3.Metabolismul General.bioenergetica

5/11/2018 3.Metabolismul General.bioenergetica - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/3metabolismul-generalbioenergetica 1/10

CAPITOLUL III

Metabolismul general. Biocnergetica.

Oxidarea biologica. Lantul respirator ~i fosforilarea oxidativa

Meta bo Iism u l p rez i n m t ot al i ta te a t ra ns fo rr na ri l or ma te ri al e . ; ; i e ne rg etic e c e

asigu ra c res te rea , dezvo ltareas i s up rav i etu irea organ ism u lu L E I este 0activ itate

celulara cu destinatie specials, determinata de i nt er con ex iun ea sistemelor

multienzimatice,

Metabolisruul i ndep lines te u rmatoarele f un ct ii : a ) a pr ov iz io na re ac elu le lo r c u

en erg ie ch im ica, e 1iberata lilu rma s ci nd ar ii s ub st an te lo r nu tr it iv e ; b ) t ra ns fo rma re a

mole cu le lor sub sta n te lo r nutritive in blocuri de c on str uc tie , u ti Iizate d e c elu t a la

si n te za m ac romo le cu le lo r p ro prii; c ) s in te za ~idegradarea b io rnol ecu le lo r necesa re

p en tr u l nd ep l inirea unor fu nc tii s pe cif ic e in c elu la (p igmenti, h0I1110n i, coenzime,

media to ri e tc .) .

i n procesul de oxidare a substantelor se produce 0 anum ita cantitate deenergie Iibera, 0 parte din aceasta se consuma pentru efectuarea u nu i a num it

velum de lucru, restul se acu rn u l ea za "i n com p L L ~ i macroergici (ATP, e tc .) .

S in tez a ATP-u lu i co nsta d in tr-u n an sam blu d e re ac tii I I I c ar e e ne rg ia e li be ra ta

la d eh idro genarea u nu i rn etab olit, a un ui sub strat energ iceste utilizata irnediat

pentru fosforilarea ADP-ului In ATP. Procesul inansamblu se numeste fosfo ri la re

ox id at iv a, c up la ta e L L o xid are a d e su bstra t.

Interactiunea oxigeriului cu hid~gellu l are loc in cateva etape suecesive In

care atom ii de hidrogen sau num ai electronii lor sunt transportati pe sisteme

r ed ox c u a fin ita ti crescinde p entru echiv alen tii reducatori ca In final acestea s afie acceptati de catre m olecula de oxigen.

Ansam bl u I s istemetor redox (enzirnelor care participa la transferulechivalen tilo r redu cato ri ~ p roto nii de h idro gen sau electro nii de la co en zirn ele

reduse Plna la oxigen) poarta denum irea de [ant respirator.

E ne rg ia lib era, c e d ev in e d isp on ib ila la tre ce re a ele ctro nilo r p rin la ntu l re sp i-

rator in d ir ec tia g ra d ie ntu IIIide potential, e ste p artial u ti lizata p en tru sin teza de

ATP (La oxidarea NADH-ului se consuma 52,6 kcal ca ~i la sin teza a trei

m olecule de A TP). L antul respirator cuprinde trei puncte de fosforilare, adica

trei puncte de cuplare a celor doua procese: oxidativ . ; ; i fosforilant,

58



TEMA 11

Notiuni generale de metabolism. Caile generale de scindare a

proteinelor, glucidelor ~i Iipidelor. Notiuni de bioenergetidi.

Oxidarea piruvatului si ciclul Krebs

Experienta 1. Determinarea activi ti i(u dehidrogenazelor ciclului Krebs

; (izocitrat, a-cetoglutarat ~isuccinatdehidrogenazelor) in fic at prin m etoda

neotetrazolicii;

Principiul metodei. Deh id rogenaze le c ic lu lu i a ciz i lo r tricarboxiIieicatalizeaza

re ac tiile d e o xid are a su bstra te lo r re sp ec tiv e p rin d eh id ro ge na re . I n c alita te d e

accep to r de h id ro gen se fo lo seste neo tetrazo lu l care red ucin du -se se transforms

in forrnazon colorat In roz. D upa intensitatea culorii se determ ina aetiv itatea

enzirneior,

M od de lucru , Inrr-o ep ru beta d e cen trifu gare se in tro du c 0 ,2 5 m l d e su bstrat

respectiv, 0,5 m I s ol utie d e n eo te tr az ol, 0,1 m I s olutie de NA D (In afara de

eprubeta in c are se d ete rm in a a ctiv ita te a s uc cin atd eh id ro ge na ze i) ~i0,5 m lomogenat hepati c. i n eprubeta, In care se deterrn ina ac ti v ita te a

izocitratdehidrogenazei, se m ai adauga 0,1 m l M gC~. Eprubeta se agita si se

incubeaza tirn p de 10m inute in baia de ap a la 3 7° e.

D u pa in cu ba re , in fiecare eprubeta se adauga cite 5 rnl acetona (pentru

stoparea activ itatiienzim atlce). E prubetele se astupa cu dopuri si se lasa la

intuneric timp de a ora, apoi se centrifugheaza timp de 10 m inute cu viteza

d e 1 000 r ota tii /r nin . C en tr if ug atu ! s e f oto co lo ri rn etr ea za la 0 lungim e de unda

de 525 nm (filtru l verde), cuva de ID em fa~a de proba de control.

Notii. S e p re ga te sc 1~2probe de control, care au acelasi continut ea si

probete de experienta num ai ea in lac de ornogenat se adauga 0,5 m l solutie

tampon. Calculele se fac dupa curba-etalon,

lm portan fa m etod ei, D eterrn in area activ itati ienzirnelor i nd i ea te p re zi nt a

i nf ormatie p re ti oa sa p riv in d s ta re a rnetabolisrnulu i t esu tu !ui re spect iv ,

Teme pentru autopregatire

1. Notiuni generale de m etabolism . Catabolism ul si anabolismul, Caile

me ta bo li ce c en tr ale , c ic lic e ~is pe ci fi ce . .

2 . M e ta bo lisrn ul in te rm ed ia r, M e to de le d e stu die re .

59,

\



3. Not iun i de e ne rg ie Iib era sta nd ard , Compu si rnacroergici - structura eh irnica

~irolul lor, Ciclu] ATP-ului.

4. Caracteristiea starii energetice a celulei, Judicii ce 0 caracterizeaza,

Reglarea metabolismului celular,

5. D ecarboxiiarea ox idariva a ac idu lui piruv ie - enz imele , cofac to ri i,reglarea,6 ..Ciclul Krebs- r ea cti ile p ar ti ale , E s en ta b io lo gic a a c ic lu lu i Krebs, reglarea

lui. Notiune de fosforilare la nivel de substrat, Stoichiometria ciclului Krebs.

7. R ea cti i Ie anaple rotic e (reacti iIe care fum izeaza prod use interm ed iare ale

ciclul ui acizilor tricarboxilici),

Situatii de problema

I.Num it i toate enzimele ciclul ui Krebs si aratati tip ur i le r ea cti ilor eatal izate

de ele, Unde este localizat acest ciclu 1 1 1 celula?

2. Enurnerati componentele complexului piruvatdehidrogenazic. Scrieti

forrnulele vitaminelor care intra In cornponenta acestui complex. Aratati

schematic procesu Ide formare a acetil-CoA.

3. De ce ciclul acizilor tricarboxilici este un proces aerob?

4. Ce cantitate de energie se elibereaza la descompunerea unui mol de

ATP irtconditii standard? Care este durata vietii moleculei de ATP In celulele

organismelor superioare?

5. Tinind cont de faptul ca In o rg an isr nu l o rn ulu i matur in fiece zi se

forrneaza 0 cantitate mare de ATP, structura, cornpozitia si masa corpului nu

se modifies evident in acest timp. Cum se poateexplica aceasta?

6. Care enzime ale ciclului Krebs sunt reglatorii? Care metaboliti ~i In ce

mod influenteaza a ct iv it at ea a ce st or enzime? Explicati caracterul amfibolic al

ciclului Krebs.

7 . Ox al ilacetatu I. se formeaza " inu ltimaetapa a c ic lu lu i Krebs:

a) E posibila oare sinteza OA din acelil-CoA doar sub actiunea enzimelor

si cofactorilor ciclului Krebs r a r a utilizarea produseJor intermediate ale

ciclului? D ati raspuns detal iat,

b) Cum se completeaza rezervele de OA?

8. A TP sintetizat In rnitocondrii trebuie uti Iizat in celula?

a) Cum ATP parase~te rnitocondriile?

b) Cum se cornpleteaza rezervele de ADP ~ide fosfat anorganic?

60



TEMA 12

Oxidarea biologica. Lantul respiratorsi Iosforilarea oxidativa

Experienfa 1.Reactia clllitativii de determinare a activitii(ii catalazei.

Principiul metodei. Catalaza face parte din clasa oxidoreductazelor,Ea se contine in toate tesuturile si lichidele biologice. Intr-o cantitate mai

mare catalaza se in tilneste in eri troc ite .~ficat. La oxidarea unor s ub st an te se

f ormea za p er ox id de hidrogen, s ub st an ta to xic a care se poate acum ula in or-

ganism. Rolul biologic al catalazei consta in descompunerea peroxidului de

hidrogen inoxigen s i a pa : 2HP2 ~ 2Hp + 02catalaza

Catalaza contine fier. La d esc orn pu ne re a p ero xid ulu i de hidrogen are

lo c oxidarea ~ireducerea fierului care intra in corn po nenta acestei enzime.

Mod de lucru, Activitatea catalazei singelui. in doua eprubete se iau

cite Iml Hp, se adauga 2 picaturi de singe. ° proba se fierbe pentru

inactivarea enzimei. Dupa racire in ambele eprubete se adaug a cite 5-10picaturi solutie de HP2 de 3% si continutul eprubetelor se agita. i n eprubetade experienta se observe degajarea bulelor de oxigen.

Experienta 2_Determinarea cantitativii a catalazei In singe.

Principiul metodei. Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea cantitatii

de HP2 descompusa de enzima intr-o perioada anumita de timp dupa

u rma to ar ea e cu ati e:

2 K1vfn04 + 5 HP2 + 4 H2S04 ---) 2 KHS04

+ 2 MnS04 + 8 ~O + 5°2

A ctivitatea catalazei se exprim a prin num arul de catalaza ~i indicele de

catalaza. Numdrul de cataiaziieste cantitatea de peroxid de hidrogen, in

mg , d e sc o rnpus a de 1 m I de singe. Despre cantitatea de H20, descompusa se

judeca dupa d i ferenta can ti ti it i ide KM nO 4 utilizat .Iatitrare pilla s i dupa act iunea

catalazei.

Mod de lucru. Singele diluat (l:1000) se agita, in doua baloane se iau

cite 1m I singe, 7 m 1ap a disti lata, in proba deexperienta se adauga 2 m I

H20z de 1%, in cea de control ~ 5 m l solutie de H2S0

4de 10%. In mediul

acid (proba de control) actiunea enzimei se stopeaza, deoareceea este activa la

pH::: 7,4. Baloanele selasa pentru 30 minute la temperatura camerei. Apoi

in proba de experienta se adauga 5 ml solutie de H2S04de 10% , iar 'in cea

de control ~2 ml solutie de HP2de 1%. Continutul fiecarei probe se titreaza

c u s ol ut ie de KMn04 de 0,1 N pilla la culoarea roza. Se calculeaza un itatea

61



catalazei (UC) dupa formula: UC = (A - 8) x 1,7, unde: A - cantitatea

de solutie de KMn04 de 0 ,1 N consurnata la titrarea probei de control

(m I); B - cantitatea de perm anganat ehe itu ita la ti trarea probei de

experienta, ° cantitate m ai mare va merge 1a titrarea probei de control,

unde eatalaza nu actioneaza. D iferenta capatata 0 inrnultim la 1, 7 ~iobtinern indicele de catalaza pentru singele studiat. in norma aceasta

unitate este egala eu 10 - 15 unitati (vezi nota).

Nota: 1 mol/l HP2 este de 17 g;

1 ml 0, IN solutie confine 1,7 m 1 1 1 0 1 / 1 (1,7 m g) HP 2 ~iI ml 0, 1 KMn04

e ste e ch i v ale nt ell 1 m I 0 ,1 N HP 2 .

Importanta chnieo-dlagnostica. Determinarea activitatii catalazei

singelui are irnportanta pentru diagnosticul cancerului, anemiei, tuberculozei.

I n cazul acestor boli, concentratia catalazei in singe se reduce.

Experienta 3. Oxidarea malatului $I glutamatului in muocondrii

(metoda polarograficd).Principiul metodei. ° pe-

reche de electrozi (anod si catod)

acoperiti Cll 0 pel icu I ii .de pol ieti lena

se introduc in vasul Cll suspensie

rn ito co nd riala stu diata. O xig en u I

absorb it paate difuza prin pelicu III

ajungind laelectrozi. Altesubstante

din suspensie nu pot trece prin

membrana polietilenica. Intre

electrozi se men tine 0 tensiune

constanta egala cu 0,65 V. Lareducerea electrolitica aoxigenului

pe catod, intre electrozi se creeaza

un curen tp roport ional cont inu tu lu i

de oxigen d i l l arnestecul reactio-

nar.Intensitatea curentului se in- 0

registreaza automat.

(! I I I

2

.: I;

/. . . . . . .

1 I, I I

~

/E :

/

ttl ! G t

1 ~ 9 r

D

D O

8

Absorbtia mitocondriala a oxigenuluideterminata cu ajutorul electrodului

deoxigeo.

62



Mod de lucru. Intr-un vas se iau 3,7 ml amestec, care contine 20 mmo l

so lu tie tam po n tris-H CI, 8 0mm ol K C1~ i 5 mm ol MgCI2 pH=7,4. La intervalele

d e timp in dic ate in im aginea de la p. 63, In vas se adauga reactivele enum erate

ma i j os 1 1 1 u rma to ar ea o rd in e:

A -lnceputul il1scr ier i i. in punctele notate au fast efectuate urmatoarelesuplirnente:

B ~0,1 m l suspensie m itocondriala din ficatu Isobolan i[or;

C - 0,1 ml solutie ce contine 0,5 m 1de glutamat si 0,1 ml de malat eu pH = 7,4;

D - 0,02 m l de 50 m mol solurie ADP;

E ~ 0,05 rn l de 10mmol solutie ADP;

F - 0,05ml solutie din itro fen oll 0 rnrnol,

Amestecul sepune la incubare (t = 30°C); tot i reactan tii au fast satu rati cu

aero in imaginea de la p. 63 sunt indicate rezultatele experientei obtinute la

stud ierea respiratiei m itocon d_ riaie prin m etod a po laro grafica (ell ajutorul

e le ct ro dul ui d e ox ig en ).

D e re rm in ati v alo ar ea r ap or tu lu i P/O s i c oe fi ci en tu lu i r es pi ra to r in ca zu l o xi-dari irn ala tu lu i-g l u ta rn atu 1u i..xidarea rnalatu lu i9 igl u tam atu lui In m itocon-

d ri i l e f ic at ul u iare loc dupa schem a de m aijos:

C ore sp un de o are ra po rtu l P IO dat reiesind d in schem a ind icata acelei v alo ri,

care a fo st obt inut a experimen ta l?

Nola: Intr-un litru de solutie apoasa saturata Cll aer la 30"C se con tin

0,23 5 mM o xig en.

Exper ienra 4. Fosjo-

rilarea oxidativii (s in teza

ATP).

Principiul metodei.

E nergia eliberata In procesulox idari i s ub str ate [ or (succinat,

izocitrat, m alat) este utilizata

partial la esterificarea fosfa-

tu 1 uianorgan ic la sin te za ATP

(ADP + Pi --7 ATP ). Sursa

enzimelor este suspensia de

m it oc on dr ii. S ca de re a c on tin u-

tu l ui d e f os fa t ( ut i! i za t la s in te za

Oxaloacetat

~:

Aspartat

FumaratJ

Malar

Mala~

" " "alatul adaugat

Schema oxidarii substratelor (Ia expo 4).

63



ATP) in proba de experienta se determ ine dupa rnolibdatul d e arn on iu ~i

a ci du l a sc or bic fata de proba de control (culoarea albastra este rnai putin

intense in proba de experienta),

Mod de lucru.

Proba de experierua. in ep rubeta se ia 1 m I amestec de incu bare (so I II tietampon de fosfati cu pH =7,4,. zaharoza, MgCI2. KCI), 0,02 m I ADP, 0,5 III I

so lu tie d e su bstra t respectiv (la ind icatia profesorului) si 0 ,5 rn I s usp ensie d e

m itocondri i. P roba se Ia sa p en tr u 25 m inute la tem peratura cam e rei, apoi In

eprubeta se introduce 1 ml solutie acid tricloracetic (10% ). Continutul

eprubetei se titreaza.

Proba de control se efectueaza concornitent eu proba de experienta,

In eprubeta se introduc aceiasi reactivi casi in proba de experienta CLl

exceptia, c a in loc de 0,5 m l solutie de substrat in eprubeta se introduc

0,5 m l de ap a distilata.

Determinareafosfatului: In alta eprubeta se introduc I m l de filtrat, 1 m!

solutie de mol ibda tde arnoniu (25%) si 0,5 ml sol ut ie d e ac id asc orb ic (0 ,5% ).Continutul eprubetei se agita, apoi se mai introduc 7,5 ml de apa distilata,

Peste 10 minute probele (de control ~i de experienta) se colorim etreaza la

FEe (filtru l rosu, cuva ~ 10 m m) fata de am estecu! de incubare. R ezultatele

se calculeaza dupa curba etalon, se t ra g c oncl uz ii le r es pe ct iv e.

Teme pentru autopregatire

I .Ox ida rea biologica, Deh id ro ge n are a su bstra te lo r ~ su rsa e ne rg etic a p en tru

sin te za ATP -u lui. E nz im ele d eh idrog en arii, t. . /:

2. Lantul respi rator (schema). Com p lexele enzim atice. Acceptor] i

principali de electroni si protoni, structura lor chimica,

3. Potentialu l de oxido-reducere a com ponentelor lantului respirator.

F osfori Iarea oxidativa, L ocuri Je de fosfo ri Iare. Prod use Je final e al e ox idar! i,

4. R eglarea intensitati i functionarii lantului respirator. C oeficientul

PIO, c on tr ol ul r es pi ra to r.

5. Decuplarea produselor de oxidare si fosforilare, principalii agenti

d ec u p J an 1 :1 .R o lul biologic al produsu lu id e d ec up la re , r es pi ra tia Iib er a,

6. M itocondriile, structura si penneabilitatea selectiva a rnem branelor

pentru diferiti com pusi. Sistem ele-naveta de transport al echivalentilor de

reducere.

64



7 . Ip ote ze le p rin cip ale c u p riv ire la p ro ce se le d e fo sfo rila re o xid ativ a. Ip otez a

lu i Mitchell.

8. O xid area rn icro zorn ala, roh rl cito cro mulu i P450 in reactiile de oxido-

reducere,

9 . Vi ta rn ine le ~iro lu l lo r in p ro ce se le d eo xid ar e b io lo gic a,

1 0. N otiu ne d e ra dic al ilib eri. O x id area p ero xid ic a a a ciz i lo r g ra si n esatu ra ti

d in m em bran e. S i stem ele d e p ro tectie a celu lei im po triv a acu mu larii rad icalilo r

liberi,

Intrebari pentru autocontrol ~i situapi de problema

I . C are v ita m in e .} i s u b stan te cu activ itate v itam in i ca in tra in co m ponenta

la ntu lu i r esp ira to r? S cr ie ti fo rm u le le lo r.

2 . D e ce la reducerea N AD -ului are loc acidularea solutiei? Ilustrati aceasta

p rin e xem p lu l re du ce rii NAD .

3. Adaugarea ro tenonei la rnitocondriile, care respira pe glutarnat, duce

atit la in cetarea sintezei A TP -u lui, cit ~ila transportul de electroni. C um se potrestab ili aceste p rocese? (Am in tim c a rotenone blocheaza transportal de

electroni in lantul respirator pe sectorul N AD - ubjchinona),

4. A daugarea oiigom ieinei ia m itocondrii, care respira pe succinat, duce

la intreruperea tra nsp artu lu i d e e le ctro ni si a formarii de AfP. Adaugarea

u lte rio ara a d in itr of en olu lu i sa u a io nilo r d e C a . ....c on du c la re in ce pe re a im e dia ta

a transportului de electroni in lantul respirator lara generarea concomitenta

de A TP . C are proces inh iba a Iigom ici n a?

5. A daugarea malonatu lui (inh i b i torul competitiv al succinatde-

h id rag en azei) la m ito co nd riile care resp ira p e su ccin at, in trerup e tran sp ortu i

de electroni si sin teza A TP-ulu .i. Cum se poate relua: a) nurnai transportal de

electroni? b) tran sp ortu l d e electronisi sinteza ATP?

6 . in ce stare (red usa sau o xid ata) se v or afla tran sp orto rii lan tulu i respirato r

la adaugarea in suspensia de m itocondrii a antirnicinei A si oxidului de carbon

CO ?

7 . D e ce d in itro fen olu l, tiro xin a, acizii g rasi lib eri ~ia lte su bs ta nte r na re sc

tennogeneza?

8. D e ce sarurile acidului cianhidric, care nu influenteaza proceseJe de

d eh id ro ge nar e, b lo ch ea za re sp ir atia tisu la ra ?

65



9. Care este valoarea coeficientului P IO la oxidarea rnalatului,

succinatuiui §i a izocitratului? Scrieti reactiile respective.

I O . Calc uIati cite m0lecu Ie de N AD se f0n11eaza la ox idarea com pleta a

unci molecule de piruvat (plna la CO2~i apa), Cite molecule de ATP se

vor forma in caz daca toti atom iide hidrogen vor intra in lantul respirator?

II. Cite molecule de ATP se genereaza la 0 rotatie a ciclului Krebs 1 1 1

conditiile 1 1 1 care toti atomii de hidrogen intra in lantul respirator? Aratati

coeficientul P IO pentru fiecare substrat de oxidare, Explicati.

12. Reprezentati schematic calea lunga, medie si scurta de oxidare.

D ete rrn in ati numaru l de molecule de ATP formate si prod use Ie finale de

oxidare,

13. Care este cantitatea totala de ATP ce se descornpune ~ise sintetizeaza

timp de 24 ore 'in organ ismu [ omulu imatur (2000 kcal, 70 kg)? Eficacitatea

transformarii produselor alimentare in energia de ATP este de 50%.

14. Care este variatia energiei libere standard [a transportul a z s de la

NAD la 02 in calorii saujouli?

l 5. Ce se intirn pia eu energia e lectroni lor In procesu [ de m igrare al lor In

lantul respirator al mitocondriilor? Cita energie se consurna in celule la sinteza

unui mol de ATP?

16. Care rea ctie de oxidare din ci c lu IKrebs asigura intrarea electronilor in

calea medie de oxidare? Cite molecule de ATP se formeaza In ciclul Krebsla

fosforilarea la nivel de substrat?

17.La adaugarea rnalonarului de sodiu la 0suspensie de mitocondrii, ce are

ca sursa unica de cornbustibil nurnai acidul piruvic, respiratia lor se intrerupe

brusc si se acum uleaza unu I din produsele metabolice intermediare:

1. Care este structura produsului intermediar acumulat?

2. De ce el se acumuleaza?

3. De ce se intrerupe consumarea oxigenului?

4.1n ce mod se poate inlatura aceasta inhibitie? Explicati,

18. La rnasurarea cantitatii de oxigen folosite de mitocondriile rnuschilor

porum be lulu is-a observat un caz surpri nzator: cantitatea de oxigen consumata

a fost de 7 ori mai mare decit cea necesara pentru oxidarea cornpleta a

oxal iIacetatu lui sau malatu lui pina Ia CO2~ iH2 O.

66



1

j,

1. De ce adaugarea OA sau malatului rnareste consurnul de 02 folosit?

2. De ce cantitatea de 02 absorbit depaseste de rnulte ori cantitatea de

02 necesara pentru oxidarea completa a OA $1malatului adaugat?

19 . Ce proprietati trebuie sa posede membrana intema am itocondri ilorpentru

a asigura procesele de fosforilare oxidativa?

20.In mitocondriile grasimii brune la nou-nascuti si la animalele In stare de

hibernare, randarnentul ATP~ului la un atom de oxigen absorbitconstituie

mai putin de 0molecula:

1. Ce functle fiziologica poate fi determinata prin asa raport rnic P IO in

g ra sim e a b ru na a n ou -n as cu tilo r?

2. lndicati mecanismele posibile care ar putea determina un ast.fei de

raport P IO caracteristic pentru rnitocondriile grasirnii brune.

I

Documents

3.Metabolismul General.bioenergetica