Tugas Rekayasa Genetika FG-D

Teknik Modifikasi dan Analisis dalam Manipulasi Gen

Alifah Ismawati (1206212382), Clarissa (1206238974), Ghilandy Ramadhan (1206242012),

Lucia Purwanti (1206212496), Primantono Rachman (1206262121),

Rizka Margi Astuty (1206212470)

Jurusan Teknologi Bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik,

Universitas Indonesia

Abstrak

Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik

untuk kepentingan manusia. Rekayasa genetika sendiri merupakan teknik untuk memodifikasi

DNA yang berperan sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas

pewarisan sifat untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang

diinginkan (Chang, 2009). Beberapa contoh rekayasa genetika meliputi analisis dan modifikasi

genetic antara lain adalah transformasi genetic, pemurnian plasmid, elektroforesis gel, dan metode

sekuensing. Manipulasi gen yang semula dilakukan secara acak, dapat diarahkan pada target yang

lebih tepat dengan teknik transformasi genetik. Mendapatkan vektor kloning berupa plasmid dapat

didapatkan dengan pemurnian plasmid. Elektroforesis gel digunakan untuk menyediakan

informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Sedangkan,

sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen

DNA lainnya.

Kata Kunci: Elektroforesis gel, rekayasa genetika, sekuensing, teknik pemurnian plasmid, dan

transformasi genetik

I. Transformasi Genetik

I.1 Prinsip Dasar Transformasi Genetik

Transformasi genetik merupakan proses perpindahan gen asing yang diisolasi dari

tanaman, virus, bakteri, atau hewan ke dalam suatu genom baru. Transformasi genetik

merupakan bentuk bioteknologi yang terus dikembangkan sampai sekarang ini yang

bertujuan untuk meningkatkan taraf hidup manusia maupun lingkungan. Proses

transformasi genetic dapat dilakukan melalui 2 teknik, yaitu teknik langsung dan teknik

tidak langsung.

Proses transformasi genetik secara langsung diartikan sebagai proses pemasukan

gen asing ke dalam sel tanpa menggunakan perantara seperti yang digunakan oleh metode

tidak langsung. Proses transformasi genetik yang dilakukan secara langsung dapat

dilakukan menggunakan beberapa metode seperti heat shock, penembakan eksplan gen

dengan gene gun atau yang disebut particle bombardment, microinjection, dan

elektroporasi. Metode transformasi genetik secara langsung dengan metode heat shock

merupakan metode yang paling sederhana. Metode ini akan menaikan suhu lingkungan

yang terdiri dari sel, dengan adanya perbedaan tekanan diantara bagian luar dan bagian

dalam sel, akan terjadi induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil

dapat masuk ke bagian dalam sel. Setelah itu sel akan kembali ke bentuk normal jika suhu

kembali ke keadaan normal, fenomena ini disebut dengan self-heal. Metode Particle

Bombardment dikembangkan untuk memungkinkan terjadinya penetrasi dinding sel

sehingga materi genetik yang mengandung gen asing dapat masuk ke dalam sel. Metode

ini dimulai dengan proses pelapisan partikel microprojectiles (seperti emas atau tungsten)

dengan plasmid DNA, dimana terjadi aselerasi dengan tekanan udara dan tembakan

jaringan sel pada cawan petri. Microprojectiles yang masuk ke dalam sel, akan melepaskan

transgen dari permukaan partikel dan dapat memasukannya ke dalam DNA kromosom sel

tersebut (Gan, 1989).

Gambar 1. Ilustrasi dari transfer gen menggunakan metode

Gene Gun atau Particle Bombardement

Sumber: http://nptel.ac.in/courses/102103016/module3/lec24/2.html

Metode transformasi genetik secara langsung dengan microinjection yang

menyuntikan DNA langsung ke dalam protoplas tanaman atau sel (khusus ke dalam inti

atau sitoplasma) dengan menggunakan jarum kaca kapiler atau micropipettes.

Metode transformasi genetik secara langsung dengan tenik elektroporsi umumnya

menggunakan protoplas tumbuhan karena dinding sel tumbuhan tebal sehingga akan

membatasi pergerakan makromolekul (Bates, 1999). Rangsangan listrik diberikan pada

suspensi protoplas dengan DNA yang ditempatkan di antara elektroda di dalam kuvet

elektroporasi. Tegangan tinggi yang diberikan oleh rangsangan arus pendek akan

merangsang pembentukan celah mikro sementara membran sel akan memungkinkan DNA

yang diinisiasi akan masuk ke dalam sel dan ke bagian inti.

Proses transformasi genetik secara tidak langsung menggunakan bakteri

Agrobacterium tumifaciens. Secara alami bakteri A. tumifaciens hanya dapat menginfeksi

tanaman dikotil, sehingga awalnya transformasi ini hanya terbatas pada tanaman dikotil,

namun seiring dengan perkembangan teknologi, penelitian menunjukan proses

transformasi menggunakan bakteri A. tumifaciens dapat dilakukan untuk tanaman

monokotil (Slamet-Loedin, 1994). Bakteri ini memiliki kemampuan untuk memindahkan

DNA ke dalam sel tanaman karena bakteri ini merupakan bakteri fitopatogen. Bakteri A.

tumifaciens memiliki plasmid single copy yang berukuran besar dan disebut Plasmid Ti

atau tumour inducing. Sebagian dari DNA plasmid yaitu tDNA atau DNA transfer akan

dipindahkan ke dalam sel tanaman dan akan masuk ke dalam genom tanaman yang

terinfeksi. Gen-gen tersebut selanjutnya dapat diekspresikan oleh sel tanaman, contohnya

seperi sintesis auksin atau sitokinin. Sesuai istilah yang digunakan yaitu tumour inducing,

jaringan tanaman yang terinfeksi akan mengalami proliferasi sel (fase sel saat mengalami

pengulangan siklus sel tanpa hambatan) yang tak terkendali dan menghasilkan jaringan

tumor. Pertumbuhan tumor ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tumbuhan secara in

vitro (Day and Lichtenstein, 1992; White, 1993; Heldt, 1999).

Keunggulan metode transformasi secara langsung adalah dapat digunakan kepada

berbagai jenis tanaman dan kekurangan metode transformasi secara langsung adalah gen

yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan yang banyak sehingga peluang terjadi

penyusunan kembali gen tersebut menjadi besar. Sedangkan keunggulan metode

transformasi secara tidak langsung adalah tidak membutuhkan peralatan khusus karena

dapat dilakukan dalam laboratorium yang sederhana dan sisipan gen tunggal berpeluang

lebih tinggi dibandingkan transformasi langsung sehingga stabilitas ekspresi gen lebih

tinggi (Hansen and Chilton, 1996).

I.2 Fungsi Tranformasi Genetik

Fungsi transformasi genetik tergantung terhadap peruntukannya, namun secara

umum transformasi genetic memiliki fungsi untuk menghasilkan sifat baru seperti

ketahanan hama, penyakit, atau herbisida, untuk meningkatkan kandungan metabolit

sekunder, untuk meningkatkan daya simpan, dan untuk menghilangkan sifat-sifat yang

tidak diinginkan.

I.3 Kompenen yang Terlibat dalam Transformasi Genetik

Kompenen yang terlibat dalam proses terjadinya transformasi genetik secara umum

adalah gen-gen asing yang telah diisolasi seperti tanaman, virus, bakteri, atau hewan;

genom baru yang ingin disisipi dengan gen asing tersebut, dan agen perantara untuk

transformasi genetic secara tidak langsung. Salah satu contoh agen perantara yang biasa

digunakan adalah A. tumifaciens. Sampai saat ini, transformasi genetik sudah berkembang

dengan pesat, organisme-organisme yang telah menjadi target transformasi genetik adalah

tanaman, bakteri, dan hewan.

I.4 Mekanisme Transformasi Genetik

Secara umum, mekanisme transformasi genetik secara keutuhan dibagi menjadi 4

buah tahapan besar yaitu insersi, integrasi, ekspresi, dan pewarisan sifat baru. Ketiga buah

tahapan lanjutan ketika pemasukan gen asing telah dilakukan. Berikut ini adalah penjelasan

mengenai mekanisme transformasi genetik bagian inisiasi secara langsung atau tidak

langsung melalui contoh.

Contoh Transformasi Genetik secara Langsung

Salah satu contoh tranformasi genetic secara langsung adalah SNA transformasi

pada bakteri E.coli. Membran sel E.coli mempunyai ratusan pori-poro yang disebut dengan

zona adisi. Membran sel bakteri tersusun dari molekul-molekul negatif karena adanya

fosfat. Walaupun zona adisi cukup besar untuk loop DNA yang akan masuk, namun karena

loop DNA juga bermuatan negative, maka akan terjadi tolakan. Penggunaan larutan CaCl

atau kalsium klorida sebagai medium akan menyumbangkan ion kalsiumnya yang

bermuatan positif, sehingga akan membuat keadaan menjadi netral. Dengan melakukan

penurunan suhu, maka molekul lipid menjadi lebih diam dan keadaan akan menjadi lebih

stabil sehingga terbentuk seperti suatu perisai. Dengan penaikan suhu secara mendadak

atau yang disebut dengan heat shock, maka akan terjadi ketidakseimbangan suhu di kedua

buah sisi membrane, sehingga loop DNA dapat masuk melalui zona adisi.

Gambar 2. Keadaan dimana terjadi ketidakseimbangan suhu bagian dalam dan luar membran

sel dan loop DNA masuk melalui zona adisi

Sumber: http://shomusbiology.weebly.com/

Contoh Transformasi Genetik secara Tidak Langsung

Proses transformasi genetic secara tidak langsung menggunakan bakteri A.

tumifaciens yang merupakan agen perantara. Gen DNA asing yang ingin dimasukan di

dalam genom yang ingin diubah informasi genetiknya, sebelumnya disisipkan ke dalam

plasmid dari A. tumifaciens atau yang disebut plasmid Ti melalui serangkaian tahap yang

telah dijelaskan sebelumnya. Selanjutnya rangkaian tahapan diatas dilanjutkan dengan

proses infeksi bakteri ke dalam sel tanaman meliputi 3 tahapan besar sebagai berikut:

1. Pengenalan A. tumifaciens dengan molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman

yang terinfeksi, lalu secara kemotaksis bakteri akan bergerak dan menempel pada sel

tanaman.

2. Gen-gen pada plasmid Ti akan merespon sinyal yang dihasilkan oleh tanaman dan akan

menginduksi ekspresi gen-gen vir untuk memotong rantai tungga tDNA dan

memindahkannya ke dalam inti sel tanaman.

3. tDNA akan terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen pada tDNA diekspresikan

dalam sel tanaman.

Gambar 3. Proses infeksi alami dari A. tumefaciens

Sumber:http://www.biotek.lipi.go.id/images/stories/biotrends/vol4no1/agrobacterium2630.pdf

II. Pemurnian Plasmid

II.1 Prinsip Dasar Pemurnian Plasmid

Inti dari pemurnian plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga

semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA

ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian

dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang dapat digunakan

untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,

alkaline lysis, dan enzimatic digestion.

II.2 Fungsi Pemurnian Plasmid

Plasmid telah diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan untuk

digunakan sebagai vektor kloning (Gregory & Funnell 2004). Agar dapat digunakan

sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria, yaitu berukuran kecil,

relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number), memiliki gen penanda

seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs pemotongan enzim restriksi untu

memudahkan penyisipan DNA ke dalam vektor plasmid (Gregory & Funnell 2004).

Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan.

Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan

memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan

untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu

dinding sel dan beberapa protein (Sambrook & Russell 2006).

II.3 Komponen yang Terlibat dalam Transformasi Genetik

Komponen yang terlibat dalam proses terjadinya pemurnian plasmid secara umum

adalah DNA Plasmid, DNA Kromosom dan zat zat pengotor yaitu dinding sel , protein

juga organel lainnya.

Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom

dan bisa ditemukan pada sel hidup (Royston 1972). Di dalam satu sel, dapat ditemukan

lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak

mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut (Royston 1972).

Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada

keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA

plasmid dapat dibuang (Royston 1972). Berdasarkan fungsinya plasmid dapat

dikelompokkan menjadi:

Fertility- F plasmids

Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses

konjugasi yang juga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen.

Resistance- R plasmids.

Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor

pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.

Plasmid penyandi bacteriocins.

Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode

protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins yang merupakan

senyawa untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain, contohnya adalah plasmid Col

pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.

Degradative plasmids.

Merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi yang tidak umum seperti toluene.

Virulence plasmids.

Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut pathogen.

Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel dapat dibedakan menjadi:

Low copy number plasmid: dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau

beberapa plasmid saja.

High copy number: dimana dalam satu sel mengandung banayak plasmid hingga

ribuan, contohnya bakteri E.coli.

Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain:

Supercoiled (covalently closed-circular): DNA plasmid berbentuk sirkular dengan

bentuk rantai yang terpilin.

Relaxed circular: kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.

Supercoiled denature: kedua ujung DNA menyatu tetapi pasangan basanya tidak

sempurna.

Nicked open circular: rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja.

II.4 Mekanisme Pemurnian Plasmid

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap

kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu

memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat

pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel),

membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri

atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan

membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi di

dalamnya.

Gambar 4. Tahapan dalam pemurnian Plasmid

Sumber: https://www.acgtinc.com

Beberapa cara untuk menghilangkan DNA genom pada pemurnian DNA plasmid

telah banyak dikembangkan. Cara pemisahan DNA plasmid dengan DNA genom pada

prinsipnya berdasarkan ukuran dan konformasinya. Ukuran DNA plasmid sangat kecil bila

dibandingkan dengan ukuran DNA genom. Ukuran DNA plasmid yang terbesar, kurang

dari 8% ukuran DNA genom bakteri, dan sebagaian besar DNA plasmid berukuran lebih

kecil daripada ukuran tersebut. Dengan demikian teknik yang dapat memisahkan molekul

DNA yang kecil dengan DNA yang berukuran besar akan sangat efektif untuk memisahkan

DNA plasmid (Radji, M., 2011). Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan

DNA plasmid dengan DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient

densitas. Teknik sentrifugasi gradient densitas etidium bromida sesium klorida, yang

berkecepatan tinggi, merupakan cara yang sangat efektif untuk memperoleh DNA plasmid

murni. Dengan teknik tersebut DNA plasmid akan membentuk pita pada titik tertentu yang

terpisah dengan pita genom, dimana protein akan mengapung pada permukaan gradient,

dan RNA akan berada pada dasar tabung. Posisi pita - pita DNA dalam tabung bisa terlihat

melalui pendaran etidium bromide yang disinari dengan ultra violet. DNA plasmid dapat

diambil dengan menusukkan jarum suntik pada dinding tabung dimana pita DNA plasmid

terlihat dan menyedotnya. Sedangkan etidium bromide yang terikat pada DNA plasmid

dapat diekstraksi dengan n-butanol, dan CsCl dihilangkan dengan cara dialisis. Teknik

pemisahan ini dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat digunakan sebagai

vector kloning. (Radji, M., 2011)

III. Sekuensing

III.1Prinsip Dasar Sekuensing

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA

yang relatif pendek. Pengurutan atau sequencing asam nukleat memungkinkan kita

mengetahui kode genetic dari molekul DNA. DNA sequencing menggunakan metode

PCR ( Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan

urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan ( template) untuk kemudian

diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR,

namun ada penambahan beberapa pereaksi t ertentu. Proses ini dinamakan cycle

sequencing. Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang)

seperti PCR

ddNTPs ( dideoxy-Nucleotide Triphosphate) a dalah modifikasi dari d NTPs dengan

menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa.

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan

dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA

cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi

akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3 -OH yang seharusnya bereaksi

dengan gugus 5 -fosfat dNTP berikutnya membentuk ikatan fosfodiester. Pada akhir cycle

sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi.

Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-

pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.

Prinsip Dasar Sekuensing Sanger

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim

DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah

kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya

untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus

hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi

nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak

dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen

klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau

terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa

yang dibawa oleh molekul ddNTP. Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA

menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat

reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada

masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang

polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang

ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang

ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai

contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA

dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3nya.

III.2 Fungsi Sanger Sequencing

Fungsi dari metode sequencing sanger adalah untuk menentukan identitas maupun

fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan

sekuens DNA lain yang sudah diketahui.

III.3 Kompenen yang Terlibat dalam Sanger Sequencing

Kompenen yang terlibat dalam proses terjadinya Sanger Sequencing secara umum

adalah template DNA yang akan disekuensing, oligonucleotide primer yang dilabeli,

DNA polymerase, empat deoxynucleoside triphosphates: dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dan

empat dideoxy nucleoside triphosphates (nucleoside triphosphates lacking both 2- and 3-

hydroxy groups): ddATP, ddGTP, ddCTP, dd.

III.4 Mekanisme Sanger Sequencing

Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975,

yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang

masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang

ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang

ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.

Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan

pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah.

Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai

dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer

yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer

yang dilabel melainkan dNTP.

Gambar 5. Prinsip Sanger Method dengan primer labelling

Sumber: http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna /

Dye primer dengan label yang berbeda

Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1

lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi

cycle sequencing. Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat

dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur

electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara

sebelumnya.

Gambar 6. One Cycle of Dye Primer Cycle Sequencing

Sumber: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-

sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/

Dye terminators sequencing

Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas

menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda

untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing

dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja.

Sangat simple dan cepat. Setiap empat terminator dideoxy (ddNTP) dipasangkan dengan

dye fluoresens yang berbeda. Pertumbuhan rantai dibatasi sekaligusdan ditandai dengan

dye yang terhubung dengan basa.

Gambar 7. One Cycle of Dye Terminator Cycle Sequencing

Sumber: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-

sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/

Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan

fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat

dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga

96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah

sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.

Automated DNA sequencing

Pada automated DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak digunakan dan

ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam satu tabung tunggal. Hal Ini dikarena pada tiap

ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda. Sehingga warna yang ada pada

tiap fragmen yang disintesa berhubungan dengan warna yang berikatan pada

dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen. Isi dari satu

tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada gel dan dielektroforesis.

Gambar 8. Komponen autometed sequencing

Sumber: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/dnasequencing.pdf

Gambar 9. Hasil dari automated DNA sequencing

Sumber: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/dnasequencing.pdf

III.5 Metode Maxam-Gilbert

Metode ini dikembangkan oleh A.M Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1987.

Prinsip dari metode ini adalah DNA yang akan diurutkan terlebih dahulu harus diberi label

di salah satu ujung saja. Hal ini dilakukan dengan pemberian enzim kinase dengan 32P

ATP di ujung 5. Bahan kimia yang digunakan akan merusak DNA di masing-masing

empat basa nukleotida dalam kondisi hanya satu rantai yang rusak yang dibuat. DNA yang

dimodifikasi kemudian dapat dipecah oleh piperidin panas (CH2)5NH. Lalu empat tabung

disiapkan yang masing masing berisi Adenin, Timin, Guanin, dan Sitosin. Fragmen dalam

empat reaksi yang dielektroforesis berdampingan pada denaturasi gel akrilamida untuk

pemisahan ukuran. Untuk memvisualisasikan fragmen, gel diberi film sinar-X untuk

autoradiografi yang menghasilkan serangkaian band gelap yang masing-masing

menunjukkan lokasi molekul DNA radiolabeled identik. Dari keberadaan dan tidak

adanya fragmen tertentu urutan mungkin disimpulkan. Setelah elektroforesis gel dan

autoradiografi hanya fragmen yang memiliki gugus 5 terminal 32P grup fosfat muncul

pada gel pada posisi dasar dimodifikasi.

Gambar 10. Prinsip prosedur Maxam-Gilbert.

Gambar menunjukan hanya untuk satu basa

Adenin

Sumber:http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine

/molecular/index_14.htm

Gambar 11. Pembacaan sekuens pada gel

Sumber:http://wiki.biomine.skelleftea.se/

biomine/molecular/index_14.htm

IV. Elektroforesis Gel

IV.1 Prinsip dasar Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik pemisahan (dan kadang pemurnian)

asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan atau bentuk permukaannya dengan

memanfaatkan perpindahan atau migrasi molekul bermuatan dalam suatu medan listrik.

Tujuaan dari elektroforesis gel antara lain:

a) Mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel DNA atau RNA.

b) Digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA

c) Dalam bidang kesehatan , elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran dan

jumlah basa dalam suatu sekuen DNA tertentu. Ketika molekul bermuatan

ditempatkan pada medan listrik, maka molekul tersebut akan berpindah ke kutub

negatif atau positif, tergantung dengan muatnnya. Berbeda dengan protein yang bisa

bermuatan positif dan negatif, asam nukleat bermuatan negatif yang berasal dari

oodfatnya, sehingga asam nukleat akan berpindah ke anoda (kutub positif).

IV.2 Komponen yang Terlibat dalam Elektroforesis Gel

Komponen yang terlibat dalam elektroforesis gel adalah sebagai berikut:

Gen / asam nukleatAsam nukleat yang akan dianalisis diambil dari organisme.

Enzim restriksi: merupakan enzim yang digunakan untuk memotong-motong asam

nukleat menjadi lebih kecil sebelum dielektroforesis.

Gel: suatu lembaran tipis yang digunakan sebagai medium elektroforesis. Gel

dicampur dengan buffer yang menyediakan ion untuk membawa aliran dan untuk

menjaga pH tetap stabil. Gel dapat dibuat dari agarosa ataupun poliakrilamid.

Gel agarosa: merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut, biasa

digunakan dengan konsentrasi 0,5 2%, semakin banyak konsentrasinya, semakin

kenyal gel tersebut. Gel agarosa memiliki rentang separasi yang luas, tetapi memiliki

daya pemecahan rendah.

Gel poliakrilamid: merupakan polimer silang akrilamid, penggunaan untuk gel

dengan konsentrasi 3,5 20%. Gel poliakrilamid lebih sulit dibuat daripada gel

agarose. Poliakrilamid tidak beracun namun dalam pembuatan gel tersebut harus

menggunakan masker dan sarung tangan agar terhindar dari akrilamid

bebas.Poliakrilamid memiliki rentang separasi yang rendah, namun memiliki

kekuatan pemecahan yang sangat tinggi. Poliakrilamid gel lebih sering digunakan

untuk elektroforesis protein.

Sample combs: Merupakan suatu cetakan untuk membuat sumur sampel dalam gel

Buffer Elektroforesis: untuk menjaga kestabilan pH dan sebagai sumber ion, biasanya

Tris-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).

Loading Buffer: mengandung sesuatu yang padat (contoh gliserol) agar sampel jatuh

ke sumur gel.

Alat elektroforesis: untuk proses elektroforesis, terdiri atas alat pencetak gel dan

sumber listrik

Bahan pewarna: Staining atau pewarnaan dapat menggunakan methylene blue atau

etidhium bromide. Tujuan dari staining ini adalah untuk memudahkan pengamatan

hasil elektroforesis.

Transiluminator (kotak UV): untuk memvisualisasikan DNA yang telah

dielektroforesis.

Kurva standar: untuk membantu menganalisis hasil akhir elektroforesis.

IV.3 Mekanisme Proses Elektroforesis

Mekanisme proses elektroforesis gel meliputi:

Persiapan Sampel

Sampel gen disiapkan kemudian ditambahkan enzim restriksi kedalamnya,

lalu dipanaskan pada suhu 37 selama satu jam. Pemanasan ini berfungsi untuk

mengaktifkan enzim agar bekerja secara optimal dalam menjalankan fungsinya untuk

memotong gen.

Gambar 12. Proses menyiapkan sampel

Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4

Pembuatan gel

Gel yang digunakan adalah agarosa. Gel agarosa dicampur dengan loading

buffer kemudian dipanaskan. Campuran didinginkan kemudian dimasukkan kedalam

cetakan elektroforesis gel. Setelah gel mengeras, cetakan diangkat dan terbentuklah

gel yang siap digunakan.

Gambar 13. Proses pembuatan gel agarose


Penempatan sampel gen

Sampel - sampel gen disuntikkan ke dalam masing masing sumur sampel.

Gambar 14. Penempatan sampel


Proses elektroforesis

Proses ini memanfaatkan energi listrik sehingga langkah awalnya adalah

mengkoneksikan alat elektroforesis ke sumber listrik kemudian menyalakan power

supply. Saat terjadi elektroforesis, DNA yang diletakkan di kutub negatif (sumur

sampel) akan berpindah ke kutub positif, bukti bahwa elektroforesis bekerja adalah

adanya gelembung pada elektroda.

Gambar 15. Proses elektroforesis


Pewarnaan atau staining

Pewarnaan dilakukan dengan cara memberi methylene blue pada hasil akhir

elektroforesis, kemudian mengalirkan air. Setelah itu akan terbentuk hasil akhir yaitu

sampel yang berwarna.

Gambar 16. Proses staining


Visualisasi menggunakan UV Transiluminator

Sampel hasil elektroforesis yang telah diwarnai ditempatkan di bawah

transiluminator UV, dengan demikian sampel dapat tervisualisasi dan dapat

dianalisis. Proses visualisasi harus segera dilakukan setelah proses elektroforesis dan

pewarnaan karena DNA dapat berdifusi ke dalam gel. Menganalisis hasil akhir

elektroforesis dengan cara membandingkannya dengan kurva standar.

Gambar 17. Hasil akhir elektroforesis gel


Gambar 18. Kurva Standar


Hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator adalah seperti gambar di

atas. Sampel tersebut kemudian dianalisis menggunakan kurva standar agar diketahui

berat molekulnya. Semakin jauh perpindahan fragmen DNA, maka berat molekulnya

semakin kecil, hal ini dikarenakan pasangan basanya juga sedikit.

Jika dilakukan plot jarak perpindahan DNA dari sumur terhadap log10 atau berat

molekul / jumlah pasangan basa, maka hubungan linear seperti gambar di atas akan

tampak.

V. Kesimpulan

Salah satu contoh manipulasi gen adalah proses transformasi gen dan pemurnian

plasmid. Transformasi gen dilakukan secara langsung (menggunakan heat shock, gene gun,

microinjection, elektroporasi) dan tidak langsung (menggunakan vektor perantara). Untuk

melakukan transformasi ini diperlukan plasmid sebagai vektor kloning. Maka, plasmid

dimurnikan dengan menghacurkan membran sel sehingga didapatkan DNA kromosomal dan

DNA plasmid. Proses transformasi gen ini perlu diawasi sehingga diperlukan elektroforesis

gel sebagai metode analisis dan persiapan pemisahan fragmen fragmen DNA berdasarkan

berat molekulnya. Selain itu, untuk mengetahui sifat sifat dan kode genetik dari DNA

sebelum dan sesudah dilakuakn manipulasi gen, diperlukan sequencing agar diketahui urutan

basa DNA tersebut.

VI. Daftar Pustaka

Anonym.2010.Plant Transformation Using Particle Bombardment.

http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-

bombardment (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 12.56 WIB)

Anonim.2014.Bacterial Transformation: The Heat Shock Method.

http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-

shock-method (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 13.27 WIB)

Gan C. (1989) Gene Gun Accelerates DNA-Coated Particles To Transform Intact Cells. The

Scientist 3(18):25.

Manuhara, Y. Sri Wulan.2006.Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman untuk

Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia.

http://s2biologi.fst.unair.ac.id/publikasidosen/Makalah%20Seminar%20Nasional%20

Biodiversitas.pdf (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 15.03 WIB)

Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA. Amsterdam

: Academic Press.

Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta :Erlangga.

Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. Molecular Cell

Biology. Wh Freeman Company

Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta:

Universitas Negeri Yogyakarta.

Agarose Gel Electrophoresis of DNA.

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html (Diakses

pada tanggal 12 September 2014 pukul 23.10 WIB)

Biological sciences Initiative. Gel Electrophoresis [pdf]. University of Colorado. Tersedia

pada http://www.colorado.edu/outreach/BSI/pdfs/gel_electrophoresis.pdf

Documents

Tugas Rekayasa Genetika FG-D