ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROORGANISME KITINOLITIK ASAL

LIMBAH CAIRAN RUMEN SAPI SERTA OPTIMASI PRODUKSI ENZIM

KITINASE

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian syarat memperoleh

Derajat Sarjana S-1 pada Program Studi Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

OLEH :

WA ODE SURYANI

F1C1 11 035

UNIVERSITAS HALUOLEO

KENDARI

2016

ii

iii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Allah SWT atas limpahan

rahmat, taufik serta hidayah-Nya sehingga hasil penelitian yang berjudul “Isolasi

Dan Identifikasi Mikroorganisme Kitinolitik Asal Limbah Cairan Rumen

Sapi Serta Optimasi Produksi Enzim Kitinase” dapat diselesaikan. Teriring

doa, shalawat dan salam atas Nabi Muhammad SAW beserta keluarga.

Secara khusus dengan hati yang tulus penghargaan, rasa patuh dan terima

kasih yang tak terhingga penulis persembahkan kepada Ayahanda La Ode

Masrani dan Ibunda Musrifa tercinta sebagai tanda bakti atas doa restu,

semangat bimbingan, arahan kepercayaan, pengorbanan, curahan kasih sayang

dan dukungan materil yang diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan hasil penelitian ini tidak

sedikit hambatan yang dihadapi tetapi semuanya itu dapat teratasi berkat petunjuk

dari Allah SWT dan disertai ketabahan, kesabaran dan keyakinan dalam berusaha

serta berkat bimbingan dan arahan yang sangat berharga dari berbagai pihak.

Untuk itu pada kesempatan ini penulis menyampaikan penghargaan dan terima

kasih yang setinggi-tingginya kepada Ibu Desy Kurniawati, S,Si., M.Si dan

Bapak Drs. H. Muh. Natsir, M.Si., yang selalu memberikan pengarahan dan

bimbingan serta meluangkan waktu untuk memberikan arahan dan perbaikan-

perbaikan sejak awal hingga penyelesaian hasil penelitian ini.

Suatu hal yang tidak terlupakan atas dorongan dan bimbingan, serta

iv

arahan dan bantuan kepada penulis selama melakukan penelitian, maka patutlah

kiranya penulis menyampaikan ucapan terima kasih serta penghargaan kepada

semua pihak, khususnya :

1. Bapak Prof. Dr. Ir. Usman Rianse, M.Si selaku Rektor Universitas Halu Oleo.

2. Bapak Dr. Muh. Zamrun F., M.Si., M.Sc. selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Halu Oleo.

3. Bapak Dr. La Ode Ahmad Nur Ramadhan, M.Si selaku Ketua Jurusan Kimia

FMIPA Universitas Halu Oleo.

4. Ibu Desy Kurniawati, S,Si., M.Si selaku Sekretaris Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Halu Oleo.

5. Bapak Dr. Imran M.Si., selaku kepala Laboratorium Jurusan Kimia

FMIPA Universitas Halu Oleo yang telah memberikan izin kepada penulis

untuk melaksanakan penelitian di laboratorium Biokimia.

6. Bapak Dr. Imran M.Si., ibu Dr. Prima Endang Susilowati, M.Si., dan ibu

Halimahtussaddiyah Ritonga, S.Si., M.Si selaku Dewan Penguji yang telah

banyak memberikan ide dan saran bagi penulis dalam menyelesaikan tugas

akhir.

7. Bapak dan ibu dosen Jurusan Kimia, serta seluruh staf di lingkungan FMIPA

UHO atas segala fasilitas dan pelayanan yang diberikan kepada penulis dalam

menuntut ilmu.

8. Kepada saudaraku La Ode Halim, Wa Ode Agustina, Wa Ode Nur Hanifa,

Wa Ode Resky dan La Ode Yusuf serta seluruh keluarga tercinta terima

kasih atas doa dan motivasinya sehingga penulis dapat menyelesaikan studi

v

dengan baik.

9. Kepada analis laboratorium Ibu Hafni, Ibu Hasma dan Kak Meilani Safitri,

S.Si., yang telah membantu memperlancar berlangsungnya penelitian ini.

10. Saudara-saudariku Angkatan 2011 (Sukma S.Si, Ratih, Ain S.Si, Fati, Tia,

Osti, Kadek, Melani S.Si, Nur S.Si, Mega S.Si, Herlin S.Si, Tini S.Si, Fetty

S.Si, Lia S.Si, Didit S.Si, Sri S.Si, Via S.Si, Hasmi S.Si, Risma S.Si, Ida S.Si,

Lusi, Anatia, Suri, Anti, Tuti S.Si, Delvi S.Si, Dedeng, Fina S.Si, Chen Chen

S.Si, Andri, Hendra S.Si, Anugrah S.Si, Efraim S.Si, Dion S.Si, Jafar S.Si,

Adi, Herdin S.Si, Arham, Andi S.Si, Izar S.Si, Alfan S.Si, Razi S.Si, Ahyar,

Wino S.Si, Manan) terima kasih atas kerja samanya selama perkuliahan dan

penelitian.

11. Senior-senior yang baik hati Kak Jiran S.Si, Kak Marni S.Si, Kak Yuyun

S.Si, Kak Amel S.Si, Kak Dijah S.Si, Kak Piteng S.Si, Kak Asnin S.Si yang

senantiasa menyumbangkan pemikiran dan ide maupun tenaga kepada

penulis.

12. Anak-anak Biokimia Sukma, Ratih, Andri, Ain, Osti, Kadek, Fina, Fati, Diva,

Wulan terima kasih atas kerjasama selama ini sebagai rekan-rekan

seperjuangan di Biokimia.

13. Junior-junior yang sering membantu Ismar, Hasrobin, Pipi Andriani, Dahlia,

Muli dan yang lainnya dari angkatan 2012, 2013 dan 2014 yang tidak bisa

disebut satu persatu.

14. Kepada semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang

turut membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan laporan hasil

vi

penelitian.

Semoga Allah memberikan balasan yang lebih baik, dan mencatatnya

sebagai amal jariyah sehingga akan memperoleh balasan pahala dari Allah

subhanahu Wata’Ala, akhir kata penulis berharap semoga khasanah ilmu yang

terungkap dalam hasil penelitian ini dapat memberikan banyak manfaat. Aamiin.

Kendari, April 2016

Penulis

vii

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROORGANISME KITINOLITIK

ASAL LIMBAH CAIRAN RUMEN SAPI SERTA OPTIMASI PRODUKSI

ENZIM KITINASE

Oleh :

Wa Ode Suryani

F1C1 11 035

INTISARI

Isolasi dan identifikasi mikroorganisme kitinolitik asal limbah cairan rumen sapi

serta optimasi produksi enzim kitinase telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan

untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan mengoptimasi produksi enzim kitinase

yang dihasilkan oleh bakteri kitinolitik yang berasal dari limbah cairan rumen sapi

yang diperoleh dari Tempat Pemotongan Hewan (TPH) Anggoeya, Kendari

Sulawesi Tenggara. Penelitian ini terdiri atas tiga tahap, yaitu isolasi dan seleksi

bakteri kitinolitik, karakterisasi dan identifikasi isolat terpilih dan optimasi

produksi enzim kitinase. Mencakup variasi konsentrasi substrat, variasi suhu dan

variasi pH. Kondisi optimum produksi enzim kitinase yang diukur aktivitas

kitinasenya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 584

nm. Enzim kitinase dapat diperoleh dari hasil isolasi bakteri kitinolitik dengan

cara menumbuhkan pada media Luria Bertani cair yang mengandung substrat

kitin sebagai penginduksi kitinase pada suhu dan pH tertentu yang sesuai. Isolat

bakteri kitinolitik yang berhasil ditumbuhkan dan diisolasi, diperoleh indeks

kitinolitik sebesar 7,59. Hasil pengamatan morfologi dan uji biokimia

menunjukkan isolat bakteri kitinolitik merupakan bakteri Gram negatif berbentuk

batang dari spesies bakteri Lactobacillus ruminus. Enzim kitinase diperoleh pada

kondisi optimum yaitu konsentrasi substrat sebesar 0,08% (b/v) dengan suhu

optimum produksi 40ºC pada pH 6 dengan aktivitas enzim sebesar 125,943 U/mL.

Kata Kunci : Kitin, Kitinolitik, N-asetilglukosamin, Rumen Sapi

viii

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CHITINOLYTIC

MICROORGANISM FROM THE COW RUMEN LIQUID WASTE AND

OPTIMATION OF ENZYME CHITINASE PRODUCTION

By :

Wa Ode Suryani

F1C1 11 035

ABSTRACT

Isolation and identification of microorganisms chitinolytic from cow rumen fluid

waste and chitinase enzyme production optimation was carried out. The aims of

this study are to isolate, characterize and optimize the production of chitinase

enzymes produced by chitinolytic bacteria from cow rumen fluid waste obtained

from slaughtering place (TPH) Anggoeya, Kendari, Southeast Sulawesi. The

study consisted of three stages, there are the isolation and selection of chitinolytic

bacteria, characterization and identification of selected bacteria and optimation of

the production of the enzyme chitinase. Includes a variety of substrate

concentration, temperature variations and variations in pH. The optimum

production conditions of the chitinase enzyme activity was measured by UV-Vis

spectrophotometer at a wavelength of 584 nm. Chitinase enzyme can be obtained

from the isolation of chitinolytic bacteria by growing in Luria Bertani liquid

medium containing chitin as an inducer of chitinase substrate at a certain

temperature and pH appropriate. Chitinolytic bacterial isolates were successfully

grown and isolated, obtained chitinolytic index of 7.59. The observation of

morphological and biochemical tests showed bacteria chitinolytic a rod-shaped

Gram-negative bacterium of the species Lactobacillus ruminus. Chitinase enzyme

obtained at the optimum condition that is the substrate concentration of 0.08%

(w/v) with a temperature of 40ºC production optimum at pH 6 with the enzyme

activity of 125.943 U/mL.

Keywords : Chitin, Chitinolytic, N-asetilglukosamin, Cow Rumen

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL i

HALAMAN PENGESAHAN ii

KATA PENGANTAR iii

INTISARI vii

ABSTRACT viii

DAFTAR ISI ix

DAFTAR TABEL xii

DAFTAR GAMBAR xiii

DAFTAR LAMPIRAN xiv

DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN xv

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang 1

B. Rumusan Masalah 3

C. Tujuan Penelitian 3

D. Manfaat Penelitian 4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Rumen Sapi 5

B. Kitin 7

C. Mikroorganisme Kitinolitik 8

D. Kitinase 9

E. Identifikasi Mikroorganisme

1. Morfologi koloni Bakteri (Makroskopis)

2. Morfologi Sel Bakteri (Mikroskopis)

3. Uji Biokimia

10

11

12

F. Kondisi Produksi Enzim 14

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian 16

B. Alat dan Bahan 16

x

1. Alat 16

2. Bahan 16

C. Metode Penelitian 17

1. Pengambilan dan Preparasi Sampel Rumen Sapi 17

2. Proses Pembuatan Kitin 17

a. Deproteinasi 17

b. Demineralisasi 18

c. Dekolorisasi 18

3. Pembuatan koloidal kitin 18

4. Pembuatan Media Kitin 19

5. Isolasi Bakteri Kitinolitik 19

6. Karakterisasi Bakteri Kitinolitik 20

a. Identifikasi Isolat Terpilih

1. Morfologi Bakteri

2. Pewarnaan Gram

20

b. Uji Biokimia

1. Uji Fermentasi karbohidrat

2. Uji Methyl Red- Voges Proskauer (MR-VP)

3. Uji Sitrat

4. Uji Katalase

5. Uji Hidrogen Sulfida

21

7. Optimasi Kondisi Produksi Enzim 22

a. Penentuan Substrat Optimum untuk Produksi Enzim

Kitinase

b. Penentuan Suhu Optimum untuk Produksi Enzim

Kitinase

c. Penentuan pH Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

22

23

23

8. Pengukuran Aktivitas Enzim 23

9. Penentuan Indeks Kitinolitik 24

a. Penentuan Indeks Kitinolitik 24

b. Penentuan Aktivitas Kitinase 24

xi

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel Cairan Rumen Sapi 26

B. Isolasi, dan Seleksi Bakteri 26

C. Karakterisasi dan Identifikasi Isolat 28

D. Optimasi Kondisi Produksi

1. Penentuan Substrat Optimum untuk Produksi Enzim

Kitinase

2. Penentuan Suhu Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

3. Penentuan pH Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

32

32

33

35

E. Kurva Pertumbuhan Bakteri Kitinolitik 36

V. PENUTUP 38

DAFTAR PUSTAKA 39

LAMPIRAN 44

xii

DAFTAR TABEL

No Teks Halaman

1. Kandungan cairan rumen 6

2. Perbedaan Gram Positif dan Gram Negatif 12

3. Aktivitas Kitinolitik Bakteri 27

4. Uji Biokimia pada Isolat Bakteri Kitinolitik 29

xiii

DAFTAR GAMBAR

No Teks Halaman

1 Rumen Sapi 5

2 Struktur Kitin 8

3 Gambaran morfologi koloni bakteri 11

4 Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan Mikroba 14

5 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan Mikroba 15

6 Kondisi Fisik Rumen Sapi 26

7 Morfologi Bakteri Kitinolitik 31

8 Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Produksi Enzim

Kitinase

33

9 Pengaruh Variasi Suhu terhadap Produksi Enzim Kitinase 34

10 Pengaruh Variasi pH terhadap Produksi Enzim Kitinase 36

11 Kurva Pertumbuhan Bakteri kitinolitik 37

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

No Teks Halaman

1 Peta Lokasi Pengambilan Sampel Cairan Rumen Sapi 44

2 Gambaran Umum Alur Penelitian 45

3 Diagram Alir Pengambilan Sampel, Isolasi dan Seleksi

Bakteri Kitinolitik, Uji Mikroskopi dan Biokimia

46

4 Pembuatan Koloidal Kitin 49

5 Pembuatan Media 50

6 Optimasi Kondisi Produksi Enzim Kitinase 51

7 Pengukuran Aktivitas Enzim 52

8 Diagram pembuatan kitin dari kulit udang 53

9 Pembuatan Larutan 54

10 Hasil Penelitian 57

11 Dokumentasi 62

xv

DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN

Lambang / Singkatan Arti Lambang / Singkatan

%

LB

g

mL

mg/mL

μL

mm

cm

°C

±

BTB

MR-VP

pH

rpm

λ

NA

GlcNAc

TPH

Persen

Luria bertani

Gram

Mili Liter

Mili gram per mili liter

Mikro Liter

Mili Meter

Senti Meter

Derajat Celsius

Kurang lebih

Brom Timol Blue

Methyl Red_Voges Proskauer

Negatif Logaritma dari Konsentrasi

Ion H+

Rotasi per menit

Panjang gelombang

Nutrient Agar

N-asetilglukosamin

Tempat Pemotongan Hewan

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Perkembangan dan kemajuan bioteknologi telah mempengaruhi

peningkatan pendayagunaan enzim, baik digunakan dalam bentuk hasil

ekstraksinya maupun langsung dalam bentuk sel mikroorganisme. Enzim telah

banyak digunakan dalam produksi pangan maupun non pangan (Judoamidjojo,

dkk. 1989).

Salah satu enzim yang banyak digunakan dalam bidang industri baik

pangan maupun non pangan ialah enzim kitinase. Peranan kitinase menjadi

perhatian besar karena berperan terhadap kehidupan masyarakat dalam bidang

pangan maupun non pangan mendorong ilmuwan dan peneliti melakukan

eksplorasi mikroorganisme kitinolitik. Mikroorganisme penghasil kitinase ini

masih belum banyak diketahui baik tentang jumlah, keragaman maupun fungsi

kitinase yang dihasilkan, walaupun kitin merupakan salah satu polimer yang

melimpah di alam (Haliza, 2012).

Kitin ialah senyawa karbohidrat yang termasuk dalam polisakarida,

tersusun atas monomer-monomer asetilglukosamin yang saling berikatan dengan

ikatan 1,4 beta membentuk suatu unit polimer linier yaitu β 1,4-N-asetil-D-

glukosamin yang merupakan salah satu zat yang banyak digunakan dalam

produksi pangan dan non pangan (Pujiastuti, 2001). Kitin adalah polimer yang

paling melimpah di laut. Pada kelimpahan di muka bumi, kitin menempati posisi

kedua setelah selulosa. Hal ini karena kitin dapat ditemukan di berbagai

organisme eukariotik termasuk serangga, moluska dan krustasea.

2

Mikroorganisme pendegradasi kitin umumnya berasal dari kelompok

bakteri. Enzim kitinase yang dihasilkan oleh mikroorganisme kitinolitik

mempunyai potensi tinggi untuk mendegradasi limbah yang mengandung kitin,

karena dengan adanya enzim kitinase memungkinkan konversi kitin yang

melimpah menjadi produk yang berguna (Muharni, 2010).

Beberapa bakteri kitinolitik yang telah berhasil diisolasi dari air dan tanah

diantaranya Streptomyces, Bacillus dan Arthrobacter. Namun, bakteri kitinolitik

juga terdapat dalam rumen sapi. Rumen sapi dilaporkan memiliki aktivitas

kitinolitik, yakni mampu menguraikan kitin. Mikroorganisme kitinolitik yang

terdapat dalam rumen sapi berasal dari pakan yang dikonsumsinya, beberapa jenis

pakan yang mengandung kitin ialah bekatul dan rumput raja. Hal ini diungkapkan

oleh Wahyu (1992) yang menjelaskan bahwa bekatul mengandung zat anti nutrisi

seperti kitin, hemoglutinin dan anti tripsin. Kemampuan ini menyebabkan

kelompok bakteri tersebut berpotensi besar untuk dimanfaatkan, misalnya: sebagai

penghasil kitinase yang berguna dalam industri pangan, kosmetik, farmasi, dan

lain-lain (Pujianto ,dkk. 2008).

Rumen merupakan kantong besar dengan berbagai kantong yang

menyimpan dan mencampur pakan hasil fermentasi mikroba. Kondisi dalam

rumen adalah anaerobik (Padmono. 2005). Mikroorganisme yang terdapat di

dalam rumen didominasi oleh bakteri dan protozoa, selain itu juga terdapat

mikroorganisme lain seperti fungi dan flagellata yang sering terdapat pada hewan-

hewan ruminansia muda. Perbandingan mikroorganisme di dalam rumen berkisar

3

dari 1,4x107 per mL cairan rumen sedangkan jumlah protozoa sebesar 10

6 per mL

cairan rumen ( Nuswantara. 2002 ).

Berdasarkan pemaparan di atas, maka peneliti berkeinginan untuk

melakukan penelitian mengenai isolasi dan identifikasi mikroorganisme kitinolitik

asal limbah cairan rumen sapi serta optimasi produksi enzim kitinase.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Bagaimana kemampuan bakteri kitinolitik dari limbah cairan rumen sapi dalam

mendegradasi kitin?

2. Bagaimana karakteristik isolat bakteri kitinolitik yang berasal dari limbah

cairan rumen sapi?

3. Bagaimanakah kondisi pH, konsentrasi substrat dan suhu optimum untuk

produksi enzim kitinase?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini, yaitu:

1. Mengetahui kemampuan bakteri kitinolitik dari limbah cairan rumen sapi

dalam mendegradasi kitin.

2. Mengetahui karakteristik isolat bakteri kitinolitik yang berasal dari limbah

cairan rumen sapi.

3. Menentukan kondisi optimum produksi enzim kitinase baik pH, konsentrasi

substrat dan suhu optimum.

4

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Dapat memberikan informasi tentang pemanfaatan limbah cairan rumen sapi

sebagai penghasil bakteri kitinolitik dan kemampuan bakteri tersebut dalam

mendegradasi kitin.

2. Mengembangkan keterampilan untuk mengisolasi dan identifikasi bakteri

kitinolitik.

3. Menambah wawasan keilmuan peneliti, khususnya bidang bioteknologi.

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Rumen Sapi

Rumen ialah bagian lambung sapi yang merupakan organ utama proses

pencernaan fermentatif. Di dalam rumen hidup berbagai jenis mikroba seperti

bakteri, fungi, yeast dan protozoa. Menurut Dehority dan Orpin (1997) populasi

terbesar mikroba rumen terutama adalah bakteri anaerob dan protozoa bersilia

yang terutama berperan dalam aktivitas fermentasi (Rahayu, dkk. 2003).

Kondisi dalam rumen adalah anaerob dan mikroorganisme yang paling

sesuai dan dapat hidup yang ditemukan di dalamnya. Tekanan osmosisnya mirip

dengan tekanan aliran darah. Temperatur di dalam adalah 30-42oC, pH

dipertahankan dengan adanya absorpsi asam lemak dan amonia. Saliva yang

masuk kedalam rumen berfungsi sebagai buffer dan membantu mempertahankan

pH pada 6,8. Hal ini disebabkan oleh tingginya kadar ion HCO3- dan PO4

3- (Arora,

1989).

Sumber : Commons.wikimedia.org, 2013

Rumen merupakan salah satu limbah rumah pemotongan hewan yang

belum dimanfaatkan secara optimal bahkan ada yang dibuang begitu saja sehingga

Gambar 1. Rumen sapi

6

menimbulkan pencemaran lingkungan. Limbah ini sangat potensial bila

dimanfaatkan sebagai bahan pakan ternak karena rumen merupakan bahan pakan

yang belum tercerna sempurna. Selain itu, rumen sapi kaya akan berbagai

komposisi sebagaimana ditunjukkan pada Tabel. I berikut.

Tabel. 1 Kandungan Cairan Rumen (Suhermiyati. 1984)

Kandungan Persentase (%)

Air 8,8

Protein kasar 9,63

Lemak 1,81

Serat kasar 24,60

Berat Ekstrak Tanpa Nitrogen 38,40

Abu 16,76

Kalsium 1,22

Posfor 0,29

Cairan rumen sapi, selain mengandung mikroba dan enzim-enzim yang

disekresikan oleh mikroba tersebut, juga mengandung zat-zat makanan hasil

perombakan mikroba, serta vitamin-vitamin dan mineral-mineral yang larut dalam

cairan rumen. Zat-zat makanan tersebut kaya akan protein dan asam amino.

Komposisi asam amino, mineral dan vitamin dalam endapan cairan rumen seperti

halnya enzim-enzim, juga tergantung dari perlakuan pakan yang diberikan

(Budiansyah, dkk. 2011).

Dalam rumen terdapat empat jenis mikroorganisme, yaitu bakteri,

protozoa, fungi dan flagellata. Dari keempat mikroorganisme tersebut bakteri

mempunyai jenis dan populasi yang paling tinggi. Cacahan sel per gram isi rumen

dapat mencapai 1010

-1011

(McDonald, dkk. 2002). Mikroba rumen menghasilkan

produk fermentasi berupa Volatil Fatty Acid (asam asetat, asam propionat, asam

butirat), CO2, CH4, dan NH3. Zat makanan yang didegradasi adalah karbohidrat,

7

lemak dan protein. Interaksi yang terjadi antar mikroba rumen adalah simbiosis

mutualisme. Bakteri dan protozoa yang hidup dalam rumen menjadikan

ruminansia mampu mencerna serat (Hobson dan Stewart, 1992).

B. Kitin

Kitin adalah suatu polisakarida, polimer linier yang tersusun oleh

monomer β-1,4-N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc). Kelimpahan kitin di alam

menempati urutan terbesar kedua setelah selulosa dan terdistribusi luas di

lingkungan biosfer seperti pada kulit crustaceae (kepiting, udang dan lobster),

ubur-ubur, komponen struktural eksoskeleton insekta, dinding sel fungi (22-40%),

alga dan nematoda. Kitin mempunyai rumus kimia (C8H

13NO

5)n

dengan struktur

β-(1,4)-2-asetamida-2-deoksi-D-glukosa didapat dari isolasi kulit dan kepala

hewan berkulit keras (Crustacea), serangga dan jamur dengan cara deproteinasi

dan demineralisasi (Windholz, 1983). Kitin memiliki ukuran molekul yang relatif

besar dan kelarutan rendah, sulit diserap tubuh manusia, sehingga aplikasinya

sangat terbatas dan menjadi sumber utama pencemaran senyawa organik (Haliza.,

W, dkk. 2012).

Kitin dan turunannya banyak diaplikasikan pada beberapa industri antara

lain industri pangan, farmasi, kosmetik, tekstil dan dapat digunakan sebagai bahan

tambahan atau pengawet alami pada makanan. Kitin juga digunakan sebagai

antikoagulasi darah, mempercepat penyembuhan luka, dapat menghambat

pertumbuhan bakteri dan fungi sehingga banyak dimanfaatkan sebagai

antimikroba (Apriani, 2008).

8

Sumber : (Cahyani, 2013)

Menurut Muzarelli (1977) proses isolasi kitin secara kimiawi melibatkan

proses pemisahan mineral (demineralisasi), pemisahan protein (deproteinisasi)

dan penghilangan warna (dekolorisasi). Ikatan antara kitin dengan protein dalam

bahan adalah ikatan hidrogen antara gugus karboksil dari protein dengan amino

pada glukosamin. Larutan NaOH akan memecahkan ikatan hidrogen tersebut dan

menghasilkan Na-proteinat yang larut. Kitin dikelilingi oleh matriks protein

(Zikakis, 1984).

C. Mikroorganisme kitinolitik

Bakteri penghasil enzim kitinolitik banyak berada pada habitat yang

memiliki kandungan kitin, seperti kompos yang mengandung kitin (Sakai,

dkk.1998), eksoskeleton crustacea (Vogan, dkk. 2002), air laut, sedimen laut dan

tanah (Chemin, dkk. 1995). Pada tahun 1992, Liaw dan Mah menyatakan bahwa

bakteri kitinolitik umumnya merupakan bakteri halofilik karena banyak dijumpai

pada air, sedimen laut dan crustacea yang hidup pada lingkungan berkadar garam

tinggi.

Mikroorganisme kitinolitik adalah mikroorganisme yang dapat

mendegradasi kitin dengan menggunakan enzim kitinase. Mikroorganisme ini

Gambar 2. Struktur Kitin

9

dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti rizosphere, phyllosphere, tanah atau

dari lingkungan air seperti laut, danau, kolam atau limbah udang dan sebagainya.

Selain lingkungan mesofil, mikroorganisme kitinolitik juga telah berhasil diisolasi

dari lingkungan termofilik seperti sumber air panas, daerah geotermal dan lain-

lain. Mikroorganisme kitinolitik dapat diseleksi keberadaannya dengan

mendegradasi media agar kitin yang dapat dideteksi dengan adanya zona bening

disekitar koloni bakteri (Herdyastuti ,dkk. 2009).

D. Kitinase

Kitinase adalah enzim yang mendegradasi kitin menjadi N-

asetilglukosamin, Degradasi kitin dapat dilakukan oleh organisme kitinolitik

dengan melibatkan enzim kitinase. Organisme pendegradasi kitin umumnya

berasal dari kelompok mikroorganisme diantaranya adalah dari kelompok bakteri.

Enzim kitinase yang dihasilkan oleh mikroorganisme kitinolitik mempunyai

potensi tinggi untuk mendegradasi limbah yang mengandung kitin, karena dengan

adanya enzim kitinase memungkinkan konversi kitin yang melimpah menjadi

produk yang berguna (Muharni, 2010).

Enzim kitinolitik juga berperan sebagai agen biokontrol terhadap jamur.

Hal ini dikarenakan kitin yang merupakan komponen utama dinding sel jamur

dapat didegradasi enzim kitinase menghasilkan produk yang ramah lingkungan

dibandingkan penggunaan zat kimia juga sebagai agen biokontrol terhadap

serangga patogen pada tumbuhan, biopestisida, terlibat dalam pembuatan protein

sel tunggal dan berperan sebagai obat terhadap penyakit parasit (Apriani, 2008).

10

Produksi enzim kitinolitik banyak dilakukan dengan memanfaatkan

bakteri kitinolitik karena medium pemeliharaan tidak mahal, sehingga dapat

mengurangi biaya produksi enzim (Saules, dkk. 2006). Sama seperti enzim pada

umumnya, aktivitas enzim kitinolitik juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan

seperti pH, dan suhu, serta oleh faktor kimiawi tertentu secara khusus dapat

mempengaruhi enzim tersebut (Campbell, dkk. 2002). pH optimum enzim

kitinolitik berbeda bagi setiap organism. pH optimum enzim kitinolitik pada

tumbuhan tingkat tinggi dan alga adalah 4-9, pada hewan 4,8-7,5 dan pada

mikroorganisme 3,5-8. Stabilitas enzim kitinolitik terhadap suhu juga bervariasi

untuk setiap organisme (Koga, dkk. 1999).

E. Identifikasi Mikroorganisme

1. Morfologi koloni Bakteri (Makroskopis)

Identifikasi bakteri yang tumbuh pada media kultur dimulai dengan

mengamati karakteristik koloni bakteri. Hal ini penting dikarenakan, dari

karakteristik koloni tersebut kita bisa menentukan prosedur atau pemeriksaan

selanjutnya untuk identifikasi bakteri yang pasti. Identifikasi terhadap

karakteristik koloni bakteri dilakukan secara visual langsung terhadap

pertumbuhan bakteri pada permukaan agar. Beberapa hal yang biasa dijadikan

sebagai acuan untuk menentukan karakteristik sebuah koloni bakteri, yaitu:

Ukuran (biasanya dalam milimeter atau ukuran relatif seperti kecil, sedang,

besar)

Warna/pigmentasi

Bentuk (sirkuler, filamentosa, irreguler)

11

Elevasi (datar, meninggi, konveks, umbilikasi)

Batas (tegas, irreguler)

Densitas (opak, translusen, transparan)

Perubahan pada media (misalnya perubahan pH indikator) (Lay,1994)

Gambar 3. Gambaran morfologi koloni bakteri

Sumber : Microbiology 101 Laboratory Manual, 2012

2. Morfologi Sel Bakteri (Mikroskopis)

Pengamatan morfologi sel bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan

bantuan pewarnaan yaitu pewarnaan Gram. Uji pewarnaan Gram termasuk dalam

pewarnaan differensial yang membutuhkan paling sedikit tiga reagen kimia yang

digunakan secara berurutan pada ulasan yang difiksasi menggunakan panas.

Pewarnaan bertujuan untuk membedakan bakteri ke dalam kelompok Gram

negatif dan Gram positif. Berdasarkan bentuk dan efek pewarnaan Gram, bakteri

dikelompokkan menjadi kokus Gram-positif, kokus Gram-negatif, batang Gram-

positif dan batang Gram-negatif. Morfologi sel bakteri secara mikroskopis dapat

membantu untuk identifikasi bakteri. Perbedaan bakteri Gram positif dan Gram

negatif dapat dilihat pada Tabel 2.

12

Tabel 2. Perbedaan Gram Positif dan Gram Negatif

Ciri Perbedaan relatif

Gram Positif Gram negatif

Struktur dinding sel Tebal (15-80 nm) berlapis

tunggal (mono)

Tipis (10-15 nm)

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah

(1-4%)

Peptidoglikan ada sebagai

lapisan tunggal;

komponen utama

merupakan lebih dari 50%

berat kering pada sel

bakteri

Asam tekonat

Kandungan lipid tinggi

(11-25%)

Peptidoglikan ada

didalam lapisan kaku

sebelah dalam; jumlahnya

sedikit, sekitar 10% berat

kering

Tidak ada asam tekonat

Kerentanan terhadap

penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Pertumbuhan dihambat

oleh zat-zat warna

dasar

Pertumbuhan dihambat

dengan nyata

Pertumbuhan tidak begitu

dihambat

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

Sumber : Pelczar, 1988

3. Uji Biokimia

Penentuan karakteristik kultural dari mikroorganisme dilakukan dengan uji

biokimia terhadap metabolisme bakteri. Hal ini dilakukan untuk membantu dalam

mengidentifikasi dan mengklasifikasikan organisme dalam kelompok

taksonominya. Prinsip uji biokimia adalah bila mikroorganisme ditumbuhkan

dalam beberapa jenis media, maka mikroorganisme tersebut akan menunjukkan

suatu perbedaan secara makroskopik dalam pertumbuhannya. Perbedaan inilah

yang dengan karakteristik kultural. Data yang diperoleh digunakan sebagai dasar

pengelompokan mikroorganisme dalam taksonominya masing-masing.

Karakteristik kultural ditentukan dengan mengkulturasi mikroorganisme

pada media diferensial, yaitu media yang digunakan untuk membedakan secara

13

morfologi dan biokimia kelompok organisme. Media ini mengandung senyawa

kimia yang jika mikroorganisme diinokulasi atau inkubasi maka akan

menghasilkan perubahan pada penampakan pertumbuhannya atau media yang

mengelilingi koloni menunjukkan perbedaan (Cappucino, 1983). Uji karakterisasi

yang digunakan antara lain : uji fermentasi karbohidrat, uji hidrogen sulfida, uji

katalase, uji simmon sitrat dan uji methyl red adalah sebagai berikut :

a. Uji fermentasi karbohidrat bertujuan menentukan kemampuan mikroorganisme

mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang diikuti oleh

pembentukan gas atau asam atau keduanya.

b. Uji hidrogen sulfida merupakan uji untuk mengetahui kemampuan

mikroorganisme dalam menghasilkan hidrogen sulfida dari senyawa seperti

asam amino yang mengandung sulfur atau senyawa sulfur anorganik.

c. Uji katalase merupakan uji untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

mendegradasi hidrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase.

d. Methyl red adalah indikator pH antara 6,0 (berwarna kuning) sampai 4,4

(berwarna merah). Tes ini merupakan tes kuantitatif untuk bakteri yang

menghasilkan asam. Bakteri yang mampu menghasilkan asam kuat (laktat,

asetat, formik) dari glukosa melalui jalur fermentasi asam dapat dideteksi

dengan uji methyl red. Bakteri yang mempertahankan pH asam dalam jangka

waktu yang lama (inkubasi 48-72 jam) yang dikatakan tes methyl red-nya

positif (Lay, 1994).

e. Uji Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan

sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bila mikroorganisme

14

mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan,

sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari

hijau menjadi biru.

F. Kondisi Produksi Enzim

Produksi enzim memerlukan optimasi kondisi dalam labu erlenmeyer,

yaitu pH, suhu dan konsentrasi subsrat. Lloyd dan Nelson (1984) menyatakan

bahwa aktivitas optimum enzim berkisar pada pH pertumbuhan mikrooganisme

penghasil enzim tersebut, sehingga pH optimum aktivitas enzim ini berbeda-beda

tergantung mikroorganisme penghasil enzimnya.

Gambar 4. Pengaruh pH terhadap pertumbuhan Mikroba

Sumber : Benefield dan Randall (1980) dalam Jujubandung

Suhu berpengaruh langsung terhadap kecepatan pertumbuhan

mikroorganisme, kecepatan sintesis enzim dan kecepatan inaktivasi enzim. Suhu

yang terlalu tinggi dapat mengakibatkan proses pengeringan protein sehingga

dapat mengakibatkan kematian sel. Sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat

mengakibatkan aktivitas enzim berkurang dan pertumbuhan mikroorganisme

terganggu (Gambar 5).

7

pH

1 2 3 4 5 11 8 12 6 10 9

Asidofilik Neutrofilik

Alkalifilik

15

Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan Mikroba

Sumber : Benefield dan Randall (1980) dalam Jujubandung

Aerasi berfungsi untuk mempertahankan kondisi aerobik untuk desorpsi

CO2, mengatur temperatur subsrat dan mengatur kadar air. Aerasi juga membantu

menghilangkan sebagian panas yang dihasilkan sehingga temperatur dapat

dipertahankan pada temperatur optimal untuk produksi enzim. Tingkat aerasi

dipengaruhi oleh sifat mikroorganisme. Tingkat O2 yang dibutuhkan untuk

sintesis produk, jumlah panas metabolik yang harus dihilangkan dari bahan yang

mudah menguap harus dihilangkan dan tingkat ruang udara yang tersedia didalam

subsrat (Richana, 2000).

Temperatur (°C)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tipe Psikrofilik

(Flavobacterium)

Termofilik ekstrim

(Thermococcus) Tipe Mesofilik

(Eschercia)

Tipe Termofilik

(Thermos)

16

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2015 sampai dengan bulan

April 2016 bertempat di Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Halu Oleo Kendari.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah neraca analitik (Acis),

autoklaf (Wiseclave), Spektrofotometer UV-Vis, waterbath (HWS24), lemari

pendingin (SHARP), pipet mikro (DRAGON ONEMED), mistar, spidol, tabung

eppendorf, jarum ose, tip, cawan petri (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), gelas kimia

(Pyrex), labu takar (Pyrex), erlenmeyer (Pyrex), corong (Pyrex), batang L,

spatula, dan pipet ukur, batang pengaduk, hot plate, Oven (Memmert), Filler,

termometer, termos air panas (Lion Star).

2. Bahan

Bahan yang digunakan yaitu: cairan rumen sapi dari Tempat Pemotongan

Sapi (TPH), spritus, Alkohol 96%, Medium LB (Luria Bertani) (Pepton 0,4%,

Yeast Extract 0,25%, NaCl 0,5%, MgSO40,3%, Akuades, MgSO4.7H2O), Medium

NA (Nutrien Agar), Reagen pewarnaan Gram (kristal violet, aquades, yodium,

etanol, safranin), kaldu karbohidrat (glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, manitol,

BTB (Brom Timol Blue), kaldu methyl red-Voges Proskauer (MR-VP) (Pepton

0,7% (b/v), dekstrosa 0,5% (b/v), dan KH2PO4 0,5% (b/v)), media SIM (pepton 30

17

17

g/L, beef extract 3 g/L, ferro ammonium sulfat 0,2 g/L, natrium tiosulfat 0,025

g/L, dan agar 3 g/L), Kitin (kulit udang, NaOH 3,5 %, aseton teknis 360 mL,

akuades, HCl), Medium koloidal kitin (HCl pekat, NaOH 12 N) dan medium kitin

(koloidal kitin, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl , (NH4)2SO4, yeast extract dan

agar), kasa, kapas steril, alumunium foil, kertas saring, kertas pH dan tisu.

C. Metode Penelitian

1. Pengambilan dan Preparasi Sampel Rumen Sapi

Sampel diambil dari Tempat Pemotongan Hewan (TPH) Anggoeya Kota

Kendari dengan menggunakan botol steril. Semua sampel disegarkan dalam media

cair LB (Luria Broth), kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30°C.

(Rahayu, S. 2003).

2. Proses Isolasi Kitin

Proses isolasi kitin dilakukan sesuai metoda Hang (Fahmi, 1997). Isolasi

kitin dari kulit udang meliputi tahap deproteinisasi, demineralisasi dan

dekolorisasi.

a. Deproteinasi

Kulit udang yang telah dibersihkan dan dikeringkan, diperkecil ukurannya

kemudian ditimbang sebanyak 42 gram. Setelah itu, kulit udang dipanaskan

hingga suhu diatas 100ºC menggunakan pelarut NaOH 3,5% dengan

perbandingan 1:10 (b/v) yaitu sebanyak 420 mL yang dilengkapi dengan

pengaduk, termometer dan diletakkan diatas penangas air. Pemanasan ini

bertujuan untuk proses penghilangan kalsium karbonat yang berlangsung selama 3

18

jam dengan pengadukan terus-menerus. Kemudian dicuci beberapa kali dengan air

bersih sampai pH netral dan dikeringkan pada suhu 50ºC selama 12 jam.

b. Demineralisasi

Kitin kasar hasil deproteinasi sebanyak 24 gram dimasukkan dalam gelas

kimia 1000 mL. Kemudian sempel ditambahkan HCl sebanyak 360 mL dengan

perbandingan 1:15 (b/v) kemudian dilakukan pengadukan tanpa proses pemanasan

selama 1 jam. Setelah itu, dilakukan penyaringan sehingga diperoleh residu dan

filtrat. Terjadinya pemisahan mineral ditunjukkan dengan terbentuknya gas CO2

yang berupa gelembung-gelembung udara pada saat larutan HCl ditambah ke

dalam sampel. Residunya dicuci dengan akuades sampai pH netral yang diukur

dengan indikator universal. Kemudian residu dikeringkan dalam oven pada suhu

60oC selama 24 jam, sehingga diperoleh kitin kering.

c. Dekolorisasi

Kitin yang telah didemineralisasi kemudian didekolorisasi dengan cara

merendamnya dengan larutan aseton teknis sebanyak 360 mL atau sampai seluruh

kitin telah terendam. Proses perendaman berlangsung selama 7 jam. Setelah

proses perendaman, kitin tersebut terlebih dahulu dicuci dengan air mengalir

sampai sisa asetonnya hilang lalu dicuci dengan akuades hingga pH netral.

Kemudian dikeringkan diudara terbuka.

3. Pembuatan Koloidal Kitin

Koloidal kitin dibuat dengan melarutkan 10 gram bubuk kitin dalam 150

mL HCl pekat, lalu diaduk selama 1 jam. Kemudian ditambahkan akuades

sebanyak 800 mL, larutan kemudian disaring untuk diambil residunya. Kemudian

19

residu dicuci dengan akuades sampai pH koloid kitin menjadi 3 (Hsu dan

Lockwood,1975).

4. Pembuatan Medium Kitin

Medium kitin yang dimodifikasi yaitu dengan mencampurkan koloidal

kitin 2 gram, K2HPO4 0,1 g, MgSO4.7H2O 0,01 g, NaCl 3 g, (NH4)2SO4 0,7 g,

yeast extract 0,05 g dan agar 2 g dalam 100 mL akuades, larutan kemudian

dihomogenkan dengan magnetic stirrer dan dipanaskan hingga larut kemudian

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Medium yang telah

steril tersebut kemudian dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga

mengeras (Park, dkk. 2000).

5. Isolasi Bakteri Kitinolitik

Sebanyak 30 mL medium Luria Bertani yang telah disiapkan kemudian

disebar pada media pada medium kitin. Isolasi bakteri dilakukan dengan

menggunakan media yang mengandung koloidal kitin yaitu 1%; yeast extract

0,2% (b/v); bacto pepton 0,5% (b/v); MgSO4.7H2O 0,05% (b/v); NaCl 0,5% (b/v);

CaCl 0,015% (b/v); H3BO3 0,015% (b/v); Na2MoO4.2H2O 0,015% (b/v) dan

bubuk agar-agar sebanyak 3% (b/v) (Yuneta dan Putra, 2010). Sampel diambil

sebanyak 0,2 mL dan disebarkan diatas padatan agar untuk menumbuhkan bakteri.

Isolat diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30ºC.

20

6. Karakterisasi Bakteri Kitinolitik

a. Identifikasi Isolat Terpilih

1. Morfologi bakteri

Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan metode seri pengenceran

(Platting method) yang dilakukan dengan mengambil sebanyak 1 mL sampel

dimasukkan kedalam Erlenmeyer yang berisi 9 mL larutan fisiologis sehingga

didapat pengenceran 10-1

, untuk mendapatkan pengenceran 10-2

dilakukan dengan

mengambil 1 mL dari pengenceran 10-1

dimasukkan kedalam tabung reaksi yang

berisi 9 mL larutan fisiologis, demikian seterusnya sampai dibuat pengenceran 10-

6. Masing-masing seri pengenceran diambil 0,1 mL disebar kedalam cawan petri

yang telah berisi media padat. Selanjutnya diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu

optimum. Koloni yang tumbuh diamati secara makroskopis meliputi bentuk,

ukuran, tekstur dan warna. Berdasarkan koloni lalu dilakukan tahap pemurnian

sehingga akan diperoleh sejumlah isolat (Darmayasa, 2008).

2. Pewarnaan Gram

Kaca penutup dan kaca obyek dibersihkan dengan alkohol 96% hingga

bebas lemak, kemudian dilewatkan di atas nyala lampu spritus. Diambil secara

aseptik sebanyak satu ose isolat bakteri dan diletakkan pada kaca obyek seluas ± 1

cm2 kemudian dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus. Diteteskan zat warna

dasar (kristal violet) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu

dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Apusan kemudian ditetesi dengan

larutan lugol iodine dan didiamkan selama 1 menit. Setelah kering, dicuci dengan

larutan peluntur (alkohol 96%) selama ± 30 detik. Selanjutnya dicuci dengan air

21

mengalir lalu dikeringkan. Setelah kering diberi larutan zat warna

pembanding/penutup (safranin) selama 2 menit dan dicuci dengan air mengalir

lalu dikeringkan. Setelah itu diamati dengan mikroskop, bakteri Gram positif

tampak berwarna biru keunguan sedangkan Gram negatif berwarna merah (Lay,

1994).

b. Uji Biokimia

1. Uji Fermentasi Karbohidrat

Uji fermentasi karbohidrat dapat dilakukan dengan menyiapkan kaldu

karbohidrat 1% yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol. Kaldu

karbohidrat yang mengandung BTB (Brom Timol Blue) dimasukkan dalam tabung

reaksi. Biakan bakteri dinokulasi pada media salanjutnya diinkubasi pada suhu

30ºC selama 24 jam. Uji positif, bila terjadi pembentukan asam (kaldu berubah

menjadi warna kuning) (Lay, 1994).

2. Uji Methyl Red- Voges Proskauer (MR-VP)

Uji metil red dapat dilakukan dengan menyiapkan kaldu methyl red-Voges

Proskauer (MR-VP) (Pepton 0,7% (b/v), dekstrosa 0,5% (b/v), dan KH2PO4 0,5%

(b/v)). Biakan bakteri kemudian diinokulasikan kedalam kaldu MR-VP dan

diinkubasi pada suhu 30ºC selama 48 jam atau pada suhu optimum selama 72 jam.

Hari berikutnya ditambahkan reagen methyl red. Hasil uji positif bila berwarna

merah, dan jika warna kaldu berwarna kuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).

3. Uji Sitrat

Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar ((NH4)2PO4 0,1% (b/v),

KH2PO4 0,1% (b/v), NaCl 0,5% (b/v), Na-Sitrat 0,2% (b/v), MgSO4 0,02% (b/v),

22

BTB 0,08% (b/v), Agar 3% (b/v)) dengan inokulum yang tipis, kemudian

diinkubasi pada suhu 30ºC selama 48 jam. Jika terjadi perubahan warna hijau

menjadi biru menunjukan hasil uji positif (Lay,1994).

4. Uji Katalase

Biakan ditumbuhkan pada media Nutrien Agar (NA) dengan cara

ditotolkan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30ºC kemudian ditambahkan

reagen H2O2 3%. Uji positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara pada

biakan dan disekitarnya (Lay, 1994).

5. Uji Hidrogen Sulfida (H2S)

Uji produksi H2S dilakukan dengan menginokulasi biakan bakteri ke

media SIM (Sulfide Indole Motil) (pepton 30 g/L, beef extract 3 g/l, ferro

ammonium sulfat 0,2 g/L, natrium tiosulfat 0,025 g/L, dan agar 3 g/L) selama 24-

48 jam pada suhu 30ºC. Uji positif dengan terbentuknya endapan hitam

(Lay,1994).

7. Optimasi Kondisi Produksi Enzim

a. Penentuan Substrat Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

Penentuan substrat optimum untuk produksi enzim kitinase dilakukan

dengan menumbuhkan bakteri sebanyak 0,5 mL pada mdia LB mengandung kitin

dari limbah cairan rumen sapi 0,02-0,14% dengan interval konsentrasi 2%,

kemudian biakan diinkubasi pada suhu 30ºC selama 24 jam. Aktivitas enzim

kitinase diukur dengan menggunakan panjang gelombang 584 nm.

23

b. Penentuan Suhu Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

Suhu optimum untuk produksi enzim kitinase, dilakukan dengan

menumbuhkan isolat bakteri pada media cair LB yang mengandung substrat

optimum yang telah didapatkan untuk produksi enzim kitinase dengan variasi

suhu 30ºC, 40ºC, 50ºC dan 60ºC selama 24 jam. Aktivitas enzim kitinase diukur

menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 584 nm dengan

menggunakan larutan standar N-asetilglukosamin.

c. Penentuan pH Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

pH optimum untuk produksi enzim kitinase dilakukan dengan

menumbuhkan isolate bakteri sebanyak 0,5 mL pada media cair LB yang

mengandung substrat optimum yang didapatkan dari hasil optimasi produksi

enzim, dengan variasi pH 3, 4, 5, 6 dan 7, selanjutnya diinkubasi pada suhu

optimum yang didapatkan dari hasil optimasi produksi enzim selama 24 jam.

Aktivitas enzim kitinase diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 584 nm dengan menggunakan larutan standar N-asetilglukosamin.

8. Pengukuran Aktivitas Enzim

Aktivitas enzim kitinase ditentukan berdasarkan jumlah N-asetil-D-

glukosamin yang dibebaskan hidrolisa substrat koloidal kitin. Senyawa N-asetil-

D-glukosamin diukur dengan metode Schales (Imoto dan Yagashita,1971)yang

dimodifikasi. Satu unit aktivitas dinyatakan sebagai jumlah N-asetil-D-

glukosamin (Mmol) yang terbentuk permenit.

Aktivitas enzim kitinase menggunakan 200 µL substrat kitin 0,3 %, 200

µL buffer pH 7 dan 200 µL ekstrak kasar enzim yang diinkubasi selama 30 menit

24

pada suhu 40ºC. Campuran tersebut kemudian diinkubasi dengan kecepatan 9000

rpm selama 4 menit. Selanjutnya 500 µL filtrat yang dihasilkan ditambahkan 500

µL akuades dan di tambahkan 1 mL pereaksi Schales, dipanaskan selama 10

menit untuk menghentikan aktivitas enzim dan setelah dingin diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 584 nm. N-asetilglukosamin sebagai

kurva standar.

9. Analisis Data

a. Penentuan Indeks Kitinolitik

Penentuan indeks kitinolitik (IK) dilakukan dengan cara mengukur

diameter zona bening yang terbentuk disekitar koloni bakteri, kemudian dibagi

dengan diameter koloni yang tumbuh (Tresnawati, dkk., 2006).

Indeks Kitinolitik = Diameter Zona Bening - Diameter Koloni

Diameter Koloni

b. Penentuan Aktivitas Kitinase

Aktivitas enzim Kitinase dihitung berdasarkan data kadar N-asetil

glukosamin relatif sebagai mg N-asetil glukosamin yang dihasilkan per mL filtrat

enzim dengan menggunakan rumus :

A = [ N - Asetilglukosamin]

BM.N - Asetilglukosamin

dimana, A = Aktivitas enzim kitinase (Unit/mL)

[N-asetilglukosamin] = Kadar N-asetil glukosamin hasil hidrolisis

(mg/L)

BM N-asetilglukosamin = Berat molekul N-asetil glukosamin (g/mol)

t = Waktu inkubasi (menit)

25

Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang

diperlukan untuk melepas 1 µmol N-asetil glukosamin/menit. Penentuan kadar N-

asetil glukosamin hasil hidrolisis oleh enzim kitinase didasarkan pada kurva

larutan standar N-asetil glukosamin. Larutan standar N-asetil glukosamin dibuat

pada kisaran konsentrasi N-asetil glukosamin 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5 dan 15 dan

diukur serapannya setelah penambahan pereaksi Schales secara spektrofotometer

pada panjang gelombang 584 nm (Richana, 2002).

26

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel Cairan Rumen Sapi

Pengambilan sampel limbah cair rumen sapi dilakukan di Tempat

Pemotongan Hewan (TPH) Anggoeya, Kendari Sulawesi Tenggara. Kondisi

rumen sapi pada tempat pengambilan sampel mempunyai pH 7 dan suhu 30˚C.

Kondisi fisik sampel dapat dilihat pada Gambar. 6.

Gambar 6. Kondisi Fisik Rumen Sapi

(Koleksi Pribadi, 2015)

B. Isolasi dan Seleksi Bakteri Kitinolitik

Tahap isolasi dan seleksi bakteri dilakukan untuk memperoleh spesies

bakteri dalam bentuk yang terpisah. Koloni terpisah yang dihasilkan kemudian

ditumbuhkan pada media pertumbuhan yang mengandung koloidal kitin sehingga

diperoleh bakteri yang dapat tumbuh pada konsentrasi tertentu.

Komposisi media pertumbuhan bakteri yaitu pepton dan yeast extract yang

berfungsi sebagai sumber asam amino, nukleotida, vitamin dan juga sumber

karbon. Mineral yang harus ada dalam media pertumbuhan yaitu NaCl yang

berfungsi sebagai sumber natrium, MgSO4.7H2O sebagai kofaktor enzim, CaCl2

27

sebagai sumber kalsium, agar sebagai agen pemadat, penambahan koloidal

kitin dalam media berfungsi sebagai substrat untuk enzim kitinase.

Hasil isolasi dan seleksi bakteri pada media kitin diketahui adanya bakteri

yang tumbuh dengan tingkat pertumbuhan bakteri yang ditunjukkan dengan

indeks kitinolitik yang berbeda-beda jumlahnya (Tabel 3). Hal ini disebabkan

karena perbedaan tingkat adaptasi bakteri dengan medium atau lingkungan

hidupnya. Pada media padat selektif diketahui bahwa bakteri berpotensi sebagai

penghasil kitinase dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni. Semakin

banyak enzim yang dihasilkan maka zona bening juga akan semakin luas karena

kitin yang terdegradasi semakin banyak (Margareta, 2003).

Tabel 3. Indeks Kitinolitik Bakteri

Variasi Indeks Kitinolitik

A1 5,19

A2 4,39

A3 7,59

Hasil seleksi terhadap kemampuan bakteri pada media yang mengandung

substrat koloidal kitin diperoleh bakteri yang memiliki kemampuan mendegradasi

kitin dengan baik. Koloidal kitin merupakan penginduksi yang efektif karena

koloidal kitin adalah modifikasi kitin yang bersifat amorf dengan kerapatan

polimer yang rendah sehingga lebih mudah dihidrolisis oleh enzim.

Bakteri yang memiliki aktivitas kitinase ditunjukkan dengan adanya zona

bening di sekitar koloni. Isolat bakteri yang dihasilkan dari limbah cair rumen sapi

menunjukkan zona bening. Zona bening terbentuk akibat enzim kitinase yang

dibebaskan keluar sel bakteri untuk memecah makromolekul kitin menjadi

28

molekul kitin yang lebih kecil, sehingga bakteri dapat mengambil nutrisi dalam

bentuk molekul-molekul kecil.

Hasil penelitian menunjukkan isolat A3 mempunyai indeks kitinolitik

yang besar. Indeks kitinolitik menunjukkan kemampuan degradasi mikroba

terhadap kitin. Semakin banyak enzim yang dihasilkan maka zona bening juga

akan semakin luas karena kitin yang terdegradasi semakin banyak. Bakteri yang

dihasilkan yang memiliki indeks kitinolitik terbesar yang selanjutya

dikarakterisasi dan diidentifikasi.

C. Karakterisasi dan Identifikasi Isolat

Identifikasi isolat bakteri dilakukan untuk mengetahui ciri morfologis dan

karakteristik biokimia. Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang

berbeda dapat tampak serupa oleh karena itu ciri fisiologi dan biokimia

merupakan kriteria yang penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak

dikenal.

Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang

biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme antara

lain uji katalase, uji methyl red, uji hidrogen sulfida, uji sitrat, dan uji fermentasi

karbohidrat (Dwidjoseputro,1994).

Identifikasi isolat bakteri kitinolitik asal limbah cairan rumen sapi

dilakukan untuk mengetahui genus bakteri ini. Teknik pewarnaan Gram bertujuan

untuk membedakan permeabilitas dinding sel suatu bakteri. Kandungan

peptidoglikan dalam dinding sel bakteri merupakan salah satu indikator dalam

pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang

29

lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif. Pewarnaan bakteri Gram positif

akan menunjukkan warna biru, sedangkan pada Gram negatif menunjukkan warna

merah muda saat bakteri ditambahkan reagen pewarna (safranin, iodium dan

kristal ungu) (Beishir, 1991).

Identifikasi sifat isolat bakteri kitinolitik secara kualitatif dilakukan

dengan memfermentasi bakteri pada berbagai sumber nutrisi sebagai uji biokimia.

Tabel. 4 menunjukkan hasil uji biokimia terhadap bakteri kitinolitik yang

dihasilkan.

Tabel 4. Uji Biokimia pada Bakteri Kitinolitik

No. Jenis Uji Hasil Uji

1. Fermentasi Karbohidrat

Glukosa Positif

Maltosa Positif

Sukrosa Positif

Manitol Positif

Laktosa Positif

2. Uji Metil merah Positif

3. Uji sitrat Positif 4. Uji katalase Negatif 5. Uji hidrogen sulfida Negatif

Uji fermentasi pada beberapa jenis karbohidrat (Glukosa, Maltosa,

Sukrosa, Manitol, Laktosa), menunjukkan semua hasil fermentasi berupa asam.

Hal ini ditandai dengan hasil uji yang positif yaitu warna media karbohidrat yang

semula kuning berubah menjadi merah. Indikator yang digunakan untuk

mendeteksi penurunan pH pada media adalah larutan methyl red. Hasil ini sejalan

dengan hasil uji metil merah yang menunjukkan adanya perubahan pH menjadi

asam, yaitu warna hasil fermentasi menjadi merah (Lay, 1994). Pada penelitian ini

hasil uji fermentasi pada beberapa jenis karbohidrat menunjukkan hasil positif

dengan berubahnya warna media yang semula kuning menjadi merah.

30

Uji sitrat dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri kitinolitik

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Pada

pengujian ini digunakan media agar yang mengandung Na sitrat (sumber karbon),

NH4+ (sumber N) dan brom thymol blue (indikator pH). Bila mikroorganisme

mampu menggunakan sitrat, maka terjadi peningkatan pH dan mengubah warna

media menjadi biru (Lay, 1994). Bakteri kitinolitik yang diisolasi dari rumen sapi

memiliki kemampuan dalam menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber

karbon, hal ini menunjukkan bahwa bakteri kitinolitik yang diperoleh positif uji

sitrat.

H2S diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme melalui pemecahan

asam amino yang mengandung unsur belerang (S). Adanya H2S dapat diamati

dengan menambahkan garam logam berat ke dalam media. Hasil positif apabila

H2S menghidrolisis logam berat yang ditandai dengan terbentuknya logam sulfit

yang berwarna hitam. Hasil negatif apabila mikroorganisme tidak memiliki

kemampuan untuk menghidrolisis logam berat yang terkandung dalam media.

Hasil yang diperoleh menunjukkan uji H2S bakteri kitinolitik ialah negatif. Pada

penelitian ini, bakteri kitinolitik yang dihasilkan menunjukkan hasil yang negatif.

Katalase merupakan salah satu enzim yang digunakan oleh

mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida. Pada uji katalase yang

dilakukan tidak terbentuk gelembung gas disekitar koloni ketika ditambahkan

H2O2. Penentuan adanya katalase diuji dengan larutan H2O2 3%, dimana terbentuk

gelembung udara yang merupakan gas O2 di sekitar koloni jika uji yang dilakukan

31

memberikan hasil positif (Lay, 1994). Penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri

kitinolitik yang dihasilkan negatif uji katalase.

H2O2 H2O + ½ O2

Katalase Gelembung udara

Berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, karakteristik

morfologi dan hasil uji biokimia isolat bakteri kitinolitik menunjukkan ciri-ciri

dari genus Lactobacillus murinus yang merupakan kelompok bacteria. Genus

Lactobacillus murinus umumnya memiliki bentuk sel batang (basil) dalam bentuk

tunggal maupun berpasangan, hal ini sesuai dengan morfologi koloni bakteri yang

diperlihatkan pada Gambar 7. Taksonomi genus Lactobacillus murinus

berdasarkan Bergey’s Manual Trust (2002) yaitu :

Gambar 7. Morfologi Bakteri Kitinolitik

(Perbesaran 100 x 10)

Kingdom : Bacteria

Domain : Firmicutes

Filum : Bacilli

Kelas : Lactobacillales

Order : Lactobacillaceae

Family : Lactobacillus

Genus : Lactobacillus murinus

32

Berdasarkan hasil identifikasi makroskopis menunjukkan bahwa bakteri

kitinolitik berbentuk bulat, berwarna putih, tepi koloni utuh dengan permukaan

koloni halus sedangkan hasil identifikasi secara mikroskopis dengan pewarnaan

Gram menunjukkan bahwa bakteri kitinolitik merupakan bakteri Gram negatif

berbentuk bacilli (batang).

D. Optimasi Kondisi Produksi

1. Penentuan Substrat Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

Substrat koloidal kitin merupakan penginduksi aktivitas kitinolitik yang

paling efektif karena koloidal kitin merupakan turunan kitin yang bersifat amorf

dengan kerapatan polimer lebih rendah sehingga lebih mudah dihidrolisis enzim

(Fawzya, dkk. 2004) dan lebih mudah tersebar merata dalam medium cair

(Muzzarelli, 1977). Konsentrasi substrat adalah faktor penentu untuk produksi

enzim. Pada penelitian ini telah dilakukan variasi konsentrasi substrat 0,02-0,14%

(b/v) untuk mengetahui konsentrasi yang tepat untuk produksi enzim kitinase.

Aktivitas kitinase meningkat pada media yang mengandung substrat

dengan konsentrasi 0,02% (b/v) sampai 0,08% (b/v) (Gambar 8). Aktivitas

tertinggi tercapai oleh adanya substrat kitin 0,08% (b/v) pada media, dengan

aktivitas enzim sebesar 0,277 U/mL. Pada konsentrasi substrat diatas 0,08% (b/v)

menyebabkan produksi enzim semakin menurun. Hal ini dikarenakan dalam suatu

reaksi enzimatik, enzim akan mengikat substrat membentuk kompleks enzim-

substrat, kemudian kompleks ini akan terurai menjadi enzim dan produk. Makin

banyak kompleks enzim substrat yang terbentuk, makin cepat reaksi berlangsung

sampai batas kejenuhan. Pada konsentrasi substrat melampaui batas kejenuhan

33

kecepatan reaksi akan konstan. Berdasarkan hasil tersebut maka kondisi produksi

enzim kitinase akan optimum dengan penambahan substrat koloidal kitin 0,08%.

Gambar 8. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Produksi Enzim Kitinase

Konsentrasi substrat optimum dalam produksi enzim kitinase juga berbeda

untuk setiap jenis bakteri yang berbeda, seperti yang dilakukan oleh Wulandari

dan Herdyastuti (2013) yang menyatakan bahwa isolat kitinolitik LA 21 asal

tambak udang Lamongan memiliki aktivitas enzim maksimal 0,06%, sedangkan

Brzezinska dan Donderski pada tahun 2001 yang menunjukkan aktivitas kitinase

Aeromonas hydrophila tertinggi pada konsentrasi koloidal kitin 2%.

2. Penentuan Suhu Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

Suhu juga berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroorganisme, sintesis

enzim dan kecepatan inaktivasi enzim. Suhu yang terlalu tinggi dapat

mengakibatkan proses denaturasi protein sehingga dapat mengakibatkan kematian

sel. Pada suhu yang terlalu rendah berakibat aktivitas enzim berkurang dan

selanjutnya akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme.

34

Uji pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim dilakukan untuk

mengetahui kondisi optimum enzim dalam mendegradasi substrat. Setiap enzim

memiliki aktivitas maksimum pada temperatur tertentu, aktivitas enzim akan

semakin meningkat dengan bertambahnya temperatur hingga temperatur optimum

tercapai. Kenaikan temperatur di atas temperatur optimum akan menyebabkan

aktivitas enzim menurun (Baehaki, 2011).

Penentuan suhu optimum untuk produksi enzim kitinase dilakukan dengan

variasi suhu 30ºC, 40ºC, 50ºC dan 60ºC. Dari hasil penelitian, diperoleh bahwa

suhu optimum untuk produksi enzim kitinase ialah pada suhu 40ºC dengan

aktivitas enzim sebesar 0,886 U/mL (Gambar. 9). Penelitian untuk jenis bakteri

kitinolitik menunjukkan kondisi optimum yang sama dalam produksi enzim

kitinolitik seperti yang dilaporkan oleh Donderski dan Trzebiatowska (2000)

bahwa Anthrobacter sp. menunjukkan bahwa aktivitas kitinolitik tertinggi pada

suhu 40ºC. Di samping itu, bakteri kitinolitik jenis Streptomyces sp. PTK19 yang

dikaji oleh Pratiwi, dkk. 2015 suhu optimum enzim kitinase sebesar 40°C dan

stabil pada kisaran suhu 30-45°C.

Gambar 9. Pengaruh Variasi Suhu terhadap Produksi Enzim Kitinase

35

3. Penentuan pH Optimum untuk Produksi Enzim Kitinase

Organisme memiliki rentang pH kultivasi yang cukup sempit untuk

pertumbuhannya. Penentuan pH kultivasi merupakan faktor yang penting untuk

pertumbuhan mikroorganisme dan pembentukan produk metabolitnya. Llyod dan

Nelson (1984) menyatakan bahwa aktivitas optimum enzim berkisar pada pH

pertumbuhan mikroorganisme penghasil enzim tersebut, sehingga pH optimum

aktivitas enzim ini berbeda-beda tergantung mikroorganisme penghasil enzimnya.

Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan

aktivitas maksimum (Lehninger, 1995). Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH

medium tempat reaksi terjadi (Suhartono, 1989), dan pada umumnya enzim aktif

pada pH netral atau dengan kisaran pH 5–9 (Rahayu, 2000).

Penentuan pH optimum untuk produksi enzim kitinase dilakukan pada

rentang pH 3, 4, 5, 6 dan 7. pH optimum untuk produksi enzim kitinase ialah pH 6

dengan aktivitas enzim sebesar 0,194 U/mL. Hal ini sejalan dengan penelitian

yang dilakukan oleh Herdyastuti, dkk. pada tahun 2009 yang berhasil mengisolasi

genus Trichoderma yang mempunyai stabilitas pH pada kisaran 3,5 - 6,0. Nilai pH

optimum 6 juga ditemukan pada kitinase Trichoderma harzianum (Katatny et al.,

2000). Namun, berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Bhattacharya S,

dkk. (2012) yang melaporkan pH optimum untuk pertumbuhan Serratia

marcescens penghasil enzim kitinase adalah pH 7.

36

Gambar 10. Pengaruh Variasi pH terhadap Produksi Enzim Kitinase

E. Produksi Enzim Kitinase

Optimasi waktu produksi dilakukan untuk mengetahui waktu panen yang

tepat selama proses produksi enzim kitinase, dimana bakteri kitinolitik

menghasilkan kitinase dengan aktivitas tertinggi. Untuk menentukan waktu

optimum, maka dilakukan produksi enzim pada 0 jam sampai 24 jam dengan

selang waktu 2 jam dilakukan sampling untuk penentuan aktivitas kitinase yang

dihasilkan. Aktivitas kitinase yang diperoleh dari supernatan kultur meningkat

pada jam ke 0 sampai 6 jam, aktivitas enzim tertinggi berada pada 6 jam yang

dinyatakan dengan nilai aktivitas enzim sebesar 125,943 U/mL dan kemudian

menurun pada 20 jam sampai 24 jam.

Peningkatan aktivitas enzim menunjukkan bahwa semakin banyak substrat

yang terhidrolisis. Aktivitas enzim kitinase terus meningkat dari 0 jam inkubasi

hingga mencapai waktu inkubasi optimum, hal ini dapat terjadi karena pada 0 jam

masih sedikit enzim yang bereaksi dengan substrat dan akan meningkat seiring

dengan peningkatan waktu inkubasi hingga mencapai waktu inkubasi optimum.

37

Setelah mencapai waktu optimum, aktivitas enzim menurun dikarenakan telah

terjadi akumulasi produk hidrolisis yang selanjutnya dapat menghambat aktivitas

enzim (Gambar. 11).

Gambar 11. Kurva Produksi Enzim Kitinase

Aktivitas enzim kitinase yang ditunjukkan oleh bakteri merupakan

parameter yang digunakan dalam seleksi bakteri kitinolitik (Park, dkk. 2000).

Seleksi sebenarnya membantu untuk mengetahui apakah suatu mikroorganisme

menghasilkan senyawa kimia tertentu seperti enzim, antibiotik atau metabolit

sekunder lainnya (Huang, dkk. 1999). Aktivitas enzim yang dihasilkan oleh

mikroorganisme dapat diketahui dengan seleksi pada media selektif. Media

selektif merupakan media dengan komposisi tertentu, sehingga hanya jenis-jenis

tertentu saja yang dapat hidup (Gandjar, 1992).

Enzim kitinase yang diproduksi dapat diketahui dengan melihat aktivitas

enzim kitinolitik. Aktivitas enzim merupakan ukuran perubahan molekul substrat

yang menjadi produk dalam satuan waktu pada kondisi tertentu (Green, dkk.

2005). Penentuan aktivitas enzim kitinolitik dapat dilakukan dengan metode

Schales menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

38

V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka disimpulkan:

1. Bakteri kitinolitik asal limbah cairan rumen sapi memiliki kemampuan yang

baik dalam mendegradasi kitin. Hal ini dibuktikan dengan adanya zona bening

dengan indeks kitinolitik sebesar 7,59.

2. Karakteristik bakteri kitinolitik asal limbah cairan rumen sapi menunjukkan

isolat bakteri kitinolitik merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

dari spesies bakteri Lactobacillus ruminus.

3. Kondisi optimum produksi enzim kitinase ialah pada konsentrasi substrat

0,08% (b/v) dengan suhu 40ºC pada pH 6 dengan aktivitas enzim sebesar

125,943 U/mL

B. Saran

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk:

1. Perlu dilakukan pemurnian enzim kitinolitik asal limbah cairan rumen sapi.

2. Perlu dilakukan karakterisasi enzim kitinase.

39

DAFTAR PUSTAKA

Apriani, L. 2008. Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Kitinolitik Serta Pengujian

Beberapa Variasi Suhu dan pH untuk Produksi Enzim. Fakultas

Mamatematika dan Ilmu Pengatahuan Alam. Departemen Biologi.

Universitas Indonesia: Depok.

Arora, S. P. 1989. Pencernaan Mikrobia pada Ruminansia. Gadjah Mada

University Press: Yogyakarta.

Baehaki, A., Rinto dan B. Arif. 2011. Isolasi dan Karekterisasi Protease dari

Bakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. J. Teknologi dan

Industri Pangan, Vol. XXII No. 1.

Bhattacharya S, Chakrabortty S, and Das A. 2012. Optimization of Process

Parameters for Chitinase Production by a Marine Isolate of Serratia

marcescens. J. Pharm. Biol. Sci. 2:2, 8-20.

Budiansyah, A., Resmi, Nahrowi, Wiryawan, K. G, Suhartono, M. T dan

Widyastuti, Y. 2011. Karakteristik Endapan Cairan Rumen Sapi asal

Rumah Potong Hewan sebagai Feed Supplement. Jurnal Ilmiah Ilmu-

Ilmu Peternakan,Vol. XIV. No.1.

Brzezinska, M.S. and Donderski, W. 2001. Occurence of Chitinolytic Bacteria in

Water and Bottom Sediment of Eutrophic Lakes in Hawski Lake

District. Polish Journal of Environmental Studies Vol. 10 No.5.

Cahyani, L. 2013. Pemanfaatan Tepung Cangkang Udang Sebagai Media

Produksi Kitinase oleh Bakteri Kitinolitik Isolat 26. Jurusan Biologi

FMIPA. Universitas Jember.

Cappucino, J.G., and Sherman, N. 1983. Microbiology: A laboratory Manual.

Addison-Wesley Publishing Company, Inc. Menlo Park, California.

Chemin, L., Z. Ismailov, S. Haran and I. Chet. 1995. Chitinolytic Enterobacter

Agglomerans Antagonistic to Fungal Plant Pathogens. Appl. Environ

Microbiol. Vol. 61 No. 5.

Commons.wikimedia.org, 2013. Pengertian Rumen dan Fungsinya.

Darmayasa, I. B. G. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pendegradasi Lipid

(Lipid) pada Beberapa Tempat Pembuangan Limbah dan Estuari DAM

Denpasar. Jurnal Bumi Lestari. Vol. 8 No. 2.

40

Dehority, B.A and C.G Orphin.1997. Development of Natural Fluctuation in

Rumen Microbial Population. In: The Rumen Microbial Ecosystem.

PN. Hobson, P. N and C. S Stewart (Editors). Blackie Academic &

Professional. London.

Donderski, W. and M. Trzebiatowska. 2000. Influence of Physical and Chemical

Factors on The Activity of Chitinases Produced by Planktonic Bacteria

Isolated from Jeziorak Lake. Polish Journal of Environmental Studies.

Vol. 9 No.2.

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambaran.

Erni Mawar Indah S, Nies Suci Mulyani dan Purbowatiningrum Ria S., 2002.

Pengaruh Variasi Temperatur Terhadap Aktivitas Xilanase Hasil isolasi

dari Aspergillus niger pada media pertumbuhan CBD (Chapek’s Dox

Broth) Hasil Modifikasi dengan sekam Padi. Jurusan Kimia:

Universitas Diponegoro Semarang.

Fahmi, R. 1997. Isolasi dan Transformasi Kitin menjadi Kitosan. Jurnal Kimia

Andalas. Vol. 3. No.1.

Fawzya, Y.N., N. Indriati dan T.D. Suryaningrum. 2004. Pengaruh Penambahan

Kitin pada Medium Produksi Terhadap Kitin Deasetilase dari Bacillus

K29-14. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia. Vol. 10 No.3

Gandjar, I., I.R. Koentjoro., W. Mangunwardoyo. & L. Soebagya. 1992. Pedoman

Praktikum Mikrobiologi Dasar. Jurusan Biologi FMIPA-UI, Depok.

Green, A.T., M.G. Healy and A. Healy. 2005. Production of Chitinolytic by

Serratia Marcescens Qmb1466 using Various Chitinous Substrates.

Journal of Chemical Technology and Biotechnology. Vol. 80.

Haliza, Winda dan Suhartono, M., T. 2012. Karakteristik Kitinase dari Mikrobia.

Buletin Teknologi Pascapanen Pertanian. Vol. 8 No. 1.

Herdyastuti, N., Raharjo, T. J., Mudasir dan Matsjeh, S. 2009. Kitinase dan

Mikroorganisme Kitinolitik:Isolasi, Karakterisasi dan Manfaatnya.

Indo.J. Chem. Vol. 9 No. 1.

Hobson, P. N and C. S Stewart.1992. The Rumen Microbial Ecosystem. Blackie

Academic & Professional. New York.

Hsu, SC and Lockwood. 1975. Powdered Chitin Agar As a Selective

Enumerationof Actinomycetes in Water and Soil. Applied

Microbiology. Vol. 29 No. 1.

41

Huang, L., S.S. Miles and R.B. Lingham. 1999. Screening for activities. Dalam:

Demain, A.L. & J.E. Davies. 1999. Manual of industrial microbiology,

Washington.

Imoto, I. And K. Yagashita. 1971. A Simple Activity Measurement of

Lisoenzyme. Agric. Biol. Chem. 35: 1154-1156.

Judoamidjojo. M., E. G. Said., L. Hartono. 1989. Biokonversi Biotek. PAU. IPB.

Bogor.

Katatny, M. H. E., Somitsch, W. Robra, K. H. Katatny, M. S. E., and Gubitz, G.

M. 2000. Production of Chitinase and 1,3-glucanase by Trichoderma

harzianum for Control of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium

rolfsii. J. Food. Technol. Biotechnol. Vol. 38. No.3.

Koga, D., M. Mitsutomi, M., M. Kono and M. Matsumiya. 1999. Biochemistry of

Chitinases. Dalam: Jolles, P. dan R.A.A Muzzarelli. 1999. Chitin and

Chitinases. Birkhauser Verlag, Basel.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba dilaboratorium. PT. Raja Grafindo Persada.

Jakarta.

Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia. Jilid 1. Erlangga, Jakarta.

Lestari, R., E.I.N. Aidil dan N. Anita. 2002. Biologi. Terjemahan dari Biology.

Edisi Kelima oleh Campbell, N.A., J.B. Reece dan L.G. Mitchell..

Penerbit Erlangga.

Liaw, H. J. and R. A. Mah. 1992. Isolation and Characterization of

Haloanaerobacter Chitinovorans Gen. Appl. Environ Microbiol. Vol. 58

No. 1.

Lloyd, N.E. and W.J. Nelson. 1984. Glucose and Fructose Containing Sweeteners

from Starch. In Whesler et al. (Eds.). Starch. Chemistry and

Technology. Academic Press. p. 611-659.

Margareta, M., 2003. Penapisan dan karakterisasi Sejumlah Isolat Bakteri

Termofilik Amilolitik. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

McDonald, P., R. A. Edwards, J. F. D. Greenhalgh and C. A. Morgan. 2002.

Animal Nutrition. Prentice Hall. London.

Microbiology 101 Laboratory Manual. www.slic2.wsu.edu. Diakses pada 25

Maret 2015.

42

Muharni, 2010.Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase dari Sumber Air

Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. Jurnal Penelitian Sains. 10:06-

09.

Mulyono, HAM. 2006. Membuat Reagen Kimia di Laboratorium. PT. Bumi

Aksara: Jakarta.

Muzarelli RAA. 1977. Chitin. Pergamon Press: New York.

Nasran, S., F. Ariyani dan N. Indriati. 2003. Produksi Kitinase dan Kitin

Deasetilase dari Vibrio harveyl. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia.

Vol. 9 No. 5.

Nuswantara, Limbang Kustiawan. 2002. Ilmu Makanan Ternak Ruminansia (Sapi

Perah). Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak. Fakultas Peternakan

Unversitas Diponegoro: Semarang

Padmono, Djoko. 2005. Alternatif Pengolahan Limbah Rumah Potong Hewan

Cakung (Suatu Studi Kasus). Jurnal Teknologi Lingkungan P3TL.-

BPPT. Vol. 6 No. 1.

Park, S.H., J. Lee and H.K. Lee. 2000. Purification and Characterization from a

Marine Bacterium, Vibrio sp. 98CJ11027. The Journal of Microbiology.

Vol. 38 No. 4.

Pelczar, M.J. dan Chan E.C.S. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 2. Jakarta.

Pujianto, S., Kusdiyantini, E., dan Hadi, M. 2008. Isolasi dan Seleksi Bakteri

Isolat Lokal yang Berpotensi untuk Mengendalikan Larva Nyamuk

Aedes Aegypti L. Biodiversitas. Vol. 9 No. 1.

Pujiastuti, P. 2001. Kajian Transformasi Khitin Menjadi Khitosan Secara Kimiawi

dan Enzimatik, Seminar Nasional Jurusan Kimia, Jurusan Kimia F

MIPA: UNS.

Rahayu, S. 2000. Pemurnian dan Karakterisasi Kitinase dan Kitin Deasetilase

Termostabil dari Isolat Bacillus K-29-14 Asal Kawah Lamojang, Jawa

Barat. Thesis Program Pascasarjana, IPB.

Rahayu, Sri, Suhartati F., M. Rimbawanto E.,A. Dan Iriyanti, N. 2003. Isolasi dan

Identifikasi Bakteri Kitinolitik asal Rumen. Animal Production Journal.

Vol. 5 No. 2.

Richana,N., P Lestari, A. Thontowi dan Rosmimik., 2000. Seleksi Isolat Bakteri

Lokal Penghasil Xilanase. Jurnal Mikrobiologi Indonesia. Vol. 5 No.2.

43

Sakai, K., A. Yokota, H. Kurokawa, M. Wakayama dan M. Moriguchi. 1998.

Purification and Characterization of Three Thermostable

Endochitinases of A Noble Bacillus Strain MH-1, Isolated from Chitin-

Containing Compost. Appl. Environ Microbiol. Vol. 64 No. 9.

Saules. Meija, J.E., K.N. Waliszewski, M.A. Garcia and R. Cruz-camarillo. 2006.

The Use of Crude Shrimp Shell for Chitinase Production by Serratia

marcescens. WF. Food Technol. Biotechnol. Vol. 44 No. 1.

Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Depdikbud. Ditjen Dikti–PAU.

IPB, Bogor. p. 53–102.

Suhermiyati, S. 1984. Pengujian Cobaan Bahan Limbah RPH dan Ragi Makanan

Ternak serta Kombinasinya dalam Ransum Ayam Pedaging. Thesis

Fakultas Peternakan IPB, Bogor.

Sutardi, T., 1977. Ikhtisari Ruminologi. Bahan Kursus Peternakan Sapi Perah

Kayu Ambon, Lembang. Direktorat jendral Peternakan. Jakarta.

Vogan, C.L., C. Costa-Ramos and A.F Rowley. 2002. Shell Disease Syndrom in

The Edible Crab, Cancer Pangurus-Isolation, Characterization and

Pathogenicity of Chitinolytic Bacteria. Microbiology.

Wahyu, J., 1985. Ilmu Nutrisi Ternak. Gadjah Mada University Press.

Yogyakarta.

Windholz. 1983. Chitin and Chitosan. N.Y University : New Castle.

Wulandari, H. A. dan Herdyastuti, N. 2013. Optimasi Pertumbuhan Isolat

Kitinolitik La 21 yang Diisolasi dari Tambak Udang di Lamongan.

UNESA Journal of Chemistry. Vol. 2, No. 2.

Yuneta. R dan Putra R.S. 2010. Pengaruh Suhu pada Lipase dari Bakteri Bacillus

subtilis. Prosiding Kimia. MIPA. Institut Teknologi Sepuluh November.

Surabaya.

Zikakis, JP. 1984. Chitin, Chitosan, and Related Enzymes. Introduction.

Academic Press: San Diego.

44

LAMPIRAN

Lampiran 1. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Cairan Rumen Sapi

Keterangan :

Tanda Merah : TPH Anggoeya, Tempat Pengambilan Sampel Cairan Rumen sapi

45

Lampiran 2. Gambaran Umum Alur Penelitian

Isolasi dan Seleksi bakteri

Kitinolitik

Sampel cairan rumen sapi dari

Tempat Pemotongan Hewan (TPH)

Kendari Sulawesi Tenggara

Identifikasi Isolat Terpilih

Karakteristik sifat

biokimia

Karakteristik

mikroskopi

Uji bakteri

Gram +/-

Bentuk sel

Uji katalase

Uji fermentasi

karbohidrat

Uji sitrat

Uji Methyl Red

Uji H2S

Optimasi Produksi

Enzim

Substrat Optimum

Suhu Optimum

pH Optimum

Kurva Pertumbuhan

Aktivitas Enzim

Analisis Data

Karakterisasi Isolat

46

Lampiran 3. Diagram Alir Pengambilan Sampel, Isolasi dan Seleksi Bakteri

Kitinolitik, Uji Mikroskopi dan Biokimia

1. Pengambilan Sampel

2. Isolasi dan Seleksi bakteri dari sampel cairan rumen sapi

Kultur bakteri dalam

media cair LB

- diambil 0,2 mL

- disebar pada cawan petri berisi media agar selektif

kitinase

- diinkubasi selama 48 jam

Kultur bakteri

kitinolitik

- diuji pada media koloidal kitin 1%

- diinkubasi selama 48 jam pada suhu optimum

- diamati zona bening yang terbentuk

Bakteri kitinolitik

Sampel dari TPH

starter

- disegarkan dalam media cair LB (Luria Bertani)

- diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC

47

3. Analisis Isolat Bakteri Kitinolitik

a. Karakteristik makroskopi (Metode Pengenceran)

b. Karakteristik Mikroskopi (Uji Pewarnaan Gram)

Isolat bakteri

Isolat Bakteri

pengenceran 10-1

sampai 10-6

- disebarkan pada media padat LB

- diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam

- diamati bentuk, tekstur dan warna koloni

Hasil

- diencerkan

Isolat Bakteri yang telah diremajakan

- diambil sebanyak 1 osse

- dioles diatas permukaan kaca objek

- diteteskan larutan ungu Kristal pada bagian olesan bakteri dan

didiamkan selama 1 menit

- dicuci dengan air dan dibiarkan sampai kering

- diteteskan larutan iodium dan didiamkan selama 2 menit

- dicuci dengan air dan dibiarkan sampai kering

- diteteskan alkohol dan didiamkan selama 30 detik

- diteteskan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik

- dicuci dengan air dan dibiarkan sampai kering

- diamati di bawah mikroskop

Penampakan

48

c. Uji biokimia Isolat Terpilih

Uji Biokimia

Uji karbohidrat Uji katalase Uji Methyl Red Uji Sitrat

Bergey’s Mannual of

Determinative

Uji H2S

49

Lampiran 4. Pembuatan Koloidal Kitin

Bubuk Kitin

Residu Filtrat

Endapan: Koloidal kitin

- dimasukkan ke dalam gelas kimia 1000 mL

sebanyak 5 gram

- ditambahkan 75 mL HCl pekat

- diaduk selama 1 jam

- ditambahkan akuades sebanyak 500 mL

- disaring

- dicuci dengan akuades sampai pH 3

50

Lampiran 5. Pembuatan Media

1. Media Luria Bertani (LB) Cair

2. Media Kitin Modifikasi

Koloidal Kitin 2%

Medium Kitin

- dimasukkan kedalam erlenmeyer

- dimasukkan akuades sebanyak 100 mL

- ditambahkan KH2PO4 0,1 g

- ditambahkan MgSO4.7H2O 0,01 g

- ditambahkan NaCl 3 g

- ditambahkan (NH4)2SO4 0,7 g

- ditambahkan yeast extract 0,05 g

- ditambahkan agar 2 g

- dipanaskan sambil di homogenkan dengan magnetic stirer

hingga larut

- disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15

menit

- dituang kedalam cawan petri

- dibiarkan memadat

- dimasukan dalam erlenmeyer

- ditambahkan pepton 0,15 gr

- ditambahkan yeast extract 0,075 gr

- ditambahkan NaCl 0,15 gr

- ditambahkan MgSO4.7H2O 0,09 gr

- ditambahkan CaCl2, 0,003 gr

- disterilisasi dalam autoklaf pada suhu

121°C selama 15 menit.

30 ml akuades

Medium LB

Hasil Sterilisasi

- didinginkan

- dimasukkan isolat sebanyak 200 µL

- diinkubasi selama 48 jam

- Medium LB

51

Lampiran 6. Optimasi Kondisi Produksi Enzim Kitinase

a. Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum

b. Penentuan Suhu Optimum

c. Penentuan pH Optimum

0,5 mL Isolat Bakteri

- ditumbuhkan pada media LB cair modifikasi

dengan konsentrasi (0,02-0,14 %)

- diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30ºC

- dilihat absorbansnya pada spektrofotometer UV-Vis

dengan panjang gelombang 584 nm menggunakan

larutan standar N-asetil glukosamin

-

Substrat Optimum Enzim

0,5 mL Isolat Bakteri

- ditumbuhkan pada media cair LB yang mengandung

substrat optimum

- di variasikan suhu pertumbuhannya yaitu 30ºC, 40ºC,

50ºC dan 60ºC selama 24 jam

- diukur aktivitasnya dengan spektrofotometer pada λ

584 nm menggunakan larutan standar N-asetil

glukosamin

Suhu Optimum Enzim

0,5 mL isolat bakteri

- ditumbuhkan pada media cair LB yang mengandung

substrat optimum dengan variasi pH 3, 4, 5, 6 dan 7

- diinkubasi pada suhu optimum yang didapatkan dari hasil

optimasi produksi enzim selama 24 jam

- diukur aktivitasnya menggunakan spektrofotometer pada λ

584 nm dengan larutan standar N-asetil glukosamin

pH Optimum Enzim

52

Lampiran 7. Pengukuran Aktivitas Enzim

200 µL ekstrak kasar

enzim

- dimasukkan kedalam tabung reaksi

- ditambahkan 200 µL substrat kitin 0,3 %

- di tambahkan 200 µL buffer pH 7

- diinkubasi selama 30 menit dengan suhu optimum

- disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 4

menit

- dipisahkan filtrat dengan residunya

Aktivitas Enzim

Residu Filtrat

- diambil 500 µL

- ditambahkan 500 µL akuades

- ditambahkan 1 mL pereaksi Schales

- dipanaskan selama 10 menit

- diukur absorbansinya pada panjang gelombang

584 nm. N-asetilglukoamin sebagai standar.

53

Lampiran 8. Diagram pembuatan kitin dari kulit udang

a. Deproteinasi

b. Demineralisasi

c. Dekolorisasi

Kulit udang

- dibersihkan dan dikeringkan

- ditimbang sebanyak 45 gram

- dipanaskan hingga suhu diatas 100ºC dengan pelarut

NaOH 3,5% dengan perbandingan 1:10 (b/v) selama 3 jam

- dicuci beberapa kali dengan air mengalir sampai pH netral

- dikeringkan pada suhu 50ºC selama 12 jam

Kulit udang deproteinasi

Kulit udang deproteinasi

- diambil sebanyak 25 gram

- dimasukkan ke dalam gelas kimia 1000 mL

- ditambahkan HCl sebanyak 375 mL dengan perbandingan 1:15

(b/v)

- diaduk tanpa proses pemanasan selama 1 jam

- disaring

Filtrat Residu

- dicuci dengan akuades hingga pH netral

- dikeringkan pada suhu 60°C selama 24 jam

Kulit udang demineralisasi

Kulit udang demineralisasi

- direndam dengan aseton teknis sebanyak 360 mL selama 7

jam

- dicuci dengan air mengalir hingga pH netral

- dikeringkan diudara terbuka

Kitin

54

Lampiran 9. Pembuatan Larutan

1. Pembuatan Media LB (Luria Bertani)Cair 30 mL

Bahan :

Pepton : 0,15 g

Yeast Extract : 0,075 g

NaCl : 0,15 g

MgSO4.7H2O : 0,09 g

CaCl2 : 0,003 g

Pelarut : akuades

2. Pembuatan Media LB Padat Modifikasi 120 mL

Bahan :

Koloidal Kitin : 2,4 g

KH2PO4 : 1,2 g

MgSO4.7H2O : 0,012 g

NaCl : 3,6 g

Yeast extract : 0,06 g

Amonium Sulfat : 0,84 g

Agar : 3,36 g

Pelarut : akuades

3. Pembuatan Larutan Standar N-asetilglukosamin

Bahan :

N-asetilglukosamin : 10 mg

Akuades : 10 ml

55

10 mg = 10.000 µg = 1000 µg/mL

10 mL 10 mL = 1000 ppm

Untuk konsentrasi 2,5 µg/mL

5 µg/mL. V1 = 2,5 µg/mL . 10 mL

V1 = 25/5 = 5 mL

4. Pembuatan buffer pH

Larutan buffer KHP-HCl (Mulyono, 2006)

Larutan A : Kalium Hidrogen Ptalat (KHP):

Timbang 5,11 gram KHP dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL ¼ labu,

dan homogenkan; tambah lagi akuades sampai tanda batas.

Larutan X (HCl 0,1 M) :

Dipipet 0,82 mL HCl 0,1 M dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL ¼

labu, dan homogenkan; tambah lagi akuades sampai tanda batas.

pH

A (50 mL) +

x (mL) y (mL)

3,00 22,3 27,7

3,50 8,2 41,8

4,00 1,0 49,0

Keterangan: A = larutan KHP

X = larutan HCl 0,1 M

Y = akuades

Larutan buffer KHP-NaOH (Mulyono, 2006)

Larutan x (NaOH 0,1 M)

Dipipet 7,51 mL NaOH 0,1 M dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL ¼

labu, dan homogenkan; tambah lagi akuades sampai tanda batas.

56

pH

A (50 mL) +

x (mL) y (mL)

5,00 22,6 27,4

Keterangan : A = Larutan KHP

X = Larutan NaOH 0,1 M

Y = Akuades

Larutan buffer KH2PO4-NaOH (Mulyono, 2006)

Larutan A (KH2PO4)

Ditimbang 1,361 gram KH2PO4 dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL

¼ labu, dan homogenkan; tambah lagi akuades sampai tanda batas.

pH

A (50 mL) +

x (mL) y (mL)

6,00 5,6 44,4

7,00 29,1 20,9

8,00 46,1 3,9

5. Pembuatan Larutan Schales (Imoto and Yagishita, 1971)

Ditimbang 13,25 g Na2CO3 dimasukkan ke dalam dimasukkan labu takar

250 mL ¼ labu, dan homogenkan kemudian ditambahkan 0,125 g K3[Fe(CN)6];

tambah lagi akuades sampai tanda batas.

57

Lampiran 10. Hasil Penelitian

1. Hasil Uji Aktivitas Bakteri Kitinolitik dengan Metode Campur

Variasi Zona Bening

(cm)

Diameter Koloni

(cm)

Indeks Kitinolitik

A1 2,6 0,5 5,19

A2 2,2 0,5 4,39

A3 3,8 0,5 7,59

Indeks Kitinolitik = Diameter zona bening – Diameter Koloni

Diameter Koloni

= 280 – 0,5

0,5

= 759 = 7,59

2. Kurva Standar N-Asetilglukosamin

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

(A)

2,5 0,011

5 0,018

7,5 0,023

10 0,027

12,5 0,032

15 0,036

Diukur pada panjang gelombang 584 nm

58

3. Optimasi Substrat Enzim Kitinase

Konsentrasi Substrat (%) Absorbans

(A)

Aktivitas Enzim

(U/mL)

0,02 0,282 0,216

0,04 0,273 0,209

0,06 0,253 0,193

0,08 0,359 0,277

0,10 0,316 0,243

0,12 0,210 0,159

0,14 0,249 0,190

Diukur pada panjang gelombang 584 nm

Contoh Perhitungan:

(0,02 % (b/v) Y = 0,002 X + 0,007

0,282 = 0,002 X + 0,007

X = 0,275

0,002

X = 137,5 mg/mL

A = [ N - Asetilglukosamin]

BM.N – Asetilglukosamin x t

= 0,216 µmol/menit.mL

= 0,216 U/mL

= 137,5 mg/mL x 1000 µmol/mmol

221 mg/mmol x 2880 menit

59

4. Optimasi Suhu Enzim Kitinase

Suhu (ºC) Absorbans

(A)

Aktivitas

Enzim (U/mL)

30 0,199 0,151

40 1,135 0,886

50 0,052 0,035

60 0,023 0,013

Diukur pada panjang gelombang 584 nm

(40ºC) Y = 0,002 X + 0,007

1,135 = 0,002 X + 0,007

X = 1,128

0,002

X = 56 mg/mL

A = [ N - Asetilglukosamin]

BM.N – Asetilglukosamin x t

= 0,886 µmol/menit.mL

= 0,886 U/mL.

= 564 mg/mL x 1000 µmol/mmol

221 mg/mmol x 2880 menit

60

5. Optimasi pH Enzim Kitinase

pH Absorbans

(A)

Aktivitas Enzim

(U/mL)

3 0,041 0,027

4 0,049 0,033

5 0,038 0,024

6 0,254 0,194

7 0,151 0,113

Diukur pada panjang gelombang 584 nm

(pH 6) Y = 0,002 X + 0,007

0,254 = 0,002 X + 0,007

X = 0,247

0,002

= 123,5

A = [ N - Asetilglukosamin]

BM.N – Asetilglukosamin x t

X = 123,5 mg/mL

= 0,194 µmol/menit.mL

= 0,194 U/mL.

= 123,5 mg/mL x 1000 µmol/mmol

221 mg/mmol x 2880 menit

61

6. Penentuan Produksi Enzim Kitinase

Waktu Inkubasi

(Jam)

Absorbans

(A)

Aktivitas Enzim

(U/mL)

2 0,769 57,466

4 1,235 92,609

6 1,677 125,943

8 1,701 127,753

10 1,738 130,543

12 1,693 127,149

14 1,761 132,278

16 1,813 136,199

18 1,726 129,638

20 1,906 143,213

22 1,743 130,920

24 1,653 124,133

Diukur pada panjang gelombang 584 n

Contoh Perhitungan :

(6 jam) Y = 0,002 X + 0,007

1,677 = 0,002 X + 0,007

X = 1,67

0,002

X = 835 mg/mL

A = [ N - Asetilglukosamin]

BM.N – Asetilglukosamin x t

= 125,942 µmol/menit.mL

= 125,942 U/mL.

= 835 mg/mL x 1000 µmol/mmol

221 mg/mmol x 30 menit

62

Lampiran 11. Dokumentasi

1. Kegiatan Pengambilan Sampel Cairan Rumen Sapi di Tempat Pemotongan

Hewan (TPH) Anggoeya, Sulawesi Tenggara

63

2. Kegiatan Skrining Bakteri Air Sungai Pohara

Preparasi sampel rumen Metode Pengenceran

A1

A2 A3

64

3. Kegiatan Identifikasi Bakteri

Uji methyl red Uji Katalase Uji sitrat

Uji fermentasi karbohidrat Uji H2S

65

4. Kegiatan Pembuatan Koloidal Kitin

Cangkang udang Dicampur larutan asam pekat

Ditambahkan akuades Disaring