Mutagenesis Evania Hutasoit (1206248483) Fhani Melliana (1206212413)

Haqqyana (1206262090) Retno Ulfiah (1206262102)

Sharima Umaya (1206212325)

Kelompok HG-7

OUTLINE PRESENTASIPengertian dan Jenis Mutagenesis Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Kelebihan Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Mencari Kode Basa Nitrogen Apoptin Menentukan Letak Theorin 108 Membuat Primer PCR Sesuai Jenis Mutasi Pelaksanaan Proses PCR Transformasi Plasmid ke Host Screening dari Hasil Transformasi Permasalahan-Permasalahan yang Mungkin Terjadi dalam Penggunaan Site

Directed Mutagenesis Quality Control Penggunaan Site Directed Mutagenesis

PROBLEM STATEMENTTheorin 108 sangat

berpengaruh pada fungsi apopin sebagai penginduksi kematian sel pada sel kanker. Untuk mengklarifikasi fungsi Theorin 108, mutasi apoptin!

e

PENGERTIAN & JENIS

REKAYASA GENETIKA

MUTAGENESIS

MUTAGENESIS/mjutdnss/

Perubahan informasi genetik pada suatu organisme yang disebabkan oleh mutagen fisika dan kimia

JENIS MUTAGENESISDirected

Oligonuclotide Oligonucleotide directed with Plasmid DNA PCR Amplified Oligonucleotide

Random Directed evolution or molecular breeding

Insertional Signature tagged Virus

PCR Site Directed Mismatched 5Add on Cassette

our focus

SITE DIRECTED MUTAGENESIS

Mutasi yang terjadi pada lokasi spesifik suatu untai DNA

Merupakan mutagenesis in vitro Menggunakan primer oligonuklei2da yang dimodikasi khusus

METODE YANG DIPILIH UNTUK MEMUTASI THEORIN 108 DARI GEN APOPTIN ADALAH

Q5 SITE-DIRECTED MUTAGENESIS

Q5 SITE-DIRECTED

REKAYASA GENETIKA

MUTAGENESIS KIT

Q5 Site-Directed Mutagenesis KitDESCRIPTION

non-overlapping primers (1 mutagenic and 1 silent) merupakan turunan dari

QuickChange

Mampu melakukan insersi dan delesi panjang dapat diaplikasikan secara luas dalam percobaan laboratorium

Modifikasi standar basa tunggal serta delesi dan adisi dengan panjang berapapun, termasuk adisi sinyal lokalisasi nuklir ke protein terkloning

Q5 Hot Start High-Fidelity Polymerase

Q5 Site-Directed Mutagenesis KitKit Components:

Disimpan pada suhu (C)

Konsentrasi

Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix -20 2X

KLD Enzyme Mix -20 10X

KLD Reac2on Buer -20 2X

Control SDM Primer Mix -20 10 M

Control SDM Plasmid -20 5 g/ml

NEB 5-alpha Competent E. coli (High Eciency) -80

pUC19 Transforma2on Control Plasmid -20 0.05 ng/l

SOC Outgrowth Medium 4

KELEBIHAN

REKAYASA GENETIKA

Q5 SITE-DIRECTEDMUTAGENESIS

1 DESAIN PRIMERTUMPANG TINDIH

TIDAK

kuat amplifikasi eksponensial menghasilkan persentase yang tinggi dari mutasi yang diinginkan dari berbagai template

2 LIGASI INTRAMOLEKUL DAN TRANSFORMASI MENJADI NEB EFISIENSI TINGGI YANG KOMPETEN MENGHASILKAN SEL DALAM KOLONI TINGGI

3

Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase mengurangi waktu screening

TINGKAT KESALAHAN

SANGAT RENDAH

4

SUHU KAMAR

HOT START POLIMERASE MEMUNGKINKAN SET UP REAKSI PADA

5 REDUKSI DPNL MEMUNGKINKAN BERBAGAI KONSENTRASI TEMPLATE AWAL

6 PENGGUNAAN PRIMER STANDAR MENGHILANGKAN BIAYA TAMBAHAN DARI OLIGOS TERFOSFORILASI OLIGOS YANG DIMURNIKAN

7 PCR MASTER MIX MUDAH DIGUNAKAN DAN MULTI-ENZIM KLD CAMPURAN YANG UNIK MENAWARKAN KENYAMANAN DAN KUALITAS

8 LANGKAH PERLAKUAN YANG CEPAT DAN LANGSUNG DILAKUKAN PADA SUHU KAMAR DALAM 5 MENIT

MENCARI KODE BASA NITROGEN

REKAYASA GENETIKA

APOPTIN

Chicken anemia virus (CAV), merupakan virus non-envelopedyang resitant terhadap inaktivasi termal dan perlakuan oleh pelarut lipid (von Bulow and Schat, 1997). CAV merupakan agen kausatif dari penyakit anemia pada ayam, penyakit ini menyebabkan anemia aplastik, atropi pada organ getah bening, dan imunosupresi pada ayam.

Vir us ini mentranskripsi dan mentranslasi protein protein viral, VP1, VP2, dan VP3, yang masing masing dikodekan oleh ORF3, ORF1, dan ORF2 dari genom CAV. Protein VP3, terdiri atas susunan 121 asam amino atau dengan kata lain tersusun oleh 363 basa nukleotida.

MENCARI GEN APOPTIN

Amplifikasi CAV dengan kultur virus Isolasi Virus

Kultur CAV Subkultur CAV

Isolasi DNA/Plasmid dengan metode fenol - kloroform

Isolasi genom CAV Alat-alat: Larutan NaAc 3 M Larutan 100% EtOH Larutan etanol Aquades Sampel MDCC-MSB1 Larutan fenol Kloroform Bahan-bahan : Tabung reaksi Alat pendingin Alat sentrifugasi Labu erlenmeyer

TAHAPAN MENCARI KODE APOPTIN

TAHAPAN ISOLASI CAV Menambahkan larutan fenol jenuh dengan volume yang sama

seperti sampel.

Mengocok sampel selama 3 menit kemudian melakukan sentrifugasi pada 14000 rpm selama (5 menit)

Fenol akan terpisah pada bagian bawah tabung. Lapisan atas dipisahkan dan dicampurkan dengan kloroform pada volume yang sama dengan sampel.

Sampel disentrifugasi kembali pada 14000 rpm (5 menit). Supernatan dipisahkan.

Menambahkan larutan NaAc 3 M pada sampel sebanyak 1/10 dari volume sampel. Dan kemudian menambahkan juga 100% EtOH sebanyak 2 kali volume sampel.

TAHAPAN ISOLASI CAV

Setelah itu pelet dibiarkan kering sehingga tidak ada cairan lagi didalam sampel.

Pelet kemudian disuspensikan didalam air. Sampel tersebut mengandung DNA virus CAV yang murni untuk kemudian dilakukan tahapan berikutnya.

Setelah mengocok sampel selama beberapa detik, sampel didinginkan pada suhu -20oC selama 30 menit.

Sentrifugasi pada 14000 rpm (5 menit). Bila tidak terbentuk pelet pada sampel lakukan ulang sentrifugasi.

Memisahkan pelet dari supernatan dengan pipet perlahan. Menambahkan etanol untuk mengendapkan DNA (DNA bersifat yang sangat

polar struktur fosfat).

MENENTUKAN LETAK

REKAYASA GENETIKA

THEORIN 108

MENENTUKAN LETAK THEORIN 108

Terdapat 121 asam amino penyusun gen apoptin. Melalui urutan tersebut kita menentukan posisi Threonin 108 dengan menghitung dari belakang susunan asam amino tersebut.

1 MNALQEDTPP GPSTVFRPPT SSRPLETPHC REIRIGIAGI 41 TITLSLCGCA NARAPTLRSA ADNSESTGF KNVPDLRTDQ 81 PKPPSKKRSC DPSEYRVSEL KESLITTTPS RPRTARRCIR L 121 Threonin 108

Menerjemahkan asam amino ke susunan basa menggunakan converter pada : http://in-silico.net/tools/biology/sequence_conversion

Menjadi

SETELAH DIPEROLEH SUSUNAN BASA THEORIN 108 (ACG) MAKA THEORIN 108 DIMUTASI MENJADI ASAM AMINO LAIN DENGAN MENGUBAH POSISI BASA 322 MENJADI G, DAN URUTANNYA MENJADI GCG

Threonin

(ACG) Alanin

(GCG)

Substitusi Klarifikasi

GCG ADALAH ASAM AMINO ALANIN, MAKA THEORIN DISUBSTITUSI OLEH ALANIN. PERUBAHAN 1 BASA DIMAKSUDKAN SUPAYA TIDAK TERJADI PERUBAHAN SIGNIFIKAN DAN UNTUK MENGKLARIFIKASI FUNGSI THEORIN 108 PADA APOPTIN DALAM INDUKSI SEL KANKER. OLEH KARENA ITU, THEORIN DIMUTASI DENGAN ASAM AMINO LAIN

MEMBUAT PRIMER

REKAYASA GENETIKA

PROSES PCRSESUAI JENIS MUTASI

MENDESAIN PRIMERDesain primer yang dipilih memiliki beberapa parameter yang harus diikuti untuk

menghasilkan primer yang cocok dan paling optimal dalam melakukan quick

change site directed mutagenesis.

Kedua primer mutagen harus mengandung mutasi yang diinginkan dan anneal ke

sekuen yang sama pada untai yang komplemen pada

plasmid.

Panjang primer harus sekitar 25 sampai 45 basa, dengan suhu leleh (Tm) 780C. Primer dengan panjang lebih dari 45 basa dapat digunakan namun dapat meningkatkan kemungkinan terbentuknya struktur sekunder yang akan mempengaruhi efisiensi reaksi mutagenesis. Persamaan yang digunakan untuk menentukan Tm primer.

Tm = 81,5 + 0,41(%GC) 675/N - %mismatch (1)

N adalah panjang basa primer

Nilai %GC dan %mismatch adalah bilangan bulat

Untuk perhitungan Tm primer untuk proses yang melibatkan delesi dan insersi

menggunakan persamaan yang telah dimodifikasi berikut ini.

Tm = 81,5 + 0,41(%GC)-675/N (2)

Dimana N tidak melibatkan basa yang akan diinsersi ataupun didelesi

Gen apoptin akan di-mutagenesis dengan menggunakan Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit dari New England Biolabs. Pada sistem tersebut DNA yang akan dimutasi diperlukan dalam bentuk plasmid. Karena itu, tahapan awal sebelum dilakukan mutagenesis adalah

kloning gen apoptin ke dalam plasmid vektor.

MODIFIKASI GEN APOPTINATGAACGCTC TCCAAGAAGA TACTCCACCC GGACCATCAA CGGTGTTCAG GCCACCAACAAGTTCACGGC

CGTTGGAAAC CCCTCACTGC AGAGAGATCC GGATTGGTAT CGCTGGAATTACAATCACTC TATCGCTGTG

TGGCTGCGCG AATGCTCGCG CTCCCACGCT AAGATCTGCAACTGCGGACA ATTCAGAAAG CACTGGTTTC

AAGAATGTGC CGGACTTGAG GACCGATCAACCCAAGCCTC CCTCGAAGAA GCGATCCTGC GACCCCTCCG

AGTACAGGGT AAGCGAGCTAAAAGAAAGCT TGATTACCAC TACTCCCAGC CGACCCCGAA CCGCAAGAAG

GTGTATAAGACTGTAA

Modifikasi gen apoptin akan dilakukan dengan cara PCR.

Oleh karena itu, perlu dilakukan desain primer untuk memperbanyak gen apoptin serta memperpanjang gen tersebut dengan situs enzim restriksi.

(BamI apoptin HindII)

PRIMER YANG AKAN DIGUNAKAN DALAM GEN APOPTIN

Forward : 5-GGATCCATGCGCTGCAGGAGGATACC-3

Reverse : 5-AAGCTTTTACAGTCTTATACACCTT-3

TRANSFORMASI GEN DAN VEKTOR KE DALAM HOST CELL E. COLI

Vektor yang telah disisipkan gen apoptin akan dimasukkan ke sel host E.Coli. Teknik transformasi yang digunakan adalah elektroporasi karena DNA plasmid yang dibutuhkan untuk transformasi tidak perlu terlalu banyak.

Elektroporasi dilakukan dengan cara membuat perbedaan potensial (kejutan). Perbedaan potensial biasanya dibuat dengan charging kapasitor kemudian discharging melintasi elektroda.

Perbedaan potensial menyebabkan pembentukan pori pada membran sel.Pori tersebut membuat struktur membran sel menjadi permeable untuk proses pemindahan DNA menuju sitoplasma dalam sel.

SCREENING SEBELUM MENYISIPKAN GEN

Untuk seleksi klon rekombinan,

digunakan metode colony PCR.

Colony PCR adalah teknik untuk

mendeteksi ligasi yang sukses

dilakukan dalam vektor gen

kloning.

PERSIAPAN METODE COLONY PCR

Tabung PCR ditambahkan komponen PCR yaitu, buffer enzim Taq polimerase, dNTP mix, enzim Taq polimerase, primer reverse

dan primer forward.

Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR

dan memasuki tahap predenaturasi dengan suhu 95 oC

selama 5 menit.

PELAKSANAAN METODE COLONY PCR

Denaturasi 1 menit

pada 95 oC

Annealing selama 30 detik pada suhu 55 oC

Sintesis selama 2

menit pada 72 oC

Pasca sintesis pada 72 oC

selama 5 menit dan 15 oC selama 10

menit.

Hasil PCR dideteksi dengan

elektroforesis.

Siklus diulang 30 kali

MENYISIPKAN GEN APOPTIN KE DALAM VEKTOR

Gen apoptin dimasukkan kedalam MCS pada vektor yang telah disesuai dengan metode Q5 Site Directed Mutagenesis yaitu pUC19. Vertor ini telah disediakan oleh perusahaan penyedia Q5 Site Directed Mutagenesis.

Gen apoptin dimasukkan kedalam daerah restriksi diantara EcoR1 dan BamH1. Pada daerah EcoR1 akan dimasukkan ujung N Terminal, sedangkan pada daerah BamH1 dimasukkan ujung C Terminal dari gen apoptin.

Gen apoptin yang disisipkan adalah gen apoptin yang belum dimutasi, hal ini karena dengan menggunakan metode Q5 site directed mutagenesis dibutuhkan plasmid yang sudah tersisipi gen apoptin yang nantinya akan di PCR dengan primer yang sudah didesain dengan jenis mutasi yang diinginkan.

Pemilihan daerah EcoR1 dan BamH1 karena ketersediaan enzim restriksi yang dijual dan kedua daerah restriksi ini menghasilkan sticky end sehingga akan meningkatkan kemungkinan adanya penyisipan yang sempurna.

Penyisipan dilakukan dengan metode cut and ligase.

PELAKSANAAN

REKAYASA GENETIKA

PROSES PCR

BAHAN YANG DIGUNAKAN UNTUK PROSES PCR

Q5 hot start high fidelity 2X master

mix 12,5 L dengan konsentrasi 1X

10M forward primer 1,25L

dengan konsentrasi 0,5M

10M reverse primer 1,25L

dengan konsentrasi 0,5M

Template DNA ( 1 25 ng/L ) 1L

dengan konsentrasi 1

25 ng

Nuclease free water

TAHAP PELAKSANAAN PCR

Initial Denaturation dengan suhu 980C selama 30 detik

25 Cycles dengan suhu 980C selama 10 detik, kemudian 50 720C selama 10 30 detik selanjutnya 720C selama 20

30 detik/kb

Final Extension dengan suhu 720C selama 2 menit

Hold dengan suhu 4 100C

KLD TREATMENT (KINASE, LIGASE, DPNI)

Bahan yang dibutuhkan:

Produk PCR 1L, 2X KLD Reaction Buffer sebanyak 5L dengan konsentrasi 1X, 10X KLD Enzyme Mix sebanyak 1L dengan konsentrasi 1X dan nuclease free water

sebanyak 3L

Semua bahan yang sudah ada kemudian dicampur dengan cara memipet naik dan

turun kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.

TRANSFORMASI

REKAYASA GENETIKA

PLASMID KEHOST

Menyiapkan tabung dengan NEB 5- dengan sel E. Coli kompeten dalam es

Menambahkan 5L dari campuran KLD pada tahap sebelumnya yang berisi sel

yang dicairkan

Pelan-pelan mengocok tabung 4-5 kali untuk

dicampurkan,

Meletakkan pada es selama 30 menit

Dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit

Melakukan heat shock pada suhu 420C selama 30 detik

Mencampur sel dengan mengocok tabung dan

membolak-balik

Melakukan inkubasi selama 370C selama 60 menit dengan pencocokan

(250 rpm)

Memipet 950L pada suhu ruang SOC dalam

campuran

TAHAPAN TRANSFORMASI

SELEKSI HASIL AKHIR SEBELUM SCREENING

Menyebar hasil akhir sebanyak 50-100L ke

dalam plate untuk menseleksi

Menginkubasi semalaman pada

suhu 370C

OPSIONAL Bisa juga dilakukan pengenceran dengan 10-40 untuk transformasi campuran di

SOC sebelum disebar di plate

TUJUAN Untuk menghindari keberadaan koloni yang terlalu dekat

SCREENING

REKAYASA GENETIKA

HASIL DARITRANSFORMASI

METODE SCREENING YANG DIPILIH SESUAI JENIS VEKTOR YANG

DIGUNAKAN, MENGGUNAKAN:

BLUE WHITE SCREENING

MENGAPA BLUE WHITE SCREENING?

Pemilihan ini dikarenakan vektor memiliki area LacZ

yang merupakan pengkode sintesis beta-

galaktosidase.

MENGAPA PROSES SCREENING DILAKUKAN?Screening ini baru membuktikan apakan tahapan penyisipan

dan transformasi berhasil atau tidak.

Untuk mengetahui apakah mutasi berhasil atau tidak dan adakah pengaruh keberadaan Threonin 108 pada aktivitas apoptosis maka perlu dilakukan langkah tambahan seperti

pengujian aktivitas apoptosis hasil mutasi pada sel tumor atau dengan melakukan sekuensing untuk mengetahui urutan basa

nitrogen baru.

Menebarkan sel pada plate LB (100 g/ml ampicillin,40 g/ml X-gal, 50 g/ml IPTG) yang

dijaga pada suhu ruangan

Membiarkan plate tersebut semalaman pada suhu 370C hingga ditumbuhi sel

Membiarkan plate pada suhu 300C selama 24 jam agar warna yang dihasilkan lebih terlihat

TAHAPAN SCREENING

PERMASALAHAN YANG MUNGKIN TERJADI DALAM

REKAYASA GENETIKA

PENGGUNAANSITE-DIRECTED MUTAGENESIS

PERMASALAHAN Koloni hasil

transformasi tidak ada atau sedikit

Hasil PCR tidak ada atau sedikit

Efisiensi mutageneis

rendah

False Positive

Plasmid yang dihasilkan tidak mengandung mutasi yang diinginkan

KOLONI YANG DIHASILKAN PROSES SANGAT MINIM

Memastikan primer yang digunakan murni Menggunakan annealing temperature Mengecek mutasi yang diinginkan pada primer

Mengecek primer

Visualisasi template DNA dengan gel agarosa

Memastikan hasil PCR yang murni

Hanya 1 l, jika terlalu banyak dapat mengurangi efisiensi transformasi

Produk PCR yang digunakan untuk reaksi

KLD

Kurang dari 5 l, jika lebih harus digunakan sebelum proses transformasi

Hasil reaksi KLD yang digunakan pada

transformasi

Menggunakan pipet yang berukuran sangat kecil, dan memasukkan pipet ke bawah lapisan mineral

Mineral tidak terlibat dalam transformasi ketika memipet DNA

yang sudah direaksikan dengan Dpn I

Menambahkan jumlah DNA yang telah direaksikan dengan enzim hingga 4l

Memas2kan cukupnya DNA mutan yang disintesis pada

proses transformasi

Sesuai dengan agen seleksi yang digunakan pada plates

Tanda yang terseleksi pada plasmid

Sel kompeten disimpan dalam suhu-80C Sel kompeten (E. Coli) telah disimpan dalam suhu rendah

Hasil transformasi dikatakan efisien jika mengandung 1 x 109 Colony Farming Units (CFU) per g.

Mengecek efisiensi trasnformasi sel kompeten

EFISIENSI MUTAGENESIS RENDAH

Dipengaruhi penggunaan thermal cyclers, oleh karena itu parameter-parameter yang mempengaruhi perlu diperhatikan untuk meningkatkan efisiensi mutagenesis dan mengontrol reaksi Memastikan agar plate dipersiapkan dengan benar, untuk blue-white screening plates diinkubasi pada suhu 30C selama 24 jam

Campuran dNTP harus dihindarkan dari proses freeze-thaw, siapkan single aliquot yang akan digunakan lalu disimpan pada suhu -20C

M u n c u l n y a s t r u k t u r sekunder yang dapat m e n g h i b i s i r e a k s i mutagenesis. Struktur sekunder tersebut dapat d i h i l angkan deng an meningkatkan annealing temperature hingga 65C

HASIL PCR TIDAK ADA ATAU SEDIKIT

Memastikan Ta (optimal

annealing temperature)

Memastikan waktu elongasi cukup untuk panjang

plasmid (10-20 detik per kb

plasmid)

Memastikan konsentrasi

akhir tiap primer 0.5 m

Memurnikan primer dengan

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(PAGE)

False Positives

Kualitas primer rendah Mengecek degradasi

gel akrilamid atau sintesis ulang primer

Pembuatan primer yang salah

Meningkatkan annealing temperature

hingga 68C

MUTASI YANG DIINGINKAN TIDAK ADA PADA PLASMID

Memastikan desain primer mutagenik sudah benar

Mengoptimasi kondisi PCR

Menggunakan sel kompeten yang didesain untuk mencegah adanya rekombinasi plasmid DNA

Menggunakan 1-25 ng template pada tahapan PCR

QUALITY CONTROL

REKAYASA GENETIKA

PENGGUNAANSITE-DIRECTED MUTAGENESIS

QUALITY CONTROL TRANSFORMERTM SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT

T r a n s f o r m e r S i t e - D i r e c t e d Mutagenesis Kit didesain untuk melangsungkan mutagenesis dengan metode site-directed pada rantai ganda DNA

Satu Kit terdiri dari 2 Box dengan konten sebagai berikut: Box 1: 200 l E. coli BMH 71-18 mutS Box 2: 150 l 10 X Annealing buffer 100 l 10 X Synthesis buffer 30 l T4 DNA polymerase 30 l T4 DNA ligase 20 l Nde I endonuclease 20 l pUC19M plasmid DNA

20 l Control Selection Primer (25mer) GAGTGCACCATGGGCGGTGTGAAAT

20 l Control Mutagenic Primer (22mer) CAGGGTTTTCCCAGTCACGACG

Sistem yang sangat efisien untuk site-directed mutagenesis in-vitro

Mutasi Spesifik (Substitusi, delesi, atau insersi dapat diperkenalkan ke gen target atau daerah kloning dengan situs restriksi yang unik dan dengan bacterial selection marker)

Kit dapat digunakan untuk meningkatkan delesi searah

QUALITY CONTROLKONDISI

PENYIMPANAN

Kotak penyimpanan 1: -70C.

Kotak penyimpanan 2: -20C.

UMUR PENYIMPANAN RAK

Disimpan dalam kondisi penyimpanan yang sesuai hingga 1 tahun sejak tanggal produksi

KONDISI SHIPPING

Kotak 1 dan Kotak 2: Dry Ice (70C)

Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit diuji untuk menguji kesuksesan mutagenesis menggunakan DNA pUC19M. Persen koloni biru yang dihasilkan ialah 78.4%