fragmen DNA (Primrose dkk, 2001)

• Hasil pemotongan oleh enzim restriksi endonuklease ini akan tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, sehingga dapat diketahui urutan serta panjang basa nitrogen yang dihasilkan (Ratna dkk, 2008).

Tipe Enzim Restriksi Endonuklease

• Tipe I

• Tipe II

• Tipe III

• Penggolongan ini didasarkan pada kemampuan mengenal dan memotong urutan DNA. (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

Enzim Restriksi Endonuklease: Tipe I

• Dapat mengenal urutan pengenal (recognition sequens) hingga 1000-5000 basa sepanjang molekul DNA.

• Melakukan pemotongan ikatan fosfodiesfer secara acak.

• Untuk dapat bekerja dengan baik, golongan ini juga memerlukan ATP dan S-adenosil metionin (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

Enzim Restriksi Endonuklease: Tipe III

• Melakukan pemotongan secara acak di luar urutan pengenal.

• Hanya memotong satu rantai molekul DNA berantai ganda dan menghasilkan DNA rantai tunggal (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

Enzim Restriksi Endonuklease: Tipe II

• Dapat memotong DNA pada posisi tertentu di dalam urutan pengenal.

• Mampu mengenal secara spesifik 4 sampai 7 pasang urutan nukleotida pada DNA untai ganda.

• Urutan ini bersifat polindrom yang berarti mempunyai urutan basa yang simetri jika ditarik garis sumbu di tengah-tengah.

• Mampu memotong molekul DNA tepat pada atau dekat kedua untai urutan pengenal tersebut (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

Nomenklatur Enzim Restriksi Endonuklease

• Huruf pertama dari nama genus organisme: Thermus aquaticus. (Ditulis miring)

• Dua huruf pertama dari nama spesies organisme: Thermus aquaticus. (Ditulis miring)

• Strain dari organisme

T a q I

Urutan Pengenal (Recognition Sequences)

• Enzim restriksi endonuklease dapat bekerja secara spesifik memotong molekul DNA sesuai dengan urutan pengenal yang dimilikinya. Sebagai contoh, enzim EcoRI yang mengenali urutan GAATTC.

• Posisi pemotongan DNA oleh enzim restriksi ditandai dengan symbol ‘/’.

• Urutan pengenal yang diperlihatkan hanya satu untai DNA saja, dengan arah dari ujung 5’ ke ujung 3’. Maka urutan pengenal enzim EcoRI dapat ditulis sebagai G/AATTC (Primrose dkk, 2001).

• Sumber: Principle of Gene Manipulation, edisi ke-6

Jenis Fragmen Restriksi

• Ujung tumpul (blunt end)

• Ujung lengket atau lancip (sticky/ cohesive)

Jumlah dan Ukuran Fragmen Restriksi

• Jumlah fragmen restriksi yang dihasilkan dari pemotongan molekul DNA ditentukan oleh banyaknya urutan pengenal yang dimiliki oleh DNA tersebut.

• Bila enzim mempunyai urutan pengenal dengan 4 nukleotida, maka tempat pemotongan diperkirakan sebanyak 44 atau 256 nukleotida (Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4, 2013).

MODIFIKASI GEN

Modifikasi Gen

• Modifikasi Gen dapat terjadi secara delesi, insersi dan substitusi. Selain itu juga terdapat enzim-enzim yang berperan dalam modifikasi gen ini.

• Untuk modifikasi secara insersi dan delesi dilakukan dengan bantuan DNA Polimerase yang akan membawa oligonukleotida untuk ditambahkan atau dikurangi dari gen

• Dalam memodifikasi gen dengan menginsersi atau delesi, kita perlu memotong DNA terlebih dahulu dan melakukan penyambunga setelah penyisipan telah selesai

• Jika mengsubstitusi nukleotida, maka tidak perlu memotong DNA terlebih dahulu. Tapi dengan menggunakan PCR yang akan mengganti nukleotida yang ingin diganti pada DNA

PENGGABUNGAN FRAGMEN DNA

Penggabungan

• DNA rekombinan dibuat dengan menggabungkan dua DNA dari asal yang berbeda.

Metode Penggabungan DNA

1. Penyambungan dengan menggunakan enzim DNA ligase terhadap ujung kohesif yang dibentuk oleh enzim restriksi

2. Penyambungan dengan menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase

3. Penyambungan dengan menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase

Metode 1

• Digunakan untuk menyambungkan untai tunggal DNA dengan ujung yang lengket (sticky end) menggunakan DNA Ligase.

• Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain.

• Suhu optimum untuk menyambung DNA pada metode ini dilakukan pada rentang suhu 4-15ºC (Dugaiczyk et al. 975, Ferretti & Sgaramella 1981).

Metode 2

• Penggabungan dua fragmen DNA menggunakan bantuan enzim T4 DNA ligase.

• Terdiri dari tiga tahap:

• Pembentukan sebuah ikatan kompleks kovalen enzim-AMP yang dihubungkan dengan sebuah lysine side-chain pada sisi aktif enzim.

• Proses pemindahan AMP ke 5’ phosphate dari fragmen DNA.

• Penyerangan pada ikatan AMP-DNA oleh 3’-OH menghasilkan ikatan kovalen fosfodiester dan menghasilkan AMP.

Skema Penggabungan DNA, dengan bantuan enzim ligase

Metode 3

• Penggabungan fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan enzim deoksinukleotidil transferase terminal untuk mensintesis untai tunggal 3’-homopolimer pada ujung-ujung fragmen.

MOLEKUL YANG BERPERAN DALAM REKAYASA GENETIKA

DNA

• DNA, merupakan unit terkecil yang membawa sifat keturunan (gen). DNA plasmid vektor harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim yang sesuai sehingga terbuka, sedangkan DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk membentuk rekombinan buatan harus dipotong dengan enzim yang sama.

Vektor

Vektor adalah replika yang akan memungkinkan gen untuk ditempatkan di sel induk (host cell) dan melibatkan plasmid pada bakteri induk. Contoh vektor adalah Yeast Artificial Chromosome (YAC)

Persyaratan suatu vektor adalah sebagai berikut:

•Replikasi autonom dalam inang

•Berpenanda untuk seleksi

•Berposisi kloning tunggal

•Berberat molekul kecil

•Memiliki beberapa salinan pada tiap sel

•Tidak berkonjugasi

Enzim

• Enzim lisozim yang bertugas untuk memecah dinding sel bakteri, yang kemudian dilisis dengan NaOH dan larutan dedosil sulfat.

• Enzim nuklease (endonuklease restriksi) yang bertugas untuk memotong DNA plasmid dan DNA yang akan disisipkan.

• Eksonuklease lebih berfungsi sebagai pemendekan dari DNA dengan tepi ganda

Enzim

• Enzim ligase yang bertugas untuk menyambung DNA yang sudah dipotong dengan DNA plasmid yang juga telah dipotong agar menjadi satu.

• Enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.

• Enzim polimerase yang bertugas untuk membuat salinan dari molekul DNA.

Enzim

• T4 DNA ligase merupakan salah satu enzim yang dihasilkan oleh bakteri. Berfungsi untuk pembentukan ikatan phosphodiester antar nukleotida pada DNA yang akan disambung. Enzim T4 DNA ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang mempunyai ujung tidak rata, yang disebut dengan sticky end, dengan ujung rata (blunt end). Untuk meligasi ujung rata, dibutuhkan konsentrasi enzim yang cukup besar

TRANSFORMASI GEN

Transformasi Gen

Prinsip Dasar :

Transformasi genetik merupakan proses perpindahan gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri, atau hewan ke dalam suatu genom baru untuk menghasilkan sifat baru dan untuk menghilangkan sifat-sifat yang tidak diinginkan.

Mekanisme Transformasi Genetik

Metode Transformasi GenetikMetode Langsung Metode Tidak Langsung

Proses transformasi genetik secara langsung diartikan sebagai proses pemasukan gen asing ke dalam sel tanpa menggunakan perantara

Transformasi genetik secara tidak langsung adalah metode yang dilakukan dengan cara menyisipkan gen asing melalui perantara , dan perantara menginfeksi sel tujuan transformasi.

Metode Transformasi Genetik

Metode Langsung vs Tdk LangsungMetode Langsung Metode Tidak Langsung

Kelebihan Kekurangan Kelebihan Kekurangan

dapat digunakan kepada berbagai jenis tanaman

gen yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan yang banyak sehingga peluang terjadi penyusunan kembali gen tersebut menjadi besar

• tidak membutuhkan peralatan khusus karena dapat dilakukan dalam laboratorium yang sederhana• sisipan gen tunggal berpeluang lebih tinggi sehingga stabilitas ekspresi gen lebih tinggi

• sekuen yang ditransfer ke genom target bersifat acak• ada kemungkinan yang ditransfer bukan gen target

PEMURNIAN PLASMID

Apa itu Plasmid ??

• Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal(terpisah dari kromosom) yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup (Royston 1972).

• Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung).

• plasmid berperan sebagai vektor (kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing.

Pemurnian Plasmid

Prinsip Dasar :

Inti dari pemurnian plasmid adalah memisahkan

Plasmid dengan DNA Kromosom dan zat – zat

pengotor yaitu dinding sel , protein juga organel

lainnya.

Mekanisme Pemurnian Plasmid

Metode Pemurnian Plasmid

DNA ELEKTROFORESIS GEL

Definisi

Teknik pemisahan asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan atau bentuk permukaannya dengan memanfaatkan migrasi molekul bermuatan dalam suatu medan listrik.

tujuan :

1.Mengetahui ukuran dan bentuk partikel DNA atau RNA

2.Digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi DNA

3.Mengetahui ukuran dan jumlah basa dalam sekuen DNA

Prinsip Dasar

Komponen Elektroforesis Gel

Agarose dan Poliakrilamid Gel

Agarosa• Dapat memisahkan fragmen DNA

100bp-50bb, tergantung konsentrasi agarose yang digunakan

• Power lebih rendah

• Penggunaan dengan konsentrasi 0,5-2%, dari rumput laut, semakin tinggi konsentrasi semakin kenyal gel tersebut

• Medan gerak horizontal

• Rentang separasi luas, daya pemecahan rendah

Poliakrilamid• Efektif untuk pemisahan

fragmen DNA 5-500bp

• Power ekstrim tinggi, perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp

• Merupakan polimer akrilamid

• Medan gerak vertikal

• Rentang separasi rendah, daya pemecahan tinggi

Mekanisme DNA Elektroforesis Gel

Persiapan Sampel

Sumber: Agarose Gel Electrophoresis of DNA http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html, diakses pada 12 september 2014 pk. 23.10.

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html



Pembuatan Gel





Penempatan Sampel Gen

Sampel - sampel gen disuntikkan ke dalam masing – masing sumur sampel.





Proses Elektroforesis Gel• Menghubungkan alat

elektroforesis dengan arus listrik

• Bagian sumur DNA diletakkan pada ujung kutub negatif

• Elektroforesis berjalan jika terdapat gelembung pada elektroda





Pewarnaan/Staining

• Hasil akhir elektroforesis diberi metilen blue, warna terserap fragmen DNA

• Dialirkan air ke dalamnya

• Terbentuk hasil akhir sampel berwarna





Analisis dengan UV

• DNA yang telah diberi warna bila dilihat dengan sinar UV tampak seperti pita – pita hitam dengan jarak perpindahan beragam

• Semakin jauh perpindahan fragmen DNA, semakin pendek rantai DNA tersebut





DNA SEQUENCING

Definisi

• Merupakan cara untuk mengetahui urutan basa dalam suatu fragmen DNA

• Mirip dengan PCR, namun PCR menggunakan deoxy-Nucleotyde Triphospate (dNTP), sedangakn sequencing menggunakan dideoxy-Nucleotyde Triphospate (ddNTP) http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html ,

diakses pada 19 september 2014 pk 15.28

http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html

Komponen DNA Sequencing

Metode Sanger• Primer (oligonukleotida)

• Polimerase

• dNTP (dATP, DGTP, dCTP, dTTP)

• Dideoksinucleotyde triphosphate (ddNTP)

Metode Maxam - Gilbert• Primer (oligonukleotida)

• enzim kinase dengan 32P ATP di ujung 5’

• Piperidin

Metode Maxam - Gilbert

• Kurang populer dibanding Sanger karena rumit

• DNA yang akan diurutkan dilabel dengan enzim kinase dengan 32P ATP di ujung 5’

• Diberi piperidin panas (CH2)5NH agar DNA pecah

• Fragmen dimasukkan ke dalam masing – masing empat tabung reaksi berisi A, T, G dan C

• Dilakukan elektroforesis untuk melihat urutannya

Video Metode Maxam - Gilbert

Metode Sanger

• Dikembangkan oleh Frederick Sanger tahun 1975

• Lebih populer daripada metode Maxam-Gilbert

• Mengalami banyak perkembangan dari tiap – tiap percobaannya hingga akhirnya ditemukan automated sequencing

Prinsip Dasar

• Double strand DNA dipisahkan dengan pemanasan single strand DNA

• dNTPs dan enzim polimerase disiapkan

• Primer menempel dan membentuk rantai nukleotida dengan bantuan enzim polimerase

• Pembentukan rantai nukleotida terhenti ketika ddNTP menempel

• Terbentuk fragmen – fragmen DNA

• Fragmen – fragmen tersebut dielektroforesis untuk mengetahui urutan basanya

Metode Sanger : Labelled primerGenerasi 1 • Dilakukan dalam empat tabung

terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan.

• ddNTP yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung.

• Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.

• Dilakukan elektroforesis, primer dilabeli dengan radioaktif sehingga berpendar ketika terkena UV

http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna/

Metode Sanger : Dye Primer dengan Label Berbeda

• Pada saat denaturasi, dilabeli dengan 4 warna berbeda

• Terjadi pembentukan rantai DNA, berhenti ketika berikatan dengan ddNTP

• Menghasilkan produk yang telah terlabeli sesuai warna pada gambar

http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/

Metode Sanger : Dye Terminator Sequencing

• ddNTP langsung dilabel dengan 4 warna berbeda

• Pertumbuhan rantai dibatasi sekaligusdan ditandai dengan dye yang terhubung dengan basa.

http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/

Automated DNA Sequencing

• tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda.

• warna yang ada pada tiap fragmen yang disintesa berhubungan dengan warna yang berikatan pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Pengertian

• Metode amplifikasi rantai DNA atau RNA dengan waktu yang sangat cepat. PCR menggunakan molekul alami yang digunakan pada proses duplikasi DNA pada makhluk hidup.

• PCR berhubungan erat dengan metode pemanasan

Primer Enzim Polimerase DNA building blocks

Kelebihan Kekurangan

1. Memiliki spesifitas tinggi 1. Sangat mudah terkontaminasi

1. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

2. Biaya peralatan dan reagen mahal

2. Dapat membedakan varian mikroorganisme

3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infekssi pasif atau laten)

3. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya

4. Mudah di set up5. Sensitivitas PCR menjadi kekurangan dari

metode ini, karena sedikit kontaminan (dari sample lain) dapat ikut teramplifikasi

Peralatan

Thermal Cycler

High Resolution Electrophoresis

UV Transilluminator PCR Vial

Analisis DNA hasil PCR

Tempat penyimpanan reagen PCR

Memperlihatkan DNA yang telah dielektroforesis

Mengatur suhu

operasi

Proses Amplifikasi DNA/RNA dengan PCR

Reaktan dicampur dalam PCR vial. Campuran mengandung DNA yang ingin diamplifikasi, enzim polymerase, sekuen primer DNA dan sejumlah basa nukleotida A,T,G,C (dNTP). Vial diletakkan dalam mesin PCR

Campuran dipanaskan hingga mencapai 90–95ᵒC selama sekitar 30 detik. Pada suhu ini kedua untai DNA akan terpisah karena ikatan hidrogen yang menjaganya telah hancur.

Campuran didinginkan hingga 55-60 ᵒC. Pada suhu ini primer menempel pada untai tunggal DNA. Primer adalah urutan pendek basa nukleotida yang harus menempel pada awalan untai DNA dalam proses pencetakan pasangan basa DNA

Pada tahapan terakhir, campuran dipanaskan lagi hingga mencapai 75ᵒC sedikitnya selama satu menit. Ini adalah suhu optimum bagi DNA polymerase untuk bereaksi. Enzim ini akan menambahkan dNTP pada ujung primer dan membuat untai DNA komplemen yang identik dengan molekul asli.

Tiga langkah terakhir tersebut dapat diulang hingga sekitar 30 kali untuk menghasilkan sekitar 1 miliar kopi DNA asli. Keseluruhan proses hanya menghabiskan waktu sekitar 3 jam.

Jenis PCR

Hal yang mempengaruhi keberhasilan proses PCR

• Konsentrasi dan Kualitas DNA

• Konsentrasi MgCl2

• Enzim Polimerase

• Jumlah siklus PCR

• dNTP

• Buffer PCR

• Kecermatan Teknik Laboratorium

• Pemisahan pekerjaan PCR dari reaksi yang lain

• Mikropipet dan Tip

• Sumber kontaminasi yang lain

• Penggunaan Kontrol

• Primer

Faktor yang mempengaruhi Primer

• Konsentrasi dan Kualitas Primer

• Temperatur Annealing dari kedua primer

• Panjang Primer

• Primer melting temperature

• GC content

• GC clamp

• Primer secondary structures

Design Primer

Syarat Primer• Panjang sekitar 17 hingga 30 nukleotida

• Persen GC sekitar 50%

• Temperatur annealing antara primer forward dan reverse diusahakan serupa

• Diusahakan tidak mengandung basa berulang lebih dari tiga basa

• Diusahakan primer tidak saling komplemen terhadap dirinya sendiri atau primer pasangannya

• Diusahakan tidak menempatkan lebih dari dua basa G atau C pada 5 basa terakhir

• Hindari nilai ΔG hairpin yang lebih rendah dari -0,5 Kcal/mol

• Hindari nilai ΔG dimer yang lebih rendah dari -4,0 Kcal/mol.

Modifikasi PCR

• Improving Specificity (Hot Start PCR, Touch Down PCR, Nested PCR)

• Hard Copy

• Inverse PCR

• Reverse Transcriptase PCR

• In Situ PCR

• Quantitative

• Mutagenesis

• Asymetric PCR

• Anchored PCR

• Emulsion PCR

• Isothermal PCR

Referensi• Anam, Khairul. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika Laporan III (DNA Rekombinan). Program

Studi Bioteknologi. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. 2010

• Buletin Konservasi Biodiversitas Raja4 Vol. 2 No. 11. 2013. Enzim Restriksi. FPPK UNIPA. (diakses dari http://ibcraja4.org/assets/file/Buletin6November2013.pdf pada 14 September 2014 pukul 18.09 WIB)

• Hirma, Ratna Dwi., Hariyati., dan Yuniati, Afrina. 2008. Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen yang Terpotong. (diakses dari https://23bios1unsoed.files.wordpress.com/2008/11/k04-td-04-b1j006019.pdf pada 11 September 2014 pukul 19.01 WIB)

• Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge University Press

• Jamsari, Yusniwati, dan Syukriani, Lily.nd.”Bahan Ajar Rekayasa Genetika. (diakses dari http://faperta.unand.ac.id/deposit/BahanAjarRekayasaGenetika.pdf pada 12 September pukul 21.00 WIB)

Referensi• Np.nd.”DNA Ligase”. (diakses dari

http://www.biochem.umd.edu/biochem/kahn/molmachines/replication/DNA%20Ligase.htm pada 13 September 2014 pukul 20.00 WIB)

• Oswald, Nick.2007.”The Basics: How Does DNA Ligase Work?”. (diakses dari http://bitesizebio.com/10279/the-basics-how-does-dna-ligation-work/ pada 13 september 2014 pukul 19.35 WIB)

• Primrose. Principles of Gene Manipulation 6 Edition. Blackwell Science. UK. 2001

• Primrose. Sandy B., Twyman, Richard M., dan Old, Robert W. 2001. Principle of Gene Manipulation 6th edition. Blackwell Science Ltd.

• Sumastri.2005.Rekayasa Genetika.Bandung. (diakses dari http://www.p4tkipa.net/modul/Tahun2005/SMK/Biologi/Rekayasa%20Genetika.pdf pada 12 September 2014 pukul 20.15 WIB)

Documents

Rekayasa Genetika HG 3