of 53 /53
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni stres u mozgu štakora Diplomski rad Zagreb, 2015.

Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih ... · Reakcija reaktivnih radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem lipidnog

  • Author
    others

  • View
    4

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih ... · Reakcija reaktivnih radikala i...

  • Sveučilište u Zagrebu

    Prirodoslovno-matematički fakultet

    Biološki odsjek

    Jure Krasić

    Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na

    oksidativni stres u mozgu štakora

    Diplomski rad

    Zagreb, 2015.

  • Ovaj rad je izrađen na Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

    Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom izv.prof.dr.sc. Domagoja Đikića, Rad je predan na

    ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi

    stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.

  • TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

    Sveučilište u Zagrebu

    Prirodoslovno-matematički fakultet

    Biološki odsjek Diplomski rad

    Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni

    stres u mozgu štakora

    Jure Krasić

    Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

    Prethodna toksikološka istraţivanja ukazuju da su krvno moţdana barijera i cirkulacija

    središnjeg ţivčanog sustava vrlo osjetljivi na učinke lijekova s vazodilatacijskim ili

    antikoagulativnim svojstvima. Na staničnoj razini, dobro su opisani štetni učinci oksidativnog

    stresa uzrokovanog lijekovima uobičajenima u domaćinstvu, koji se uzimaju bez recepta

    (acetilsalicilna kiselina) te biljnih lijekova i tableta (npr. ginko) ili lijekova na recept s

    antikoagulativnim svojstvima (varfarin). Mnogo manje se zna o međusobnim interakcijama

    navedenih tvari na razine oksidativnog stresa, osobito u mozgu. U okviru ovog rada štakori

    soja Y59 tretirani su dnevno s odgovarajućim preporučenim dozama kombinacija

    acetilsalicilne kiseline, ginka i varfarina, tijekom 15 dana. Razina oksidativnog stresa

    procijenjena je mjerenjem četiri markera oksidativnog stresa; superoksid dismutaze (SOD),

    katalaze (CAT), glutationa (GSH) i malondialdehida (MDA) u različitim regijama mozga.

    Rezultati su pokazali promijenjene razine oksidacijskog stresa u prefrontalnom korteksu,

    kortikalnoj regiji i malom mozgu izloţenih ţivotinja. Ove promjene ukazuju na sinergistički

    toksični potencijal izazvan simultanim uzimanjem navedenih lijekova.

    (47 stranica, 4 tablice, 22 slike, 35 literaturna navoda, jezik izvornika: Hrvatski)

    Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici

    Ključne riječi: aspirin, varfarin, ginko (Ginkgo biloba), Centella asiatica,

    oksidativni stres, mozak

    Voditelj: izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić,

    Ocjenitelji:

    Rad prihvaćen:

  • BASIC DOCUMENTATION CARD

    University of Zagreb

    Faculty of Science

    Division of Biology Graduation Thesis

    The effects of vasodilators and anticoagulants on the oxidative stress

    levels of the rat brain

    Jure Krasić

    Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

    Previous toxicological research showed that blood brain barrier and brain vascular system are

    highly susceptible to the effects of pharmaceuticals with vasodilatation or anticoagulative

    properties. The adverse effects on cellular oxidative stress caused by over the counter (OTC)

    household drugs (acetylsalicylic acid), herbal remedies and pills (for example ginkgo) or

    prescription drugs (warfarin) are well described. Much less is known about mutual interaction

    between these substances on oxidative stress levels especially in the brain. Within this study

    Y59 rats were treated daily with corresponding recommended doses and combinations of

    acetylsalicylic acid, ginkgo and warfarine during 15 days. Four markers of oxidative stress

    were assessed; superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), gluthathione (GSH) and

    malondialdehyde (MDA) in various brain regions. The results have shown changes of

    oxidative stress levels in prefrontal cortex, cortical regions and cerebellum of exposed

    animals. These changes implicate synergistic and potentiated toxic potential of combinations

    of named drugs.

    (47 pages, 4 tables, 22 figures, 35 references, original in: Croatian)

    Thesis deposited in the Central Biological Library

    Key words: aspirin, warfarine, ginkgo (Ginkgo biloba), Centella asiatica,

    oxidative stress, brain

    Supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Assoc. Prof.

    Reviewers:

    Thesis accepted:

  • Sadržaj:

    1 Uvod

    1.1 Oksidativni stres 1

    1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD 4

    1.1.2 Katalaza 5

    1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx) 6

    1.2 Mozak 7

    1.3 Klasični lijekovi 9

    1.3.1 Acetilsalicilna kiselina 9

    1.3.2 Varfarin 11

    1.4 Biljni pripravci 13

    1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji 13

    1.4.2 Ginko 14

    1.4.3 Gotu kola 16

    1.4.4 Borovnica 17

    1.4.5 Vulkan 17

    1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka 17

    1.5.1 Ginko i varfarin 18

    1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina 18

    1.6 Cilj istraţivanja 18

    2 Materijali i metode 19

    2.1 Materijali 19

    2.2 Metode 20

    2.2.1 Tretman ţivotinja 20

    2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva 22

    2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju 22

    2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH) 23

    2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) 24

    2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze 24

    2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije 24

    2.2.8 Statistička analiza podataka 25

    3 Rezultati 26

    3.1 Aktivnost katalaze 26

    3.2 Aktivnost SOD 29

    3.3 Koncentracija GSH 32

    3.4 Koncentracija MDA 35

    3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima 38

    4 Rasprava 40

    5 Zaključak 43

    6 Popis literature 44

  • 1. Uvod

    1.1 Oksidativni stres

    Neravnoteţa između oksidansa i antioksidansa (u korist oksidansa) se naziva oksidativnim

    stresom. Oksidativni stres uzrokuje štetne događaje poput lipidne peroksidacije i oksidativnog

    oštećenja DNA, ali i regulira fiziološke procese i unutarstanični prijenos signala. Oksidansima

    nazivamo molekule i ione koji imaju nesparene elektrone pa su zbog toga reaktivniji i

    nestabilniji. Najčešći oksidansi su reaktivni kisikovi radikali (ROS) i reaktivni dušikovi

    radikali (RNS) (Yoshikawa i Naito 2002). Oksidansi nastaju endogenim metaboličkim

    reakcijama, kao posljedica ionizirajućeg zračenja, hiperoksije, izloţenosti ozonu i dimu te u

    reakcijama s teškim metalima (Birben i sur. 2012).

    Slika 1. Prikaz ravnoteţe i neravnoteţe sustava oksidativnog stresa (Preuzeto od -

    http://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%

    20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20he

    alth.pdf )

    ROS (eng. Reactive oxygen species) su najprisutniji izvor oksidativnog stresa u stanicama, a u

    njih ubrajamo superoksidni radikal (O2-), hidroksilni radikal (

    .OH) koji je najreaktivniji,

    peroksilni radikal (R.O2), alkoksilni radikal (RO

    .), hipokloritnu kiselinu (HClO), ozon (O3),

    singletni kisik (1∆gO2) i vodikov peroksid (H2O2) (Slika 2.) (Birben i sur. 2012).

    http://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20health.pdfhttp://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20health.pdfhttp://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20health.pdf

  • Slika 2. Najčešći kisikovi radikali i reakcije koje ih proizvode (Preuzeto s -

    http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)

    ROS-ovi nastaju neezimatski, Fentonovom i Haberovom reakcijom (Slika 3.) i enzimatski

    (monoamin oksidazom u mitohondrijima u procesu nastanka ATP-a, NADPH

    oksidazom/oksidativnim praskom, ksantin oksidoreduktazom, mijeloperoksidazom u

    eozinofilima i neutrofilima, u procesu stvaranja hipoklorične kiseline itd.). Funkcija ROS-ova

    u stanicama je raznolika: posreduju fagocitozu, apoptozu, reakcije detoksifikacije, sudjeluju u

    inflamatornim procesima, uključeni su u signalne puteve odrţavanja stanične homeostaze itd.

    ROS-ovi reguliraju razne metaboličke i stanične procese uključujući proliferaciju i migraciju

    stanica, ekspresiju gena, imunost i zacjeljivanje. Glavna mjesta nastanka ROS-ova u

    stanicama su mitohondriji i endoplazmatski retikulum (Birben i sur. 2012).

    Slika 3. Fentonova i Haber-Weissova reakcija (Preuzeto s -

    http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)

    Oksidativni stres je povezan s patogenezom brojnih bolesti poput astme (disfunckija

    mitohondrija), ateroskleroze (oksidativna modifikacija LDL-a), Alzheimerove i Parkinsonove

    bolesti (Noori 2012). Stanične membrane lako oksidiraju u prisutnosti reaktivnih radikala

    zbog velike koncentracije nezasićenih masnih kiselina u membranama. Reakcija reaktivnih

    radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem

    lipidnog hidroperoksida, koji se moţe dalje razgraditi u aldehid poput malonaldehida ili 4-

    hidroksi-nonenala. Posljedice lipidne peroksidacije su promijenjena membranska fluidnost,

    „cross-linking“ membranskih proteina te nastajanje lipid-protein i lipid-DNA udruţivanja koji

    mogu oteţavati funkcioniranje stanice. Proteini mogu biti direktno i indirektno oštećeni u

    interakciji s reaktivnim radikalima, što rezultira peroksidacijom, promjenama u tercijarnoj

  • strukturi, proteolitičkom degradacijom i fragmentacijama. DNA, unatoč tome što je stabilna i

    dobro zaštićena molekula, moţe doći u interakciju s reaktivnim radikalima i proći razna

    oštećenja, poput modifikacije DNA baza, jednolančanih i dvolančanih lomova DNA, gubitka

    purina, oštećenja na deoksiriboznim šećerima i oštećenja sustava popravka DNA. Posljedica

    oštećenja DNA je modifikacija genetskog materijala koja rezultira staničnom smrti,

    mutacijama, karcinogenezom i starenjem (Kunwar i Priyadarsini, 2011).

    Nekontrolirana proizvodnja reaktivnih radikala moţe dovesti do njihove akumulacije i

    uzrokovati oksidativni stres u stanicama. Zbog toga su stanice evolucijski stekle brojne

    obrambene mehanizme (Kunwar i Priyadarsini 2011). Prva linija obrane je prevencija

    stvaranja reaktivnih radikala, bilo izbjegavanjem sunčevog zračenja traţenjem zaklona ili

    pakiranjem DNA u kromatin da bi se zaštitio genetski materijal. Kelacija metala je bitan

    faktor u kontroli lipidne peroksidacije i fragmentacije DNA, tako da su metal-vezujući

    proteini (feritin, transferin itd.) bitni u prevenciji oštećenja. Također postoje i enzimatski

    sustavi, poput glutation-S-transferaze, koji sprječavaju formiranja reaktivnih radikala

    katalizom stvaranja tioetera iz tiola i glutationa djelovanjem citokroma P450. Druga linija

    obrane je presretanje postojećih reaktivnih radikala koje moţe biti posredovano neezimatskim

    antioksidansima ili enzimatskim antioksidansima. Neenzimatsko presretanje uključuje

    prijenos od osjetljivijih dijelova stanice do specijalnih kompartimenata gdje se reaktivni

    radikali prevode u nereaktivne i neradikalne metabolite - tu spadaju vitamini C i E, glutation

    itd.. Sve stanice eukariotskih organizama sadrţe jake antioksidativne enzime. Tri glavne

    skupine tih enzima su superoksid dismutaze (SOD), katalaze i glutation peroksidaze (GPx).

    Zadnji korak obrane je faza popravka staničnim mehanizmima (Slika 4.) (Sies 1997).

  • Slika 4. Shematski prikaz enzimatskog i neenzimatskog antioksidativnog sustava (Preuzeto s -

    http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-

    for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-

    antioxidant-actions )

    1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD)

    Superoksid dismutaza je najvaţniji antioksidativni enzim za sve tipove stanice jer je

    superoksid najčešći ROS proizveden iz raznih izvora. SOD ima tri oblika, CuZn-SOD, Mn-

    SOD i EC-SOD koji su široko rasprostranjeni u svim tkivima čovjeka. Mn-SOD je lokaliziran

    u mitohondrijskom matriksu. EC-SOD je primarno lokaliziran u ekstracelularnom matriksu,

    osobito u područjima koja sadrţe velike količine kolagenih vlakana tipa I i oko plućnih i

    sistemskih ţila. Općenito, CuZn-SOD i Mn-SOD se smatraju glavnim presretačima

    superoksidnih radikala. SOD prevodi superoksidne radikale nastale aerobnim metabolizmom

    u manje reaktivne vrste (kisik i vodikov peroksid) (Slika 5.), čija se redukcija dalje nastavlja s

    katalazom i glutation peroksidazom (Birben i sur., 2012).

    http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-antioxidant-actionshttp://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-antioxidant-actionshttp://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-antioxidant-actions

  • Slika 5. Shema djelovanja SOD-a u mitohondrijima (Preuzeto s -

    http://www.trevigen.com/item/5/25/0/636/HT_Superoxide_Dismutase_Assay_Kit/)

    1.1.2 Katalaza

    Katalaza je tetramerni enzim koji se sastoji od četiri identične podjedinice, od kojih svaka

    sadrţi jednu hem grupu. Pri visokim koncentracijama vodikovog peroksida u stanici katalizira

    reakciju dvije molekule vodikovog peroksida u dvije molekule vode i molekularni kisik. Pri

    niskim koncentracijama vodikovog peroksida, uz prisutnost donora vodika, djeluje

    peroksidativno, uklanja vodikov peroksid uz oksidaciju supstrata (Slika 6.). Katalaza štiti

    stanice od endogeno proizvedenog vodikovog peroksida. Iako katalaza nije esencijalna za sve

    tipove stanica u standardnim uvjetima, igra vaţnu ulogu u stjecanju tolerancije na oksidatvni

    stres u adaptivnom odgovoru stanica. Stopa preţivljavanja štakora izloţenih 100% kisiku je

    povećana kad su se liposomi koji sadrţe SOD i katalazu ubrizgali intravenozno prije i za

    vrijeme izloţenosti 100% kisiku (Mates i sur. 1999). Katalaza veţe NADPH radi sprječavanja

    oksidativne inaktivacije vodikovim peroksidom dok ga reducira u vodu (Birben i sur., 2012).

    http://www.trevigen.com/item/5/25/0/636/HT_Superoxide_Dismutase_Assay_Kit/

  • Slika 6. Reakcije katalizirane katalazom (Preuzeto s - http://www.science-

    projects.com/catalasekinetics.htm)

    1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx)

    Glutation peroksidaza je glikoprotein koji sadrţi seleno-cisteinski ostatak u svakoj od svoje

    četiri podjedinice i esencijalan je za enzimsku aktivnost. Glutation peroksidaza katalizira

    redukciju hidroperoksida pomoću glutationa, štiteći time stanice sisavaca od oksidativnog

    oštećenja. Metabolizam glutationa je jedan od esencijalnih antioksidativnih obrambenih

    mehanizama. Kod sisavaca postoji pet izoenzima GPX, koji su prisutni u svim stanicama i

    tkivima i čija razina ovisi o tipu tkiva. Glutation peroksidaza reducira lipidne hidroperokside i

    vodikov peroksid u odgovarajuće alkohole i vodu, koristeći glutation kao donor elektrona koji

    se oksidira do glutationdisulfida (GSSG) (Slika 7.). Iako GPX i katalaza oboje kataliziraju

    redukciju vodikovog peroksida, samo GPX moţe reducirati lipidne i druge organske

    hidroperokside koji su glavni uzrok niskih razina oksidativnog stresa (Mates i sur. 1999).

    Slika 7. Shema djelovanja glutation peroksidaze (Preuzeto s -

    http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/14/3927.figures-only)

    http://www.science-projects.com/catalasekinetics.htmhttp://www.science-projects.com/catalasekinetics.htmhttp://cancerres.aacrjournals.org/content/60/14/3927.figures-only

  • 1.2 Mozak

    Mozak je središnji organ ţivčanog sustava kod svih kraljeţnjaka i većine beskraljeţnjaka.

    Mozak se nalazi u glavi, smješten blizu primarnih senzoričkih organa i najkompleksniji je

    organ u kraljeţnjaka. Fiziološka funkcija mozga je ispoljavanje centralizirane kontrole nad

    organima tijela, što omogućuje brze i koordinirane odgovore na promjene u okolišu. Osnovni

    tipovi odgovora, poput refleksa, mogu biti posredovani leđnom moţdinom ili periferalnim

    ganglijima, ali sofisticirana usmjerena kontrola ponašanja, zasnovana na kompleksnim

    senzoričkim ulaznim signalima, zahtijeva sposobnosti integriranja informacija kakve ima

    centralizirani mozak (Pelvig i sur. 2008).

    Mozak se primarno sastoji od dvije skupine stanica - neurona i glija stanica. Glija stanice

    sluţe za strukturalnu potporu, metaboličke funkcije, izolaciju, obranu, usmjeravanje razvoja i

    popravak, dok neuroni imaju jedinstvenu sposobnost slanja signala specifičnim stanicama

    preko velikih udaljenosti. Signali putuju preko aksona (mijelinizirano tanko protoplazmičko

    vlakno neurona) u obliku elektrokemijskih izboja (akcijskog potencijala), a podraţuju druge

    neurone preko sinapsi (specijalizirane pukotine). Akcijski potencijal putuje niz akson, dolazi

    do sinapse, potiče lučenje neurotransmitera u sinapsu, koji se veţu na receptorne molekule u

    membrani ciljne stanice (Kandel i sur. 2000).

    Eksperimentalno, studijama oksidativne ravnoteţe se pristupa na dva načina: genetskom

    eliminacijom antioksidativnog mehanizma i augmentacijom antioksidativne obrane. Prvim

    načinom je pokazano kako je utišavanje Cu/Zn SOD u miševa povezano s povećanom stopom

    neuronalnih oštećenja i smrti. Eliminacija mitohondrijskog SOD-a je pokazala drastičnije

    učinke, koji su letalni u neonatalnom periodu. Miševi bez ekspresije Mn-SOD, uz zatajenje

    srca, pate od poremećaja u CNS-u poput mitohondrijske vakuolizacije i oksidacije lipidnih

    zaliha. Miševi s niskim razinama glutation peroksidaze su osjetljiviji na ishemiju i

    neurotoksine. Miševi deficijentni u transportnom proteinu vitamina E razvijaju ataksiju i

    neurodegenerativne bolesti, dok je povećan unos vitamina E pokazao da usporava progresiju

    Alzheimerove bolesti (Browne i sur. 1999).

    Povećana koncentracija metala (poput bakra i cinka) ubrzava nakupljanje amiloida. Za redoks

    aktivne metale (poput bakra i ţeljeza) se pretpostavlja da sudjeluju u raznim oksidativnim

    procesima, poput oksidacije proteina inducirane Aβ peptidom i inaktivacije antioksidativnih

    mehanizama poput hem oksigenaze. Kelacija bakra Clioquinolom je pokazala da usporava

    nakupljanje amiloidnih naslaga u Alzheimereovoj bolesti kod miševa (Huang i sur. 1999).

  • Genetski i biokemijski pristupi poboljšavanju antioksidativne obrane idu u prilog teoriji kako

    je oksidativni stres kritičan mehanizam u neurodegeneracijskim putevima. Prekomjerna

    ekspersija Cu/Zn SOD-a kod transgeničnih miševa i štakora pruţa značajnu zaštitu od

    ishemije, hladnog edema i neurotoksina i promiče preţivljavanje neurona u kulturi stanica i

    nakon transplantacije. Genetski inducirana povećana ekspresija Tn-SOD-a djeluje protektivno

    na mitohondrije i stanice od oksidativnog stresa. Povećana ekspresija vanstaničnog SOD-a ili

    glutation peroksidaze je pokazala protektivan učinak od raznih neurotoksina na CNS. Studije

    na mušicama i gujavicama su pokazale da povećana ekspresija SOD-a i katalaze značajno

    produţuje njihov ţivotni vijek. Kod knockout mušica, moţe se povećati ţivotni vijek do 60%

    ţivotnog vijeka divljeg tipa ekspresijom SOD-a u motornim neuronima. Nova saznanja

    impliciraju da antioksidativni enzimi i mali antioksidansi (vitamin E i C, kelacija metala)

    igraju vaţnu ulogu u zaštiti CNS-a (Ischiropoulos i Beckman 2003).

    Slobodne radikale mogu proizvesti sve stanice mozga, npr. NADPH oksidazu (enzim koji

    katalizira produkciju superoksida kod fagocita) ne eksprimiraju samo mikroglija stanice, već i

    neuroni i astroglija. Superoksid ni vodikov peroksid nisu osobito toksični, dok se hidroksilni

    radikal često navodi kao jedan od najtoksičnijih slobodnih radikala in vivo. Proizvodnja

    hidroksilnog radikala Haber-Weissovom ili Fentonovom reakcijom je prespora i

    prenespecifično je reaktivan da bi bio značajno toksičan. Da bi se u kulturi stanica primijetila

    toksičnost vodikovog peroksida, njegova koncentracija mora biti veća od koncentracije kisika

    u mediju (Tammariello i sur. 2000).

    Dva su moguća puta povećanja toksičnosti djelomično reduciranih kisikovih radikala. Upalne

    stanice uvelike povećavaju toksičnost vodikovog peroksida lučenjem peroksida i produkcijom

    hipokloraste kiseline i drugih hipohalogenih kiselina. Stanice mogu povećati toksičnost

    superoksida produkcijom dušikovog monoksida, koji zajedno reagiraju i proizvode

    peroksinitrit, najbrţom reakcijom poznatoj biologiji. U prisutnosti ugljikovog dioksida,

    peroksinitrit modificira proteine u nitrotirozine. Nitrotirozini mogu biti formirani

    peroksidaznom oksidacijom nitrita (nusprodukta metabolizma dušikovog monoksida) i

    vodikovog peroksida (Slika 8.). Doprinos dušikovog monoksida neuralnim oštećenjima je

    pokazan uporabom inhibitora sintaze dušikovog monoksida (NOS) na sojevima miševa

    deficijentnim za neuralnu izoformu NOS-a (NOS1). Miševi deficijentni u NOS1 imalisu

    manju incidenciju moţdanog udara, veću otpornost na neurotoksičnost N-metil-D-aspartatom

    i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom. Uz NOS1, studije su pokazale i učinak NOS2

    (inducibilna forma NOS-a, primarno nađena u glija stanicama) na neuralna oštećenja. Plakovi

  • pacijenata oboljelih od multiple skleroze su pokazali povećanu imunoreaktivnost na NOS2 i

    nitrotirozin. Nitracija je povezana s kompromitiranjem integriteta krvno moţdane barijere kod

    multiple skleroze. Kod ţivotinjskih modela multiple skleroze i moţdanog udara, urična

    kiselina se pokazala inhibitorom nitracije tirozina i pokazala je protektivan učinak na krvno

    moţdanu barijeru. Blokada aktivacije NOS2 i mikroglija je pokazala neuroprotektivan učinak

    kod Parkinsonove i Alzheimerove bolesti. Aktivacija mikroglija stanica (koja dovodi do

    formiranja peroksinitrita) je povezana s Aβ peptidom uzrokovanom neurotoksičnosti

    (Ischiropoulos i Beckman 2003).

    Slika 8. Shema reakcija kisikovih radikala i dušikovog monoksida (Preuzeto s -

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC151889/)

    1.3 Klasični lijekovi

    1.3.1 Acetilsalicilna kiselina

    Acetilsalicilna kiselina (aspirin) je trenutno nakorišteniji lijek na planeti, on je nesteroidni

    antiinflammatorni lijek antipiretičkog i analgetičkog učinka. Glavni mehanizam njegovog

    djelovanja je sprječavanje biosinteze prostaglandina preko inhibicije ciklooksigenaznih

    enzima (Vane i Botting 2003).

    Aspirin interferira s biosintezom cikličnih prostanoida (tromboksana A2 – TXA2 i

    prostaciklina) i drugih prostaglandina (PGE2 i PGI2). Prostanoidi nastaju enzimski

    kataliziranom oksidacijom arahidonske kiseline (iz membranskim fosfolipida). Prostaglandin

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC151889/

  • H-sintetaza metabolizira arahidonsku kiselinu u PGG2 i PGH2 zbog svog ciklooksigenaznog i

    peroksidaznog učinka (Slika 9.). PGG2 dalje modificiraju specifične sintetaze do TXA2 i

    prostaciklina.

    Prostaglandin H-sintetaza (COX) postoji u dvije izoforme koje imaju velik postotak

    homologije u aminokiselinskoj sekvenci. Prva izoforma (COX-1) je eksprimirana u

    endoplazmatskom retikulumu većine stanica i sintetizira homeostatske prostaglandine

    zasluţne za obavljanje normalnih staničnih funkcija, poput zaštite ţeluca mukoznim

    sekretom, odrţavanja normalnog bubreţnog optoka krvi i regulacije aktivnosti i agregacije

    trombocita. Druga izoforma (COX-2) se ne nalazi aktivna u većini stanica sisavaca, ali je brzo

    induciraju inflamatorni signali i faktori rasta, što rezultira u sintezi prostaglandina koji

    doprinose upalnom odgovoru.

    Slika 9. Shema sinteze prostaglandina iz arahidonske kiseline (Preuzeto s -

    http://circ.ahajournals.org/content/101/10/1206.full.pdf)

    Aspirin ima značajan antitrombotičan učinak koji ostvaruje preko inhibicije PGH-sintaze

    (COX) ireverzibilnom actilacijom Ser530 (u COX-1 izoformi) ili Ser516 (u COX-2 izoformi).

    Aspirin potpuno inaktivira COX-1, dok COX-2 ne inaktivira potpuno, već mu mijenja

    djelovanje tako da arahidoničnu kiselinu ne metabolizira u PGH2, već u 15-R-HETE. Kako

    http://circ.ahajournals.org/content/101/10/1206.full.pdf

  • prisustvo aspirina onemogućuje produkciju PGH2, kod obje izoforme (nuţan korak u

    produkciji prostanoida) dolazi do smanjene produkcije prostaglandina i tromboksana, što je

    odgovorno za pozitivne i negativne učinke aspirina.

    Aspirin također štiti LDL od oksidativnih modifikacija te tako sprječava ili usporava

    aterosklerozu (Awtry i Loscalzo 2000).

    Aspirin smanjuje razinu vaskularne produkcije O2-

    smanjivanjem NAD(P)H oksidazne

    aktivnosti (Tauseef i sur. 2008).

    Predloţeno je nekoliko mehanizama antioksidativnog učinka aspirina. Salicilat je inhibitor

    indukcije ovisne o citokinu genske ekspresije NOS-II preko mehanizma koji uključuje

    aktivaciju NF-kB, što dovodi do smanjenja oksidativnog stresa koji prati produkciju citokina.

    Aspirin redukcijom hidroksilnih radikala prelazi u derivate 2,3- i 2,5-dihidroksibenzoata, koji

    sluţe kao markeri oksidativnog stresa i smanjuju protok oksidativnih radikala. Aspirin moţe

    acetilirati lizinske nastavke proteina što sprječava njihovu oksidaciju, što je bitan faktor u

    antioksidativnoj zaštiti lipoproteina i fibrinogena (Awtry i Loscalzo 2000).

    Nedavna istraţivanja na ljudskim HepG2 stanicama raka su pokazala da aspirin pokreće

    apoptozu kod stanica raka. Aspirin u stanicama raka povećava produkciju slobodnih radikala,

    smanjuje dostupnost staničnog glutationa i inhibira aktivnost kompleks respiratornih

    mitohondrijskih enzima, NADH-ubiquinon oksidoreduktaze (kompleks 1), citokrom c

    oksidaze (kompleks 4) enzim mitohondrijskog matriksa, akonitazu. Apoptozu pokreće

    promjena u mitohondrijskoj permeabilnosti, inhibicija sinteze ATP-a, smanjena ekspresija

    antiapoptotičkog proteina Bcl-2, oslobađanje citokroma c i aktivacija proapoptotičke kaspaze-

    3 i enzima popravka DNA PARP (Raza i sur. 2010).

    1.3.2 Varfarin

    Varfarin je derivat kumarina s antikoagulativnim učinkom, kojeg ostvaruje interferiranjem u

    interkonverziji vitamina K i njegovog 2,3-epoksida. Vitamin K je kofaktor za karboksilaciju

    glutamatnih nastavaka do γ-karboksiglutamata na N-terminalnim regijama vitamin K ovisnih

    proteina (među njima su koagulacijski faktori 2, 7, 9 i 10). Inhibicijom interkonverzijskog

    ciklusa vitamina K, varfarin inducira jetrenu produkciju djelomično dekarboksiliranih

    proteina s reduciranom koagulantskom aktivnosti.

  • Karboksilacija potiče vezanje vitamin K ovisnih koagulacijskih faktora na fosfolipidne

    površine (što ubrzava koagulaciju krvi). Za γ-karboksilaciju je potreban reducirani oblik

    vitamina K (vitamin KH2). Kumarin sprječava formiranje vitamina KH2 inhibicijom enzima

    vitamin K epoksid reduktaze i time ograničava γ-karboksilaciju Vitamin K ovisnih

    koagulacijskih proteina (Slika 10.). Uz to, antagonisti vitamina K inhibiraju karboksilaciju

    regulatornih antikoagulacijskih proteina C i S. Antikoagulativne efekte kurmarina moguće je

    nadvladati niskim dozama vitamina K1 jer vitamin K1 zaobilazi vitamin K epoksid

    reduktazu.Varfarin također interferira u karboksilaciji Gla proteina sintetiziranih u kostima.

    Slika 10. Prikaz djelovanja varfarina na ciklus vitamina K (Preuzeto s -

    http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1132287)

    Varfarin je racemična mješavina dva optički aktivna izomera, R i S forme, u otprilike

    jednakim odnosima. Brzo se upija kroz probavni sustav, ima visoku biodostupnost te doseţe

    najvišu koncentraciju u krvi za 90 minuta nakon oralnog uzimanja. Racemični varfarin ima

    poluţivot između 36 i 42 sata, cirkulira vezan za proteine plazme (najčešće albumine) i

    nakuplja se u jetri gdje dva izomera prolaze različite metaboličke puteve (Hirsh i sur. 2003).

    S-varfarin se metabolizira u neaktivne metabolite (S-7 hidroksivarfarin) izoenzimom

    CYP2C9, dok se R-varfarin metabolizira izoenzimima CYP1A2, CYP2C19 i CYP3A4 u 6-,

    8- i 10-hidroksivarfarin. Neaktivni metaboliti se izlučuju urinom i fecesom (Teles i sur. 2012).

    http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1132287

  • Odnos između doze varfarina i njegovog odgovora je uvjetovan genetskim i okolišnim

    faktorima. Bitni genetski faktori su učestale mutacije u genu za kodiranje citokroma P450,

    jetrenog enzima odgovornog za metabolizam S izomera varfarina. Opisano je nekoliko

    genetskih polimorfizama za enzim, koji su povezani uz niţe potrebne doze i veću stopu

    nuspojava krvarenja u odnosu na divlji tip enzima CYP2C9 i VKORC1. Uz brojne genetske i

    okolišne faktore, na odgovor varfarina utječu drugi lijekovi, prehrana i brojne bolesti (Hirsh i

    sur. 2003).

    Interakcije varfarina s drugim supstancama se dijele u dvije kategorije: farmakokinetske i

    farmakodinamičke efekte.

    Interakcije koje modificiraju farmakokinetiku varfarina uključuju promjene u apsorpciji (koja

    smanjuje antikoagulacijski efekt), metabolizmu (induciranjem izoenzima CYP2C9 što

    smanjuje antikoagulativan učinak, enzimskom inhibicijom CYP2C9 koja povećava

    antikoagulativan učinak) i transportu (spojevi koji se veţu na proteine plazme, osobito

    albumin, dislociraju vezani varfarin što povećava koncentraciju slobodnog varfarina u krvi i

    antikoagulativan učinak).

    Interakcije koje modificiraju farmakodinamiku varfarina uključuju sinergizme (djelovanje na

    hemostazu i smanjivanje sinteze koagulacijskih faktora), kompetitivni antagonizam (vitamin

    K) i promjene u fiziološkoj kontroli ciklusa vitamina K (nasljedna otpornost na oralne

    antikoagulante) (Teles i sur. 2012).

    1.4 Biljni pripravci

    1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji

    Od početaka ljudske civilizacije, biljni pripravci su se koristili za liječenje raznih bolesti i

    poboljšanje zdravlja. Prema procjenama Svjetske zdravstvene organizacije 80% svjetske

    populacije koristi biljne pripravke u nekom obliku iz zdravstvenih razloga. Veliki razlog

    njihove popularnosti leţi u njihovoj lakoj dostupnosti i u tome što se smatraju zdravima, jer su

    prirodni. Unatoč tome, mnogi od njih imaju ozbiljne nuspojave, bilo zbog direktnog toksičnog

    učinka biljke, alergijskih reakcija, utjecaja kontaminanata, bilo zbog prisutnosti teških metala,

    interakcije s klasičnim lijekovima ili nenavedenih farmaceutskih spojeva, namjerno i ilegalno

    dodanih da bi se postigao ţeljeni učinak (Dulger, 2012.).

  • U skladu s europskim zakonodavstvom, da bi medicinski pripravci koji sadrţe biljne

    supstance/preparate mogli biti pušteni na trţište, moraju spadati u jednu od tri navedene

    kategorije:

    1.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju medicinski tradicionalne upotrebe. Mora

    postojati dovoljno informacija o njegovoj sigurnosti i njegova učinkovitost mora biti

    uvjerljiva.

    2.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju utemeljene upotrebe za medicinske svrhe.

    Kriterij za to je znanstvena literatura koja potvrđuje da se aktivne supstance proizvoda

    utemeljeno koriste u medicinske svrhe unutar Unije bar deset godina, s utvrđenom

    učinkovitošću i prihvaćenom razinom sigurnosti.

    3.) Proizvod se moţe odobriti nakon provjere prijave za puštanje na trţište koja se sastoji

    od podataka o sigurnosti i učinkovitosti iz firme proizvođača (samostojeća studija) ili

    kombinacije vlastitih podataka firme i postojećih bibliografskih podataka (mješovita

    aplikacija). (DIRECTIVE 2001/83/EC)

    1.4.2 Ginko

    Ginko (Ginkgo biloba) je jedini ţivući član porodice Ginkgoaceae i spada u „žive fosile“

    (najduţe ţivuće vrste na planeti), budući da postoje fosilni nalazi stari 150 milijuna godina.

    Lišće i plodovi ginka su često korišteni u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje

    plućnih, srčanih i mokraćnih problema te koţnih bolesti. Prije dvadesetak godina

    standardiziran je ekstrakt lista ginka, Egb761, i najčešće se koristi kao suplement za

    kognitivne probleme.

    Standardizirani ekstrakt lista ginka Egb 761 sadrţi 24 % flavonoidnih glikozida, 6 %

    terpenskih laktona, i manje od 5 ppm ginkolične kiseline (Droy-Lefaix, 2005).

    Glavni farmakološki aktivni spojevi u ekstraktu lista ginka su flavonoidi i terpenoidi.

    Flavonoidi prisutni u ekstraktu lista ginka su flavoni, flavonoli, tanini, biflavoni i vezani

    glikozidi kvercitina i kamferola na 3-ramnozidima i p-kumarinskim esterima. Oni djeluju kao

    antioksidansi, inhibitori enzima i kelatori kationa. Flavonoidni sastav listova ginka varira

    između sezona. Biodostupnost flavonoida je relativno niska zbog ograničene apsorpcije i brze

    eliminacije. Glikozidni oblik flavonoida se slabo apsorbira u crijevu, samo aglikonični oblik

    se moţe direktno apsorbirati. Neapsorbirane flavonoide koji dospiju u debelo crijevo

    http://link.springer.com/search?facet-creator=%22M.+T.+Droy-Lefaix%22

  • metaboliziraju bakterije a nakon toga se apsorbiraju u crijevu. Apsorbirani flavonoidi

    dospijevaju do jetre, ondje se metaboliziraju u konjugirane derivate čija biološka aktivnost

    nije uvijek ista kao u originalnih spojeva. Dva su tipa terpenoida prisutna u ekstraktu lista

    ginka: ginkolidi i bilobalid (Bilia, 2002).

    Ekstrakt lista ginka je pokazao pozitivne učinke u liječenju neurodegenerativnih bolesti poput

    Alzheimerove, kardiovaskularnih bolesti, raka, stresa, gubitka pamćenja, tinitusa, bolesti

    vezanih uz starenje i psihijatrijskih poremećaja poput šizofrenije. Ti učinci se objašnjavaju s

    više mehanizama, poput antioksidativnog učinka, antiagregacijskog učinka (za srčane i krvno-

    moţdane bolesti), inhibicije agregacije beta amiloidnih peptida (za usporavanje progresije

    Alzheimerove) i smanjene ekspresije perifernih benzodiazepinskih receptora (za olakšanje

    stresa i poboljšanje cirkulacije) (McKenna i sur. 2001).

    Smatra se da je glavni mehanizam terapeutskog učinka ekstrakta lista ginka na kronične

    bolesti (neurodegenerativne i kardiovaskularne bolesti i rak) njegovo antioksidativno

    djelovanje. Dva su predloţena mehanizma njegovog djelovanja: vezanja slobodnih radikala i

    indirektna inhibicija formiranja slobodnih radikala. Ekstrakt lista ginka moţe vezati kisikove

    radikale poput hidroksilnih radikala, peroksidne radikale, superoksidnog aniona, NO-,

    vodikovog peroksida i ţeljezne ione. Ekstrakt lista ginka moţe pojačati aktivnost

    antioksidativnih enzima poput superoksid dismutaze, glutation peroksidaze katalaze i hem-

    oksigenaze-1 i tako indirektno djelovati kao antioksidant. Studije također pokazuju da

    ekstrakt lista ginka povećava ekspresiju mitohondrijskih enzima poput NADH dehidrogenaze,

    što utječe na stvaranje kisikovih radikala u mitohondrijima, jer djeluje izravno na oksidativnu

    fosforilaciju, što povećava razinu ATP-a i regulaciju energetskog metabolizma. U usporedbi s

    drugim antioksidansima, ekstrakt lista ginka je regulativan i adaptivan, moţe dilatirati i

    kontrahirati krvne ţile i kontrolirati neurokemikalije i neuroendokrine indikatore ovisno o

    situaciji. Glavne aktivne tvari tih mehanizama su flavonoidi (kvercetin kempferol) i terpenoidi

    (ginkolidi i bilobalid), koji doprinose antioksidativnom učinku na različite načine. Flavonoidi

    djeluju preko inhibicije enzima ciklooksienaze 2 (COX2), koja je dio ciklusa sinteze

    prostaglandina. Bilobalid povećava aktivnost antioksidativnih enzima (SOD-a i katalaze) i

    poboljšava vijabilnost stanica.

    Proantocijanidini prisutni u ekstraktu lista ginka se veţu na proteine i inaktiviraju

    antioksidativne enzime (katalazu, glutation peroksidazu i laktat dehidrogenazu), tako da

  • njihova prisutnost u ekstraktu moţe smanjivati antioksidativni učinak ginka (Mahadevan i

    Park, 2008).

    1.4.3 Gotu kola

    Gotu kola (Centella asiatica) je penjačica koja spada u porodicu Apiaceae, a nalazi se u

    tropskom i suptropskom području Indije, Pakistana, Šri Lanke, Madagaskara, Juţne Afrike i

    Istočne Europe. Cijela biljka se koristila za medicinske svrhe u tradicionalnoj indijskoj i

    kineskoj medicini, za liječenje visokog tlaka, revitalizaciju moţdanih stanica i ţivaca,

    emocionalne poremećaje i koţne bolesti (Gohil i sur. 2010).

    Farmakološki aktivni spojevi gotu kole su triterpenski saponini (triterpenoidi) podnazivom

    aziatikozidi od kojih su najpoznatiji madekasozid i madazijatska kiselina. Ti triterpeni saponini

    i njihovi sapogenini se smatraju odgovornima za zaliječivanje rana i vaskualrno djelovanje

    produkcijom kolagena na mjestu rane. Drugi spojevi izolirani iz gotu kole, poput brahmozida

    i brahminozida, mogu biti odgovorni za djelovanje na CNS i relaksantno djelovanje, ali

    njihovo djelovanje još nije klinički potvrđeno. Ekstrakti gotu kole sadrţe glikozide koji su

    pokazali antifertilni učinak kod miševa. Centelozid i njegovi derivati su se pokazali

    efikasnima u tretmanima venske hipertenzije. Među ekstraktima gotu kole se nalaze biljni

    steroli, flavonoidi i spojevi za koje se ne zna farmakološka aktivnost (tanini, esencijalne

    kiseline, fitosteroli, slobodne aminokiseline, flavonoidi, alkaloidi i masne kiseline)

    (Srivastava i sur. 1997).

    Gotu kola revitalizira mozak i ţivčani sustav, povećava koncentraciju i usporava starenje.

    Studija na štakorima je pokazala antioksidativan učinak i kognitivno stimulirajući učinak.

    Štakori tretirani s gotu kolom pokazuju dozno ovisan napredak kognitivnog ponašanja u

    testovima pasivnog izbjegavanja i labirintskim testovima. Značajno smanjenje razine MDA i

    povećanje razine katalaze i SOD-a je primijećeno kod štakora tretiranih visokim dozama gotu

    kole (Hussin i sur. 2005). Također je dokazana povećana razina fosforilacije CREB-a (cyclic

    AMP response element binding proteina) u kulturi stanica neuroblastoma i embrijskim

    kortikalnim stanicama štakora tretiranih ekstraktom gotu kole. Pretpostavlja se da je za to

    djelovanje odgovoran signalni putERK/RSK (extra cellular signal-regulated kinase-ribosomal

    S6 kinaza). Studija na miševima, koji su oralno uzimali ekstrakt gotu kole 14 dana, pokazala

    je povećanje razine antioksidativnih enzima (SOD-a, katalaze i glutation peroksidaze).

    Derivati azijatske kiseline povećavaju razine antioksidativnih enzima u kulturi kortikalnih

    stanica pa se pretpostavlja da štite stanice od oksidativne štete nastale zbog izloţenosti višim

  • razinama glutamata u ţivčanim stanicama. Azijatikozidni derivati su djelovali protektivno na

    beta-amiloid neurotoksičnost u kulturi B103 stanica. Tri azijatikozidna derivata pokazuju

    inhibiciju apoptoze uzrokovane beta-amiloidima i slobodnim radikalima (Gohil i sur. 2010).

    1.4.4 Borovnica

    Borovnica (Vaccinium myrtillus) je nisko rastući grm čiji plodovi su bogati antocijaninima i

    daju im karakterističnu plavu boju. Apsorpcija antocijana je brza, ali imaju slabu

    biodostupnost (11-22 %).

    Antocijani su se, mehanizmima vezanja slobodnih radikala i keliranjem metalnih iona,

    pokazali kao dobri antioksidansi. Štakori tretirani ekstraktom plodova borovnica su pokazali

    smanjenu lipidnu peroksidaciju u serumu i povećanu razinu glutationa u stanicama srčanog

    mišića (Chu i sur. 2011).

    1.4.5 Vulkan

    Vulkan je dodatak prehrani za poboljšanje muške potencije. Sastav vulkana, po navodima

    proizvođača, trebalibi biti samo biljni ekstrakti: ekstrakt lista ginka, matičnjaka (Melissa

    officinalis), hmelja (Humulus lupulus) i origana (Origanum vulgare). Ekstrakt matičnjaka je

    pokazao niz neuroprotektivnih i antioksidativnih učinaka mehanizmima inhibicije MAO-A i

    vezanja vodikovog peroksida (López i sur. 2009). Ekstrakt hmelja sadrţi brojne polifenole

    koji sprječavaju oksidativna oštećenja DNA vezanjem hidroksilnih radikala i superoksidnih

    radikala (Wang i sur. 2014). Fenoli nađeni u ekstraktu origana pokazuju antioksidativan

    učinak vezanjem slobodnih radikala i u studijama su pokazali značajan učinak u smanjenju

    lipidne peroksidacije (Aranha i Jorge. 2012).

    1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka

    Rastuća globalna popularnost alternativne medicine rezultirala je povećanim interesom za

    posljedice interakcije biljnih pripravaka i klasičnih lijekova, osobito za lijekove uskog

    sigurnosnog raspona doze.

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%B3pez%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19760174

  • Studija provedena 2007. je pokazala kako 15% pacijenata tretiranih klasičnom

    farmakoterapijom uzima biljne pripravke. Kod njih 40% su primijećene moguće interakcije

    klasičnih lijekova s biljnim suplementima, ali je često teško odrediti točan uzrok interakcije,

    osobito kod onih čija terapija uključuje više lijekova (Dulger, 2012.).

    1.5.1 Ginko i varfarin

    Studije rađene in vitro i na štakorima su pokazale da ginko utječe na enzime CYP2C9,

    CYP2D6 i CYP2E1, dok su rezultati utjecaja na CYP3A4 nejasni ili su pokazali da utjecaj

    ginka nije klinički značajan. Farmakološke studije na pacijentima i zdravim volonterima nisu

    pokazale interakciju između ginka i varfarina. Prijavljena su krvarenja kod zajedničkog

    uzimanja, ali nema dokaza koji bi objasnio mehanizam ni pokazao da je to rezultat interakcije

    (Beikang i sur. 2014).

    1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina

    Zabiljeţena su krvarenja kod pacijenata koji su uzimali ekstrakt lista ginka uz acetilsalicilnu

    kiselinu, što bi moglo biti rezultat interakcije inhibicijskog utjecaja flavonoida i terpenoida

    prisutnih u ekstraktu lista ginka na zgrušavanje krvi. (Abebe, 2002)

    1.6 Cilj istraţivanja

    Cilj ovog rada je istraţiti kakva je interakcija između lijekova (čiji su učinci na oksidativni

    stres dobro poznati) i biljnih pripravaka na oksidativni stres mozga. Mjerenjem markera

    oksidativnog stresa kod grupa koje primaju pojedinačne supstance i grupa koje dobivaju

    kombinacije supstanci usporedit će se razina oksidativnog stresa na tri regije mozga.

  • 2. Materijali i metode

    2.1 Materijali

    Priloţen je tablični prikaz otopina korištenih u istraţivanju.

    Tablica 1. Priprema pokusnih otopina

    Otopina Priprema otopine

    Otopina D (određivanje proteina

    prema Lowryu)

    Pomiješati otopine u omjeru A:B:C=48:1:1

    A: 2% (w/v) Na2CO3 u 0,1 mM NaOH

    B: 1% (w/v) natrij-kalij tartarat u dH2O

    C: 0,5% (w/v) CuSO4× 5H2O u dH2O

    Otopina E (određivanje proteina

    prema Lowryu)

    Pomiješati Folin & Ciocalteu's phenol reagent i

    dH2O u omjeru 2:1

    0,81% TBA (određivanje MDA)

    Otopiti 0,8 g TBA u 40 mL dH2O uz lagano

    zagrijavanje. Dodati 500 μL 5M NaOH te nadopuniti

    s dH2O do 100 mL.

    Reagens A (određivanje MDA) Pomiješati 100 μL 8,1% SDS sa 750 μL 20% octene

    kiseline namještene na pH=3,5 i 750 μL 0,81% TBA

    0,5 M pufer PBS (Phosphate

    Buffered Saline) - određivanje GSH

    Pomiješati 17 mL 1 M Na2HPO4× 2 H2O (otopiti 3 g

    Na2HPO4 × 2H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 17 mL)

    i 183 mL 1 M Na2HPO4× 12 H2O (otopiti 65,5 g

    Na2HPO4×12 H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 183

    mL)

    0,5 M EDTA (određivanje GSH) Otopiti 37,2 g EDTA u dH2O i nadoliti dH2O do 200

    mL

    0,25 M pufer PBS s 0,25 M EDTA

    (određivanje GSH)

    Pomiješati 200 mL 0,5 M pufer PBS i 200 mL 0,5 M

    EDTA

    0,035 M HCl (određivanje GSH) Pomiješati 7 mL 0,1M HCl s 193 mL dH2O

    Ellmanov reagens (određivanje

    GSH)

    Otopiti 20 mg DTNB (ditionitrobenzoična kiselina) u

    5 mL 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA

    0,8 mM NADPH (određivanje GSH) Otopiti 6,67 mg NADPH s 10 mL 0,5M pufer PBS s

    0,25 M EDTA

    50 mM PBS (određivanje SOD) Pomiješati 17 mL (otopiti 1,56 g NaH2PO4× 2H2O u

    50 mL dH2O) i 183 mL ( otopiti 5,678 g Na2HPO4 u

  • 200 mL dH2O), namjestiti pH=7,8 te nadopuniti do

    800 mL s d H2O

    50 mM PBS s 0,1 mM EDTA

    (određivanje SOD)

    Otopiti 3,72 mg EDTA u 100 mL 50 mM PBS

    Reakcijska otopina A (određivanje

    SOD)

    Pomiješati 190 mL 0,05 mM citokroma c (otopiti 29

    mg citokroma c u 190 mL 50 mM PBS s 0,1 mM

    EDTA ) i 19 mL 1 mM ksantina ( uz lagano

    zagrijavanje otopiti 3 mg ksantina u 19,74 mL 1 mM

    NaOH)

    10 mM H2O2 (određivanje katalaze) 100 μL 30% H2O2 pomiješati sa 100 ml dH2O

    Otopina B enzima ksantin oksidaze

    (aktivnost 0,8 U/mL) (određivanje

    SOD)

    Pomiješati 40 μL ksantin oksidaze i 960 μL dH2O

    2.2 Metode

    2.2.1 Tretman ţivotinja

    Za potrebe istraţivanja korišteno je 48 štakora soja Y59, podijeljenih u osam grupa po pet

    štakora i dvije grupe po četiri štakora (Tablica 2.). Devet grupa je bilo dnevno tretirano

    odgovarajućim preporučenim dozama (mg/kg) od strane proizvođača (referentne doze od

    strane proizvođača, korekcija na bazi mase ţivotinja) acetilsalicilne kiseline, ginka, varfarina,

    vulkana, goji bobica, gotu kole i borovnica i njihovim kombinacijama, dok je kontrolna grupa

    bila tretirana fiziološkom otopinom. Tretiranje se provodilo 15 dana po standardnom OECD

    protokolu 407 za ispitivanje subkronične toksičnosti.

  • Tablica 2. Pokusne skupine i doziranje preparata

    Oznaka skupine Sastav pokusne otopine Doziranje

    0.KONTROLA Fiziološka otopina 2 mL svaki dan

    1.GINKO Komercijalni pripravak ginka Ginkgo

    biloba (GINKOCEL Dietpharm)- 400

    mg preparata sadrţi 120 mg ginka

    5,71 mg preparata/kg

    svaki dan

    2.VULKAN Komercijalni pripravak mješavine

    različitih biljaka: hmelj, matičnjak,

    ekstrakt origana i Ginkgo biloba

    (VULKAN Avala pharma)- 1650 mg

    preparata sadrţi 150 mg ginka

    23,5 mg preparata/kg

    svaki dan

    3.ACETILSALICILNA

    KISELINA

    Otopina 0,86 mg acetilsalicilne

    kiseline na 1 mL vode

    4,2 mg/kg svaki dan

    4.VARFARIN Otopina varfarina Kroz 12 dana fiziološka

    otopina,a zadnja 3 dana

    varfarin u dozi 0,4

    mg/mL

    5.VULKAN+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 2.

    Vulkan i 4. varfarin

    Kroz 12 dana otopina

    2.Vulkan, nakon 13.

    dana u tretiranje je

    uključena i otopina

    4.Varfarin

    6.VULKAN+ACETILSA

    LICILNA KISELINA

    Kombinacija otopina skupina 2.

    Vulkana i 3. Acetilsalicilna kiselina

    Kroz 12 dana otopina

    2.Vulkan, nakon 13.

    dana u tretiranje je

    uključena i otopina 3.

    Acetilsalicilna kiselina

    7.GINKO+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 1.

    Ginko i 4.Varfarin

    Kroz 12 dana otopina 1.

    Ginko, nakon 13. dana u

    tretiranje je uključena i

    otopina 4. Varfarin

    8.GINKO+ACETILSALI Kombinacija otopina skupina 1. Kroz 12 dana otopina 1.

  • CILNA KISELINA Ginko i 3. Acetilsalicilna kiselina Ginko, nakon 13. dana u

    tretiranje uključena i

    otopina 3. Acetilsalicilna

    kiselina

    9.GINKALERT Komercijalni pripravak Ginko biloba

    i mješavine biljnih pripravaka: Gota

    Kola (Centella asiatica) s 10%

    triterpena i borovnica s 36%

    antocijanozida (GINKALERT

    Solaray) – 720 mg preparata sadrţi

    120 mg ginka

    10,2 mg preparata/kg

    2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva

    Nakon 15 dana tretmana, ţivotinje su anestezirane mješavinom Xilapana i Narketana, i.p. 25

    mg/kg) i ţrtvovane, zatim su im izolirani mozgovi. Sa svakog mozga je izoliran i izvagan dio

    korteksa, prefrontalnog korteksa i malog mozga te stavljen u Eppendorf-epruvetu s fosfatnim

    puferom u volumenu 10× većim od mase uzorka. Uzorci su homogenizirani ultrazvučnim

    homogenizatorom i zatim centrifugirani 15 minuta na 15 000 g i pri 60C. Nakon

    centrifugiranja je odvojen supernatant i pohranjen u hladnjaku na -200C do početka testiranja.

    2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju

    Metoda određivanja proteina po Lowryju (1951.) je biokemijski test za određivanje ukupne

    koncentracije proteina u otopini, a temelji se na biuretskoj reakciji, promjeni boje otopine

    zbog oksidacije aromatskih aminokiselina u njoj. U biuretskoj reakciji ioni bakra reagiraju s

    peptidnim vezama proteina u luţnatom mediju, pri čemu dolazi do njihove redukcije u Cu+.

    Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje fenolni reagens koji reagira sa Cu+–proteinskim

    kompleksom i bočnim ograncima aromatskih aminokiselina, prilikom čega uzrokuje njihovu

    oksidaciju i svoju redukciju, što dovodi do nastanka plavog obojenja. Promjena apsorbancije

    uslijed obojenja mjeri se pomoću spektrofotometra.

    Metodom po Lowryju određene su razine proteini u štakorima. Uzorci mozgova razrijeđeni su

  • 10 puta u PBS-u. U epruvete je dodano po 100 μL razrijeđenog uzorka i 2 mL otopine D

    (Tablica 1) i inkubirano 10 min na sobnoj temperaturi. Sve je rađeno u duplikatima. Zatim je

    dodano 200 μL otopine E (Tablica 1), nakon čega je snaţno vorteksirano i inkubirano 30 min

    na sobnoj temperaturi. Količina proteina određena je na spektrofotometru mjerenjem

    apsorbancije na valnoj duljini od 600 nm. Kao standard, upotrijebljen je albumin goveđeg

    seruma (eng. Bovine serum albumin, BSA) u koncentracijama od 2 mg/mL prema manjim

    koncentracijama (2; 1; 0,25; 0,125 i 0 mg/mL). Iz standardne krivulje ovisnosti apsorbancije o

    koncentraciji BSA, određen je nagib pravca. Preko nagiba pravca izračunata je koncentracija

    proteina u uzorcima. Koncentracija proteina izraţena je kao mg/mL.

    2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH)

    Koncentracija ukupnog glutationa u mozgu štakora određena je prema modificiranoj metodi

    koju je opisao Tietze (1969). Metoda se temelji na reakciji tiolnog reagensa 5,5-ditiobis-2-

    nitrobenzoične kiseline (DTNB, Ellmanov reagens) s GSH, pri čemu se stvara kromofor 5-

    tionitrobenzoična kiselina (TNB) koja se moţe fotometrijski očitati na 412 nm. Uz TNB,

    stvara se i GS-TNB koji se reducira pomoću GSH reduktaze (GR) i NADPH, pri čemu se

    otpušta druga molekula TNB i reciklira GSH. Brzina nastanka TNB proporcionalna je

    recilirajućoj reakciji, koja je proporcionalna koncentraciji glutationa u uzorku. Pri ovoj

    metodi, sav oksidirani GSH (disulfid GSSG) prisutan u reakcijskoj smjesi ili nastao iz

    miješanog disulfida GSH s GS-TNB, brzo se reducira do GSH. Konačan rezultat koji se

    dobije odgovara ukupnoj koncentraciji reduciranog i oksidiranog GSH u uzorku.

    Koncentracija ukupnog GSH mjeri se u mikrotitarskoj pločici. U jednu jaţicu dodaje se 20 μL

    uzorka, 40 μL 0,035 M HCl i 40 μL 10 mM DTNB te se mjeri apsorbancija na valnoj duljini

    od 415 nm. Zatim se dodaje 100 μL otopina GR i NADPH i mjeri se apsorbancija tijekom 5

    min. Priprema navedenih otopina prikazana je u Tablici 2. Kao slijepa proba korišten je PBS u

    reakcijskoj smjesi. Za standard korištene su koncentracije reduciranog GSH (5-100 μM).

    Nacrtani su pravci za sve standarde, kao promjena apsorbancije u vremenu. Očitani su nagibi

    pravaca, nacrtan je pravac kao ovisnost nagiba pravca o koncentraciji GSH. Konačno, taj

    dobiveni pravac korišten je za dobivanje koncentracije ukupnog GSH u uzorku prema formuli

    (nagib pravcauzorak – nagib pravcaslijepa proba)/nagib pravcastandard. Koncentracija ukupnog GSH

    prikazuje se kao μg GSH po mg proteina.

  • 2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)

    Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze provedeno je prema posrednoj metodi po Flohé i

    Ötting (1984.) koja se temelji na inhibiciji redukcije citokroma C u sustavu ksantin/ksantin

    oksidaza.

    U ovoj metodi korištene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sastojala se samo od

    otopine A (Tablica 1) te je apsorbancija u spektrofotometru mjerena na 550 nm tijekom 3

    min. Druga slijepa proba sluţila je za namještanje aktivnosti ksantin oksidaze (XOD). U

    epruvetu Eppendorf- je stavljeno 1,45 mL otopine A, 25 μL dH2O i 20-30 μL XOD (0,8

    U/mL) (Tablica 1). Odmah nakon dodavanja enzima i brzog miješanja, reakcijska smjesa

    prelivena je u kivetu i mjerena je promjena apsorbancije, odnosno aktivnost enzima ksantin

    oksidaze tijekom 3 min na 550 nm. Aktivnost XOD mora biti oko 0,025 U/min. U ovom

    slučaju, odgovarajući volumen XOD bio je 25 μL. Nakon što se postigla optimalna aktivnost

    SOD, analizirani su uzorci. U svaku reakcijsku smjesu, umjesto dH2O, dodano je 25 μL

    uzorka te odgovarajući volumen XOD (30 μL) i odmah nakon toga mjerena je apsorbancija u

    spektrofotometru. Enzimska aktivnost mjerena je kao postotak inhibicije aktivnosti XOD te

    izraţena kao %inhibicije=100-(ΔAuzorka/ΔAslijepa proba)×100.

    2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze

    Aktivnost katalaze određena je spektrofotometrijskom metodom po Aebiju (1984). Prema toj

    metodi, aktivnost katalaze određuje se kao količina potrošenog H2O2. U reakcijsku smjesu u

    kivetu dodano je 980 μL10 mM H2O2 (Tablica 1), a ostatak do ukupnog volumena od 1 mL

    bio je nerazrijeđeni uzorak. Nakon toga je na spektrofotometru mjereno smanjenje količine

    H2O2 pri 240 nm tijekom jedne minute. Aktivnost katalaze izraţena je preko ekstinkcijskog

    koeficijenta H2O2 (ε= 39,4 mM–1

    cm–1

    ) kao U/mg proteina, što odgovara μmol razgrađenog

    H2O2 po minuti po miligramu proteina.

    2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije

    Količina lipidne peroksidacije određivana je modificiranom metodom koju su opisali Lamsal i

    sur. 2007. Metoda nalaţe mjerenje koncentracije malondialdehida (MDA), jednog od glavnih

    produkata lipidne peroksidacije. Temelji se na reakciji MDA s tiobarbiturnom kiselinom, pri

    čemu se stvara kromogen koji je moguće mjeriti spektrofotometrijski.

  • U eppendorf-epruvetu je dodano 100 μL 8,1%-tni SDS, 750 μL 20%-tne octene kiseline

    (pH=3,5), 750 μL 0,8%-tne TBA (Tablica 1) i 100 μL homogenog uzorka. Otopina je zatim

    stavljena u vodenu kupelj na 100 °C na 60 minuta. Nakon toga je naglo ohlađena na ledu i

    zatim centrifugirana 15 min na 5000 rpm pri 4–6 °C. Supernatant je odvojen i izmjerena je

    apsorbancija pri 532 nm iz koje je putem Beer-Lambertovog zakona izračunata ukupna

    koncentracija MDA, izraţena kao nmol MDA po mg proteina.

    2.2.8 Statistička analiza podataka

    Softverski program "Statistica" korišten je za statističku analizu istraţivanjem dobivenih

    podataka. Provedena je analiza varijance (ANOVA) koja je dala pregled u podudarnostima i

    razlikama između pojedinih pokusnih grupa, a razlike između grupa potvrđene su LSD post

    hoc testom. Određena je vrijednost medijana i standardne devijacije pokusnih ţivotinja u

    grupama. Dobiveni podatci korišteni su u daljnjoj analizi podudarnosti i razlika između

    pojedinih varijabli koje su mjerene u ovome istraţivanju.

  • 3. Rezultati

    3.1 Aktivnost katalaze

    Mjerenje aktivnosti katalaze u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane

    ginkom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te

    ginkalertom pokazuju smanjenu stopu aktivnosti u usporedbi s kontrolnom grupom, grupa

    tretirana vulkanom pokazuje višu stopu aktivnosti, a grupe tretirane acetilsalicilnom

    kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju sličnu stopu

    aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 11.)

    Slika 11. Aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga (P CAT). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje aktivnosti katalaze u kortikalnoj regiji je pokazalo da grupe tretirane ginkom,

    varfarinom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom pokazuju niţu

    stopu aktivnosti od kontrolne grupe, dok grupe tretirane vulkanom, acetilsalicilnom

    kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju

    sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna.

    (Slika 12.)

    Slika 12. Aktivnost katalaze u kortikalnoj regiji mozga (C CAT). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje aktivnosti katalaze u regiji malog mozga je pokazalo da grupe tretirane ginkom,

    vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom

    kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti od kontrolne

    grupe, grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom ima povećanu stopu aktivnosti u

    odnosu na kontrolnu grupu, dok grupa tretirana varfarinom ima sličnu stopu aktivnosti kao

    kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 13.)

    Slika 13. Aktivnost katalaze u regiji malog mozga (CI CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa

    tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom

    kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:

    grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka

    i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa

    tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • 3.2 Aktivnost SOD

    Mjerenje aktivnosti SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane

    vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i

    acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju višu stopu aktivnosti

    od kontrolne grupe, grupa tretirana ginkalertom ima manju stopu aktivnosti, a grupe tretirane

    ginkom te ginkom i varfarinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Porast

    aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.(Slika 14.)

    Slika 14. Aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga (P SOD). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje aktivnosti SOD-a u kortikalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom,

    acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom

    kiselinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok

    grupe tretirane vulkanom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom

    imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan kod grupe

    tretirane ginkalertom. (Slika 15.)

    Slika 15. Aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga (C SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa

    tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom

    kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:

    grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka

    i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa

    tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje aktivnosti SOD-a u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane

    acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, ginkom i varfarinom te

    ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane

    ginkom, vulkanom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom

    kiselinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan

    kod grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 16.)

    Slika 16. Aktivnost SOD-a u regiji malog mozga ( CI SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa

    tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom

    kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:

    grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka

    i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa

    tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • 3.3 Koncentracija GSH

    Mjernje koncentracije GSH u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i

    varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i

    acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na

    kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom i

    varfarinom imaju koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički

    značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,

    ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 17.)

    Slika 17. Koncentracija glutationa u prefrontalnoj regiji mozga (PGSH). C: kontrolna grupa,

    G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje koncentracije GSH u kortikalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i

    varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i

    acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na

    kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom imaju

    manju koncentraciju GSH u odnosu na kontrolnu grupu. Porast koncentracije je statistički

    značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,

    ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 18.)

    Slika 18. Koncentracija glutationa u kortikalnoj regiji mozga (C GSH). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

  • Mjerenje koncentracije GSH u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane vulkanom,

    vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom

    i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu koncentracije GSH u odnosu na

    kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom imaju

    koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički značajan kod

    grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i

    varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 19.)

    Slika 19. Koncentracija glutationa u regiji malog mozga (CI GSH). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • 3.4 Koncentracija MDA (malondialdehid)

    Mjerenje koncentracije MDA u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane

    acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i

    varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju

    MDA u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom te vulkanom i

    varfarinom imaju koncentraciju MDA poput kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je

    statistički značajan kod grupa tretiranih varfarinom, ginkom i varfarinom te ginkom i

    acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 20.)

    Slika 20. Koncentracija malondialdehida u prefrontalnoj regiji mozga (P MDA). C: kontrolna

    grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje koncentracije MDA u kortikalnoj regiji pokazalo je da sve grupe imaju manju

    koncentraciju MDA od kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je statistčki značajan kod

    grupa tretiranih s acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. (Slika

    21.)

    Slika 21. Koncentracija MDA u kortikalnoj regiji mozga (C MDA). C: kontrolna grupa, G:

    grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

    acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

    ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

    kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • Mjerenje koncentracije MDA u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom i

    vulkanom imaju višu koncentraciju MDA od kontrolne grupe, dok grupe tretirane varfarinom,

    vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom

    kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju MDA od kontrolne grupe, a grupe

    tretirane acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i varfarinom imaju koncentraciju MDA

    poput kontrolne grupe. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 22.)

    Slika 22. Koncentracija MDA u regiji malog mozga (CI MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa

    tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom

    kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:

    grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka

    i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa

    tretirana ginkalertom.

    srednja vrijednost

    standardna devijacija

    vrijednosti koje

    odskaču

    ekstremi

  • 3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima

    Priloţeni su tablični prikazi statistički značajnih promjena po regiji mozga i po markerima

    oksidativnog stresa. (Tablice 3. i 4.)

    Tablica 3. Prikaz statistički značajnih promjena po regiji mozga. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:

    koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost

    katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,

    C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:

    aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija

    GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga

    0: nema statistički značajne promjene

    Regija

    mozga

    Ginko Vulkan Acetilsalicilna

    kiselina

    Varfarin Vulkan

    +

    Varfarin

    Vulkan

    +

    Acetilsalicilna

    kiselina

    Ginko

    +

    Varfarin

    Ginko

    +

    Acetilsalicilna

    kiselina

    Ginkalert

    P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0

    P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0

    C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad

    C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0

    Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0

    Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0

  • Tablica 4. Prikaz statistički značajnih promjena po markerima oksidativnog stresa. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:

    koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost

    katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,

    C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:

    aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija

    GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga.

    0: nema statistički značajne promjene

    Markeri Ginko Vulkan Acetilsalicilna

    kiselina

    Varfarin Vulkan

    +

    Varfarin

    Vulkan

    +

    Acetilsalicilna

    kiselina

    Ginko

    +

    Varfarin

    Ginko

    +

    Acetilsalicilna

    kiselina

    Ginkalert

    P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

    P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0

    C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad

    Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0

    P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

    P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0

    C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0

    Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0

  • 4. Rasprava

    Rastuća popularnost biljnih pripravaka, praćena njihovom lakom dostupnosti, dovodi do

    njihovih sve češćih uzimanja uz klasične farmakoterapije. Iako se reklamiraju kao sigurni i

    bez nuspojava u kombinaciji s klasičnim lijekovima su primijećene interakcije u djelovanju. U

    ovom istraţivanju smo pratili učinke nekih popularnih biljnih pripravaka i klasičnih lijekova

    na markere oksidativnog stresa na tri različite regije mozga štakora. Kako su za korištene

    biljne pripravke studije pokazale moguć antioksidativni utjecaj i kako se smatra da imaju

    utjecaj na kognitivne sposobnosti, zanimalo nas je mijenjaju li u interakciji s klasičnim

    lijekovima oksidativnu ravnoteţu u mozgu. Tretirali smo deset grupa ţivotinja s tri biljna

    pripravka (tabletama ginka, vulkanom i ginkalertom), dva klasična lijeka (varfarinom i

    acetilsalicilnom kiselinom), njihovim kombinacijama i fiziološkom otopinom. Ţivotinje su

    bile tretirane oralnim putem tako da bi supstance prošle jednak metabolički put kao kod ljudi

    koji ih uzimaju. Razine markera oksidativnog stresa su praćene u tri regije mozga:

    prefrontalnoj regiji, kortikalnoj regiji i regiji malog mozga, kako bi pokrili što veći dio mozga

    i regije odgovorne za kognitivne sposobnosti. Dobiveni rezultati su uspoređivani s grupom

    tretiranom fiziološkom otopinom koja je bila kontrolna grupa.

    Tretirane grupe su pokazale brojna odstupanja u razinama markera oksidativnog stresa u

    odnosu na kontrolnu grupu. Grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom je pokazala smanjenu

    aktivnost SOD-a u regiji malog mozga i manju koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji

    mozga. Ti rezultati se poklapaju s pretpostavljenim antioksidativnim učincima acetilsalicilne

    kiseline. Smanjena aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat aspirinom smanjene razine

    vaskularne produkcije O2-

    inhibicijom NAD(P)H oksidazne aktivnosti (Tauseef i sur. 2008),

    odnosno aspirinom posredovane inhibicije NOS-II i inhibicije COX enzima. Acetilsalicilna

    kiselina moţe dovesti do acetilacijelizinskih nastavaka proteina, koji igraju ulogu u njihovoj

    zaštiti od slobodnih radikala (Awtry i Loscalzo, 2000), što bi, zajedno s manjom stopom

    produkcije slobodnih radikala, moglo objasniti niţu koncentraciju MDA.

    Grupa tretirana varfarinom je pokazala manju koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji

    mozga. Smanjena koncentracija MDA kod tretmana varfarinom bi mogla biti rezultat

    djelovanja varfarina, koji moţe dovesti do smanjene pokretljivosti i veće gustoće lipidne

    membrane, što oteţava pristup slobodnim radikalima i smanjuje stopu lipidne peroksidacije.

    (Amin i sur. 1986)

  • Grupa tretirana vulkanom i varfarinom je pokazala veću aktivnost SOD-a i koncentraciju

    GSH u sve tri regije mozga. Povećana aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat sinergije

    antikoagulacijskog djelovanja varfarina i vazodilatatorskog djelovanja ginka prisutnog u

    vulkanu (Beikang i sur. 2014), što moţe dovesti do krvarenja i veće razine oksidativnog

    stresa. Kako grupe tretirane samo varfarinom ili samo vulkanom nisu pokazale slične

    promjene aktivnosti, čini se da je povećana aktivnost rezultat međudjelovanja. Povećana

    koncentracija GSH bi mogla biti odgovor organizma na opisano krvarenje uzrokovano

    interakcijom vulkana i varfarina, potpomognuto antioksidativnim učinkom biljnih ekstrakata

    koji se nalaze u vulkanu (López i sur. 2009; Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).

    Grupa tretirana ginkom i varfarinom je pokazala veću koncentraciju GSH u sve tri regije

    mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana koncentracija

    GSH moţe biti objašnjena indirektnim antioksidativnim djelovanjem ekstrakta lista ginka.

    Indirektan antioksidativan učinak ekstrakta lista ginka djeluje preko terpenoida prisutnih u

    ekstraktu lista ginka (Mahadevan i Park, 2008), koji mogu povećavati aktivnost

    antioksidativnih enzima, i flavonoida koji inhibiraju enzim COX2 i smanjuju razinu slobodnih

    radikala u organizmu. Smanjena koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena već navedenim

    djelovanjem varfarina te direktnim i indirektnim antioksidativnim učincima ekstrakta lista

    ginka. Spojevi prisutni u ekstraktu lista ginka mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti

    stopu lipidne peroksidacije (Mahadevan i Park, 2008). Moguća je interakcija između

    inhibicije COX2, povećane aktivnosti antioksidativnih enzima, vezanja radikala i veće

    gustoće lipidnih membrana.

    Grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala povećanu koncentraciju GSH

    u sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana

    koncentracija GSH bi mogla biti rezultat već opisanih antioksidativnih učinaka ginka, dok bi

    niţa koncentracija MDA mogla biti rezultat sinergističkog učinka s acetilsalicilnom kiselinom

    koja acetiliralipidne proteinske nastavke i smanjuje produkciju O2-

    i spojeva prisutnih u

    ekstraktu lista ginka koji veţu slobodne radikale.

    Grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala veću koncentraciju GSH u

    sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji mozga. Povećana

    koncentracija GSH bi se mogla objasniti antioksidativnim učincima ekstrakta biljaka nađenih

    u vulkanu, osobito ginku. Niţa koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena interakcijom već

    navedenih mehanizama acetilsalicilne kiseline (acetilacijalizinskih nastavaka proteina i

  • smanjene stopa produkcije slobodnih radikala) i brojnih polifenola prisutnih u vulkanu, koji

    mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti stopu lipidne peroksidacije (López i sur. 2009;

    Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).

    Grupa tretirana ginkalertom je pokazala smanjenu aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga

    i povećanu koncentraciju GSH u prefrontalnoj regiji mozga i regiji malog mozga. Smanjena

    aktivnost SOD-a bi mogla biti objašnjena interakcijom ekstrakta lista ginka, koji moţe vezati

    slobodne radikale i inhibira COX 2 enzim time smanjujući produkciju slobodnih radikala, sa

    ekstraktom gotu kole i antocijana prisutnih u ekstraktu borovnice (Chu i sur. 2011) koji mogu

    vezati slobodne radikale i kelirati metale te tako smanjiti sveukupni oksidativni stres, jer

    grupa tretirana samo ginkom nema smanjenu stopu aktivnosti SOD što navodi da je to rezultat

    interakcije. Povećana koncentracija GSH se moţe objasniti već navedenim antioksidativnim

    učinkom ekstrakta lista ginka, gotu kola također moţe povećati aktivnost antioksidativnih

    enzima, a antocijani prisutni u ekstraktu borovnice mogu dovesti do povećanja razine GSH

    (Chu i sur. 2011).

    Dobiveni rezultati pokazuju najveće promjene kod grupa koje su uzimale kombinacije biljnih

    pripravaka i klasičnih lijekova, što upućuje na zaključak da su promjene u razini oksidativnog

    stresa rezultat interakcije, obzirom na to da se grupe tretirane ginkom i vulkanom ne razlikuju

    od kontrolne grupe, a promjene kod grupa s kombinacijama su drukčije od grupa tretiranih

    acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Promjene su zabiljeţene kod aktivnosti SOD i

    koncentracija GSH i MDA, dok aktivnost katalaze nije odstupala od vrijednosti kontrole.

    Najveća odstupanja koncentracije GSH, prisutna su kod grupa tretiranih kombinacijama

    biljnih pripravaka i klasičnih lijekova. Zabiljeţen je porast koncentracije GSH u sve tri regije

    mozga i smanjena koncentracija MDA. Povećana koncentracija GSH vjerojatno nije samo

    rezultat antioksidativnog djelovanja biljnih suplemenata jer nije zabiljeţena kod grupa

    tretiranih samo biljnim suplementima pa je vjerojatno da dolazi do povećane produkcije

    oksidativnih radikala. Smanjena koncentracija MDA je zapaţena i kod grupa tretiranih samo

    klasičnim lijekovima i moţe se objasniti njihovim djelovanjem. Grupa tretirana vulkanom i

    varfarinom pokazuje porast aktivnosti SOD-a i koncentracije GSH i jednaku razinu MDA kao

    i kontrolna grupa, dok je grupa tretirana s varfarinom imala smanjenu koncentraciju MDA. To

    sugerira da je interakcija biljnih ekstrakata u vulkanu s varfarinom dovela do povećanja

    oksidativnog stresa u mozgu, koji je poništio zaštitni učinak varfarina na lipidne membrane.

    Suprotno tome, grupa tretirana ginkalertom, koji je mješavina biljnih ekstrakata, pokazuje pad

    razine SOD-a, porast koncentracije GSH i koncentraciju MDA u razini kontrolne grupe i

  • grupa tretiranih samo biljnim suplementima, što moţe upućivati na sinergistički učinak

    antioksidansa u toj kombinaciji biljnih ekstrakata, koja bi mogla djelovati neuroprotektivno

    ali bi i mogla narušavati biološke procese regulirane slobodnim radikalima.

  • 5. Zaključak

    Iako se sluţbeno reklamiraju kao pripravci koji nemaju nuspojave i kontraindikacije, ovo

    istraţivanje je potvrdilo da postoji interakcija između klasičnih lijekova i biljnih suplemenata.

    Razine aktivnosti i koncentracije markera oksidativnog stresa kod grupa tretiranih

    kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova bile su značajno promijenjene u odnosu

    na kontrolnu grupu.

    Koncentracija GSH je bila značajno povećana u svim regijama mozga kod grupa tretiranih

    kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova što bi moglo biti indikator potencijalne

    toksičnosti. Koncentracija MDA je bila smanjena u regiji prefrontalnog korteksa kod grupa

    tretiranih ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom i u kortikalnoj regiji kod

    grupe tretirane vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. Aktivnost SOD-a je povećana u

    prefrontalnoj regiji kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.

    Grupa tretirana vulkanom i varfarinom koja uz povećane koncentracije GSH ima i povećanu

    aktivnost SOD-a i višu koncentraciju MDA od drugih grupa tretiranih kombinacijama

    predstavlja najveću promjenu razina oksidativnog stresa.

    Laka dostupnost klasičnih lijekova i biljnih suplemenata, uz njihovu sve veću popularnost,

    nuţno dovodi do sve češćih zajedničkih uzimanja, stoga su potrebna daljnja istraţivanja da bi

    se razjasnile posljedice njihovog zajedničkog uzimanja.

  • 6. Popis literature

    Abebe W. (2002): Herbal medication: Potential for adverse interactions with analgesic drugs.

    Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 27:391-401

    Awtry E. H.,Loscalzo J. (2000): Aspirin. Circulation 101:1206–1218

    Beikang G., Zhen Z., Zhong Z. (2014): Updates on the Clinical Evidenced Herb-Warfarin

    Interactions. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 18 str.

    Bilia A. R. (2002): Ginkgo biloba Fitoterapia 73:276–9

    Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O. (2012): Oxidative stress and

    antioxidant defense. World Allergy Organization Journal 5:9–19

    Browne S. E., Ferrante R. J., Beal M. F. (1999): Oxidative stress in Huntington’s disease.

    Brain Pathology 9:147–163

    Chu W., Cheung S. C. M., Raw L., et al. (2011): Bilberry (Vaccinium myrtillus) U: Benzie

    IFF, Wachtel-Galor S, editors. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects.

    2.izdanje. Boca Raton (FL): CRC Press; Chapter 4.

    DIRECTIVE 2001/83/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL

    of 6 November (2001): on the Community code relating to medicinal products for human use.

    OJ L 311, p. 67

    Droy-Lefaix M. T. (1997): Effect of the antioxidant action of Ginko biloba extract (EGb 761)

    on aging and oxidative stress, AGE, 3: 141

    Dülger G. (2012): Herbal drugs and drug interactions. Marmara Pharmaceutical Journal 16:

    9-22

    Flohé L, Otting F. (1984) Superoxide dismutase assays. Methods in Enzymology 105:93–104.

    Gohil K. J., Patel J. A., Gajjar A. K. (2010): Pharmacological Review on Centella asiatica: A

    Potential Herbal Cure-all. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences,72, 546–556.

  • Hirsh J., Fuster V., Ansell J., Halperin J. (2003): American Heart Association/American

    College of Cardiology Foundation guide to warfarin th