Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih ... · Reakcija reaktivnih radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem lipidnog

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Jure Krasić

Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na

oksidativni stres u mozgu štakora

Diplomski rad

Zagreb, 2015.

Ovaj rad je izrađen na Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom izv.prof.dr.sc. Domagoja Đikića, Rad je predan na

ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi

stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni

stres u mozgu štakora

Jure Krasić

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

Prethodna toksikološka istraţivanja ukazuju da su krvno moţdana barijera i cirkulacija

središnjeg ţivčanog sustava vrlo osjetljivi na učinke lijekova s vazodilatacijskim ili

antikoagulativnim svojstvima. Na staničnoj razini, dobro su opisani štetni učinci oksidativnog

stresa uzrokovanog lijekovima uobičajenima u domaćinstvu, koji se uzimaju bez recepta

(acetilsalicilna kiselina) te biljnih lijekova i tableta (npr. ginko) ili lijekova na recept s

antikoagulativnim svojstvima (varfarin). Mnogo manje se zna o međusobnim interakcijama

navedenih tvari na razine oksidativnog stresa, osobito u mozgu. U okviru ovog rada štakori

soja Y59 tretirani su dnevno s odgovarajućim preporučenim dozama kombinacija

acetilsalicilne kiseline, ginka i varfarina, tijekom 15 dana. Razina oksidativnog stresa

procijenjena je mjerenjem četiri markera oksidativnog stresa; superoksid dismutaze (SOD),

katalaze (CAT), glutationa (GSH) i malondialdehida (MDA) u različitim regijama mozga.

Rezultati su pokazali promijenjene razine oksidacijskog stresa u prefrontalnom korteksu,

kortikalnoj regiji i malom mozgu izloţenih ţivotinja. Ove promjene ukazuju na sinergistički

toksični potencijal izazvan simultanim uzimanjem navedenih lijekova.

(47 stranica, 4 tablice, 22 slike, 35 literaturna navoda, jezik izvornika: Hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici

Ključne riječi: aspirin, varfarin, ginko (Ginkgo biloba), Centella asiatica,

oksidativni stres, mozak

Voditelj: izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić,

Ocjenitelji:

Rad prihvaćen:

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Division of Biology Graduation Thesis

The effects of vasodilators and anticoagulants on the oxidative stress

levels of the rat brain

Jure Krasić

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

Previous toxicological research showed that blood brain barrier and brain vascular system are

highly susceptible to the effects of pharmaceuticals with vasodilatation or anticoagulative

properties. The adverse effects on cellular oxidative stress caused by over the counter (OTC)

household drugs (acetylsalicylic acid), herbal remedies and pills (for example ginkgo) or

prescription drugs (warfarin) are well described. Much less is known about mutual interaction

between these substances on oxidative stress levels especially in the brain. Within this study

Y59 rats were treated daily with corresponding recommended doses and combinations of

acetylsalicylic acid, ginkgo and warfarine during 15 days. Four markers of oxidative stress

were assessed; superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), gluthathione (GSH) and

malondialdehyde (MDA) in various brain regions. The results have shown changes of

oxidative stress levels in prefrontal cortex, cortical regions and cerebellum of exposed

animals. These changes implicate synergistic and potentiated toxic potential of combinations

of named drugs.

(47 pages, 4 tables, 22 figures, 35 references, original in: Croatian)

Thesis deposited in the Central Biological Library

Key words: aspirin, warfarine, ginkgo (Ginkgo biloba), Centella asiatica,

oxidative stress, brain

Supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Assoc. Prof.

Reviewers:

Thesis accepted:

Sadržaj:

1 Uvod

1.1 Oksidativni stres 1

1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD 4

1.1.2 Katalaza 5

1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx) 6

1.2 Mozak 7

1.3 Klasični lijekovi 9

1.3.1 Acetilsalicilna kiselina 9

1.3.2 Varfarin 11

1.4 Biljni pripravci 13

1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji 13

1.4.2 Ginko 14

1.4.3 Gotu kola 16

1.4.4 Borovnica 17

1.4.5 Vulkan 17

1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka 17

1.5.1 Ginko i varfarin 18

1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina 18

1.6 Cilj istraţivanja 18

2 Materijali i metode 19

2.1 Materijali 19

2.2 Metode 20

2.2.1 Tretman ţivotinja 20

2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva 22

2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju 22

2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH) 23

2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) 24

2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze 24

2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije 24

2.2.8 Statistička analiza podataka 25

3 Rezultati 26

3.1 Aktivnost katalaze 26

3.2 Aktivnost SOD 29

3.3 Koncentracija GSH 32

3.4 Koncentracija MDA 35

3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima 38

4 Rasprava 40

5 Zaključak 43

6 Popis literature 44

1. Uvod

1.1 Oksidativni stres

Neravnoteţa između oksidansa i antioksidansa (u korist oksidansa) se naziva oksidativnim

stresom. Oksidativni stres uzrokuje štetne događaje poput lipidne peroksidacije i oksidativnog

oštećenja DNA, ali i regulira fiziološke procese i unutarstanični prijenos signala. Oksidansima

nazivamo molekule i ione koji imaju nesparene elektrone pa su zbog toga reaktivniji i

nestabilniji. Najčešći oksidansi su reaktivni kisikovi radikali (ROS) i reaktivni dušikovi

radikali (RNS) (Yoshikawa i Naito 2002). Oksidansi nastaju endogenim metaboličkim

reakcijama, kao posljedica ionizirajućeg zračenja, hiperoksije, izloţenosti ozonu i dimu te u

reakcijama s teškim metalima (Birben i sur. 2012).

Slika 1. Prikaz ravnoteţe i neravnoteţe sustava oksidativnog stresa (Preuzeto od -

http://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%

20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20he

alth.pdf )

ROS (eng. Reactive oxygen species) su najprisutniji izvor oksidativnog stresa u stanicama, a u

njih ubrajamo superoksidni radikal (O2-), hidroksilni radikal (

.OH) koji je najreaktivniji,

peroksilni radikal (R.O2), alkoksilni radikal (RO

.), hipokloritnu kiselinu (HClO), ozon (O3),

singletni kisik (1∆gO2) i vodikov peroksid (H2O2) (Slika 2.) (Birben i sur. 2012).

http://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20health.pdf



Slika 2. Najčešći kisikovi radikali i reakcije koje ih proizvode (Preuzeto s -

http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)

ROS-ovi nastaju neezimatski, Fentonovom i Haberovom reakcijom (Slika 3.) i enzimatski

(monoamin oksidazom u mitohondrijima u procesu nastanka ATP-a, NADPH

oksidazom/oksidativnim praskom, ksantin oksidoreduktazom, mijeloperoksidazom u

eozinofilima i neutrofilima, u procesu stvaranja hipoklorične kiseline itd.). Funkcija ROS-ova

u stanicama je raznolika: posreduju fagocitozu, apoptozu, reakcije detoksifikacije, sudjeluju u

inflamatornim procesima, uključeni su u signalne puteve odrţavanja stanične homeostaze itd.

ROS-ovi reguliraju razne metaboličke i stanične procese uključujući proliferaciju i migraciju

stanica, ekspresiju gena, imunost i zacjeljivanje. Glavna mjesta nastanka ROS-ova u

stanicama su mitohondriji i endoplazmatski retikulum (Birben i sur. 2012).

Slika 3. Fentonova i Haber-Weissova reakcija (Preuzeto s -

http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)

Oksidativni stres je povezan s patogenezom brojnih bolesti poput astme (disfunckija

mitohondrija), ateroskleroze (oksidativna modifikacija LDL-a), Alzheimerove i Parkinsonove

bolesti (Noori 2012). Stanične membrane lako oksidiraju u prisutnosti reaktivnih radikala

zbog velike koncentracije nezasićenih masnih kiselina u membranama. Reakcija reaktivnih

radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem

lipidnog hidroperoksida, koji se moţe dalje razgraditi u aldehid poput malonaldehida ili 4-

hidroksi-nonenala. Posljedice lipidne peroksidacije su promijenjena membranska fluidnost,

„cross-linking“ membranskih proteina te nastajanje lipid-protein i lipid-DNA udruţivanja koji

mogu oteţavati funkcioniranje stanice. Proteini mogu biti direktno i indirektno oštećeni u

interakciji s reaktivnim radikalima, što rezultira peroksidacijom, promjenama u tercijarnoj

strukturi, proteolitičkom degradacijom i fragmentacijama. DNA, unatoč tome što je stabilna i

dobro zaštićena molekula, moţe doći u interakciju s reaktivnim radikalima i proći razna

oštećenja, poput modifikacije DNA baza, jednolančanih i dvolančanih lomova DNA, gubitka

purina, oštećenja na deoksiriboznim šećerima i oštećenja sustava popravka DNA. Posljedica

oštećenja DNA je modifikacija genetskog materijala koja rezultira staničnom smrti,

mutacijama, karcinogenezom i starenjem (Kunwar i Priyadarsini, 2011).

Nekontrolirana proizvodnja reaktivnih radikala moţe dovesti do njihove akumulacije i

uzrokovati oksidativni stres u stanicama. Zbog toga su stanice evolucijski stekle brojne

obrambene mehanizme (Kunwar i Priyadarsini 2011). Prva linija obrane je prevencija

stvaranja reaktivnih radikala, bilo izbjegavanjem sunčevog zračenja traţenjem zaklona ili

pakiranjem DNA u kromatin da bi se zaštitio genetski materijal. Kelacija metala je bitan

faktor u kontroli lipidne peroksidacije i fragmentacije DNA, tako da su metal-vezujući

proteini (feritin, transferin itd.) bitni u prevenciji oštećenja. Također postoje i enzimatski

sustavi, poput glutation-S-transferaze, koji sprječavaju formiranja reaktivnih radikala

katalizom stvaranja tioetera iz tiola i glutationa djelovanjem citokroma P450. Druga linija

obrane je presretanje postojećih reaktivnih radikala koje moţe biti posredovano neezimatskim

antioksidansima ili enzimatskim antioksidansima. Neenzimatsko presretanje uključuje

prijenos od osjetljivijih dijelova stanice do specijalnih kompartimenata gdje se reaktivni

radikali prevode u nereaktivne i neradikalne metabolite - tu spadaju vitamini C i E, glutation

itd.. Sve stanice eukariotskih organizama sadrţe jake antioksidativne enzime. Tri glavne

skupine tih enzima su superoksid dismutaze (SOD), katalaze i glutation peroksidaze (GPx).

Zadnji korak obrane je faza popravka staničnim mehanizmima (Slika 4.) (Sies 1997).

Slika 4. Shematski prikaz enzimatskog i neenzimatskog antioksidativnog sustava (Preuzeto s -

http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-

for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-

antioxidant-actions )

1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD)

Superoksid dismutaza je najvaţniji antioksidativni enzim za sve tipove stanice jer je

superoksid najčešći ROS proizveden iz raznih izvora. SOD ima tri oblika, CuZn-SOD, Mn-

SOD i EC-SOD koji su široko rasprostranjeni u svim tkivima čovjeka. Mn-SOD je lokaliziran

u mitohondrijskom matriksu. EC-SOD je primarno lokaliziran u ekstracelularnom matriksu,

osobito u područjima koja sadrţe velike količine kolagenih vlakana tipa I i oko plućnih i

sistemskih ţila. Općenito, CuZn-SOD i Mn-SOD se smatraju glavnim presretačima

superoksidnih radikala. SOD prevodi superoksidne radikale nastale aerobnim metabolizmom

u manje reaktivne vrste (kisik i vodikov peroksid) (Slika 5.), čija se redukcija dalje nastavlja s

katalazom i glutation peroksidazom (Birben i sur., 2012).

http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-antioxidant-actions



Slika 5. Shema djelovanja SOD-a u mitohondrijima (Preuzeto s -

http://www.trevigen.com/item/5/25/0/636/HT_Superoxide_Dismutase_Assay_Kit/)

1.1.2 Katalaza

Katalaza je tetramerni enzim koji se sastoji od četiri identične podjedinice, od kojih svaka

sadrţi jednu hem grupu. Pri visokim koncentracijama vodikovog peroksida u stanici katalizira

reakciju dvije molekule vodikovog peroksida u dvije molekule vode i molekularni kisik. Pri

niskim koncentracijama vodikovog peroksida, uz prisutnost donora vodika, djeluje

peroksidativno, uklanja vodikov peroksid uz oksidaciju supstrata (Slika 6.). Katalaza štiti

stanice od endogeno proizvedenog vodikovog peroksida. Iako katalaza nije esencijalna za sve

tipove stanica u standardnim uvjetima, igra vaţnu ulogu u stjecanju tolerancije na oksidatvni

stres u adaptivnom odgovoru stanica. Stopa preţivljavanja štakora izloţenih 100% kisiku je

povećana kad su se liposomi koji sadrţe SOD i katalazu ubrizgali intravenozno prije i za

vrijeme izloţenosti 100% kisiku (Mates i sur. 1999). Katalaza veţe NADPH radi sprječavanja

oksidativne inaktivacije vodikovim peroksidom dok ga reducira u vodu (Birben i sur., 2012).

http://www.trevigen.com/item/5/25/0/636/HT_Superoxide_Dismutase_Assay_Kit/

Slika 6. Reakcije katalizirane katalazom (Preuzeto s - http://www.science-

projects.com/catalasekinetics.htm)

1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx)

Glutation peroksidaza je glikoprotein koji sadrţi seleno-cisteinski ostatak u svakoj od svoje

četiri podjedinice i esencijalan je za enzimsku aktivnost. Glutation peroksidaza katalizira

redukciju hidroperoksida pomoću glutationa, štiteći time stanice sisavaca od oksidativnog

oštećenja. Metabolizam glutationa je jedan od esencijalnih antioksidativnih obrambenih

mehanizama. Kod sisavaca postoji pet izoenzima GPX, koji su prisutni u svim stanicama i

tkivima i čija razina ovisi o tipu tkiva. Glutation peroksidaza reducira lipidne hidroperokside i

vodikov peroksid u odgovarajuće alkohole i vodu, koristeći glutation kao donor elektrona koji

se oksidira do glutationdisulfida (GSSG) (Slika 7.). Iako GPX i katalaza oboje kataliziraju

redukciju vodikovog peroksida, samo GPX moţe reducirati lipidne i druge organske

hidroperokside koji su glavni uzrok niskih razina oksidativnog stresa (Mates i sur. 1999).

Slika 7. Shema djelovanja glutation peroksidaze (Preuzeto s -

http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/14/3927.figures-only)

http://www.science-projects.com/catalasekinetics.htm

http://www.science-projects.com/catalasekinetics.htm

http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/14/3927.figures-only

1.2 Mozak

Mozak je središnji organ ţivčanog sustava kod svih kraljeţnjaka i većine beskraljeţnjaka.

Mozak se nalazi u glavi, smješten blizu primarnih senzoričkih organa i najkompleksniji je

organ u kraljeţnjaka. Fiziološka funkcija mozga je ispoljavanje centralizirane kontrole nad

organima tijela, što omogućuje brze i koordinirane odgovore na promjene u okolišu. Osnovni

tipovi odgovora, poput refleksa, mogu biti posredovani leđnom moţdinom ili periferalnim

ganglijima, ali sofisticirana usmjerena kontrola ponašanja, zasnovana na kompleksnim

senzoričkim ulaznim signalima, zahtijeva sposobnosti integriranja informacija kakve ima

centralizirani mozak (Pelvig i sur. 2008).

Mozak se primarno sastoji od dvije skupine stanica - neurona i glija stanica. Glija stanice

sluţe za strukturalnu potporu, metaboličke funkcije, izolaciju, obranu, usmjeravanje razvoja i

popravak, dok neuroni imaju jedinstvenu sposobnost slanja signala specifičnim stanicama

preko velikih udaljenosti. Signali putuju preko aksona (mijelinizirano tanko protoplazmičko

vlakno neurona) u obliku elektrokemijskih izboja (akcijskog potencijala), a podraţuju druge

neurone preko sinapsi (specijalizirane pukotine). Akcijski potencijal putuje niz akson, dolazi

do sinapse, potiče lučenje neurotransmitera u sinapsu, koji se veţu na receptorne molekule u

membrani ciljne stanice (Kandel i sur. 2000).

Eksperimentalno, studijama oksidativne ravnoteţe se pristupa na dva načina: genetskom

eliminacijom antioksidativnog mehanizma i augmentacijom antioksidativne obrane. Prvim

načinom je pokazano kako je utišavanje Cu/Zn SOD u miševa povezano s povećanom stopom

neuronalnih oštećenja i smrti. Eliminacija mitohondrijskog SOD-a je pokazala drastičnije

učinke, koji su letalni u neonatalnom periodu. Miševi bez ekspresije Mn-SOD, uz zatajenje

srca, pate od poremećaja u CNS-u poput mitohondrijske vakuolizacije i oksidacije lipidnih

zaliha. Miševi s niskim razinama glutation peroksidaze su osjetljiviji na ishemiju i

neurotoksine. Miševi deficijentni u transportnom proteinu vitamina E razvijaju ataksiju i

neurodegenerativne bolesti, dok je povećan unos vitamina E pokazao da usporava progresiju

Alzheimerove bolesti (Browne i sur. 1999).

Povećana koncentracija metala (poput bakra i cinka) ubrzava nakupljanje amiloida. Za redoks

aktivne metale (poput bakra i ţeljeza) se pretpostavlja da sudjeluju u raznim oksidativnim

procesima, poput oksidacije proteina inducirane Aβ peptidom i inaktivacije antioksidativnih

mehanizama poput hem oksigenaze. Kelacija bakra Clioquinolom je pokazala da usporava

nakupljanje amiloidnih naslaga u Alzheimereovoj bolesti kod miševa (Huang i sur. 1999).

Genetski i biokemijski pristupi poboljšavanju antioksidativne obrane idu u prilog teoriji kako

je oksidativni stres kritičan mehanizam u neurodegeneracijskim putevima. Prekomjerna

ekspersija Cu/Zn SOD-a kod transgeničnih miševa i štakora pruţa značajnu zaštitu od

ishemije, hladnog edema i neurotoksina i promiče preţivljavanje neurona u kulturi stanica i

nakon transplantacije. Genetski inducirana povećana ekspresija Tn-SOD-a djeluje protektivno

na mitohondrije i stanice od oksidativnog stresa. Povećana ekspresija vanstaničnog SOD-a ili

glutation peroksidaze je pokazala protektivan učinak od raznih neurotoksina na CNS. Studije

na mušicama i gujavicama su pokazale da povećana ekspresija SOD-a i katalaze značajno

produţuje njihov ţivotni vijek. Kod knockout mušica, moţe se povećati ţivotni vijek do 60%

ţivotnog vijeka divljeg tipa ekspresijom SOD-a u motornim neuronima. Nova saznanja

impliciraju da antioksidativni enzimi i mali antioksidansi (vitamin E i C, kelacija metala)

igraju vaţnu ulogu u zaštiti CNS-a (Ischiropoulos i Beckman 2003).

Slobodne radikale mogu proizvesti sve stanice mozga, npr. NADPH oksidazu (enzim koji

katalizira produkciju superoksida kod fagocita) ne eksprimiraju samo mikroglija stanice, već i

neuroni i astroglija. Superoksid ni vodikov peroksid nisu osobito toksični, dok se hidroksilni

radikal često navodi kao jedan od najtoksičnijih slobodnih radikala in vivo. Proizvodnja

hidroksilnog radikala Haber-Weissovom ili Fentonovom reakcijom je prespora i

prenespecifično je reaktivan da bi bio značajno toksičan. Da bi se u kulturi stanica primijetila

toksičnost vodikovog peroksida, njegova koncentracija mora biti veća od koncentracije kisika

u mediju (Tammariello i sur. 2000).

Dva su moguća puta povećanja toksičnosti djelomično reduciranih kisikovih radikala. Upalne

stanice uvelike povećavaju toksičnost vodikovog peroksida lučenjem peroksida i produkcijom

hipokloraste kiseline i drugih hipohalogenih kiselina. Stanice mogu povećati toksičnost

superoksida produkcijom dušikovog monoksida, koji zajedno reagiraju i proizvode

peroksinitrit, najbrţom reakcijom poznatoj biologiji. U prisutnosti ugljikovog dioksida,

peroksinitrit modificira proteine u nitrotirozine. Nitrotirozini mogu biti formirani

peroksidaznom oksidacijom nitrita (nusprodukta metabolizma dušikovog monoksida) i

vodikovog peroksida (Slika 8.). Doprinos dušikovog monoksida neuralnim oštećenjima je

pokazan uporabom inhibitora sintaze dušikovog monoksida (NOS) na sojevima miševa

deficijentnim za neuralnu izoformu NOS-a (NOS1). Miševi deficijentni u NOS1 imalisu

manju incidenciju moţdanog udara, veću otpornost na neurotoksičnost N-metil-D-aspartatom

i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom. Uz NOS1, studije su pokazale i učinak NOS2

(inducibilna forma NOS-a, primarno nađena u glija stanicama) na neuralna oštećenja. Plakovi

pacijenata oboljelih od multiple skleroze su pokazali povećanu imunoreaktivnost na NOS2 i

nitrotirozin. Nitracija je povezana s kompromitiranjem integriteta krvno moţdane barijere kod

multiple skleroze. Kod ţivotinjskih modela multiple skleroze i moţdanog udara, urična

kiselina se pokazala inhibitorom nitracije tirozina i pokazala je protektivan učinak na krvno

moţdanu barijeru. Blokada aktivacije NOS2 i mikroglija je pokazala neuroprotektivan učinak

kod Parkinsonove i Alzheimerove bolesti. Aktivacija mikroglija stanica (koja dovodi do

formiranja peroksinitrita) je povezana s Aβ peptidom uzrokovanom neurotoksičnosti

(Ischiropoulos i Beckman 2003).

Slika 8. Shema reakcija kisikovih radikala i dušikovog monoksida (Preuzeto s -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC151889/)

1.3 Klasični lijekovi

1.3.1 Acetilsalicilna kiselina

Acetilsalicilna kiselina (aspirin) je trenutno nakorišteniji lijek na planeti, on je nesteroidni

antiinflammatorni lijek antipiretičkog i analgetičkog učinka. Glavni mehanizam njegovog

djelovanja je sprječavanje biosinteze prostaglandina preko inhibicije ciklooksigenaznih

enzima (Vane i Botting 2003).

Aspirin interferira s biosintezom cikličnih prostanoida (tromboksana A2 – TXA2 i

prostaciklina) i drugih prostaglandina (PGE2 i PGI2). Prostanoidi nastaju enzimski

kataliziranom oksidacijom arahidonske kiseline (iz membranskim fosfolipida). Prostaglandin

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC151889/

H-sintetaza metabolizira arahidonsku kiselinu u PGG2 i PGH2 zbog svog ciklooksigenaznog i

peroksidaznog učinka (Slika 9.). PGG2 dalje modificiraju specifične sintetaze do TXA2 i

prostaciklina.

Prostaglandin H-sintetaza (COX) postoji u dvije izoforme koje imaju velik postotak

homologije u aminokiselinskoj sekvenci. Prva izoforma (COX-1) je eksprimirana u

endoplazmatskom retikulumu većine stanica i sintetizira homeostatske prostaglandine

zasluţne za obavljanje normalnih staničnih funkcija, poput zaštite ţeluca mukoznim

sekretom, odrţavanja normalnog bubreţnog optoka krvi i regulacije aktivnosti i agregacije

trombocita. Druga izoforma (COX-2) se ne nalazi aktivna u većini stanica sisavaca, ali je brzo

induciraju inflamatorni signali i faktori rasta, što rezultira u sintezi prostaglandina koji

doprinose upalnom odgovoru.

Slika 9. Shema sinteze prostaglandina iz arahidonske kiseline (Preuzeto s -

http://circ.ahajournals.org/content/101/10/1206.full.pdf)

Aspirin ima značajan antitrombotičan učinak koji ostvaruje preko inhibicije PGH-sintaze

(COX) ireverzibilnom actilacijom Ser530 (u COX-1 izoformi) ili Ser516 (u COX-2 izoformi).

Aspirin potpuno inaktivira COX-1, dok COX-2 ne inaktivira potpuno, već mu mijenja

djelovanje tako da arahidoničnu kiselinu ne metabolizira u PGH2, već u 15-R-HETE. Kako

http://circ.ahajournals.org/content/101/10/1206.full.pdf

prisustvo aspirina onemogućuje produkciju PGH2, kod obje izoforme (nuţan korak u

produkciji prostanoida) dolazi do smanjene produkcije prostaglandina i tromboksana, što je

odgovorno za pozitivne i negativne učinke aspirina.

Aspirin također štiti LDL od oksidativnih modifikacija te tako sprječava ili usporava

aterosklerozu (Awtry i Loscalzo 2000).

Aspirin smanjuje razinu vaskularne produkcije O2-

smanjivanjem NAD(P)H oksidazne

aktivnosti (Tauseef i sur. 2008).

Predloţeno je nekoliko mehanizama antioksidativnog učinka aspirina. Salicilat je inhibitor

indukcije ovisne o citokinu genske ekspresije NOS-II preko mehanizma koji uključuje

aktivaciju NF-kB, što dovodi do smanjenja oksidativnog stresa koji prati produkciju citokina.

Aspirin redukcijom hidroksilnih radikala prelazi u derivate 2,3- i 2,5-dihidroksibenzoata, koji

sluţe kao markeri oksidativnog stresa i smanjuju protok oksidativnih radikala. Aspirin moţe

acetilirati lizinske nastavke proteina što sprječava njihovu oksidaciju, što je bitan faktor u

antioksidativnoj zaštiti lipoproteina i fibrinogena (Awtry i Loscalzo 2000).

Nedavna istraţivanja na ljudskim HepG2 stanicama raka su pokazala da aspirin pokreće

apoptozu kod stanica raka. Aspirin u stanicama raka povećava produkciju slobodnih radikala,

smanjuje dostupnost staničnog glutationa i inhibira aktivnost kompleks respiratornih

mitohondrijskih enzima, NADH-ubiquinon oksidoreduktaze (kompleks 1), citokrom c

oksidaze (kompleks 4) enzim mitohondrijskog matriksa, akonitazu. Apoptozu pokreće

promjena u mitohondrijskoj permeabilnosti, inhibicija sinteze ATP-a, smanjena ekspresija

antiapoptotičkog proteina Bcl-2, oslobađanje citokroma c i aktivacija proapoptotičke kaspaze-

3 i enzima popravka DNA PARP (Raza i sur. 2010).

1.3.2 Varfarin

Varfarin je derivat kumarina s antikoagulativnim učinkom, kojeg ostvaruje interferiranjem u

interkonverziji vitamina K i njegovog 2,3-epoksida. Vitamin K je kofaktor za karboksilaciju

glutamatnih nastavaka do γ-karboksiglutamata na N-terminalnim regijama vitamin K ovisnih

proteina (među njima su koagulacijski faktori 2, 7, 9 i 10). Inhibicijom interkonverzijskog

ciklusa vitamina K, varfarin inducira jetrenu produkciju djelomično dekarboksiliranih

proteina s reduciranom koagulantskom aktivnosti.

Karboksilacija potiče vezanje vitamin K ovisnih koagulacijskih faktora na fosfolipidne

površine (što ubrzava koagulaciju krvi). Za γ-karboksilaciju je potreban reducirani oblik

vitamina K (vitamin KH2). Kumarin sprječava formiranje vitamina KH2 inhibicijom enzima

vitamin K epoksid reduktaze i time ograničava γ-karboksilaciju Vitamin K ovisnih

koagulacijskih proteina (Slika 10.). Uz to, antagonisti vitamina K inhibiraju karboksilaciju

regulatornih antikoagulacijskih proteina C i S. Antikoagulativne efekte kurmarina moguće je

nadvladati niskim dozama vitamina K1 jer vitamin K1 zaobilazi vitamin K epoksid

reduktazu.Varfarin također interferira u karboksilaciji Gla proteina sintetiziranih u kostima.

Slika 10. Prikaz djelovanja varfarina na ciklus vitamina K (Preuzeto s -

http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1132287)

Varfarin je racemična mješavina dva optički aktivna izomera, R i S forme, u otprilike

jednakim odnosima. Brzo se upija kroz probavni sustav, ima visoku biodostupnost te doseţe

najvišu koncentraciju u krvi za 90 minuta nakon oralnog uzimanja. Racemični varfarin ima

poluţivot između 36 i 42 sata, cirkulira vezan za proteine plazme (najčešće albumine) i

nakuplja se u jetri gdje dva izomera prolaze različite metaboličke puteve (Hirsh i sur. 2003).

S-varfarin se metabolizira u neaktivne metabolite (S-7 hidroksivarfarin) izoenzimom

CYP2C9, dok se R-varfarin metabolizira izoenzimima CYP1A2, CYP2C19 i CYP3A4 u 6-,

8- i 10-hidroksivarfarin. Neaktivni metaboliti se izlučuju urinom i fecesom (Teles i sur. 2012).

http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1132287

Odnos između doze varfarina i njegovog odgovora je uvjetovan genetskim i okolišnim

faktorima. Bitni genetski faktori su učestale mutacije u genu za kodiranje citokroma P450,

jetrenog enzima odgovornog za metabolizam S izomera varfarina. Opisano je nekoliko

genetskih polimorfizama za enzim, koji su povezani uz niţe potrebne doze i veću stopu

nuspojava krvarenja u odnosu na divlji tip enzima CYP2C9 i VKORC1. Uz brojne genetske i

okolišne faktore, na odgovor varfarina utječu drugi lijekovi, prehrana i brojne bolesti (Hirsh i

sur. 2003).

Interakcije varfarina s drugim supstancama se dijele u dvije kategorije: farmakokinetske i

farmakodinamičke efekte.

Interakcije koje modificiraju farmakokinetiku varfarina uključuju promjene u apsorpciji (koja

smanjuje antikoagulacijski efekt), metabolizmu (induciranjem izoenzima CYP2C9 što

smanjuje antikoagulativan učinak, enzimskom inhibicijom CYP2C9 koja povećava

antikoagulativan učinak) i transportu (spojevi koji se veţu na proteine plazme, osobito

albumin, dislociraju vezani varfarin što povećava koncentraciju slobodnog varfarina u krvi i

antikoagulativan učinak).

Interakcije koje modificiraju farmakodinamiku varfarina uključuju sinergizme (djelovanje na

hemostazu i smanjivanje sinteze koagulacijskih faktora), kompetitivni antagonizam (vitamin

K) i promjene u fiziološkoj kontroli ciklusa vitamina K (nasljedna otpornost na oralne

antikoagulante) (Teles i sur. 2012).

1.4 Biljni pripravci

1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji

Od početaka ljudske civilizacije, biljni pripravci su se koristili za liječenje raznih bolesti i

poboljšanje zdravlja. Prema procjenama Svjetske zdravstvene organizacije 80% svjetske

populacije koristi biljne pripravke u nekom obliku iz zdravstvenih razloga. Veliki razlog

njihove popularnosti leţi u njihovoj lakoj dostupnosti i u tome što se smatraju zdravima, jer su

prirodni. Unatoč tome, mnogi od njih imaju ozbiljne nuspojave, bilo zbog direktnog toksičnog

učinka biljke, alergijskih reakcija, utjecaja kontaminanata, bilo zbog prisutnosti teških metala,

interakcije s klasičnim lijekovima ili nenavedenih farmaceutskih spojeva, namjerno i ilegalno

dodanih da bi se postigao ţeljeni učinak (Dulger, 2012.).

U skladu s europskim zakonodavstvom, da bi medicinski pripravci koji sadrţe biljne

supstance/preparate mogli biti pušteni na trţište, moraju spadati u jednu od tri navedene

kategorije:

1.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju medicinski tradicionalne upotrebe. Mora

postojati dovoljno informacija o njegovoj sigurnosti i njegova učinkovitost mora biti

uvjerljiva.

2.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju utemeljene upotrebe za medicinske svrhe.

Kriterij za to je znanstvena literatura koja potvrđuje da se aktivne supstance proizvoda

utemeljeno koriste u medicinske svrhe unutar Unije bar deset godina, s utvrđenom

učinkovitošću i prihvaćenom razinom sigurnosti.

3.) Proizvod se moţe odobriti nakon provjere prijave za puštanje na trţište koja se sastoji

od podataka o sigurnosti i učinkovitosti iz firme proizvođača (samostojeća studija) ili

kombinacije vlastitih podataka firme i postojećih bibliografskih podataka (mješovita

aplikacija). (DIRECTIVE 2001/83/EC)

1.4.2 Ginko

Ginko (Ginkgo biloba) je jedini ţivući član porodice Ginkgoaceae i spada u „žive fosile“

(najduţe ţivuće vrste na planeti), budući da postoje fosilni nalazi stari 150 milijuna godina.

Lišće i plodovi ginka su često korišteni u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje

plućnih, srčanih i mokraćnih problema te koţnih bolesti. Prije dvadesetak godina

standardiziran je ekstrakt lista ginka, Egb761, i najčešće se koristi kao suplement za

kognitivne probleme.

Standardizirani ekstrakt lista ginka Egb 761 sadrţi 24 % flavonoidnih glikozida, 6 %

terpenskih laktona, i manje od 5 ppm ginkolične kiseline (Droy-Lefaix, 2005).

Glavni farmakološki aktivni spojevi u ekstraktu lista ginka su flavonoidi i terpenoidi.

Flavonoidi prisutni u ekstraktu lista ginka su flavoni, flavonoli, tanini, biflavoni i vezani

glikozidi kvercitina i kamferola na 3-ramnozidima i p-kumarinskim esterima. Oni djeluju kao

antioksidansi, inhibitori enzima i kelatori kationa. Flavonoidni sastav listova ginka varira

između sezona. Biodostupnost flavonoida je relativno niska zbog ograničene apsorpcije i brze

eliminacije. Glikozidni oblik flavonoida se slabo apsorbira u crijevu, samo aglikonični oblik

se moţe direktno apsorbirati. Neapsorbirane flavonoide koji dospiju u debelo crijevo

http://link.springer.com/search?facet-creator=%22M.+T.+Droy-Lefaix%22

metaboliziraju bakterije a nakon toga se apsorbiraju u crijevu. Apsorbirani flavonoidi

dospijevaju do jetre, ondje se metaboliziraju u konjugirane derivate čija biološka aktivnost

nije uvijek ista kao u originalnih spojeva. Dva su tipa terpenoida prisutna u ekstraktu lista

ginka: ginkolidi i bilobalid (Bilia, 2002).

Ekstrakt lista ginka je pokazao pozitivne učinke u liječenju neurodegenerativnih bolesti poput

Alzheimerove, kardiovaskularnih bolesti, raka, stresa, gubitka pamćenja, tinitusa, bolesti

vezanih uz starenje i psihijatrijskih poremećaja poput šizofrenije. Ti učinci se objašnjavaju s

više mehanizama, poput antioksidativnog učinka, antiagregacijskog učinka (za srčane i krvno-

moţdane bolesti), inhibicije agregacije beta amiloidnih peptida (za usporavanje progresije

Alzheimerove) i smanjene ekspresije perifernih benzodiazepinskih receptora (za olakšanje

stresa i poboljšanje cirkulacije) (McKenna i sur. 2001).

Smatra se da je glavni mehanizam terapeutskog učinka ekstrakta lista ginka na kronične

bolesti (neurodegenerativne i kardiovaskularne bolesti i rak) njegovo antioksidativno

djelovanje. Dva su predloţena mehanizma njegovog djelovanja: vezanja slobodnih radikala i

indirektna inhibicija formiranja slobodnih radikala. Ekstrakt lista ginka moţe vezati kisikove

radikale poput hidroksilnih radikala, peroksidne radikale, superoksidnog aniona, NO-,

vodikovog peroksida i ţeljezne ione. Ekstrakt lista ginka moţe pojačati aktivnost

antioksidativnih enzima poput superoksid dismutaze, glutation peroksidaze katalaze i hem-

oksigenaze-1 i tako indirektno djelovati kao antioksidant. Studije također pokazuju da

ekstrakt lista ginka povećava ekspresiju mitohondrijskih enzima poput NADH dehidrogenaze,

što utječe na stvaranje kisikovih radikala u mitohondrijima, jer djeluje izravno na oksidativnu

fosforilaciju, što povećava razinu ATP-a i regulaciju energetskog metabolizma. U usporedbi s

drugim antioksidansima, ekstrakt lista ginka je regulativan i adaptivan, moţe dilatirati i

kontrahirati krvne ţile i kontrolirati neurokemikalije i neuroendokrine indikatore ovisno o

situaciji. Glavne aktivne tvari tih mehanizama su flavonoidi (kvercetin kempferol) i terpenoidi

(ginkolidi i bilobalid), koji doprinose antioksidativnom učinku na različite načine. Flavonoidi

djeluju preko inhibicije enzima ciklooksienaze 2 (COX2), koja je dio ciklusa sinteze

prostaglandina. Bilobalid povećava aktivnost antioksidativnih enzima (SOD-a i katalaze) i

poboljšava vijabilnost stanica.

Proantocijanidini prisutni u ekstraktu lista ginka se veţu na proteine i inaktiviraju

antioksidativne enzime (katalazu, glutation peroksidazu i laktat dehidrogenazu), tako da

njihova prisutnost u ekstraktu moţe smanjivati antioksidativni učinak ginka (Mahadevan i

Park, 2008).

1.4.3 Gotu kola

Gotu kola (Centella asiatica) je penjačica koja spada u porodicu Apiaceae, a nalazi se u

tropskom i suptropskom području Indije, Pakistana, Šri Lanke, Madagaskara, Juţne Afrike i

Istočne Europe. Cijela biljka se koristila za medicinske svrhe u tradicionalnoj indijskoj i

kineskoj medicini, za liječenje visokog tlaka, revitalizaciju moţdanih stanica i ţivaca,

emocionalne poremećaje i koţne bolesti (Gohil i sur. 2010).

Farmakološki aktivni spojevi gotu kole su triterpenski saponini (triterpenoidi) podnazivom

aziatikozidi od kojih su najpoznatiji madekasozid i madazijatska kiselina. Ti triterpeni saponini

i njihovi sapogenini se smatraju odgovornima za zaliječivanje rana i vaskualrno djelovanje

produkcijom kolagena na mjestu rane. Drugi spojevi izolirani iz gotu kole, poput brahmozida

i brahminozida, mogu biti odgovorni za djelovanje na CNS i relaksantno djelovanje, ali

njihovo djelovanje još nije klinički potvrđeno. Ekstrakti gotu kole sadrţe glikozide koji su

pokazali antifertilni učinak kod miševa. Centelozid i njegovi derivati su se pokazali

efikasnima u tretmanima venske hipertenzije. Među ekstraktima gotu kole se nalaze biljni

steroli, flavonoidi i spojevi za koje se ne zna farmakološka aktivnost (tanini, esencijalne

kiseline, fitosteroli, slobodne aminokiseline, flavonoidi, alkaloidi i masne kiseline)

(Srivastava i sur. 1997).

Gotu kola revitalizira mozak i ţivčani sustav, povećava koncentraciju i usporava starenje.

Studija na štakorima je pokazala antioksidativan učinak i kognitivno stimulirajući učinak.

Štakori tretirani s gotu kolom pokazuju dozno ovisan napredak kognitivnog ponašanja u

testovima pasivnog izbjegavanja i labirintskim testovima. Značajno smanjenje razine MDA i

povećanje razine katalaze i SOD-a je primijećeno kod štakora tretiranih visokim dozama gotu

kole (Hussin i sur. 2005). Također je dokazana povećana razina fosforilacije CREB-a (cyclic

AMP response element binding proteina) u kulturi stanica neuroblastoma i embrijskim

kortikalnim stanicama štakora tretiranih ekstraktom gotu kole. Pretpostavlja se da je za to

djelovanje odgovoran signalni putERK/RSK (extra cellular signal-regulated kinase-ribosomal

S6 kinaza). Studija na miševima, koji su oralno uzimali ekstrakt gotu kole 14 dana, pokazala

je povećanje razine antioksidativnih enzima (SOD-a, katalaze i glutation peroksidaze).

Derivati azijatske kiseline povećavaju razine antioksidativnih enzima u kulturi kortikalnih

stanica pa se pretpostavlja da štite stanice od oksidativne štete nastale zbog izloţenosti višim

razinama glutamata u ţivčanim stanicama. Azijatikozidni derivati su djelovali protektivno na

beta-amiloid neurotoksičnost u kulturi B103 stanica. Tri azijatikozidna derivata pokazuju

inhibiciju apoptoze uzrokovane beta-amiloidima i slobodnim radikalima (Gohil i sur. 2010).

1.4.4 Borovnica

Borovnica (Vaccinium myrtillus) je nisko rastući grm čiji plodovi su bogati antocijaninima i

daju im karakterističnu plavu boju. Apsorpcija antocijana je brza, ali imaju slabu

biodostupnost (11-22 %).

Antocijani su se, mehanizmima vezanja slobodnih radikala i keliranjem metalnih iona,

pokazali kao dobri antioksidansi. Štakori tretirani ekstraktom plodova borovnica su pokazali

smanjenu lipidnu peroksidaciju u serumu i povećanu razinu glutationa u stanicama srčanog

mišića (Chu i sur. 2011).

1.4.5 Vulkan

Vulkan je dodatak prehrani za poboljšanje muške potencije. Sastav vulkana, po navodima

proizvođača, trebalibi biti samo biljni ekstrakti: ekstrakt lista ginka, matičnjaka (Melissa

officinalis), hmelja (Humulus lupulus) i origana (Origanum vulgare). Ekstrakt matičnjaka je

pokazao niz neuroprotektivnih i antioksidativnih učinaka mehanizmima inhibicije MAO-A i

vezanja vodikovog peroksida (López i sur. 2009). Ekstrakt hmelja sadrţi brojne polifenole

koji sprječavaju oksidativna oštećenja DNA vezanjem hidroksilnih radikala i superoksidnih

radikala (Wang i sur. 2014). Fenoli nađeni u ekstraktu origana pokazuju antioksidativan

učinak vezanjem slobodnih radikala i u studijama su pokazali značajan učinak u smanjenju

lipidne peroksidacije (Aranha i Jorge. 2012).

1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka

Rastuća globalna popularnost alternativne medicine rezultirala je povećanim interesom za

posljedice interakcije biljnih pripravaka i klasičnih lijekova, osobito za lijekove uskog

sigurnosnog raspona doze.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%C3%B3pez%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19760174

Studija provedena 2007. je pokazala kako 15% pacijenata tretiranih klasičnom

farmakoterapijom uzima biljne pripravke. Kod njih 40% su primijećene moguće interakcije

klasičnih lijekova s biljnim suplementima, ali je često teško odrediti točan uzrok interakcije,

osobito kod onih čija terapija uključuje više lijekova (Dulger, 2012.).

1.5.1 Ginko i varfarin

Studije rađene in vitro i na štakorima su pokazale da ginko utječe na enzime CYP2C9,

CYP2D6 i CYP2E1, dok su rezultati utjecaja na CYP3A4 nejasni ili su pokazali da utjecaj

ginka nije klinički značajan. Farmakološke studije na pacijentima i zdravim volonterima nisu

pokazale interakciju između ginka i varfarina. Prijavljena su krvarenja kod zajedničkog

uzimanja, ali nema dokaza koji bi objasnio mehanizam ni pokazao da je to rezultat interakcije

(Beikang i sur. 2014).

1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina

Zabiljeţena su krvarenja kod pacijenata koji su uzimali ekstrakt lista ginka uz acetilsalicilnu

kiselinu, što bi moglo biti rezultat interakcije inhibicijskog utjecaja flavonoida i terpenoida

prisutnih u ekstraktu lista ginka na zgrušavanje krvi. (Abebe, 2002)

1.6 Cilj istraţivanja

Cilj ovog rada je istraţiti kakva je interakcija između lijekova (čiji su učinci na oksidativni

stres dobro poznati) i biljnih pripravaka na oksidativni stres mozga. Mjerenjem markera

oksidativnog stresa kod grupa koje primaju pojedinačne supstance i grupa koje dobivaju

kombinacije supstanci usporedit će se razina oksidativnog stresa na tri regije mozga.

2. Materijali i metode

2.1 Materijali

Priloţen je tablični prikaz otopina korištenih u istraţivanju.

Tablica 1. Priprema pokusnih otopina

Otopina Priprema otopine

Otopina D (određivanje proteina

prema Lowryu)

Pomiješati otopine u omjeru A:B:C=48:1:1

A: 2% (w/v) Na2CO3 u 0,1 mM NaOH

B: 1% (w/v) natrij-kalij tartarat u dH2O

C: 0,5% (w/v) CuSO4× 5H2O u dH2O

Otopina E (određivanje proteina

prema Lowryu)

Pomiješati Folin & Ciocalteu's phenol reagent i

dH2O u omjeru 2:1

0,81% TBA (određivanje MDA)

Otopiti 0,8 g TBA u 40 mL dH2O uz lagano

zagrijavanje. Dodati 500 μL 5M NaOH te nadopuniti

s dH2O do 100 mL.

Reagens A (određivanje MDA) Pomiješati 100 μL 8,1% SDS sa 750 μL 20% octene

kiseline namještene na pH=3,5 i 750 μL 0,81% TBA

0,5 M pufer PBS (Phosphate

Buffered Saline) - određivanje GSH

Pomiješati 17 mL 1 M Na2HPO4× 2 H2O (otopiti 3 g

Na2HPO4 × 2H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 17 mL)

i 183 mL 1 M Na2HPO4× 12 H2O (otopiti 65,5 g

Na2HPO4×12 H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 183

mL)

0,5 M EDTA (određivanje GSH) Otopiti 37,2 g EDTA u dH2O i nadoliti dH2O do 200

mL

0,25 M pufer PBS s 0,25 M EDTA

(određivanje GSH)

Pomiješati 200 mL 0,5 M pufer PBS i 200 mL 0,5 M

EDTA

0,035 M HCl (određivanje GSH) Pomiješati 7 mL 0,1M HCl s 193 mL dH2O

Ellmanov reagens (određivanje

GSH)

Otopiti 20 mg DTNB (ditionitrobenzoična kiselina) u

5 mL 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA

0,8 mM NADPH (određivanje GSH) Otopiti 6,67 mg NADPH s 10 mL 0,5M pufer PBS s

0,25 M EDTA

50 mM PBS (određivanje SOD) Pomiješati 17 mL (otopiti 1,56 g NaH2PO4× 2H2O u

50 mL dH2O) i 183 mL ( otopiti 5,678 g Na2HPO4 u

200 mL dH2O), namjestiti pH=7,8 te nadopuniti do

800 mL s d H2O

50 mM PBS s 0,1 mM EDTA

(određivanje SOD)

Otopiti 3,72 mg EDTA u 100 mL 50 mM PBS

Reakcijska otopina A (određivanje

SOD)

Pomiješati 190 mL 0,05 mM citokroma c (otopiti 29

mg citokroma c u 190 mL 50 mM PBS s 0,1 mM

EDTA ) i 19 mL 1 mM ksantina ( uz lagano

zagrijavanje otopiti 3 mg ksantina u 19,74 mL 1 mM

NaOH)

10 mM H2O2 (određivanje katalaze) 100 μL 30% H2O2 pomiješati sa 100 ml dH2O

Otopina B enzima ksantin oksidaze

(aktivnost 0,8 U/mL) (određivanje

SOD)

Pomiješati 40 μL ksantin oksidaze i 960 μL dH2O

2.2 Metode

2.2.1 Tretman ţivotinja

Za potrebe istraţivanja korišteno je 48 štakora soja Y59, podijeljenih u osam grupa po pet

štakora i dvije grupe po četiri štakora (Tablica 2.). Devet grupa je bilo dnevno tretirano

odgovarajućim preporučenim dozama (mg/kg) od strane proizvođača (referentne doze od

strane proizvođača, korekcija na bazi mase ţivotinja) acetilsalicilne kiseline, ginka, varfarina,

vulkana, goji bobica, gotu kole i borovnica i njihovim kombinacijama, dok je kontrolna grupa

bila tretirana fiziološkom otopinom. Tretiranje se provodilo 15 dana po standardnom OECD

protokolu 407 za ispitivanje subkronične toksičnosti.

Tablica 2. Pokusne skupine i doziranje preparata

Oznaka skupine Sastav pokusne otopine Doziranje

0.KONTROLA Fiziološka otopina 2 mL svaki dan

1.GINKO Komercijalni pripravak ginka Ginkgo

biloba (GINKOCEL Dietpharm)- 400

mg preparata sadrţi 120 mg ginka

5,71 mg preparata/kg

svaki dan

2.VULKAN Komercijalni pripravak mješavine

različitih biljaka: hmelj, matičnjak,

ekstrakt origana i Ginkgo biloba

(VULKAN Avala pharma)- 1650 mg

preparata sadrţi 150 mg ginka


svaki dan

3.ACETILSALICILNA

KISELINA

Otopina 0,86 mg acetilsalicilne

kiseline na 1 mL vode

4,2 mg/kg svaki dan

4.VARFARIN Otopina varfarina Kroz 12 dana fiziološka

otopina,a zadnja 3 dana

varfarin u dozi 0,4

mg/mL

5.VULKAN+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 2.

Vulkan i 4. varfarin

Kroz 12 dana otopina

2.Vulkan, nakon 13.

dana u tretiranje je

uključena i otopina

4.Varfarin

6.VULKAN+ACETILSA

LICILNA KISELINA

Kombinacija otopina skupina 2.

Vulkana i 3. Acetilsalicilna kiselina

Kroz 12 dana otopina

2.Vulkan, nakon 13.

dana u tretiranje je

uključena i otopina 3.

Acetilsalicilna kiselina

7.GINKO+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 1.

Ginko i 4.Varfarin

Kroz 12 dana otopina 1.

Ginko, nakon 13. dana u

tretiranje je uključena i

otopina 4. Varfarin

8.GINKO+ACETILSALI Kombinacija otopina skupina 1. Kroz 12 dana otopina 1.

CILNA KISELINA Ginko i 3. Acetilsalicilna kiselina Ginko, nakon 13. dana u

tretiranje uključena i

otopina 3. Acetilsalicilna

kiselina

9.GINKALERT Komercijalni pripravak Ginko biloba

i mješavine biljnih pripravaka: Gota

Kola (Centella asiatica) s 10%

triterpena i borovnica s 36%

antocijanozida (GINKALERT

Solaray) – 720 mg preparata sadrţi

120 mg ginka


2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva

Nakon 15 dana tretmana, ţivotinje su anestezirane mješavinom Xilapana i Narketana, i.p. 25

mg/kg) i ţrtvovane, zatim su im izolirani mozgovi. Sa svakog mozga je izoliran i izvagan dio

korteksa, prefrontalnog korteksa i malog mozga te stavljen u Eppendorf-epruvetu s fosfatnim

puferom u volumenu 10× većim od mase uzorka. Uzorci su homogenizirani ultrazvučnim

homogenizatorom i zatim centrifugirani 15 minuta na 15 000 g i pri 60C. Nakon

centrifugiranja je odvojen supernatant i pohranjen u hladnjaku na -200C do početka testiranja.

2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju

Metoda određivanja proteina po Lowryju (1951.) je biokemijski test za određivanje ukupne

koncentracije proteina u otopini, a temelji se na biuretskoj reakciji, promjeni boje otopine

zbog oksidacije aromatskih aminokiselina u njoj. U biuretskoj reakciji ioni bakra reagiraju s

peptidnim vezama proteina u luţnatom mediju, pri čemu dolazi do njihove redukcije u Cu+.

Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje fenolni reagens koji reagira sa Cu+–proteinskim

kompleksom i bočnim ograncima aromatskih aminokiselina, prilikom čega uzrokuje njihovu

oksidaciju i svoju redukciju, što dovodi do nastanka plavog obojenja. Promjena apsorbancije

uslijed obojenja mjeri se pomoću spektrofotometra.

Metodom po Lowryju određene su razine proteini u štakorima. Uzorci mozgova razrijeđeni su

10 puta u PBS-u. U epruvete je dodano po 100 μL razrijeđenog uzorka i 2 mL otopine D

(Tablica 1) i inkubirano 10 min na sobnoj temperaturi. Sve je rađeno u duplikatima. Zatim je

dodano 200 μL otopine E (Tablica 1), nakon čega je snaţno vorteksirano i inkubirano 30 min

na sobnoj temperaturi. Količina proteina određena je na spektrofotometru mjerenjem

apsorbancije na valnoj duljini od 600 nm. Kao standard, upotrijebljen je albumin goveđeg

seruma (eng. Bovine serum albumin, BSA) u koncentracijama od 2 mg/mL prema manjim

koncentracijama (2; 1; 0,25; 0,125 i 0 mg/mL). Iz standardne krivulje ovisnosti apsorbancije o

koncentraciji BSA, određen je nagib pravca. Preko nagiba pravca izračunata je koncentracija

proteina u uzorcima. Koncentracija proteina izraţena je kao mg/mL.

2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH)

Koncentracija ukupnog glutationa u mozgu štakora određena je prema modificiranoj metodi

koju je opisao Tietze (1969). Metoda se temelji na reakciji tiolnog reagensa 5,5-ditiobis-2-

nitrobenzoične kiseline (DTNB, Ellmanov reagens) s GSH, pri čemu se stvara kromofor 5-

tionitrobenzoična kiselina (TNB) koja se moţe fotometrijski očitati na 412 nm. Uz TNB,

stvara se i GS-TNB koji se reducira pomoću GSH reduktaze (GR) i NADPH, pri čemu se

otpušta druga molekula TNB i reciklira GSH. Brzina nastanka TNB proporcionalna je

recilirajućoj reakciji, koja je proporcionalna koncentraciji glutationa u uzorku. Pri ovoj

metodi, sav oksidirani GSH (disulfid GSSG) prisutan u reakcijskoj smjesi ili nastao iz

miješanog disulfida GSH s GS-TNB, brzo se reducira do GSH. Konačan rezultat koji se

dobije odgovara ukupnoj koncentraciji reduciranog i oksidiranog GSH u uzorku.

Koncentracija ukupnog GSH mjeri se u mikrotitarskoj pločici. U jednu jaţicu dodaje se 20 μL

uzorka, 40 μL 0,035 M HCl i 40 μL 10 mM DTNB te se mjeri apsorbancija na valnoj duljini

od 415 nm. Zatim se dodaje 100 μL otopina GR i NADPH i mjeri se apsorbancija tijekom 5

min. Priprema navedenih otopina prikazana je u Tablici 2. Kao slijepa proba korišten je PBS u

reakcijskoj smjesi. Za standard korištene su koncentracije reduciranog GSH (5-100 μM).

Nacrtani su pravci za sve standarde, kao promjena apsorbancije u vremenu. Očitani su nagibi

pravaca, nacrtan je pravac kao ovisnost nagiba pravca o koncentraciji GSH. Konačno, taj

dobiveni pravac korišten je za dobivanje koncentracije ukupnog GSH u uzorku prema formuli

(nagib pravcauzorak – nagib pravcaslijepa proba)/nagib pravcastandard. Koncentracija ukupnog GSH

prikazuje se kao μg GSH po mg proteina.

2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)

Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze provedeno je prema posrednoj metodi po Flohé i

Ötting (1984.) koja se temelji na inhibiciji redukcije citokroma C u sustavu ksantin/ksantin

oksidaza.

U ovoj metodi korištene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sastojala se samo od

otopine A (Tablica 1) te je apsorbancija u spektrofotometru mjerena na 550 nm tijekom 3

min. Druga slijepa proba sluţila je za namještanje aktivnosti ksantin oksidaze (XOD). U

epruvetu Eppendorf- je stavljeno 1,45 mL otopine A, 25 μL dH2O i 20-30 μL XOD (0,8

U/mL) (Tablica 1). Odmah nakon dodavanja enzima i brzog miješanja, reakcijska smjesa

prelivena je u kivetu i mjerena je promjena apsorbancije, odnosno aktivnost enzima ksantin

oksidaze tijekom 3 min na 550 nm. Aktivnost XOD mora biti oko 0,025 U/min. U ovom

slučaju, odgovarajući volumen XOD bio je 25 μL. Nakon što se postigla optimalna aktivnost

SOD, analizirani su uzorci. U svaku reakcijsku smjesu, umjesto dH2O, dodano je 25 μL

uzorka te odgovarajući volumen XOD (30 μL) i odmah nakon toga mjerena je apsorbancija u

spektrofotometru. Enzimska aktivnost mjerena je kao postotak inhibicije aktivnosti XOD te

izraţena kao %inhibicije=100-(ΔAuzorka/ΔAslijepa proba)×100.

2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze

Aktivnost katalaze određena je spektrofotometrijskom metodom po Aebiju (1984). Prema toj

metodi, aktivnost katalaze određuje se kao količina potrošenog H2O2. U reakcijsku smjesu u

kivetu dodano je 980 μL10 mM H2O2 (Tablica 1), a ostatak do ukupnog volumena od 1 mL

bio je nerazrijeđeni uzorak. Nakon toga je na spektrofotometru mjereno smanjenje količine

H2O2 pri 240 nm tijekom jedne minute. Aktivnost katalaze izraţena je preko ekstinkcijskog

koeficijenta H2O2 (ε= 39,4 mM–1

cm–1

) kao U/mg proteina, što odgovara μmol razgrađenog

H2O2 po minuti po miligramu proteina.

2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije

Količina lipidne peroksidacije određivana je modificiranom metodom koju su opisali Lamsal i

sur. 2007. Metoda nalaţe mjerenje koncentracije malondialdehida (MDA), jednog od glavnih

produkata lipidne peroksidacije. Temelji se na reakciji MDA s tiobarbiturnom kiselinom, pri

čemu se stvara kromogen koji je moguće mjeriti spektrofotometrijski.

U eppendorf-epruvetu je dodano 100 μL 8,1%-tni SDS, 750 μL 20%-tne octene kiseline

(pH=3,5), 750 μL 0,8%-tne TBA (Tablica 1) i 100 μL homogenog uzorka. Otopina je zatim

stavljena u vodenu kupelj na 100 °C na 60 minuta. Nakon toga je naglo ohlađena na ledu i

zatim centrifugirana 15 min na 5000 rpm pri 4–6 °C. Supernatant je odvojen i izmjerena je

apsorbancija pri 532 nm iz koje je putem Beer-Lambertovog zakona izračunata ukupna

koncentracija MDA, izraţena kao nmol MDA po mg proteina.

2.2.8 Statistička analiza podataka

Softverski program "Statistica" korišten je za statističku analizu istraţivanjem dobivenih

podataka. Provedena je analiza varijance (ANOVA) koja je dala pregled u podudarnostima i

razlikama između pojedinih pokusnih grupa, a razlike između grupa potvrđene su LSD post

hoc testom. Određena je vrijednost medijana i standardne devijacije pokusnih ţivotinja u

grupama. Dobiveni podatci korišteni su u daljnjoj analizi podudarnosti i razlika između

pojedinih varijabli koje su mjerene u ovome istraţivanju.

3. Rezultati

3.1 Aktivnost katalaze

Mjerenje aktivnosti katalaze u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane

ginkom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te

ginkalertom pokazuju smanjenu stopu aktivnosti u usporedbi s kontrolnom grupom, grupa

tretirana vulkanom pokazuje višu stopu aktivnosti, a grupe tretirane acetilsalicilnom

kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju sličnu stopu

aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 11.)

Slika 11. Aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga (P CAT). C: kontrolna grupa, G:

grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana

acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i

varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana

ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom

kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

srednja vrijednost

standardna devijacija

vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje aktivnosti katalaze u kortikalnoj regiji je pokazalo da grupe tretirane ginkom,

varfarinom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom pokazuju niţu

stopu aktivnosti od kontrolne grupe, dok grupe tretirane vulkanom, acetilsalicilnom

kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju

sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna.

(Slika 12.)

Slika 12. Aktivnost katalaze u kortikalnoj regiji mozga (C CAT). C: kontrolna grupa, G:






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje aktivnosti katalaze u regiji malog mozga je pokazalo da grupe tretirane ginkom,

vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom

kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti od kontrolne

grupe, grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom ima povećanu stopu aktivnosti u

odnosu na kontrolnu grupu, dok grupa tretirana varfarinom ima sličnu stopu aktivnosti kao

kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 13.)

Slika 13. Aktivnost katalaze u regiji malog mozga (CI CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa

tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom

kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:

grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka

i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa

tretirana ginkalertom.

srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

3.2 Aktivnost SOD

Mjerenje aktivnosti SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane

vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i

acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju višu stopu aktivnosti

od kontrolne grupe, grupa tretirana ginkalertom ima manju stopu aktivnosti, a grupe tretirane

ginkom te ginkom i varfarinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Porast

aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.(Slika 14.)

Slika 14. Aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga (P SOD). C: kontrolna grupa, G:






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje aktivnosti SOD-a u kortikalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom,

acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom

kiselinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok

grupe tretirane vulkanom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom

imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan kod grupe

tretirane ginkalertom. (Slika 15.)

Slika 15. Aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga (C SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje aktivnosti SOD-a u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane

acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, ginkom i varfarinom te

ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane

ginkom, vulkanom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom

kiselinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan

kod grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 16.)

Slika 16. Aktivnost SOD-a u regiji malog mozga ( CI SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

3.3 Koncentracija GSH

Mjernje koncentracije GSH u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i

varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i

acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na

kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom i

varfarinom imaju koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički

značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,

ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 17.)

Slika 17. Koncentracija glutationa u prefrontalnoj regiji mozga (PGSH). C: kontrolna grupa,

G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana





srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje koncentracije GSH u kortikalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i

varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i

acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na

kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom imaju

manju koncentraciju GSH u odnosu na kontrolnu grupu. Porast koncentracije je statistički

značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,

ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 18.)

Slika 18. Koncentracija glutationa u kortikalnoj regiji mozga (C GSH). C: kontrolna grupa, G:






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

Mjerenje koncentracije GSH u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane vulkanom,

vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom

i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu koncentracije GSH u odnosu na

kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom imaju

koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički značajan kod

grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i

varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 19.)

Slika 19. Koncentracija glutationa u regiji malog mozga (CI GSH). C: kontrolna grupa, G:






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

3.4 Koncentracija MDA (malondialdehid)

Mjerenje koncentracije MDA u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane

acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i

varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju

MDA u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom te vulkanom i

varfarinom imaju koncentraciju MDA poput kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je

statistički značajan kod grupa tretiranih varfarinom, ginkom i varfarinom te ginkom i

acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 20.)

Slika 20. Koncentracija malondialdehida u prefrontalnoj regiji mozga (P MDA). C: kontrolna

grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana





srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje koncentracije MDA u kortikalnoj regiji pokazalo je da sve grupe imaju manju

koncentraciju MDA od kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je statistčki značajan kod

grupa tretiranih s acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. (Slika

21.)

Slika 21. Koncentracija MDA u kortikalnoj regiji mozga (C MDA). C: kontrolna grupa, G:






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

Mjerenje koncentracije MDA u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom i

vulkanom imaju višu koncentraciju MDA od kontrolne grupe, dok grupe tretirane varfarinom,

vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom

kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju MDA od kontrolne grupe, a grupe

tretirane acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i varfarinom imaju koncentraciju MDA

poput kontrolne grupe. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 22.)

Slika 22. Koncentracija MDA u regiji malog mozga (CI MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa






srednja vrijednost


vrijednosti koje

odskaču

ekstremi

3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima

Priloţeni su tablični prikazi statistički značajnih promjena po regiji mozga i po markerima

oksidativnog stresa. (Tablice 3. i 4.)

Tablica 3. Prikaz statistički značajnih promjena po regiji mozga. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:

koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost

katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,

C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:

aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija

GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga

0: nema statistički značajne promjene

Regija

mozga

Ginko Vulkan Acetilsalicilna

kiselina

Varfarin Vulkan

+

Varfarin

Vulkan

+

Acetilsalicilna

kiselina

Ginko

+

Varfarin

Ginko

+

Acetilsalicilna

kiselina

Ginkalert

P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0

P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0

C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad

C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0

Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0

Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tablica 4. Prikaz statistički značajnih promjena po markerima oksidativnog stresa. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:

koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost

katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,

C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:

aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija

GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga.

0: nema statistički značajne promjene

Markeri Ginko Vulkan Acetilsalicilna

kiselina

Varfarin Vulkan

+

Varfarin

Vulkan

+

Acetilsalicilna

kiselina

Ginko

+

Varfarin

Ginko

+

Acetilsalicilna

kiselina

Ginkalert

P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0

C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad

Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0

P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast

P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0

C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0

Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4. Rasprava

Rastuća popularnost biljnih pripravaka, praćena njihovom lakom dostupnosti, dovodi do

njihovih sve češćih uzimanja uz klasične farmakoterapije. Iako se reklamiraju kao sigurni i

bez nuspojava u kombinaciji s klasičnim lijekovima su primijećene interakcije u djelovanju. U

ovom istraţivanju smo pratili učinke nekih popularnih biljnih pripravaka i klasičnih lijekova

na markere oksidativnog stresa na tri različite regije mozga štakora. Kako su za korištene

biljne pripravke studije pokazale moguć antioksidativni utjecaj i kako se smatra da imaju

utjecaj na kognitivne sposobnosti, zanimalo nas je mijenjaju li u interakciji s klasičnim

lijekovima oksidativnu ravnoteţu u mozgu. Tretirali smo deset grupa ţivotinja s tri biljna

pripravka (tabletama ginka, vulkanom i ginkalertom), dva klasična lijeka (varfarinom i

acetilsalicilnom kiselinom), njihovim kombinacijama i fiziološkom otopinom. Ţivotinje su

bile tretirane oralnim putem tako da bi supstance prošle jednak metabolički put kao kod ljudi

koji ih uzimaju. Razine markera oksidativnog stresa su praćene u tri regije mozga:

prefrontalnoj regiji, kortikalnoj regiji i regiji malog mozga, kako bi pokrili što veći dio mozga

i regije odgovorne za kognitivne sposobnosti. Dobiveni rezultati su uspoređivani s grupom

tretiranom fiziološkom otopinom koja je bila kontrolna grupa.

Tretirane grupe su pokazale brojna odstupanja u razinama markera oksidativnog stresa u

odnosu na kontrolnu grupu. Grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom je pokazala smanjenu

aktivnost SOD-a u regiji malog mozga i manju koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji

mozga. Ti rezultati se poklapaju s pretpostavljenim antioksidativnim učincima acetilsalicilne

kiseline. Smanjena aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat aspirinom smanjene razine

vaskularne produkcije O2-

inhibicijom NAD(P)H oksidazne aktivnosti (Tauseef i sur. 2008),

odnosno aspirinom posredovane inhibicije NOS-II i inhibicije COX enzima. Acetilsalicilna

kiselina moţe dovesti do acetilacijelizinskih nastavaka proteina, koji igraju ulogu u njihovoj

zaštiti od slobodnih radikala (Awtry i Loscalzo, 2000), što bi, zajedno s manjom stopom

produkcije slobodnih radikala, moglo objasniti niţu koncentraciju MDA.

Grupa tretirana varfarinom je pokazala manju koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji

mozga. Smanjena koncentracija MDA kod tretmana varfarinom bi mogla biti rezultat

djelovanja varfarina, koji moţe dovesti do smanjene pokretljivosti i veće gustoće lipidne

membrane, što oteţava pristup slobodnim radikalima i smanjuje stopu lipidne peroksidacije.

(Amin i sur. 1986)

Grupa tretirana vulkanom i varfarinom je pokazala veću aktivnost SOD-a i koncentraciju

GSH u sve tri regije mozga. Povećana aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat sinergije

antikoagulacijskog djelovanja varfarina i vazodilatatorskog djelovanja ginka prisutnog u

vulkanu (Beikang i sur. 2014), što moţe dovesti do krvarenja i veće razine oksidativnog

stresa. Kako grupe tretirane samo varfarinom ili samo vulkanom nisu pokazale slične

promjene aktivnosti, čini se da je povećana aktivnost rezultat međudjelovanja. Povećana

koncentracija GSH bi mogla biti odgovor organizma na opisano krvarenje uzrokovano

interakcijom vulkana i varfarina, potpomognuto antioksidativnim učinkom biljnih ekstrakata

koji se nalaze u vulkanu (López i sur. 2009; Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).

Grupa tretirana ginkom i varfarinom je pokazala veću koncentraciju GSH u sve tri regije

mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana koncentracija

GSH moţe biti objašnjena indirektnim antioksidativnim djelovanjem ekstrakta lista ginka.

Indirektan antioksidativan učinak ekstrakta lista ginka djeluje preko terpenoida prisutnih u

ekstraktu lista ginka (Mahadevan i Park, 2008), koji mogu povećavati aktivnost

antioksidativnih enzima, i flavonoida koji inhibiraju enzim COX2 i smanjuju razinu slobodnih

radikala u organizmu. Smanjena koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena već navedenim

djelovanjem varfarina te direktnim i indirektnim antioksidativnim učincima ekstrakta lista

ginka. Spojevi prisutni u ekstraktu lista ginka mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti

stopu lipidne peroksidacije (Mahadevan i Park, 2008). Moguća je interakcija između

inhibicije COX2, povećane aktivnosti antioksidativnih enzima, vezanja radikala i veće

gustoće lipidnih membrana.

Grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala povećanu koncentraciju GSH

u sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana

koncentracija GSH bi mogla biti rezultat već opisanih antioksidativnih učinaka ginka, dok bi

niţa koncentracija MDA mogla biti rezultat sinergističkog učinka s acetilsalicilnom kiselinom

koja acetiliralipidne proteinske nastavke i smanjuje produkciju O2-

i spojeva prisutnih u

ekstraktu lista ginka koji veţu slobodne radikale.

Grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala veću koncentraciju GSH u

sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji mozga. Povećana

koncentracija GSH bi se mogla objasniti antioksidativnim učincima ekstrakta biljaka nađenih

u vulkanu, osobito ginku. Niţa koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena interakcijom već

navedenih mehanizama acetilsalicilne kiseline (acetilacijalizinskih nastavaka proteina i

smanjene stopa produkcije slobodnih radikala) i brojnih polifenola prisutnih u vulkanu, koji

mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti stopu lipidne peroksidacije (López i sur. 2009;

Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).

Grupa tretirana ginkalertom je pokazala smanjenu aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga

i povećanu koncentraciju GSH u prefrontalnoj regiji mozga i regiji malog mozga. Smanjena

aktivnost SOD-a bi mogla biti objašnjena interakcijom ekstrakta lista ginka, koji moţe vezati

slobodne radikale i inhibira COX 2 enzim time smanjujući produkciju slobodnih radikala, sa

ekstraktom gotu kole i antocijana prisutnih u ekstraktu borovnice (Chu i sur. 2011) koji mogu

vezati slobodne radikale i kelirati metale te tako smanjiti sveukupni oksidativni stres, jer

grupa tretirana samo ginkom nema smanjenu stopu aktivnosti SOD što navodi da je to rezultat

interakcije. Povećana koncentracija GSH se moţe objasniti već navedenim antioksidativnim

učinkom ekstrakta lista ginka, gotu kola također moţe povećati aktivnost antioksidativnih

enzima, a antocijani prisutni u ekstraktu borovnice mogu dovesti do povećanja razine GSH

(Chu i sur. 2011).

Dobiveni rezultati pokazuju najveće promjene kod grupa koje su uzimale kombinacije biljnih

pripravaka i klasičnih lijekova, što upućuje na zaključak da su promjene u razini oksidativnog

stresa rezultat interakcije, obzirom na to da se grupe tretirane ginkom i vulkanom ne razlikuju

od kontrolne grupe, a promjene kod grupa s kombinacijama su drukčije od grupa tretiranih

acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Promjene su zabiljeţene kod aktivnosti SOD i

koncentracija GSH i MDA, dok aktivnost katalaze nije odstupala od vrijednosti kontrole.

Najveća odstupanja koncentracije GSH, prisutna su kod grupa tretiranih kombinacijama

biljnih pripravaka i klasičnih lijekova. Zabiljeţen je porast koncentracije GSH u sve tri regije

mozga i smanjena koncentracija MDA. Povećana koncentracija GSH vjerojatno nije samo

rezultat antioksidativnog djelovanja biljnih suplemenata jer nije zabiljeţena kod grupa

tretiranih samo biljnim suplementima pa je vjerojatno da dolazi do povećane produkcije

oksidativnih radikala. Smanjena koncentracija MDA je zapaţena i kod grupa tretiranih samo

klasičnim lijekovima i moţe se objasniti njihovim djelovanjem. Grupa tretirana vulkanom i

varfarinom pokazuje porast aktivnosti SOD-a i koncentracije GSH i jednaku razinu MDA kao

i kontrolna grupa, dok je grupa tretirana s varfarinom imala smanjenu koncentraciju MDA. To

sugerira da je interakcija biljnih ekstrakata u vulkanu s varfarinom dovela do povećanja

oksidativnog stresa u mozgu, koji je poništio zaštitni učinak varfarina na lipidne membrane.

Suprotno tome, grupa tretirana ginkalertom, koji je mješavina biljnih ekstrakata, pokazuje pad

razine SOD-a, porast koncentracije GSH i koncentraciju MDA u razini kontrolne grupe i

grupa tretiranih samo biljnim suplementima, što moţe upućivati na sinergistički učinak

antioksidansa u toj kombinaciji biljnih ekstrakata, koja bi mogla djelovati neuroprotektivno

ali bi i mogla narušavati biološke procese regulirane slobodnim radikalima.

5. Zaključak

Iako se sluţbeno reklamiraju kao pripravci koji nemaju nuspojave i kontraindikacije, ovo

istraţivanje je potvrdilo da postoji interakcija između klasičnih lijekova i biljnih suplemenata.

Razine aktivnosti i koncentracije markera oksidativnog stresa kod grupa tretiranih

kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova bile su značajno promijenjene u odnosu

na kontrolnu grupu.

Koncentracija GSH je bila značajno povećana u svim regijama mozga kod grupa tretiranih

kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova što bi moglo biti indikator potencijalne

toksičnosti. Koncentracija MDA je bila smanjena u regiji prefrontalnog korteksa kod grupa

tretiranih ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom i u kortikalnoj regiji kod

grupe tretirane vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. Aktivnost SOD-a je povećana u

prefrontalnoj regiji kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.

Grupa tretirana vulkanom i varfarinom koja uz povećane koncentracije GSH ima i povećanu

aktivnost SOD-a i višu koncentraciju MDA od drugih grupa tretiranih kombinacijama

predstavlja najveću promjenu razina oksidativnog stresa.

Laka dostupnost klasičnih lijekova i biljnih suplemenata, uz njihovu sve veću popularnost,

nuţno dovodi do sve češćih zajedničkih uzimanja, stoga su potrebna daljnja istraţivanja da bi

se razjasnile posljedice njihovog zajedničkog uzimanja.

6. Popis literature

Abebe W. (2002): Herbal medication: Potential for adverse interactions with analgesic drugs.

Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 27:391-401

Awtry E. H.,Loscalzo J. (2000): Aspirin. Circulation 101:1206–1218

Beikang G., Zhen Z., Zhong Z. (2014): Updates on the Clinical Evidenced Herb-Warfarin

Interactions. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 18 str.

Bilia A. R. (2002): Ginkgo biloba Fitoterapia 73:276–9

Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O. (2012): Oxidative stress and

antioxidant defense. World Allergy Organization Journal 5:9–19

Browne S. E., Ferrante R. J., Beal M. F. (1999): Oxidative stress in Huntington’s disease.

Brain Pathology 9:147–163

Chu W., Cheung S. C. M., Raw L., et al. (2011): Bilberry (Vaccinium myrtillus) U: Benzie

IFF, Wachtel-Galor S, editors. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects.

2.izdanje. Boca Raton (FL): CRC Press; Chapter 4.

DIRECTIVE 2001/83/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL

of 6 November (2001): on the Community code relating to medicinal products for human use.

OJ L 311, p. 67

Droy-Lefaix M. T. (1997): Effect of the antioxidant action of Ginko biloba extract (EGb 761)

on aging and oxidative stress, AGE, 3: 141

Dülger G. (2012): Herbal drugs and drug interactions. Marmara Pharmaceutical Journal 16:

9-22

Flohé L, Otting F. (1984) Superoxide dismutase assays. Methods in Enzymology 105:93–104.

Gohil K. J., Patel J. A., Gajjar A. K. (2010): Pharmacological Review on Centella asiatica: A

Potential Herbal Cure-all. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences,72, 546–556.

Hirsh J., Fuster V., Ansell J., Halperin J. (2003): American Heart Association/American

College of Cardiology Foundation guide to warfarin therapy. Journal of the American College

of Cardiology 41:1633-1652

Huang X. (1999): Cu(II) potentiation of Alzheimer Abeta neurotoxicity. Correlation with cell-

free hydrogen peroxide production and metal reduction. Journal of Biological Chemistry

274:37111–37116

Hussin M., Abdul-Hamid A., Mohamad S., Saari N., Ismail M., Bejo M. H. (2007): Protective

effect of Centella asiatica extract and powder on oxidative stress in rats. Food Chemistry 100:

535–541.

Ischiropoulos H., Beckman J. S. (2003): Oxidative stress and nitration in neurodegeneration:

Cause, effect, or association? Journal of Clinical Investigation111: 163–169

Kandel E. R., Schwartz J. H., Jessell T. M. (2000): Principles of neural science. McGraw-

Hill, New York

Kunwar A., Priyadarsini K. I. (2011): Free radicals, oxidative stress and importance of

antioxidants in human health. Journal of Medical and Allied Sciences 1: 53–60

López V., Martín S., Gómez-Serranillos M. P., Carretero M. E., Jäger A. K., Calvo M. I.

(2009): Neuroprotective and neurological properties of Melissa officinalis. Neurochemical

Research 11: 1955-1961

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J (1951) Protein Measurement with

the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry 193, 265–275

Mahadevan, S.. Park, Y. (2008): Multifaceted Therapeutic Benefits of Ginkgo biloba:

Chemistry, Efficacy, Safety, and Uses. Journal of Food Science 73: R14–R19.

Matés J.M., Pérez-Gómez C., Núñez de Castro I. (1999): Antioxidant enzymes and human

diseases.Clinical Biochemistry 32: 595-603

McKenna D. J., Jones K., Hughes K. (2001):Efficacy, safety, and use of Ginkgo biloba in

clinical and preclinical applications. Alternative therapies in health and medicine 7:70, 86,

88–90

Noori S. (2012): An Overview of Oxidative Stress and Antioxidant Defensive System 1:413

Pereira M. A. C., Jorge N. (2012): Antioxidant potential of oregano extract (Origanum

vulgare), British Food Journal 7: 954 - 965

Raza H., John A., Benedict S. (2011): Acetylsalicylic acid-induced oxidative stress, cell cycle

arrest, apoptosis and mitochondrial dysfunction in human hepatoma HepG2 cells. European

Journal of Pharmacology 668:15–24

Sies H. (1997.): Physiological Society Symposium: Impaired Endothelial and Smooth Muscle

Cell Function in Oxidative Stress: Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants. Experimental

Physiology 82: 291-295

Srivastava R., Shukla Y. N., Kumar S. (1997): Chemistry and pharmacology of Centella

asiatica: a review.Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 19:1049–56

Lamsal M., Gautam N., Toora B. D., Bhattacharya S. K., Baral N. (2007): Evaluation of lipid

peroxidation product, nitrite and antioxidant levels in newly diagnosed and two months

follow-up patients with pulmonary tuberculosis. Southeast Asian Journal of Tropical

Medicine and Public Health 38:695-703

Tammariello S. P., Quinn M. T., Estus S. (2000): NADPH oxidase contributes directly to

oxidative stress and apoptosis in nerve growth factor-deprived sympathetic neurons. Journal

of Neuroscience 20:RC53.

Tauseef M., Shahid M., Sharma K. K, Fahim M. (2008): Antioxidative action of aspirin on

endothelial function in hypercholesterolaemic rats. Basic and Clinical Pharmacology and

Toxicology 4: 314–321

Teles J. S., Fukuda E. Y., Feder D. (2012): Warfarin: pharmacological profile and drug

interactions with antidepressants. Einstein (São Paulo). São Paulo1: 110-115

Vane J. R., Botting R. M. (2003): The mechanism of action of aspirin. Thrombosis Research

6: 255–258

Wang X., Yang L., Yang X. Tian Y. (2014): In vitro and in vivo antioxidant and

antimutagenic activities of polyphenols extracted from hops (Humulus lupulus). Journal of

the Science of Food and Agriculture 94: 1693–1700

Yoshikawa T, Naito Y (2002): What is oxidative stress? Japan Medical Association Journal

45:271-276

7. Životopis

Rođen sam u Zagrebu 19.12.1988. godine, gdje sam s odličnim uspjehom završio osnovnu školu Grofa

Janka Draškovića i Nadbiskupsku klasičnu gimnaziju. Na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu

Sveučilišta u Zagrebu završio sam preddiplomski studij molekularne biologije te sam upisao diplomski

studij eksperimentalne biologije, modul fiziologija i imunobiologija.

Documents

Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih ... · Reakcija reaktivnih radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem lipidnog