1. BIOLOGIJA CELICE

Biologija celice je področje biologije, ki obravnava najmanjše sestavine organizma oz tkiv (oblika, funkcija, nastanek).Biologija celice je torej veda o zgradbi in delovanju celice. Je dinamična veda, ki se hitro razvija.Meji na molekularno biologijo, ki obravnava spoznanja o odnosih med molekulami v celici; navezuje pa se tudi na morfološke vede (anatomija, histologija) ter na vedo, ki proučuje delovanje – fiziologijo.Uporaba celične biologije:

- veterina, medicina (odkritja na področju normalnega delovanja celice so omogočila odkritja in razumevanje celice pri patoloških stanjih, boleznih.

- Biologija, biotehnologija, farmacija, agronomija, genetika…

Fiziologija je veda o delovanju živega organizma in njegovih delov v procesih, ki so podlaga Patologija proučuje bolezenske strukture, njihove funkcionalne spremembe v organizmu, patološka

anatomija in morfologija. Morfologija je veda o zunanji podobi, o snovanju in preoblikovanju oblik v živalstvu in rastlinstvu

(histologija, anatomija). Makroskopska anatomija je veda o zunanji in notranji zgradbi živih bitij (živali, človek, rastline). Mikroskopska anatomija: tu opazujemo notranjo zgradbo, za kar potrebujemo ustrezno napravo (lupa,

mikroskop): – prepoznavanje bioloških sestavin z optičnim mikroskopom;– notranja anatomija je veda o zgradbi organov, o organskih sistemih – histologija Histologija je veda o zgradbi organov, organskih sistemov. Sem prištevamo še embriologijo, vedenje o

razvoju osebkov. Sama histologija se deli na splošno in specialno.o Splošna histologija se ukvarja s osnovnimi tkivi; epiteliji, vezivi, mišičnim in živčnim tkivom.

Vsa tkiva so zgrajena iz celic, ki so specifične za posamezno tkivo po obliki ali po funkciji. Za vsako tkivo je značilna tudi matična celica, ki izgrajuje in oblikuje tkiva.

Gastrulacija – nastajanje tkiv – z diferenciacijo celic nastanejo posamezne tipične celice s po tremi kličnimi listi (ektoderm, mezoderm, endoderm)

Oploditev – začetek embrionalnega razvoja (ovum+spermij=spermovij)Stopnje: brazdanje, morula, blastocista (embrionalni vozlič) – povratni procesi. Tem stopnjam sledi gastrulacija, ki je nepovratni proces: iz blastocist se diferencirajo celice, ki potujejo na določena mesta (3.klični listi). Nastanejo 4 osnovna tkiva. Vse motnje pa so vidne na novem osebku. Brez embriologije ni histologije!.Procesi pri normalnem, zdravem organizmu:

embrio (1/3nosečnosti pri človeku) – fetus – novorojenec Patološka anatomija: gre za ugotavljanje sprememb, tudi sprememb na celici. Lahko je makro- ali

mikroskopska. Spoznanja iz genetike: spremembe v genetskem razvoju povzročijo posledice na organizmu;

proučevanje dednih bolezni! Saj želimo potomce brez patoloških sprememb.

2. METODE CELIČNE BIOLOGIJE

Obstajajo številne metode celične biologije, ki so pomembne za proučevanje zgradbe same celice in njenega delovanja. Uporabljamo jih tudi pri diagnostiki (metoda za prepoznavanje vzroka bolezni) ter pri proučevanju dednosti.

1. Mikroskopija- svetlobna – svetlobni mikroskop- elektronsko-mikroskopska – elektronski mikroskop; transmisijski ali vrstični oz scan mikroskop.- Mikroskopija je glavna metoda celične biologije, ki omogoča da lahko preučujemo celico. Raba e.-m.

metode omogoča proučevanje ultrastrukture (notranja zgradba) celic oz. proučevanje ultramorfologije (notranja organiziranost) celic in njihovih celičnih organel.

2. Citokemija3. Histokemija

1

4. Imunocitokemija5. In situ hibribizacija6. Metoda tunel

Služi za dokazovanje fragmentacije DNA.7. Metode ločevanja in analize molekul v celici

npr. gelska elektroforeza, s pomočjo električne energije potujejo molekule po gelu in se izločajo na določenem mestu.

8. Gojenje celic »in vitro«Gre za gojenje živega organizma (celic, tkiv) v posodi – poskusi »in vitro«, ne na živem organizmu. Poznamo tudi »in vitro« oploditev: v določenem mediju (insemenizacija), v fazi morule se vstavi v sluznico maternice.

9. Kvantitativne metodeNa tak način merimo, štejemo ter izračunamo neko relativno vrednost; stereologija.

ANATOMIJA 0,1MM ALI VEČ ORGANI LUPA IN OKO

HISTOLOGIJA 100ΜM-1 ΜM TKIVA SVETLOBNI MIKROSKOP

CITOLOGIJA IN MOLEK. BIO.

10ΜM-0,2ΜM ULTRASTRUKTURA CELICE, CELIČNE SESTAVINE, VIRUSI

ELEKTRONSKI MIKROSKOP

MANJ OD 1NM ATOMI IN MOLEKULE

POMEMBNA ODKRITJA NA PODROČJU CELIČNE BIOLOGIJE1931 1. transmisijski mikroskop1939 1. komercialni transmisijski mikroskop1953 Odkritje dvojne vijačnice1957 Plazmina membrana – sinteza DNA v zunajceličnem

sistemu1965 1. scan mikroskop1966 Lizoencimi (lipaza)

2.1. Osnove mikroskopiranja in vrste mikroskopov

KAJ JE MIKROSKOP?Je optična naprava , sestavljena iz sistema leč. Ta leži v isti optični osi in nam tako omogoča opazovanje predmetov pod večjim zornim kotom ter z večjo ločljivostjo kot pri opazovanju s prostim očesom.Bistvena je povečava slike, ki je zmnožek povečav objektiva in okularja, ki da končno povečavo.Pomembna je tudi kvaliteta slike, saj želimo videti čim več detajlov. Merilo za kvaliteto slike je ločljivost.

Ločljivost (d) je najmanjša razdalja med dvema točkama, ki ju še lahko razločimo kot dve ločeni točki in sta pri tem jasni. Manjši d pomeni boljšo ločljivost. Ločljivost je odvisna od valovne dolžine svetlobe in od numerične aperture nekega objektiva.

Numerična apertura je sposobnost objektiva, da sprejeme določeno količino uklonskih žarkov. Odvisna je od delovne razdalje (opazovano telo+objektiv) ter od odprtinice objektiva samega.

Ločljivost: d=(0,61*valovna dolžina)/(n.a.)Lomni količnik med objektivom in čelno lečo mora biti čim bliže 1. V prostor damo oljno kaplljico in

vanjo pomočimo objektiv – dobra l.očljivost mikroskopa oz danega objektiva.

Pomen: Brez mikroskopa ni znanja o celici. Nujno je potreben za proučevanje celic. Je izum, pomemben za nastanek citologije.

1590 Jensen (NL) sestavi prvo optično napravo iz 2 leč, ki sta delovali kot okular(konkavna leča) in objektiv (konveksna leča). Tubus je sistem leč.

1628 Po zamisli Keplerja (nemški astronom) Schneider skonstruira mikroskop z obema konveksnima lečama, ki je imel razmeroma široko vidno polje in je prototip sodobnega mikroskopa. Deloval je na naravno svetlobno energijo.

2

1665 Po nasvetu Abbe-ja, da bi bilo pametno uporabiti umetno svetlobo, to prvi stori Robert Hook in opiše prvo celico »celula« v pluti.

1684 Hygens izdela okular z dvema sistemoma leč. Zbiralna in procesna leča. Ta je še danes v vseh okularjih svetlobnih mikroskopov.Abbe preuči kondenzor-napravo, ki zbere svetlobo iz umetnega vira. Več ko kondenzor zbere svetlobe, boljša je ločljivost.

1886 Podjetje ZEISS prvo na svetu izdela 1. klasični mikroskop.

Mikroskopiranje…v svetlem ali temnem vidnem poljuObjekte opazujemo s pomočjo svetlobe, ki se razprši s pomočjo kondenzorja. Od strani dobimo temno vidno polje, žarki ne padajo direktno v objektiv. Objektiv sprejeme razpršene žarke, kar vidimo kot svetleč obris – prozorne, neobarvane strukture.

Fazno-kontrastni mikroskopOpazujemo prozorne strukture, ki se med seboj razlikujejo le v optični gostoti oz v lomnem količniku. (strukture v živi celici (brez barve, fiksacije), opazovanje vseh mitotičnih figur (gibanje kromosomov)).

Fluorescenčni mikroskop (Hg žarnica)Opazujemo preparate, v katerih so prisotne fluorescirajoče molekule. Te absorbirajo svetlobo krajše valovne dolžine (UV) in pri tem oddajajo svetlobo daljše valovne dolžine; oranžno, zeleno. – klorofil, vitamin A. Sekundarna fluorescenca – preparat pobarvamo s fluorokromi.

Konfokalni mikroskopOmogoči opazovanje preparatov, debelejših od 10µm in tudi 3D sliko (predstavo). Celica je telo, ima 3 dimenzije!Z laserskimi žarki režemo in pregledujemo preparat. Skeniramo različne globine tkiva ali celice. Preparati so lahko veliki tudi nekaj sto µm. Ob opazovanju dobimo optične rezine, iz katerih lahko sestavimo 3D sliko.

Polarizacijski mikroskopPolarizirana svetloba

StereomikroskopZa opazovanje makroskopskih preparatov in manjših organizmov.

Invertni mikroskopOpazovanje celičnih struktur neposredno v posodi (petrijevki), kjer rastejo. Osvetlitev od zgoraj, podobno, kot pri elektronskem transmisijskem mikroskopu.

Elektronski transmisijski mikroskopZ njim preučujemo ultrastrukturo celice. Ločljivost je 1-2nm.Za nastanek slike uporabljamo elektronski žarek kot vir svetlobe. Svetloba gre v nasprotni smeri – drug vir svetlobe). Telo je osvetljeno od zgoraj. Valovanje elektronov je izjemo hitro, valovna dolžina je kratka.Slika na ekranu ali filmu nastane zaradi presevanje elektronov skozi preparat. Ti elektroni se nato elastično sipajo na atomih težkih kovin, s katerimi smo obdelali preparat za proučevanje z el.tr.m. (soli težkih kovin vnesemo v času priprave preparata).Vir elektronov je segreta katoda, med katodo in anodo je visoka napetost.100% vakuum, da ne bi prišlo do sipanja elektronov ko potujejo po cevi – tubusu.Elektromagnetske leče (ne steklene) oz. sistem EM leč. Kondenzor zbere snop elektronov na preparat. Objektiv poveča sliko predmeta, projektiv (isto kot okular na svetlobnem) še poveča sliko objektiva in jo projicira na ekran ali fotofilm.

Vrstični ali scan mikroskopOmogoča neposredno opazovanje površine preparata. Vir je svetloba in elektroni.

3. PREPARATI CELIC

Poznamo več načinov priprave: za svetlobno in elektronsko mikroskopijo.Vrste preparatov:

- sveži mikroskopski preparati;- trajni histološki preparati;- pol tanke rezine;- ultra tanke rezine za elektronsko mikroskopijo.

3

Sveži preparatiOpazujemo celice, ki lahko živijo ločeno od drugih celic (praživali, spolne celice, celice v kulturi, krvne celice…) ali pa z mehanskim vplivom pretrgamo vezi v celici in pripravimo preparat na objektu – predmetno stekelce, ki ga položimo na objektno mizico.Kot svež preparat lahko opazujemo tudi prosojna tkiva: škrge, plavuti, prsna mreža, druge mrene…Priprava ni težka, saj ni potrebno rezanje rezine. Preparat opazujemo v kapljici vode – ne sme se posušiti. Zato potrebujemo izotonično raztopino, s katero prilagodimo okolje tkivu.Slabost svežih preparatov: slab kontrast zaradi prosojne strukture.Kontrast povečamo z vitalnim barvanjem:

Primer: Janusovo zelenilo; lahko nam obarva mitohondrije in pomaga pri ugotavljanju njihove aktivnosti v preučevanem tkivu. Janusovo zelenilo prodre skozi plazmino membrano, ne da bi jo pri tem poškodovalo. Obarva se zelenkasto.

Trajni histološki preparatiBistveno: v tkivu preprečimo morfološke spremembe, ki nastanejo zaradi odmrtja celice. Koščke tkiv moramo fiksirati – fiksacija.

1) PerfuzijaV krvožilni sistem osebka vpeljemo fiksativ. Živ organizem je v globoki anasteziji. Fiksativ nadomesti fiziološke raztopine – kri. Noben poskus ni human, vendar skušamo delati tako, da žival čim manj trpi. Za vsak poskus na živih živalih v raziskovalnem delu je potrebno zaprositi za dovoljenje pri ustreznem veterinarskem inšpektorju (VURS). Razgradnja celice: do razgradnje pride zaradi hidrolitičnih encimov, ki so v lizosomu. Če se membrana lizosoma poškoduje, vdrejo encimi v citoplazmo in začnejo z razgradnjo.

2) FiksacijaHitrejša kot je, bolj je učinkovita. S fiksacijo preprečimo avtolizo, lastno raztapljanje, ki nastane hitro po smrti celice. Preprečimo pa tudi vstop drugih agensov (bakterije), da ne pride do kontaminacije tkiva. Poznamo fizikalno in kemijsko fiksacijo.

- Fizikalna fiksacija:o Sušenje na zraku: npr krvni razmaz: kapljico krvi kanemo na rob stekelca in z drugim

predmetnim stekelcem ustvarimo tanek film – razmažemo. Posušimo na zraku in uporabimo barvilo griemza.

o Fiksacija z zamrzovanjem: uporabimo jo, ko bi nek kemijski fiksativ ali povišanje temperature, ki ju sicer uporabljamo pri pripravi trajnih histoloških preparatov uničila tiste celične sestavine, ki jih želimo opazovati. Npr: prisotnost encimov, maščob…Fiksacija poteka tako hitro, ker ne želimo, da bi prišlo do kristalizacije. Vidni kristali nam namreč uničijo celično strukturo. Da bi bil postopek čim hitrejši uporabljamo tekoči dušik s temperaturo - 190°C, včasih pa tudi tekoči helij s temperaturo -269°C.

- Kemijska fiksacija:Uporabimo določen fiksativ ali mešanico fiksativov. Fiksativ deluje predvsem na proteinske strukture v celici. V njej ustavi življenjske procese, celica pa se pri tem ohrani – ne pride do poškodb.

Formaldehid Glutaraldehid el.mikr.; zamrzneta beljakovine v citoplazmi Kloroform Bouin Formolkalcij Ledocetna kislina svetlobna mikroskopija

Fiksativ izberemo glede na vrsto tkiva in glede na to, kaj želimo opazovati (videti). Pri fiksaciji moramo upoštevati:

o pH fiksativa = 6-8o osmolarnost fiksativao temperaturo fiksacije (običajno sobna, za elektronsko pa hladilnik)

Trajanje fiksacije: 24ur, lahko tudi dlje. Npr. kostno tkivo moramo demineralizirati, to pri zobu traja zelo dolgo.Velikost preparata za fiksacijo: za histologijo – kocka 1cm3, elektronska m. – velikost buckine glavice.

3) Izpiranje fiksativaSledi fiksaciji, za izpiranje uporabimo vodo ali fiziološko raztopino.

4) DehidracijaPreparat dehidriramo z naraščajočo koncentracijo alkohola: 50-100%

4

5) Bistrenje preparataZa bistrenje uporabimo ksilol.

6) Sušenje preparataKošček potopimo v tekoči parafin, ga damo v termostat in ga približno en dan segrevamo pri temperaturi 50-60°C. Tako pridemo do faze, ko parafin popolnoma prepoji preparat. Ko košček vzamemo iz termostata imamo strjen blok.

7) Priprava rezinBlok razrežemo na rezine in si pri tem pomagamo z mikrotomom. Odstranimo odvečni parafin. Končna debelina rezine je cca 7µm za histološko rezino.*Mikrotom je aparatura za rezanje rezin. Na poseben nož mikrotoma se prilepi rezina; rezino damo v toplo vodo, kjer se raztegne. Tako rezino ulovimo na predmetno stekelce, ki ga lahko prej premažemo s sredstvom za lažje lepljenje (jajčni beljak - kontaminacija).

8) BarvanjeOdstranimo parafin v ksilolu. Ker barvamo v vodotopnih barvilih moramo rezino rehidrirati.*Rehidracija: ksilol – absolutni alkohol – c(alkohola):100-50%, koncentracija pada. Nato vse skupaj potopimo v vodo.Temu sledi barvanje. Za barvanje uporabljamo 2 barvili:

- hematoksilin – modro (Obarva bazične strukture v celici; jedro, nukleinske kisline;- eozin ali eritrozin (kislo barvilo, obarva citoplazmo in ostale strukture v celici rožnato do rdečerožnato).Običajna barvanja so HE barvanja, ker uporabimo obe barvili.

Po barvanju preparat speremo z vodo, dehidriramo z alkoholom, damo v ksilol ter na preparat kanemo malce umetne smole (da dobimo enak lomni količnik kot ga ima steklo) in pokrijemo s krovnim stekelcem. Tako smo dobili (parafinski) trajni histološki preparat, ki traja od 40-50let, če ni vdora zraka.

Poltanke rezine- Svetlobna mikroskopija

Če želimo v celici opazovati lipide, označiti proteine s protitelesi ali opazovati encimsko aktivnost, ne smemo uporabiti fiksativa z alkoholi, zato pripravimo zamrznjene rezine. Tkivo prav tako fiksiramo, po fiksaciji ga damo v hidrofilen medij – kapljico vode in na hitro zamrznemo. Pri tem uporabimo aparaturo kriostat (-25 do -35°C) – hlajena aparatura, kot mikrotom v zamrzovalniku. Po rezu s kriostatom lahko takoj barvamo.

PRIPRAVA poltankih rezin:Pripravljamo jih predvsem za proučevanje z elektronsko mikroskopijo, Ker so tkivni koščki zelo

majhni, lahko namreč hitro izgubimo košček, ki nas zanima (pri pripravi ultra tankih rezin).Poltanke rezine torej pripravljamo zato, da ne bi česa izgubili. Velikost rezin pa je 1mm*1µm – možno opazovanje tudi s svetlobnim mikroskopom.

Za rezanje uporabimo ultramikrotom: aparaturo, ki pomaga pri rezanju rezin s pomočjo mikroskopa. Uporablja se tudi pri elektronski mikroskopiji. Ultramikrotom za rezanje uporablja stekleni ali diamantni nož.Osnove za pripravo preparata so podobne kot pri svetlobni mikroskopiji, le da je tkivni košček veliko manjši – uporabljamo kapsule, kot za antibiotike.

Košček se nahaja na dnu kapsule. V kapsulo damo umetno smolo epon ali araldit namesto parafina. Stresemo v termostat, dobimo tkivni vzorec. S pomočjo Britvice si izrežemo piramido in jo vpnemo v ultramikrotom. Prislonimo rezilo (steklen nož) in v kadičko nakapamo vodo. Rezina splava po vodi, dobimo trak, ki ga damo na mrežico (velikost buckine glavice), prilepimo enega ali več trakov. Za elektronsko mikroskopijo delamo ultra tanke rezine. Postopek je isti, preparat 10x manjši (od 1mm do 1µm).

Poltanke rezine – toluidinsko modrilo: rezino preverimo pod svetlobnim mikroskopom, da vidimo ali vsebuje delček, ki ga iščemo.Preparate za elektronsko mikroskopijo obarvamo oz kontrastiramo s solmi težkih kovin.

Pri svetlobni mikroskopiji vidimo obrise celic in celičnih struktur, jederPri elektronski mikroskopiji pa vidimo strukturo jedra, jedrce, strukturo ostalih celičnih organel. Pri vrstičnem mikroskopu ne vidimo v notranjost celic ampak samo površino, pri transmisijskem pa se elektroni odbijajo in projicirajo tudi 3D sliko notranosti.

5

4. OZNAČEVANJE IN BARVANJE

4.1. OZNAČEVANJE MOLEKUL V CELICAH Histokemijske metodeZ njimi kvalitativno ugotavljamo posamezne kemijske sestavine znotraj celic in v zunajceličnem prostoru. S temi metodami lahko natančno določimo mesto nahajanja določenih kemijskih sestavin v celici.Osnova reakcij histokemijskih metod je specifična vezava na določeno kemijsko substanco v celici. Pri teh reakcijah uporabljamo reagente, ki po vezavi na določeno kemijsko skupini spremenijo barvo. Tako dokazujemo prisotnost snovi v celici.

Bistvene kemijske sestavine v celiciCelica je dinamično organizirana celota iz vode, organskih molekul in anorganskih ionov. Vsi ti sodelujejo pri metabolizmu celice in izgrajujejo posamezne celične strukture. 70-80% vode, 1-2% anorganskih snovi ostalo so organske molekule (sladkorji, nukleotidi, maščobne kisline, aminikisline.

4.1.1. Aminokisline (DNA, RNA)Nukleinska kislina je polimerna molekula, sestavljena iz niza oz. vrste nukleotidov, ki so povezani s fosfodiestrsko vezjo. Vsak nukleotid je sestavljen iz pentoze (riboza, deoksiriboza), purinske baze (adenin, gvanin) in pirimidinske baze (citozin, timin) ter fosforne kisline.

DNASestavljena je iz dveh polinukleotidnih verig, ki potekata antiparalelno. (fosfodiestrska vez med 3` in 5` C-atomom v deoksiribozi potekajo v nasprotnih smereh)Ti dve verigi tvorita dvojno vijačnico molekule DNA. Polinukleotidni verigi DNA povezujejo vodikove vezi med dušikovimi bazami. Te vezi vedno povezujejo po eno purinsko in eno pirimidinsko bazo.Komplementarnost baz:A + 2x H vez + TC + 3x H vez + G

RNASestavljena je le iz ene polinukleotidne verige v kateri so lahko nekateri odseki medsebojno komplementarni. Ti deli molekule lahko tvorijo dvojno vijačnico v okviru ene verige nukleotidov. Pri RNA se namesto timina veže uracil (izjeme so redke).Tipi RNA (med seboj se razlikujejo po funkciji in velikosti):

mRNA – obveščevalna (messenger)tRNA – prenašalna (transfer)rRNA – ribosomalna

VLOGA nukleinskih kislinNukleinske kisline so nosilci dedne informacije. Ob vsaki delitvi celice se DNA identično podvoji, tako, da nastali celici dobita enaki dedni informaciji od katerih je odvisna sinteza proteinov v celici. Z DNA se prepisujejo molekule RNA, ki neposredno sodeluje pri sintezi proteinov.

Evkarionti DNA je zbrana predvsem v jedru. Tam je vezana na bazične proteine – histone, manjši del DNA pa je

tudi v mitohondrijih in kloroplastih. RNA je prisotna v jedru – sestavlja jedrce(nucleolus) in je tudi v citoplazmi ter ribosomih.

4.1.2. Ogljikovi hidratiV bioloških sistemih so prisotni kot:- monosaharidi:

- pentoze (riboza, deoksiriboza);- heksoze (glukoza, galaktoza, manoza, fruktoza);

- disaharidi (laktoza, saharoza);- oligo- in polisaharidi (glikogen, celuloza, škrob).

6

V sestavljenih oligo- in polisaharidih so poleg enostavnih sladkorjev prisotni tudi njihovi derivati: glukozamin, glukuronska kislina. Ti so lahko acetilirani ali pa vsebujejo žveplovo ali fosforno kislino, ni pa nujno.POMEN ogljikovih hidratov v celici

- monosaharidi in disaharidi so pomemben vir energije;- polisaharidi in oligosaharidi:

o enostavni polisaharidi predstavljajo rezervo;o sestavljeni oligo in polisaharidi so pomembna sestavina membranskih in sekrecijskih

glikoproteinov. Vežejo se tudi na lipide – glikolipidi.o oligosaharidi v rastlinah – celična stena.

4.1.3. Lipidi Enostavni lipidi

*alkoholni estri maščobnih kislin, npr. gliceridi, nevtralne maščobe, voski…*Vloga: rezervna substanca, delno tudi vir energije.

Sestavljeni lipidi*poleg alkohola in maščobne kisline vsebujejo tudi druge molekule.

Fosfolipidi- ena -OH skupina glicerola zaestrena s fosforno kislino, ostali –OH pa z maščobno kislino.- fosforna kislina v molekuli fosfolipida je lahko zaestrena:

- s holinom (fosfatidilholin ali lecitin)- z etanolaminom (fosfatidiletandamin ali cefalin)- s serinom (fosfatidilserin).

Molekule fosfolipidov so bipolarne (imajo hidrofilen in hidrofoben del) zato se v vodi urejajo v dvojne plasti – hidrofilni deli so obrnjeni proti vodi, hidrofobni pa drug proti drugemu.

VLOGA fosfolipidov:Pomembna sestavina membrane, prisotni so v vseh bioloških membranah. (glikolipidi in holesterol = membrana)

SfingolipidiAlkoholna komponenta molekule je aminoalkohol sfingozin. Poleg m.k. se nanj estrsko veže še fosforilholin ali sladkor (v cerebrozidih).

VLOGA LIPIDOV v membrani:Lipidi lahko predstavljajo signalne oz sporočilne molekule za prenos informacij iz celice in v celico. Imajo pomembno vlogo pri prnposu sporočil preko plazmine membrane. So sestavni del membranskih receptorjev, ki so sposobni sprejeti signal od zunaj in prenesti informacijo v celico preko membrane.

Med lipide sodijo tudi steroidni hormoni = splolni hormoni (estrogen ♀ in testosteron ♂).

4.1.4. Proteini Polimerne molekule iz niza aminikislin, ki se med sabo povezujejo s peptidno vezjo. Vsak protein ima specifično zaporedje aminokislin, ki predstavlja primarno zgradbo proteina.Konjugirani proteini: na polipeptidno verigo je vezana še prostetična skupina:

- oligosaharid v glikoproteinih in proteoglikanih;- lipidna molekula v lipoproteinih;- pigmentna molekula v kromoproteinih. (hem v hemoglobinu)

Histokemijske metodePrisotnost določenih kemijskih sestavin celice lahko tudi prikažemo s pomočjo histokemijskih reakcij, ki omogočajo identifikacijo kemijskih sestavin celice in lokalizacijo v histološkem preparatu. Histokemijske metode tako omogočajo predvsem kvalitativno ugotavljanje posameznih kemijskih sestavin v celicah,

7

zunajceličnem prostoru ali v tkivu. Z njimi lahko tudi natančno določimo mesto nahajanja kemijskih sestavin v histološkem preparatu.Osnova vseh histokemijskih reakcij je specifična vezava barvila na določeno substanco v celici oz v preparatu. Ta substanca je lahko fiziološka sestava celice ali pa nastane po specifični reakciji iz molekul, ki so v celici prisotne: hidroliza DNA in oksidacija molekul sladkorjev-Če želimo videti reakcijski produkt, mora biti ta netopen, stabilen in obarvan. Pri svetlobni mikroskopiji uporabljamo določena barvila, pri elektronski pa atome težkih kovin.Substanca, ki jo dokazujemo med postopkom ne sme spreminjati svoje lokacije v celici.Metoda je bolj informativna, če je tem bolj specifična za posamezno molekulo oz funkcionalno skupino molekule.

1) Dokazovanje nukleinskih kislinFeulgenova reakcija DNASchiffov reagent: z njim ugotavljamo prisotnost aldehidnih skupin, ki se sprostijo na deoksiribozi pri selektivni hidrolizi DNK, pri kateri se z deoksiriboze spustijo purinske baze. Ob prisotnosti aldehidov se barvilo obarva rdečevijolično.

- 1. stopnja: kisla hidroliza z 1M HCl, T=60°C – odstranimo purinske baze z DNA- 2. stopnja: obarvanje s Schiffovim reagentomKisla hidroliza deluje le na molekule DNA in ne na RNA, zato se v tej reakciji obarvajo samo mesta, kjer je prisotna DNA, torej jedro. Močno pozitivno reakcijo v jedru da heterokromatin, v nukleolu (jedrcu) je reakcija negativna, prav tako v citoplazmi.

2) Dokazovanje ogljikovih hidratov1. PAS-reakcija enostavni polisaharidi, nevtralni proteoglikani

Periodic Acid Schiff: s periodno kislino oksidativno razcepimo vez med C-atomoma v molekuli sladkorja ali aminosladkorja. Dobimo dialdehid, ki da pozitivno reakcijo s Schiffovim reagentom.o + reakcija: glikogen, škrob, celuloza, nevtralni proteoglikani, (žečodčna sluznica), nekateri

glikolipidi in glikoproteini.2. Alciansko modrilo in Goldnerjeva reakcija kisli proteoglikani in kisli mukopolisaharidi

a. Alcian-modro; kationsko barvilo, v tkivu se dobro vežena molekule s prostimi –COOH in SO3

- skupinami (karboksilne in sulfatne). Reaktivna mesta se obarvajo intenzivno modrozeleno.

b. Goldner – reaktivna mesta se obarvajo rahlo zeleno.

3) Dokazovanje lipidov1. Barvila sudan (OilRed – rdeče; Sudan 1,2 – rdeče; sudan črno – črno)

Barvila so dobro topna v lipidih. Raztopino pripravimo z alkoholom. Barvilo je bolj topno v lipidih, zato maščobne kapljice difundira in jih obarva.

2. Osmijev tetraoksid Os8+ (OsO4), elektronsko mikroskopiranje. Nenasičene maščobne kisline reducirajo Os8+ v nižje osmijeve okside, zato se nenasičene maščobne kisline v celici obarvajo črno oz temno sivo. Je pa tudi del fiksativa za obarvanje vseh membran v celici.

4.2. SPECIFIČNO OZNAČEVANJE CELIČNIH SESTAVIN

4.2.1. Encimska histokemijaMetode encimske histokemije omogočajo prikazovanje prisotnosti in aktivnosti specifičnega encima v celici, na osnovi njegovega delovanja na substrat.

Substrat + encim = reakcijski produktUgotavljamo prisotnost specifičnega reakcijskega produkta. Med različnimi produkti, ki nastanejo pri reakciji nastane tudi en primarni reakcijski produkt- Ta vstopi v reakcijo s specifičnim reagentom. Nastane končni reakcijski produkt. Ta mora biti netopen, kemijsko stabilen in obarvan (elektronsko gost), da ga lahko vidimo.Končni reakcijski produkt nam na nivoju svetlobne in elektronske mikroskopije pokaže natančno mesto delovanja encimov celici. Ko so encimi v celici vezani na specifične membranske sisteme in organele nam encimska histokemija tako prikaže tudi prisotnost teh celičnih struktur.Markerski encim je tak encim, ki določa celični organel.

- lizosom: kisla fosfataza

8

- mitohondrij: sukcinska dehidrogenaza- transmembranski transport: alkalna fosfataza (kjer so membrane – rdečerjavo)

Z encimsko histokemijo ugotavljamo prisotnost kislih hidrolaz v celici: fosfataze, esteraze. Prikazujemo pa tudi oksidaze, peroksidaze, dehidrogenaze.Marker za peroksidaze je katalaza.V peroksisomih nastaja H2O2, katalaza razgradi 2H2O2 2H2O + O2 in prepreči poškodbe celice, brez nje pa pride do razkroja celice.

4.2.2. Imunooznačevanje = imunocitokemijaPotrebujemo protitelesa, da z njimi ugotavljamo prisotnost celičnih sestavin, predvsem proteinov. Protitelesa se vežejo na antigen.Je zelo specifična metoda; za vsak antigen lahko izdelamo njegovo specifično protitelo.Tkivo mora biti čim manj poškodovano, zato ga fiksiramo z zamrzovanjem s tekočim dušikom ali kratko kemijsko fiksacijo. Pri tem ne spremenimo lastnosti antigenov v tkivu.Zamrznjene rezine inkubiramo s protitelesi. To so Primarna protitelesa.

Ločimo direktno in indirektno označevanje.- Direktno označevanje

Na primarno protitelo se veže izbran označevalec, vezavo protitelo-antigen lahko opazujemo s svetlobnim mikroskopom, pa tudi s pomočjo elektronske mikroskopije.

- Indirektno označevanjeUporabljamo neoznačeno primarno protitelo in nato še označeno sekundarno protitelo, ki se pripne na primarno – kompleks. Celoten kompleks se nato veže na antigen. Tako označujemo prisotnost hormonov (npr.kalcitonin) v celicah.

4.2.3. In situ hibridizacija

4.2.4. Metoda tunelUporablja se za dokaz fragmentov DNA, ki nastanejo pri propadu nucleusa oz celičnega jedra. (apoptoza=fiziološki propad)

4.2.5. Gelska elektroforezaGre za ločevanje molekul oz označevanje določene molekule na osnovi potovanja po gelu. Molekule se ločijo po velikosti. – potovanje nabitih molekul v električnem poljuTako lahko ločimo proteine, DNA in RNA.Ko molekule potujejo so večje počasnejše. Glede na čas poti se razporedijo v več pasov, pri čemer so manjše molekule višje – kromatogram na gelu. Molekule, ki so razporejene po velikosti lahko nato izrežemo in nadalje obdelamo.

4.2.6. Gojenje celic in vitro

V stekleni posodi lahko gojimo tkivne ali celične kulture. Kulture omogočijo preživetje celic mnogoceličnega organizma in seveda tudi gojenje celic izven telesa, v neživem okolju.

Za preživetje moramo pripraviti takšne pogoje, ki so bili blizu pogojem v organizmu.Gojenje v tkivnih in celičnih kulturah pogojuje definicijo celice:

Celica je najmanjša organizirana enota neke žive snovi, ki je sposobna obstajati neodvisno v primernem neživem mediju. Sčasoma ima sposobnost nadomeščanja lastne snovi s sintezo novih materjalov iz snovi, ki jih prevzame iz okolja – definicija potrjuje preživetje celic in vitro!

- Za gojenje in vitro potrebujemo:o Gojišče (hranilni medij) – osnovne hranilne snovi so: aminokisline, glukoza, vitamini, soli; o Sterilno okolje: dodamo antibiotike, da ne bi prišlo do kontaminacije;

9

o Ustrezna temperatura: sesalci - 37°C; o Petrijevke: steklo ali kvalitetna plastika;o Atmosfera;o Zrak: 5% ogljikovega dioksida zaradi rasti celic.

1) Kultura eksplantataMajhen košček tkiva (tkivo se prehranjuje z difuzijo) odvzamemo v sterilnem okolju in prenesemo v ustrezno gojišče. Pri tem tkiva ne razdelimo na celice, ampak pustimo zgradbo, kot je. V ustreznem gojišču lahko takšno tkivo preživi tudi več tednov.

2) Celična kulturaIz odvzetega tkiva pripravimo posamezne celice, tako, da prekinemo stične komplekse med celicami. – proteolitični encimi: tripsin kolagenaza raztopi vezi med celicami.Celično kulturo najlažje pripravimo iz embrionalnih celic.

o Primarna kultura: celice dobljene neposredno iz tkiv. Število delitev celic v primarni kulturi je omejeno. Nesmrtne celice dolgo preživijo – trajna celična kultura.

HELA kultura – karcinomske epitelne celice človeka; BHK kultura – fibroblasti (vezivne celice) iz ledvic hrčka; 3T3 kultura – fibroblasti mišjega embrija.Morfološko se razlikujejo od primarnih kultur.

Celice trajne celične kulture se morfološko razlikujejo od primarnih kultur. Ohranijo osnovne lastnosti, ki omogočajo preživetje v kulturi, fiziološke lastnosti pa se spremenjene.

o Konfluentna kulturaDa se celice lahko delijo morajo biti pritrjene na trdo podlago, zato dno petrijevke premažemo s fiziološko plastjo zunajceličnega matriksa. polstičnica-celice se prilepijo na matrix. Ker je matrix hrapav, se celice delijo in množijo po celi površini, dokler ne prerastejo matriksa. Med celicamo se ustvarijo medcelični kontakti – stičnice, zato razmnoževanje ni več možno.

kontaktna inhibicija: rakaste celice kontaktne inhibicije ne razvijejo in se obnašajo čisto drugače; se gibajo, slabo se pritrdijo na matrix, rastejo ena čez drugo, v kulturah je bistveno večja gostota celic kot pri nespremenjenih celicah.

POMEN gojenja in vitroS pomočjo kultur preučujemo živo celico. Z njo lahko eksperimentiramo, ne da bi pri tem posegali v živ organizem. manj poskusov na ljudeh in živalih

5. CELICA

1858 – Virchow prvi definira celico: »Vsa poznana bitja so nastala iz najmanj ene celice. Vsako večje bitje je videti kot vsota vitalnih delcev, od katerih vsak nosi značilnosti življenja (elemente za življenje).«»Kjer nastaja celica, je morala pred njo obstajati celica.«»Omnis cellula a cellula.«

NASTANEK celice – EVOLUCIJA- Nastanek Zemlje.- Kmalu za kemično evoluciji; najdbe ob pomoči mikrofosilov v najstarejših zemeljskih skladih izpred

3,5 milijarde let. Biološka evolucija traja cca 4 miliarde let. Sledi kemična evolucija izpred 5 milijard let.

- KEMIČNA EVOLUCIJAo Zemlja je že oblikovala svojo atmosfero.o Začetek z enostavnimi molekulami:

Atmosfera+energija =sestavljanje - aminokisline, ogljikovi hidrati, nukleotidi, sledi polimerizacija, nastanejo biopolimeri

o 1950: Berkley (ZDA): simulacija nastanka monomerov in biopolimerov.o 3 faze nastajanja življenja: biomonomeri, biopolimeri, nastanek membran=pojav prvih živih

sistemov pred 4 milijardami let.

10

o Pojav malih molekul štirih osnovnih kemijskih razredov: aminokislin, sladkorjev, nukleotidov in maščobnih kislin je omogočilnastanek bolj kompleksnih molekul: fosfolipidov in fosfolipidne membrane, polipeptidov in polinukleotidov. Predvidevamo, da je prva celica nastala, ko so se fosfolipidne membrane v mešanici prebiotične juhe spontano združile v membranske strukture. Te strukture so obdajale delce, ki so se lahko samopodvojevali. Iz molekul RNA in proteinov.

o Okoli te strukture se izoblikuje z membrano ločena struktura – oblikovanje polprehodnega sistema. RNA dobi kvaliteto, ki jo povezuje z nastankom proteinov. Posledica: pride do izražanja nukleotidnih sekvenc RNA.

o Na molekulo RNA so vezane 3 stopnje razvoja: Polimeri RNA so imeli sposobnost samoreplikacije, ki temelji na interakciji med

komplementarnimi baznimi pari. RNA pridobi sposobnost usmerjanja sinteze proteinov. Membrana obda strukturo:

RNA+proteini Šele nato RNA prevzame funkcijo dedne mase celice.

Na prvotni pomen RNA kot dedne zasnove nas spominjajo RNA virusi, ki ne morejo preživeti brez žive celice. Za sintezo sebi lastnih proteinov se je ob tej dedni zasnovi ob prisotnosti nukleinskih kislin razvil tudi ribosom.*Ribosom je prva celična organela, nujno potrebna za vsako celico.

5.1. PROKARIONTSKA CELICA

Sestavljena je iz membrane okoli protoplazemske vsebine, citosola, ribosomov in nukleinske kisline.V prvi celici je bilo še nekaj encimov, ki so omogočili transmembranski transport. Tako, enostavno zgradbo ima prokariontska oz. bakterijska celica.Najenostavnejši organizmi v naravi so bakterije, ki imajo skromno razvit membranski sistem (razen zunanja membrana), notranja membrana pa ne loči dednega materjala od citosola.

PROKARIONTISo enostavno zgrajene bakterije, enocelični organizmi. (Enocelični so lahko tudi nekateri evkarionti – protozooji/praživali)

- ARHEBAKTERIJEŽivijo v specifičnem vodnem mediju, npr. močvirjih, morskih globinah, slanih izvirih, v solinah, termalnih kislih izvirih (reducirajo ogljikov dioksid v metan).- EUBAKTERIJEV zemlji, vodi, drugih organizmih… gram+

1) ANAEROBNE BAKTERIJERazvile so se prve. Ko so porabile gradivo iz prebiotične juhe, so morale razviti lasten encimski sistem za izgradnjo lastnih molekul. Meni se, da je glikoliza eden najstarejših mehanizmov kemijskega razkroja.*Bistvo glikolize: glukoza se razkroji v odsotnosti kisika – anaerobna reakcija (v primarni atmosferi kisika ni bilo). Glikoliza je še vedno prisotna v vseh živih organizmih (nastanek mlečne kisline, sproščanje energije iz ATPja).Ko bakterije porabijo probiotično juho začnejo koristiti dušik in ogljikov dioksid. Za koriščenje teh dveh plinov pa je potrebno veliko energije. Da so bakterije lahko izkoristile ogljikov dioksid se je morala razviti fotosinteza. 1. reakcija: fosforilacija nukleotidov, pri tem nastane visoko energijski ATP. To je še vedno prisotni pri cianobakterijah oz modrozelenih algah, ki so sposobne izkoriščati ogljikov dioksid, ogljik in dušik. So najbolj samozadostni organizmi.S pomočjo ATPja (ko ga imamo) pride do aerobne oksidacije, do dihanja (reakcija s prenosom kisika) kar uporablja večina organizmov v naravi.Bakterije, ki so prišle v kontakt s kisikom so propadle, če niso bile prilagojene ali pa so se skrile v močvirja, morske globine…ali pa so preživele v simbiozi z aerobnimi bakterijami virus je simbiontNa osnovi tega razlagamo nastanek evkariontov in mnogoceličarjev

Prokarionti so majhni enocelični organizmi. Poznamo:- svedraste celice – spyllum;- spirohete (cca 10µm);- mikroplazme (najmanjši prokarionti.

11

Vsem prokariontom je skupno, da njihov dedni zapis, genom, ni obdan s posebno membrano, pač pa moli v citoplazmo. Prokarionti razen ribosomov nimajo drugih celičnih organel.Tipičen in najbolj preučevan predstavnik prokariontov je bakterija Escherichia Coli.

E.Coli:o Meri: 2µm*0,8µm;o Celična vsebina: citosol, protoplazemska vsebina;o Vsebino obdaja ovojnica in vlaknata dedna snov, ki je v celici – krožni kromosom;o V citosoli so ribosomi, številna zrnca.

Ko bakterija hitro raste se število ribosomov zelo poveča. E.Coli ima znatno več ribosomov od ostalih tipov celic. Ribosomi ob krožnem kromosomu so lahko urejeni v skupine 5-8 ribosomov = polisomi.Polisomi so mesta prpisovanja DNA v mRNA, kar omogoča takojšnje prevajanje molekule mRNA v proteinske molekule.E.Coli je racionalno zgrajen organizem. Taka zgradba omogoča hitro sintezo beljakovin, ki je temelj celične delitve. E. Coli se lahko v ugodnih pogojih (T=37°C) deli v 20 minutah z enostavno cepitvijo.V citosolu bakterij je visoka koncentracija prostih E in visok delež sušine (~30%) pri evkariontih pa le 10%.Fiziološko je E.Coli prisotna v prebavilih sesalcev (debelo črevo), vendar ni škodljiva, če je ni preveč. Ta bakterija je izjemno uspešna v sposobnosti sinteze lastne snovi v neživem okolju, zato se odlično razmnožuje. To je razlog, da je najbolj preučevana bakterija.

Fotosintetske bakterije imajo tudi membransko organelo (edine!). Gre za skladanico membran, ki so opremljene z encimskimi kompleksi.

OKSIDACIJA PROKARIONTOVEncimi za oksidacijo oblikujejo respiratorno obliko, ki je vezana na notranjo celično membrano.

KROMOSKOMSKO PODROČJE = NUKLEOIDKromosom prokarionta je koržna molekula iz deoksiribonukleinske kisline in ima genetsko informacijo za cca 2000-3000 različnih beljakovin (približno 1mm DNA). Zavzema cca 1/5 oz 20% notranjosti E.Coli, okoli DNA pa so nanizna ribosomi, ki jih je med 20000 in 30000.Bakterija E.Coli torej vsebuje vse tipe RNA, razne proteine, vodo in vodotopne hidrolitične encime.

CELIČNA MEMBRANA PROKARIONTOVPosebnost prokariontov je celična membrana, ki je 3-plastna.: notranja membrana, periplazemska plast, zunanja membrana.

- Notranja membrana neposredno obdaja citosol in je prava celična membrana, torej lipidni dvoslojnik. Vanj sovgrajene molekule beljakovin in vsi encimi respiratorne verige (flavoproteini, citohromi, kinomi…). Respriratorni encimi s svojim delovanjem znižujejo koncentracijo H+ ionov v citosolu v primerjavi z okolico. Posledica tega je električni naboj med zunanjostjo in notranjostjo celice, ki ga imenujemo membranski potencial.

- Periplazemska plast je sestavljena iz kovalentno vezanih ogljikovih hidratov in aminokislin. Zaradi specifične zgradbe jo imenujemo tudi peptidoglikanska plast. Ta plast je pri nekaterih bakterijah zelo tanka (gram-; E.Coli), lahko pa je tudi precej debela (bacili). Zaradi debeline se ta plast pri bacilih intenzivno obarva z jodom ter kristalvijoličnim barvilom. Prvi je to opazil mikrobiolog Gram, zato bakterije z debelo peptidoglikansko plastjo imenujemo gram pozitivne bakterije. Poleg te lastnosti ima periplazemska plast še beljakovine, ki so življenjskega pomena za bakterijo:

o Hidrolitični encimi pričnejo z razkrojem hrane, potrebne za bakterijo;o Vezalne beljakovine pomagajo pri transportu hranilnih snovi skozi notranjo celično steno.o Kemoreceptorji za ločevanje hranilnih snovi od strupov – za nas lahko usodni.

Pri nekaterih bakterijah so v periplazemsko plast vpeti še gibalni elementi, bički ali migetalke.Periplazemski gel je peptidoglikanska snov, želatinasta, skoznjo difundirajo periplazemske beljakovine.

- Zunanja membrana je dobro preučena le pri gram- bakterijah; gram + bakterije pa imajo na površini le sledove nekakšne membrane.Pri gram- bakterijah je zunanja membrana sestavljena iz fosfolipidov, prisotni pa so tudi lipoproteidi, ki zunanjo membrano pritrjujejo na peptidoglikansko plast. Poleg tega so prisotne še specifične beljakovine, potrebne za transmembranski transport molekul. Te beljakovine imenujemo pore oz porini. Skoznje prehajajo majhne molekule z difuzijo.Receptorji ali transportne beljakovine omogočijo večjim beljakovinam, da lahko vstopijo v notranjost celice.

12

Ker imajo gram+ bakterije dobro razvito peripazemsko plast, imajo le sledove zunanje membrane.

DELITEV PROKARIONTOVNotranja membrana se začne gubati in guba (mezosom) sega v notranjost celice. Na mezosom se veže krožni kromosom. Guba se prične spuščati v notranjost celice in se podaljšuje. Na sredini celice se oblikuje septa ali pretin, in sicer z notranje celične membrane in periplazemske plasti. Ko septa doseže drugo stran celice, se celica enostavno preščipne. Dobimo dve novi hčerinski celici, ki imata enake lastnosti kot izvorna celica. Vsaka ima svoj krožni kromosom.

SPORULACIJANekatere bakterije (bacili) lahko sporulirajo. Pri tem se ustvarijo spore (kot seme rastlin). Sporulacija je obrambna funkcija za preživetje v neugodnih življenjskih pogojih. Spore so metabolično neaktivne, so odporne na zunanjo temperaturo in na sušenje. V spori je območje dedne snovi, malo je citosola, predvsem pa je debela celična membrana. (rod bacullus - anthrax)

MIKROPLAZME – PPLO ( pleuropneumonia like organisms)So najmanjše bakterije: 0,125-0,150µm.Mikroplazme so negibljivi mikrobi, ki so lahko različnih oblik: zrnati, paličasti, nitasti.Imajo sorazmerno debelo celično steno (7,5nm), nimajo pa vseh 3 plasti stene. Predvsem imajo razvito lipoproteidno membrano. V citosolu je molekula DNA, molekule za sintezo proteinov in ATP (s presnovo sladkorjev) ter vse ostale molekule, ki preživijo kemijske reakcije, nujne za obstoj in delitev mikroplazme brez prisotnosti gostitelja.

RIKECIJESo prokarionti a obvezni paraziti in nujno potrebujejo gostitelja. Imajo lastno DNA, RNA, postopno rastejo in se delijo na dve hčerinski celici – clamidia psittaci povzroča psitakozo.

HIPOTETIČNO NAJMANJŠA CELICADa lahko izvaja vse reakcije, da raste in se razmnožuje, potrebuje celica encime za katalazo vsaj 100 reakcij, če vsako reakcijo vodi po ena encimska molekula, bi vse molekule med delovanje potrebovale približno 40nm prostora v premeru. Ker celica potrebuje še celično membrano, bi zato imela premer cca 50nm. V takšni celici bi bilo cca 1,5*106 atomov.

5.1.1. VirusiVelikost: 20-30nm. Niso prave celice, ne da se jih kultivirati na brezceličnem rastišču.Odkriti so bili po naključju, ko je leta 1933 Schlesinger odkril bakteriofage. Ker jih je težko videti tudi z elektronskim mikroskopom so se razvile različne metode za dokazovanje virusov:

- celične kulture;- serologija (ugotavljanje prisotnosti na osnovi specifičnih reakcij med virusi in imunoglobulini.- In situ hibridizacija.

Virus ni prava celica, ker nima lastnega metabolizma. Za rast in razmnoževanje mora vstopiti v pravo celico – nekakšen parazit.Viruse ločimo po obliki (kroglasti, valjasti ali ovalni, paličasti in poliedrični) ter po dednini (DNA ali RNA virusi).Virusi preusmerjajo celični metabolizem po vstopu v celico. Različni virusi lahko vstopajo v različne celice. Tiste, ki napadajo bakterije imenujemo bakteriofagi.

Zunajcelično oblika virusa (viron) oz virusni delec sestavlja virusni genom in pa pridružene beljakovine in lipidi, ki varujejo genom pred učinki okolja, omogočajo vstop v gostitelja.

Kapsida ali beljakovinski plašč je iz ene ali več vrst beljakovin. Kapside so lahko polžasti zvitki – heliksi ali pa ikozaedrična telesa z 20 površinskimi ploskvami.

Ko viron vstopi v celico se popolnoma spremeni. Genom se sprosti, osvobodi se dodatkov, ki ga varujejo. Genom se spremeni v takšno obliko, da se lahko replicira in pretvori svoj genski zapis v ustrezne beljakovinske molekule, ki spremenijo kvaliteto celice.

BISTVENA RAZLIKA MED VIRUSOM IN CELICO

13

Celica za obstoj, razvoj in razmnoževanje nujno rabi sposobnost nadomeščanja lastne vsebine s sintezo novih sestavin iz snovi, ki jih prevzame iz okolice.Virusi pa kažejo le nekatere lastnosti, ki so tipične za življenje. Sami ne morejo producirati snovi iz nežive tvari v njihovi okolici, zato za razmnoževanje in preživetje nujno potrebujejo živo okolje oz gostiteljsko celico.

5.1.2. Prokarionti vs evkarionti

Splošno PROKARIONTI EVKARIONTIOrganizmi Bakterije, cianobakterije Protisti, glive, rastline, živali

Organiziranost V glavnem enoceličnaVečinoma mnogocelična z

diferenciacijo celicVelikost 1-10µm 5-150µm (večina)Delitev Enostavna razdelitev Mitoza ali mejoza

Dedna snov PROKARIONTI EVKARIONTIŠt. Različnih kromosomov

1 Več kot 1

Kromosomi s histoni

Ne Da

Jedrce Ne DaGenetska

zamenjavaEnosmerna s plazmidi Z združitvijo gamet

Oblika DNA KrožnaZelo dolga dvojna vijačnica –

linearnaJedrna ovojnica Ne Da

Celične organele PROKARIONTI EVKARIONTIRibosomi 70s (30s+50s) 80s (60s + 40s)

ER Ne DaGA Ne Da

Lizosomi in peroksisomi

Ne Da

Mitohondriji Ne DaKloroplasti Ne Rastline

Mikrotubuli in mikrofilamenti

Ne Da

Peptidoglikan. celična stena

Da (razen arhebakterije) Ne

Funkcionalna stanja

PROKARIONTI EVKARIONTI

Pinocitoza in fagocitoza

Ne Včasih, po potrebi

Elektronski transport

Samo skozi celično membranoSkozi vse membrane (tudi do

organel)Citoplazemsko

strujanjeNe Da

Metabolizem Aeroben + anaeroben Aeroben

* Citoplazemsko strujanje = gibanje citosola oz same citoplazme.

*Pinocitoza, mikropinocitoza je splošna, neselektivna oblika endocitoze. Celica iz okolice prevzema tekočino in koloidne delce raznih snovi. Pinocitoza pri različnih tipih celic poteka različni hitro. Na površini celice se pojavljajo vdolbinice – kaveole. Iz katerin nastanejo pinocitotični mešički.

14

*Endocitoza je proces, ko celica zajame večje količine snovi, ki se nahaja zunaj nje. Če pri tem zajame trdne delce – tujke (virusi, bakterije, prah…) jo imenujemo fagocitoza oz celično požiranje. Če pa zajame tekičino, govorimo o celičnem pitju oz pinocitozi.Pri sprejemanju in izločanju snovi sodeluje celična membrana. Na mestu endocitoze se vse bolj ugreza, popolnoma zaobjame snov iz okolja in ustvari meurček – vezikel, ki se odcepi v notranjost. Vsebina se združi s prebavno vakuolo. fagocitoza = makrofagi

*Eksocitoza je nasprotna endocitozi, celica izloča večje količine snovi, ki so se v njej sintetizirale in metabolite (v sekrecijskih veziklih) – nadomesti se odcepljena celična membrana.

5.2. EVKARIONTSKA CELICA

Razvoj bolj kompleksnih celic.- Kopičenje dednega materjala na določenem mestu v celici – jedro;- Jedro je omejeno z jedrno ovojnico (membranski sistem!), ki loči dedni material od ostalega citosola;- Evkarionte smatramo kot prave celice. Prvi pa so se pojavili pred 1,5 milijarde let.

EVKARIONTIZanje so značilne membranske organele in mitohondriji. Meni se, da do mitohondriji in kloroplasti ostanek aerobnih bakterij.Mitohondrij je edino mesto respiracije oz. dihanja. O preteklosti lahko sklepamo zaradi velikosti, oblike, krožnega kromosoma, ribonukleinske kisline, možnosti samopodvojevanja.

Evkarionti so lahko:- enocelični organizmi: tudi nekateri evkarionti so lahko enocelični organizmi – praživali so iz ene same

življenjske enote, iz ene same celice.- mnogocelični organizmi: za mnogocelične organizme, sestavljene iz samo evkariontskih celic je

značilno, da so celice diferencirane, kar pomeni, da so specializirane za posebne naloge. Šele ko so celice diferencirane služijo celotnemu organizmu. Diferencirane enote so odvisne druga od druge, motnja pri eni enoti se lahko kaže na celotnem organizmu. (npr. motnje v živčnem sistemu: negibljivost delov ali celega organizma – hromost zaradi ene same poškodbe).Pri bakterijah lahko ena sama celica samostojno preživi in ne potrebuje diferenciacije!

BIOLOŠKI SISTEMIPosamezne celice mnogoceličnega organizma so organizirane biološke enote, ki se funkcijsko dopolnjujejio ter tako oblikujejo biološke sisteme, ki delujejo z različno stopnjo neodvisnosti.

V mnogoceličnem sistemu so celice organizirane v 4 skupine tkiv: epiteliji, veziva, maščobno in živčno tkivo.

Evkariontske celice so lahko različno velike – večina: 5-150µm; najmanjše 100-150nm

Pri mnogoceličnih organizmih se celice razlikujejo po obliki, velikosti in specifičnih dejavnostih. (npr. visokoprizmatična celica, sestavina epitelijev, prebavna cev; živčna celica-nevron, celica s citoplazemskimi podaljški, pri slonu ali žirafi lahko tudi daljši od 1m)

Med življenjskim ciklusom (celični krog) vsaka celica postopno raste do dvojne velikosti, nato pa se deli. Po delitvi nastaneta dve identični hčerinski celici razen pri mejozi, ko nastanejo 4 različne semenčice (zaradi prekrižanja).Virusi te sposobnosti nimajo. Ko se v celici namnožijo, jo zapustijo in ne spreminjajo lastnosti – ne delijo se na tak način.

Evkariontska celica je lahko rastlinska ali živalska (človeška; razlike v zgradbi ni).Značilna zanjo je visoka organiziranost, kompleksna zgradba. Tri bistvene sestavine evkariontske celice so: celična membrana, jedro (vsaj razvojna faza, zreli eritrociti nimajo jedra) in citoplazma.

Poznamo enojedrne ter dvo- ali večjedrne evkariontske celice. Oblika, zgradba in število jedr v celici je odvisno od naloge, ki jo celica opravlja.

15

Evkariontska celica ima dobro razvit membranski sistem. Plazmina membrana (lipidni dvoslojnik) obdaja celično vsebino – citoplazmo (citosol-tekoči del, celični organeli, citoskelet).Organele v citoplazmi so lahko membranske ali nemembranske. Dvojna ali enojna membrana organel loči vsebino od okolja.

Celične organele so: endoplazemski retikulum (gladek in zrnat), golgijev aparat, mitohondrij, lizosom, sekretna zrna, ribosomi (lahko so posamični, vezani na membranogER ali v skupinah 6-8:polisomi), centriol, lipidne kaplje, lipofuscini, barve.

Membrane celičnih organel ločijo različna metabolna stanja – različne funkcije.

CITOSKELETSestavljajo nitke, vlakna in filamenti, ki jih gradijo razne beljakovine. (aktinski, miozinski, intermediarni filamenti, mikrotubuli)

JEDRO oz NUCLEUS ima dvoplastno jedrno ovojnico z beljakovinsko vsebino. Vsebuje DNA, RNA, nukleosome in jedrce oz nucleolus.

CELICA je najmanjša organizirana enota žive snovi, ki je sposobna obstajati neodvisno v primernem neživem okolju. Ima sposobnost nadomeščanja lastne snovi, ki jih prevzame iz okolja, kar je nujno potrebno za samostojno preživetje.Celica kot del mnogoceličnega organizmaCelica je samostojna enota mnogoceličnega organizma. V organizmu so posebne skupine celic, ki so prilagojene določenim nalogam. Prilagojenost celice dosežejo med razvojem – diferenciacija celic. Med razvojem se celice specializirajo za opravljanje določenih funkcij, gre za prilagajanje zgradbe, oblike in funkcije.*diferenciacija je proces, pri katerem se pojavijo stalne razlike med celicami, ki vse izvirajo iz iste izhodiščne celične skupine – iz 3 kličnih listov v embrionalnem razvoju dobimo maso različnih celic.S specializacijo postane celica stabilna in se ne more več vrniti v nediferencirano stanje. Diferenciacija celic se dogaja v organizmu celo življenje, najbolj razvita pa je v embrionalnem razvoju.

1) V zigoti, ki nastane iz semenčice in jajčeca je podana osnova novega osebka – to je dedni material jajčeca in semenčice, ki sta se združila v fazi oploditve.2) Nov osebek nosi lastnosti staršev, v zigoti pride fo delitev. Značilna je hitra mitotična delitev, ki jo imenujemo tudi proliferacija, pravzaprav pa s celično proliferacijo označujemo vsako povečano število celic.3) Zgodnja delitev celic = brazdanje nam da novo celično strukturo, ki jo imenujemo morula. Pri brazdanju se poveča število celic, velikost embria pa ostane ista. V moruli pride do razmika celic, ustvarijo pa se določene strukture; mehurčaste tvorbe – blastule oz blastociste.4) V blastocisti tkiva še niso opredeljena. Do te stopnje je razvoj kvantitativen, veča se le število celic. Od stopnje blastociste dalje se celice kvalitativno spreminjajo; iz embrionalnega vozliča (celice v notranjosti blastociste) se razvijejo 3 klični listi.5) 3 klični listi so ektoderm (zunanji), mezoderm (celice, ki se vrinejo vmes) in endoderm (notranji). Iz njih se razvijejo štiri osnovna tkiva.6) Histogeneza – oblikovanje tkiv, temu sledi organogeneza – iz tkiv se oblikujejo organi.

Mitotska celična množitev – proliferacija in diferenciacija celic si sledita v določenem zaporedju.Vse motnje, ki nastanejo do diferenciacije celic so povratne, kar nastopi kasneje, pa so vse nepovratne. (hipertrofija=preveč celic; hiperplazija=povečan volumen celic).Visoko diferencirane celice praviloma izgubijo dlitveno sposobnost, lahko pa opravljajo le natančno določene naloge.

5.2.1. Osnovna klasifikacija višjih evkariontskih celic po dejavnostih

1. Celice s poudarjeno delitveno sposobnostjo

a) Vse potentne celice To so tiste celice, ki imajo potencialno sposobnost, da lahko tvorijo vse oblike specializiranih celic (somatske in spolne) v nekem izgrajenem telesu. (npr. oplojena jajčna celica) V nadaljnem razvoju totalno potenco jajčeca

16

zadržijo le spolne celice (jajčece in spermij). To je prenos, pomemben za nadaljnjo generacijo. Somatske celice potentnosti ne zadržijo!Razvoj telesa je odvisen od diferenciacije celic – rezultat diferenciacije: celice se lahko producirajo le v družini celic v katero sodijo (mišična celica ne more postati živčna). Na končni stopnji diferenciacije lahko celice povsem izgubijo delitveno sposobnost.

b) Visoko specializirane somatske celice (ne morejo nadomestiti)Delitveno sposobnost izgubijo že ob rojstvu. Matične, osnovne, celice so se tekom diferenciacije izrabile ali uničile – živčna celica

c) Visoko specializirane somatske celice (obstajajo zarodne celice, lahko nadomestijo)Po opravljeni nalogi se odstranijo iz organa. Obstajajo organizmi (zarodne celice), ki omogočijo, da se visoko specializirane somatske celice lahko nadomestijo (velja le za iste družine celic). Npr: večskladni epitelij, koža na podplatih - vrhnja plast se spremeni v keratin ter odmira, zarodne celice v bazi se nenehoma delijo, da se lahko keratinskaplast nemoteno lušči.Visoko specializirane somatske celice so med razvojem uspele obdržati delitveno sposobnost – reproduktivna sposobnost.

- organi, kjer imajo celice dolgo življenjsko dobo;- celične delitve po končani rasti ne opazimo;- jetra.

2. Celice s posebno organizirano zgradboOrganizirane so tako, da imajo specifično zgradbo citoplazme, ki služi opravljanju določenih nalog. V takšnih celicah opazimo dve aktivnosti:

- biosintezo lastnih gradbenih materialov;- opravljanje svoje specifične funkcije.

(npr. mišične celice gradijo miofilamenti in so aktivne, da se lahko krčijo; npr. fagocitmakrofag, monocit; celica, sposobna sprejeti tujek, ga razpozna in sprejme v svojo citoplazmo, ki vsebuje lizosome za razgradnjo tujka – fagocitna aktivnost je najboljši primer dvojnosti; lizosom z encimi razgradi mikrob pri tem pa se lizosom porabi in celica mora narediti novega s pomočjo sinteze proteinov preko golgijevega aparata.)Sistem nastajanja matičnih celic:- ni za živčne celice;- ni za srčno mišico – poškodovano tkivo po infarktih nadomesti vezno tkivo z drugo funkcijo-brazgotinjenje.

3. Celice za tvorbo in izločanje snovi v okolico V tovrstnih celicah opazimo biosintetsko aktivnost, ki je odvisna od potreb organizma – proizvedene snovi so beljakovinske narave.Osnovna dejavnost: biosinteza proteinov; celico prepoznamo po aktivnem jedru, jedrcu, razvitemu ER, obilnem GA (tudi do trije na celico) in veliko mitohondrijih. Takšne biosintetsko aktivne celice so naprimer endokrine celice (hormoni), plazmaciti, fibroblasti, hondroblasti, osteoblasti...

5.2.2. Delitvena sposobnost celic

Gre za odnos med delitveno sposobnostjo in delovno specializacijo.- Oplojeno jajčece je vsepotentna celica; sposobno je oblikovati vse oblike specializiranih celic. Totalno

potenco zadržijo le spolne celice, somatske pa ne.o Tvorba somatskih, spolnih celico Diferenciacija je nepovratna, celice se lahko po specializaciji za določeno funkcijo

reproducirajo le znotraj določene družine celic, ne morejo oblikovati drugih družin. Dokončno diferencirane celice izgubijo sposobnost delitve – reproduktivno sposobnost.

pri sesalcih eritrociti izgubijo jedro, izključno opravljanje funkcije.- Celice, ki z rojstvom izgube sposobnost delitve

o Nekatere visoko specializirane somatske celice;o Organizem jih ne more nadomestiti, če se izrabijo ali uničijo;o Živčna celica!

17

- Celice, ki se nenehno trošijo in obnavljajo:o Veliko vrst celic po opravljeni funkciji propade in se odstrani iz organizma;o Imajo mehanizem za nadomeščanje in sicer nove populacije zarodnih celic iste družine (mesta

z neprekinjeno nastajajočimi celicami (ravnotežno s porabljenimi);o Epiteliji (prebavila, koža);o Krvne celice (eritropoezaeritrociti).

- Celice z zadržano delitveno sposobnostjoo Izjema: specializacija ne nasprotuje toliko reproduktivni sposobnosti, ki se po dokončnem

razvoju organa, ki ga sestavljajo ne uveljavlja več;o Organi z dolgo življenjsko dobo celic; hepatociti - v je jetrih odraslih osebkov so zelo redke

delitve. Če operativno odstranimo del jeter se celice spet začnejo množiti in velikost jeter se obnovi.

- Zaviralci sposobnosti delitveo Celice, ki neskončno proliferirajo imajo spremenjeno kromosomsko vsebino – niso več

normalne.o Vse takšne celice, ki se v kulturi neskončno delijo po presaditvi v osebek, identičen izhodnemu

osebku rastejo kot rakave celice in uničujejo osebek – izgubijo sposobnost kontrole rasti.o Normalne celice v kulturi imajo omejeno število delitev – reproduktivna sposobnost somatskih

celic je omejena.o Izguba sposobnosti kontrole rasti = izgubljena občutljivost za kontrolne faktorje celične rasti.o Celica izgubi sposobnost diferenciacije in ne more izvajati normalnih funkcij. Energijo

namesto za delo izkorišča za rast.

5.3. Celični krog

Del celičnega ciklusa je tudi delitev. Življenjski cikel celice:

- interfaza (ko se celica ne deli)- delitveno obdobje* (meioza – spolne celice in mitoza – somatske celice)-

Dolžina ciklusa se razlikuje glede na vrsto celice. Dolžina interfaze je različna, dolžina mitoze pa razmeroma konstantna.*Podvoji se kromosomski material in se z mitotično delitvijo enakomerno razporedi med dve hčerinski celici.

5.3.1. InterfazaJe najdaljša faza v celičnem ciklusu. Za interfazo je značilno, da so kromosomi despriralizirani. V interfazi je tudi največja biosintetska aktivnost. V obdobju interfaze se celična biomasa povečuje, v določeni fazi interfaze pa se podvoji tudi genetski material. To je mejnik, ki fazo deli na tri stopnje:

1) G1 – preduplikacija (tu dolžina najbolj varira);G=GAPPomeni vrzel, odmor med mitozo in S stopnjo. Navadno je najdaljša, njena dolžina pa je odvisna od diferenciacije celice. Nediferencirane embrionalne celice imajo najkrajšo G1 fazo. V tej fazi celica opravlja svojo običajno funkcijo.Posebnost so nevroni – živčne celice, ki imajo fazo G0: Ta se ne nadaljuje v fazi S in G2.

2) S – sintetična ali duplikacijska;V fazi S se podvoji kromosomski material, stopnja pa traja od 6-8ur.

3) G2 – poduplikacijska.Je vrzel med S fazo in mitozo ter traja 30-120 minut.Celica je na mitozo (delitev) pripravljena že v interfazi in sicer v S stopnji, ko ima že podvojen dedni material, nato pa le še čaka na primeren trenutek za začetek mitoze.

18

5.3.1.1. Interfazno jedro oz nucleus

Jedro evkariontskih celic je lahko različnih oblik – ovalno, segmentirano, kroglasto, ledvičasto, zažeto…Oblika in število jeder v celici je odvisno od njene funkcije in od mesta, kjer se celica nahaja.- Zreli eritrociti nimajo več jedra;- trombociti niso celice, so celični fragmenti.Jedrno citoplazmensko razmerje je konstantno za določen tip celice (limfocit-več jedra; plazmatka-več citoplazme, ekscentrično jedro, biosinteza)-

Jedrna membrana: notranja in zunanja, vmes je perinuklearni prostor.Vsebina jedra:- nuklearni matriks;- vlaknate strukture – kromatin;- nucleoplasma;- jedrce oz nucleus (lahko jih je več).Vsebina je viskozna amorfna masa, v kateri so raztopljene razne snovi (proteini).Kromosomi so v interfaznem jedru v obliki močno zvitih kromatinskih nitr = kromatin (heterokromatin-zvit, evkromatin-odvit, biosintetska aktivnost).

A) HeterokromatinJe viden, barvljiv, temnejši, elektronsko gost, zvit in specifično razporejen.Poznamo periferni, intermediarni (kariosomi) heterokromatin in heterokromatinski prstan oz jederco pridruženi heterokromatin.Kromocentri so mesta, kjer se periferni heterokromatin pripenja na ovojnico. Najdemo jih tudi na heterokromatinu, ki je ob jedercu – perinuklearni heterokromatin. Elektronsko svetlejša mesta.

B) EvkromatinJe razvit v interfaznem jedru in je popolnoma dekondenziran. Elektronsko svetel prostor v interfaznem jedru.

Nuklearni oz jederni matriks: fibrilarna, vlaknasta mreža, ki jo tvorijo beljakovine.

Nukleoplazma je tekoča in vsebuje snovi, raztopljene v jedru.

JEDRNA MEMBRANA- značinlost evkariontske celice;- loči jedrno vsebino od citoplazme, kjer se odvijajo drugi metabolni procesi.

Ovoj sestavlja:- par koncentričnih membran, ki sta ločeni z medprostorom-perinuklearni prostor,, širokim 10-50nm;- notranja in zunanja membrana se mestoma združita, oblikujeta prostor, jedrno poro;- Zunanja membrana mestoma prehaja v gER in je gradnik njegove membrane, tako se poveže

perinuklearni prostor v cisterno gER. Kot na zunanjo membrano gER so tudi na zunanjo jedrno membrano pripeti ribosomi.

Jedrni membrani sta lipiodna dvoslojnika, ki se združita v jedrnih porah.Jedrne pore:

- krožni prostori;- različna količina in gostota na jedrni ovojnici – odvisno od funkcije celice;- neaktivna celica – majhno število (npr. eritrociti ptiča: 2-4 pore/µm2;- aktivna celica – ogromno število (npr. oocit: 60+ por/µm2;- v povprečju ima evkariontaska celica okoli 3000 jedrnih por.

LAMINA FINROSA – IMF – opora jedru- na notranju površini notranje membrane;- struktura vlaknatega videza;- vlakna tvorijo mrežo, ki je lahko prekinjena ali neprekinjena;- pomen: lamina fibrosa se pripenja na notranjo membrano in na ta način učvrsti steno jedra. Nanjo se

pripnejo kromatinske nitke – nukleoproteidna vlakna iz heterokromatina;- sestava: vlaknata struktura je beljakovinske narave. Filamente tvorijo proteioni lamini (več vrst: B1, A,

B2, C) iz družine polipeptidov, kot so IMF citoskeleta v celici. Premer vlaken je 10nm;

19

- med mitozo lamina fibrosa razpade – specifična kinaza povzroči fosforilacijo laminov.

PORNI KOMPLEKSSluži prehodu snovi:

- RNA iz jedra;- Prehod raznih makromolekul;- Proteini v/iz jedra;- Ribosomi v citoplazmo.

Pretok proteinov in RNA je voden, kar pomeni, da potrebuje energijo (aktiven transport). Brez energije (posivni transport) lahko potujejo le majhne molekule.Plazmina membrana preprečuje prehod makromolekul, skozi pore pa te lahko potujejo.Porni kompleks ustvarita zunanja in notranja jedrna membrana na mestih združitve. Jedrna pora je omejena s proteini, ki so urejeni v globule (4 notri, 4 zunaj). Globuli se pripnejo na mesta, kjer jedrni ovojnici prehajata ena v drugo. Učvrščujejo jih proteinski filamenti, ki so nitasti na citoplazemsko stran, na stran jedra pa imajo strukturo košare. V sredini pornega kompleksa je centralna granula, ki olajša prehod snovi skozi membrano oktagonalna simetrija. Premer jedrne pore je ~60nm, skoznjo pa se razteza annulus, cilindrična beljakovinska snov iz 3 obročkov.

Porni kompleks = pora + annulusAnnulus močno zmanjša premer pore.

- centralni kanal 30-50nm, prilagaja se velikosti molekul od 9-40nm.- ATP-aza zagotavlja energijo za prehod molekul

RNA v jedruRibonukleoproteidne enotePoleg jedrca je RNA tudi drugod v jedru:

- perikromatinska zrna (40-45nm); so elektronsko gosta, obkrožena z elektronsko svetlin dvorom; ob robovih heterokromatina; pri zavrti sintezi rRNA se količina poveča; zrna so posamična;

- interkromatinska zrna (20-25nm); v skupinah nad kariosomi;- perikromatinska vlakna ; ob robu heterokromatina, vlaknata RNA, izdelek ribosoma, predhodnik zrnc;

odstrani ribonukleaza; pri nekaterih jedrih so iz grobih vlaknatih mas in so redko razporejena (zavita telesa).

ZGRADBA DNASestavljena je iz dveh polinukleotidnih verig, ki potekata antiparalelno (3`5` in 5`3`) glede na položaj fosfodiestrskih vezi med atomoma dveh sosednjih deoksiriboz.Ti dve verigi tvorita dvojno vijačnico DNA. Polinukleotidni verihi sestavlja deoksiriboza, fosforna kislina, purinski dušikovi bazi (adenin in gvanin) in pirimidinski bazi (citozin in timin). Verigi povezujejo vodikove vezi med dušikovimi bazami, ki so si komplementarne (A=T, C≡G).DNA raste v smeri 5`3`. DNA je nosilka dednega zapisa in usmerja lastno replikacijo ter prepis v RNA.

CHARGAFFOVA PRAVILARazmerje med A in T je ena 1:1 in razmerje med G in C je 1:1, vendar je razmerje A+T parov in G+C parov lahko različno. Večje rastline in živali imajo presežek A+T. Med A in T v deoksiribonukleotidu se tvorita po 2 dušikovi vezi, med G in C pa po tri. Količina citozina je enaka gvaninu, ker mora vsak citozin v eni verigi imeti komplementarni gvanin v drugi. Podobno velja tudi za timin in adenin.Sekvence baz v antiparalelnih polinukleotidih so komplementarne, niso pa enake.

SUPERZVITA DNA – nedostopna, zato se mora odvitiTaka DNA je zvita okoli proteinov, da je lahko »stlačena« v celico. Strukturo DNA+protein imenujemo nukleosom in je najpomembnejši del kromatina. Zaporedna enota superzvite DNA na nukleosomu meri ca. 200 baznih parov. Nukleosom je globularno telo 10-11nm veliko.

RIBONUKLEOPROTEIDNE ENOTENukleoproteidi so ribosomske podenote; potrebne za sintezo beljakovin v citoplazmi.

JEDRCE OZ NUCLEOLUSElektronsko gosta struktura v jedru, vidna tudi pri svetlobni mikroskopiji. Sestoji iz fibrilarnega (svetlo) in granularnega (temno) območja. Glavna naloga jedrca je sinteza RNA na podlagi matrice DNA in proizvodnja ribosomov.

20

- eno ali več (jedra žleznih celic 10+, ker te celice izločajo in proizvajajo velike količine proteinov) število jedrc kaže visoko biosintetsko aktivnost celice.

- Nastane v interfazi zaradi delovanja nukleolarnega organizatorja oz jedrcu pridruženega heterokromatina, ki ima informacijo za tvorbi rRNA.

- Cona filamentosa – nitasto področje v osrednjem delu = nitke RNA- Cona granulosa – nitke RNA nitastega področja se združijo s proteini, ki pridejo iz citoplazme.

Izoblikuje se zrnato področje s 40S in 60S ribosomskimi podenotami.

Kljub temu, da pravimo, da je celica v interfazi v fazi mirovanja se moramo zavedati, da je interfazno jedro delavno jedro.

5.3.2. MitozaIzraz so prvič uporabili leta 1870, ko so opisali kromosome nitastega videza, ki se pojavijo tik pred celično delitvijo.Sestoji iz 4 stopenj. Je hitra, traja cca 2 uri.*Celice, ki se ne delijo so nulte celice, matične, ki čakajo na delitev.Stopnje mitoze:

- profaza (1,5h);- metafaza (20 min);- anafaza (4 min);- telofaza (45 min).

Mitoza je proces delitve pri somatskih celicah. Je način delitve jedra, ki zagotovi nespremenjeno kromosomsko garnituro v hčerinskih celicah. (Mitoza = kariokineza = posredna jedrna delitev, citokineza= delitev celice).Pri mitozi se jedro popolnoma reorganizira. V jedru se pojavijo močno barvljiva nitasta telesa oz kromosomi, ki zamenjajo kromatinska zrna interfaznega jedra. značilnost mitozne slike

kariokineza – delitev jedra, običajno jo spremlja še citokineza, delitev celice. Pri mišičnih skeletnih celicah ta ne nastopi, celice so večjedrne.

Citokineza je postopek, pri katerem se eno celično telo razdeli na dve genetsko identični hčerinski celici, ki imata približno enako količino citoplazme. Novo nastali celici sta genetsko različni kot materinska celica.

Mitoza ohranja število kromosomov, daje nove celice, ki omogočajo rast celične skupine, obstoj ter obnovo organizma.Ločimo:

- zaprto mitozo: pri enoceličnih evkariontih (kvasovke). Delitveno vreteno se oblikuje znotraj neokrnjene jedrne ovojnice (tudi kondenzacija kromosomov);

- odprto mitozo: pri večini rastlin in živali jedrna ovojnica med mitozo razpade.

Podvojitev centriolov- S faza celičnega cikla: DNA 2x, centrosom 2x- Centrosom/centriola: 2x pravokoten mikrotubul. Amorfni material, ki obdaja centrosom imenujemo

centrosfera.o Proti koncu G1 celičnega cikla se centriola pričneta odmikati drug od drugega.o V S fazi se začne pravokotno na osnovna razmaknjena centriola pojavljati drug centriol.

Centrosom: 2 centiola, ki ležita pravokotno drug na drugega. Je področje citoplazme v bližini jedra sestavljeno iz pravokotnih centriolov in centrosfere. Iz centrosfere žarkasto izhajajo mikrotubuli delitvenega vretena.

Mitotični aparat:V citoplazmi se ustvari mitotični aparat, ki ga tvorita dva astra – vsak na svojem polu, ki ju oblikuje par centriolov. V fiksnem preparatu je aster skupina vlaken, ki konvergira proti centriolu. Iz astrov se izdelajo mikrotubuli, ki oblikujejo delitveno vreteno in se pripenjajo na kromosome, ki so razporejeni v ekvatorialni ravnini jedra. Vsak aster, ki obdaja centrosfero in mitotično vreteno vleče kromosome na svojo stran. V zaključni fazi – citokineza – se citoplazma razdeli na dve enaki ločeni celici.

ZGRADBA KROMOSOMOV V MITOZIKromosom : struktura v jedru celice, ki nosi gene. Sestavljen je iz DNA, histonskih in nehistonskih proteinov.

21

V celičnem ciklu so kromosomi vidni le med mejozo in mitozo, ker imajo tedaj povečano število in specifično zgradbo. Homologni kromosom sestavljata 2 kromosoma istega tipa. En od očeta in en od matere.Osnovna sestavina kromosoma je kromatida iz dvojne vijačnice DNA, ki se je podvojila v S fazi. V mitozi je kromosom podvojen, sestavljata pa ga dve sestrski kromatidi, ki se stikata na področju centromere. Tu je konstitutivni heterokromatin, ki ostane neprepisan skozi celoten celični cikel. Na površino centromere se prilega beljakovinska struktura, ki jo imenujemo kinetohor (med profazo mitoze). Na kinetohor se pritrdijo mikrotubuli delitvenega vretena. Na nivoju elektronske mikroskopije vidimo, da ima kinetohor 3 ali 4 plastno zgradbo:- notranja plošča se neposredno prilega centromeri , sodeluje pri oblikovanju in stabilnosti kinetohora;- zunanja plošča je bogata s proteini in ima pomembno vlogo pri vezavi mikrotubulov na kinetohor. Plošči kinetohora sta ločeni z elektronsko svetlim območjem – 3 lamelarna zgradba kinetohora.Če na zunanjo ploščo niso vezani mikrotubuli se na strani zunanje plošče opazijo nitasti proteini, ki vežejo mikrotubule. To je fibrozna corona (4. lamela).Večplastni kinetohor je viden le med mitozo. Med interfazo ima centromera le videz zgoščene kepe heterokromatina, ki je ne moremo ločiti od ostalih področij heterokromatina v jedru.

Telomera je distalni konec kromosomske roke. Encim telomeraza prepreči krajšanje telomere, ki je značilno za telomere pri staranju.

Mitoza je zapleten proces, pri katerem se energija porablja. Skoraj vsa energija se porabi za razdelitev podvojenih kromosomov. V obdobju mitoze so zato vse ostale naloge celice zmanjšane na minimum. Zmanjšano je prepisovanje DNA v RNA, prevajanje mRNA v polipeptide, slab odziv na zunanje dražljaje.

5.3.2.1. Stopnje mitoze

1. PROFAZAPrehod iz G2 v mitozo se začne z opazno kondenzacijo kromosomov in z razpadom jedrca. Kondenzacija se pogosto začne na periferiji jedra (omejena področja).Oblikujejo se značilne pare niti: sestrske kromatide, ki so prvič opisane leta 1870 (mehanizem, ki omogoča kondenzacijo pa šele v zadnjih 10 letih). Pri tem sodeluje kondenzin, kompleks petih proteinov, ki pomaga pri združevanju kromosomov.Profaza se začne v jedru z razpadom jedrca.V citoplazmi krajši mirkotubuli obdajajo podvojena centriola, ki se začneta razmikati in potujeta ob jedrni ovojnici.Spremembe citoskeleta: večina mikrofilamentov razpade, tudi tisti, ki gradijo lamino fibroso ter aktinski oz stresni filamenti. Med mitozo je zato celica morfološko kroglaste oblike.Spremembe citoplazemskih organel: ER in GA razpadeta na manjše mešičke oz vezikle.

2. PROMETAFAZAZačne se nenadno, z razpadom jedrne ovojnice. Mikrotubuli (iz centrosomov) penetrirajo skozi luknje v ovojnici v jedro, kjer se pripno na kinetohore kromosomov. Ker so mikrotubuli prosti nestabilni, se jih za 5x poveča stabilnost.Po razpadu jedrne ovojnice je ER razpršen po celici v obliki veziklov.Kinetohor je 3-lamelaren. Vsaka sestrska kormatida ima svoj kinetohor. Oba kinetohora sta pod kotom 180° drug na drugega. Samo eden od kinetohorov je obrnjen proti polu delitvenega vretena. Organizacija delitvenega vretena:Za zrelo delitveno vreteno je značilna bilateralna simetrična struktura centriola, ki sta se v metafazi pomikala ob jedrni ovojnici v prometafazi dosežeta nasprotna celična pola. Mikrotubuli se pripno na kinetohor. Na vsakem polu celice je tako aster iz katerega v vse smeri žarčijo mikrotubuli iz centrosoma. Ločimo 3 oblike mikrotubulov:

1. Kinetohorni mikrotubuli segajo od celičnega pola do kinetohora.- konec: počasi rastoč proti centriolu+ konec: hitro rastoč proti kinetohoruNa ta način (+,-) je onemogočeno gibanje, ki razporedi kromosome na sredino med pola. Pravimo, da se oblikuje metafazna plošča.

2. Interpolarni mikrotubuli segajo na drugo polovico celice in se ne pripenjajo na kinetohor. Pogoste so reakcije med njimi in tovrstnimi mikrotubuli nasprotnega pola.

3. Astralni mikrotubuli se širijo iz astra in so orientirani proti celični membrani. Tu se povezujejo s celičnim cortexom, ki je oblikovan iz aktinskih filamentov in se nahaja tik pod celično membrano. Ta povezava omogoči pravilen položaj vretena.

22

3. METAFAZAPojavi se kromosomska metafazna plošča; kromosomi se zberejo v ekvatorialni ravnini (vsi!) kontrolna točka!Vsi kromosomi morajo imeti dipolarno orientacijo – en kinetohor gleda na en pol, drug pa na drugega.

Tok mikrotubulov in oscilacija:Dolžina kinetohornih mikrotubulov je približno konstantna, čeprav se mikrotubuli spreminjajo; na + konec se pripenjajo enote tubulina, na – koncu pa se odstranjujejo (v=10/s). Enote tubulina tako potujejo od + dela proti – delu. To imenujemo tok mikrotubulov oz trademilling.Kromosomi metafazni plošči se ves čas preprivajo in odkrivajo. Delajo manjše ekskurzije po ekvatorialni ravnini. – cca 1,4 µm/min.

4. ANAFAZAZačne se, ko so vsi kromosomi urejeni, kar sovpada z ločevanjem sestrskih kromatid. Anafazo delimo na:

- anafaza A: ločevanje kromatid in potovanje proti celičnima poloma (mikrotubularni tok)- anafaza B: podaljšanje celičnega telesa; posledica je krajšanje kinetohornih in daljšanje polarnih

mikrotubulov.

5. TELOFAZAPonovno se oblikuje jedrna ovojnica na površini na polih kondenziranih sestrskih kromatid. V tem obdobju se začne tvoriti tudi celična brazda.

6. CITOKINEZARazdeli celico na 2 identični hčerinski celici, pri čemer pomaga kontraktilni obroček. Na celičnem ekvatorju se aktinski filamenti razporedijo pod membrano in se povežejo z miozinskimi filamenti (tip II). Miozinski in aktinski filamenti skupaj oblikujejo tenzijo, pritisk na membrano, ki ga omogoči lahkotno sproščanje kalcijevih ionov. Tenzija oblikuje brazdo, pride do kontrakcije celice. Pri hčerinski brazdi sta celici povezani s citoplazemskim mostičem. Ta vsebuje polarne mikrotubule obdane z gosto amorfno snovjo. – vmesno, srednje ali flemingovo telo.

REZULTAT mitoze je celica, diploidna (2n), torej z diploidnim številom kromosomov.; dve identični kopiji materinske celice.Mitoza NE prispeva k variabilnosti!

MOLEKULARNI NADZORNI SISTEM ne dopušča, da bi se izvedla naslednja faza celičnega kroga, če ni bila dokončana predhodna. Delitev je torej uravnavana na molekularnem nivoju.CDK - ciklin odvisna kinaza; je encim za nadzor progresije celice v celičnem krogu.Ciklini uravnavajo aktivnost CDK in kontrolirajo nadaljevanje celotnega celičnega kroga. Vežejo se na molekule CDK v različnih stopnjah in s tem določajo katere proteine bo CDK fosforilizirala.Ciklini nadzirajo dve točki mitoze. Njihova prisotnost je potrebna za njen začetek, odsotnost pa za konec. Pri sesalcih je za uravnavo celičnega kroga potrebnih vsaj 8 različnih ciklinov in vsaj 6 različnih ciklina odvisnih baz.Združevanje ciklinov in CDK je specifično, odkrili so le nekaj kombinacij vezav:

Ciklin E + CDK II : prehod G1SCiklin B + CDK I : prehod G2 mitoza

Pri obeh prehodih lahko celica ustavi napredovanje cikla, če niso dosežene ustrezne okoliščine napredovanja dve točki nadzora!

- Dejavniki, ki lahko ustavijo napredovanje kroga, če niso doseženi pogoji za delitev.- Pri napakah ni popravkov – mutacije, lahko pride tudi do spremembe celice v rakasto celico.

Med mitozo se značilna jedrna membrana raztopi, jedra več ne prepoznamo, izgubi pa se tudi jedrce. Namesto kromatinskih zrn se pojavijo nitasti kromosomi, ki so vzdolžno iz dveh polovic oz kromatid, ki sta speti v področju centromere.

Geni so osnovne enote na kromosomu, ki usmerjajo aktivnost celice. Vsaka od hčerinskih celic po delitvi dobi natančen posnetek materinske celice, torej isti genski sestav v kromosomih. V pripravi na mitozo se geni podvojijo, kar zadeva podvojitev dvojne vijačnice DNA (S faza interfaze). Razcepitev kromosoma na dve kromatidi je tako strukturni pojav saj kromosom in kromatide poleg DNA vsebujejo tudi druge komponente. Na določeni stopnji se kromatidi povsem ločita – dobimo tetraploidno celico (4n kromosomov).

23

5.3.3. MejozaMejoza je proces zorenja spolnih celic. Sestavljena pa je iz dveh delitev:

- mejoza 1 (redukcijska delitev);- mejoza 2 (ekvacijska delitev).

Med obema delitvama je interfaza – interkinesis. Rezultat mejoze pa je celica s haploidnim številom kromosomov.

1) MEJOZA 1Pred mejozo 1 se podvoji DNA v S fazi celičnega kroga. Za redukcijsko delitev je značilna dolga profaza 1, ki je večstopenjska (preleptoten, leptoten, zigoten, pahiten, diploten, diakineza), sledi metafaza, anafaza in telofaza s citokinezo, nato pa kratka interfaza brez S faze. Emu sledi mejoza 2, ki je podobna mitozi.

PROFAZA 1*Preleptoten = preleptonema

Kromosomi so tanki, težko opazni, le spolni kromosomi so vidni kot kompaktna telesa (heteropiknotična).*Leptoten=leptonema

Je kratek, traja le nekaj ur. Kromosome vidimo kot dolge niti, ki oblikujejo kapljičaste zadebelitve – kromomere.*Zigoten=zigonema=amfiten

Kratka stopnja profaze 1. Homologni kromosomi se prično urejati v pare:- ?

Ne povsem združena homologa. Homologni kromosomi se najprej postavijo drug ob drugega, DNA sekvence poiščejo komplementarno zaporedje drugega kromosoma.

- Sinaptonemalno kompleksΦ=0,15-0,20µm Oblikuje se med priležnima kromosomoma in nekako združuje homologna kromosoma. Zgradba sinaptonemalnega kompleksa spominja na cesto. Sprednji del = centralni element=vmesna snov ima dve stranski roki=lateralna elementa. Prečni elementi povezujejo lateralna elementa z vmesno snovjo.

*Pahiten oz pahinemaProces oblikovanja sinaptonemalnih kompleksov se poplnoma oblikuje v pahinemi. Značilna je dvojna zgradba niti (bivalenina). 4. kromatide, 2 kromosoma v vzdolžni družbi (kromatidna tetrada).V sinaptonemalnem kompleksu lahko opazimo rekombinacijske vozliče (mejoza poveča genetsko raznovrstnost) na mestih, kjer pride do prekrižanja. Pahinema je dolga, lahko traja tudi nekaj let.

*Diploten=diplonema=diplofazaHomologna kromosoma pričneta z razdruževanje, sinaptonemalni kompleks izgine. Diploten je dolga stopnja. Predvsem pri ženskah je aktivnost kromosomov velika. DNA se prepisuje v RNA za material, ki se bo uporabil v prvih delitvah med embrionalnim razvojem. Pri dvoživkah dobijo kromosomi značilno obliko zank: lumpbrush kromosomi. Zanke vidimo, ker Dna prilegajo nastajajoči transkripti in ustrezni proteini. Združenost s hiazami – prečno prekrižanje, crossing over, vsaj en hiazem na bivalent.

*DiakinezaKromosomi se krajšajo in debelijo, zmanjša se število hiazem oz mest, kjer je prišlo do crossing over.Pride do gibanja hiazem vzdolžkromosomskih rok proti telomeri – terminalizacija.Homologi so na koncu speti le še s svojimi konci, jedrce izgine.Obe sestrski kinetohori sta pri mejozi na isti strani, kar omogoči potovanje celotnega homolognega kromosoma proti enemu polu celice.

PROMETAFAZA 1Kondenzacija kromosomov doseže vrhunec, razpade jedrna ovojnica. Mikrotubuli delitvenega vretena se vežejo na kromosome podobna mitozi

METAFAZA 1Kromosomi se razporedijo v ekvatorialni ravnini (mitoza). Centomere so pripravljene na razdelitev.

ANAFAZA 1Sestrski kromatidi vsakega homologa se gibljeta proti ustreznemu celičnemu polu. Podaljša se celično telo.

TELOFAZA 1Oblikuje se jedrna ovojnica.

CITOKINEZA 1Rezultat delitve sta 2 diploidni celici.

24

Temu sledi kratka interfaza brez S faze podvojevanja dednega materiala.

2) MEJOZA 2Je zelo podobna mitozi. Ima štiri stopnje:

- profaza 2 (kratka, pojav delitvenega vretena);- metafaza 2 (ekvatorialna ravnina);- anafaza 2 (potovanje na pola);- telofaza 2 (4 jedra s po eno kromatido, kromosom).

SAMEC vs SAMICASamec spermatogonij – spermatogeneza

4 spermatide s haploidnim številom kromosomov (n) gredo v proces spermatogeneze oz preoblikovanja kroglaste spermatide v spermij (biček, akson).

Samica oogonijPri samicah je proces često ustavljen za daljša obdobja. Pri vretenčarjih se vsi primarni oociti ustvarijo

pred rojstvom. Te celice vstopijo v mejozo 1, ki se ustavi v profazi. Pod vplivom spolnih hormonov nekateri primarni oociti zaključijo redukcijsko delitev. Dobimo sekundarne oocite. Sledi daljša prekinitev v metafazi mejoze 1. Delitev po končani mejozi 1 je neenaka. Dobimo 4 »celice«. Ena celica vsebuje vso citoplazmo, nastanejo pa tudi 3 polarna telesca, ki propadejo.2.mejozaOb ovulaciji nastopi (se sprosti) sekundarni oocit, ki se ob fertilizaciji šele razvije. Iz sekundarnega oocita spet dobimo 1 jajčece in eno polarno telesce. Jajčece potrebuje material za razvoj embria!

5.4. Odmiranje celicŠtevilo celic v tkivu je omejeno in je odvisno od delitev in odmiranja celis, kar pa je naraven, fiziološki proces.Z mitotskimi delitvami se nadomeščajo celice, ki so odmrle zaradi fizioloških dejavnikov (epiteliji) ali pa take, ki so odmrle zaradi travme (žarčenje sonca).Poznamo dve vrsti odmiranja celic: nekroza in apoptoza.

1) NEKROZAJe patološka celična smrt, ki nastopi zaradi ekstremnih sprememb v okolju (hipotermija, sprememba pH, pomanjkanje kisika, poškodba…)Pri spremembi okolja se poškoduje zunanja celična ovojnica oz plazmalema. Tako v celico vdrejo razni agensi (voda, ioni) in povzročijo nabrekanje celičnih organel. Pride do raztopitve oz lize celice, lize citoplazme.Pri tem se sprostijo encimi KF iz lizosomov, ki najprej uničijo lastno celico nato pa postopoma še sosednje celice, dobimo t.i. vnetni odgovor.(trn v nogi – bolečina – vnetje propadli makrofagi)

2)APOPTOZACelična smrt, ki nastopi v fizioloških okoliščinah, pri tem pa ne pride do prekinitve membrane.Je aktiven, genetsko voden proces, nekakšen samomor celice. Apoptoza se redno pojavlja pri oblikovanju tkiv.Številne apoptoze so potrebne v času embrionalnega razvoja, pa tudi tedaj, ko je potrebno vzdrževati stalno število celic v že diferenciranem tkivu, saj sicer lahko pride do benignih ali malignih tumorjev.Apoptozo lahko povzroči preveč ali premalo rastnih faktorjev, virusne infekcije ali pa motnje v regulaciji celičnega ciklusa.Apoptoza je 3-fazen proces:

- indukcijska faza: različni signali usmerjajo celico na pot apoptoze;- kontrolna faza: celica se odloči kaj se bo z njo zgodilo, lahko preživi apoptozo ali pa umre;- faza razgradnje: je nepovratna, opazimo lahko številne morfološke in biokemijske spremembe, npr-

agregacija kromatina (zgoščevanje), kondenzacija citoplazme, razpad na apoptotska telesa – odstranijo MF, cepljenje DNA z endonukleazami (odmrtje pred morfološkimi spremembami). Apoptotska telesa se odstrani z makrofagi ali sosednje celice z fagocitozo. Epitelna apoptotska telesa pa se lahko odluščijo (izriniejo iz epitela) v lumen nekega organa (koža). Pri apoptozi ne zaznamo vnetnega procesa. Najznačilnejša je sprememba jedra, v katerem se kromatin zgoščanje in formira ostro ločene skupine na periferiji jedrne ovojnice. Mitohondriji ostanejo nespremenjeni. Apoptozo prikažemo z metodo tunel.

25

AVTOFAGIJA in AVTOLIZALizosomi vsebujejo številne hidrolitične encime, kisle fosfataze, ki cepijo biološke snovi v kislem pH. V živi, zdravi celici so ti encimi v notranjosti organela z enojno membrano, delujejo pa le ob stiku z materialom za razgradnjo. Če se poškoduje lizosomalna membrana se encimi sprostijo in raztopijo lastno celico. To imenujemo avtolizaAvtofagosom nastane, ko se lizosom združi z določenim delom citoplazme oz celičnim organelom. Lizosomalni encimi ta del razgradijo, ta proces pa imenujemo avtofagija oz samožrtje. Na ta način celica odstrani organele, ki ji niso več potrebni. Glukagon v jetrih lahko sproži avtofagijo, povečanje citolizosomov in zmanjšnje primarnih lizosomov.

5.5. Endomembranski sistemVsaka evkariontska celica je zgrajena iz jedra in citoplazme, ki ju ovija plazmina membrana.DNA je od ostalih delov citoplazme ločena z jedrno ovojnico, ki je povezana s citoplazemskim organelom - ER.V citoplazmi celice se odvija največ procesov. Citoplazma je prepredena s sistemom notranjih membran, ki citoplazmo razdelijo na številne predelke, kar pa je osnovna značilnost evkarionta.Vse strukture znotraj citoplazme, ki so omejene s celično membrano so celične organele, ki imajo značilno biokemijsko sestavo, zgradbo, strukturo in funkcijo.

Membrana vsej citoplazemskih organel je lipidni dvoslojnik in je v tem smislu po lastnostih enaka plazmini membnrani. Membrane se lahko med seboj združujejo ali razdružujejo, med njimi in znotraj njih pa potekajo pomembni metabolni oz biosintetski procesi.Preko membran poteka tudi izmenjava snovi:

- med lumnom organele in citoplazmo (ven);- med citoplazmo in lumnom organela (notri).

Strukture: endoplazemski retikulum(ER), Golgijev aparat (GA), lizosomi, endosomi, drobne (sekrecijske) vakuole, mitohhondriji (M), peroksisomi (P), kloroplasti (K). Pri M, K in P ima membrana drugačno strukturo.

Vse, kar se nahaja izven citoplazemskih organel imenujemo citosol ali celični matriks. Ta vsebuje:- ribosome; - elemente citoskeleta (mikrotubule, miozinske in aktinske filamente, intermediarne filamente); - specializacije apikalne površine (biček – centriol, bazalno telo; migetalke- centirol, bazalno telo;

mikrovili – aktinski filamenti).Znotraj celičnih organel so spravljeni določeni encimi, ki regulirajo delovanje posameznih organel. Difuzijske bakterije predstavljajo oviro, povezano s funkcijo celice.

SESTAVINA PLAZMINE MEMBRANEPlazmina membrana je lipidni dvoslojnik, debela je približno 7nm (6-10nm).Membrana ima 3-lamelarno zgradbo, dve elektronsko gostejši in eno elektronsko redkejšo plast. To trilamelarno zgradbo imenujemo membranska enota.

- hidrofilni del: fosfatna glava – zunaj (2nm);- hidrofobni del: alifatski repi – vmes (3,5nm);- hidrofilni del: fosfatna glava - k citoplazmi (2nm).

Membransko enoto sestavljajo predvsem lipidi in beljakovine. Vsebujejo pa tudi oligosaharide, pripete na lipid (glikolipidi) ali na peptid (glikopeptidi).Najpogostejši fosfolipidi v evkariontih so: fosfatidil serin, fosfatidil etanolamin (noter) in fosfatidil holin, sfingomielin (ven).Večina membnran vsebuje tudi glukolipide in steroide – holesterol.Beljakovinske enote oz globuli v membrani so glavna sestavina večine bioloških membran, pomembne pa niso le kot mehanična sestavina, pač pa tudi kot nosilke oz prevodnice pri transportu. Lahko imajo regulatorne ali razpoznavne lastnosti.V membrani so beljakovinske narave tudi številni encimi, receptorji različnih vrst. Večina ima različno število beljakovinskih molekul (najmanj živčna celica, največ pa mitohonsdrijska membrana). Te molekule so neposredno vključene v lipidni dvoslojnik. Nekatere z obema terminalnima koncema molijo iz membrane.V membransko enoto so nekovalentno pričvrščeni beljakovinski kompleksi z različnimi funkcijami. Membranske enote celice so specializirane:- zunanja – 10nm;

26

- notranje – 5-7nm (ER; GA).Memnrana je asimetrilna zaradi glukokaliksa na zunanji strani ter zaradi raznih diferenciacij membran, ki so povezane z endocitozo in eksocitozo.

MEMBNRANSKI FLUIDNI MOZAIČNI MODEL – The fluid mosaic modelZdružuje pomembna spoznanja o zgradbi celične membrane, Gre za to, da so glavne membranske sestavine (lipidi, beljakovine, oligosaharidi) vanjo vsajene (pritrjene) z nekovalentnimi vezmi. Zato membrano lahko razpršijo topila, denaturanti in detergenti, čeprav ti ne razlomijo pravih kemijskih povezav.Zaradi nekovalentnih vezi lahko lipidi in proteini ter oligosaharidi v membrani opravijo določena gibanja- Pravimo, da imajo membrane navidez tekočo strukturo, ter da so lipidi in proteini razporejeni mozaično. Prva sta the fluid mosaic model opisala Singer in Nicholson.

MEMBRANSKA ENOTA (k videzu in nastanku prispevajo predvsem beljakovine)Plazmina membrana – lipidni dvoslojnik je troplas

TEKOČNOST MEMBRANEZasnova tekočnosti membrane upošteva, da se lahko lipidi in proteini gibljejo lateralno oz bočno v lipidnem dvoslojniku oz v ravnini. To dokazujejo z vezavo delcev zlata ali ogljika na membrano, pa tudi z opazovanjem gibanja protiteles, ki se vežejo na celične receptorje.

Limfocit + protitelo za določen membranski AgKopičenje Ag na tistem koncu, kjer sta GA in centrosom. Tu se oblikujejo pinocitotične invaginacije in mešički v katerih je kompleks Ag-PT. Z znižanjem temperature strdimo membrano in zadevo upočasnimo.

Združitev dveh celic z različnimi Ag (površinsko)Z virusom Sendai pospešimo združitev membran mišje in človeške celice. Dobimo heterokariontsko celico z dvema jedroma. Če vsako celico (membrane) označimo z različnim fluorescentnim markerjem (FiTC rhodamine) najprej po združitvi opazimo območje dveh membran, ki pripadata prejšnjima celicama, nato pa se membrani Ag pomešajo do te mere, da jih ne moremo več razlikovati.

FAGOCITOZA IN PINOCITOZA - ENDOCITOZA FAGOCITOZAZunanja plazmina membrana tesno obda delce, ki jih celica sprejme. Te delce v celici opazumo, kot fagosome oz vakuole. Obdani so z membrano. PINOCITOZANa enak način lahko celica sprejema tudi raztopljene makromolekule iz tekočin. EKSOCITOZAJe nasprotna endocitozi. Membransko obdani mešički se pridružijo membrani, ki se na ven razpre.Z endocitozo se velik del zunanje membnrane izdvoji in odda v notranjost celice, kar mora celica uravnati s stalnim dodajanjem drugih membran k zunanji. povratna pinocitoza, eksocitozaNa tam način se povečuje tudi mem brane med celično rastjo. FAGOCITOZAPomemben mehanizem prehranjevanja protozoojev. Pri mnogoceličnih organizmih pa funkcijo obrambe pred prahom, kolodi, tujki, bakterijami prevzame drug obrambni mehanizem. visoko organiziran proces

Razdelitev membrane na pododdelke ni pri vseh celicah enaka, odvisna je predvsem od funkcije celice.Vse evkariontske celice naj bi imele popoln komplet celičnih organel, ki so potrebne za produkcijo energije, razne metabolne procese, za biosintezo in za razgradnjo. Celica lahko razgradi samo sebe – avtofagija, avtoliza ali pa razgrajuje tujke (veliko lizosomov s kislo fosfatazo).Število posameznih organel je zelo različno glede na tip celice (prokariont, jetrna celica, celice pankreasa, črevesna epitelna celica).

- Prokariont: reven, ne vsebuje organel.- Hepatocit: je celica s specializacijo za konstituitivno sekrecijo oz za izločanje. To je bipolarna celica, v

njej so mesta sinteze, transporta sintetiziranih snovi, za izločanje snovi v zunajcelični prostor. Sekrecija pri hepatocitu ni uravnavana. Celica je metabolično aktivna zato ima več organel vzdolž biosintetskih poti. Po drugi strani pa hepatocit sprejema kisik, hrano, kri, zato ima razvito tudi endocitotsko pot za sprejem snovi. Celične organele so razporejene tako, da označujejo biosintezo in endocitozo. GA je prisoten pri apikalni površini in izloča žolč v lumen žolčne kapilare. ER proizvede GA – dokončni oblikuje, izloči.

27

- Epitelna – črevesna celica: predstavlja mejo med zunanjim svetom in notranjostjo ter sprejema hranilne snovi iz črevesja. Ima povečano površino – citoplazemski podaljški mikrovili, ki segajo v lumen črevesja. Takšna mesta na membrani služijo absorpciji snovi v citoplazmo. Ker ima zgolj funkcijo prenosa snovi, ni bogata z ER. Ima ga ravno toliko, kot ga potrebuje, ne pa kot jetra, ki so biosintetsko zelo aktivna.

- Celica pankreasa: pankreas je prislonjen med črevesne gube pri duodenumu in je žleza z notranjim izločanjem. Razdeljen je na zunanji in notranji del.

o Zunanji del: izloča prebavne encime v dvanajstnik. Ti ublažijo kisli želodčni sok. Celica zunanjega dela je polarizirana za izločanje snovi v točno določeno smer. Ima bogat gER, ki izloča encime in veliko GA proti apikalni površini. Sekreti zapustijo pankreas kot sekretna zrnca z encimi, ki se izločajo v lumen žleznega dna.

o Notranji del – endokrini pankreas: tu so langerhansovi otočki, ki izločajo hormone za uravnavanje glukoze.

ODNOS MED CELIČNO STRUKTURO IN NJENO FUNKCIJOOblika in ultrastrukturne lastnosti se med diferenciacijo spremenijo tako, da celici omogočajo opravljanje njene specifične naloge. Že iz ultrastrukturnih lastnosti lahko napovemo, kakšno funkcijo in intenziteto funkcije ima celica.

Polarizirane in nepolarizirane celicePolarizirane celice imajo apikalno površino strukturno ločeno od bazalne oz lateralne. Tesni stiki med celicami preprečijo difuzijo lipidov in proteinov med lateralno in apikalno površino. Polarizacija omogoča usmerjen transport snovi skozi celico – usmerjeno izločanje sekretov v lumen žlez. Pri nepolariziranih celicah plazmalema ni diferencirana v posamezne predele.

A) SEKRECIJSKE CELICESo intenzivno biosintetsko aktivne, zato imajo močno povečan endomembranski sistem (ER, GA) v katerem nastajajo produkti za izločanje (hormoni, encimi, glikoproteini…). Razvit ER kaže na aktivnost v smislu sinteze sekrecijskih produktov. V celici so tudi številna sekretna zrna – po njihovem številu lahko sodimo o konstituitivni sekreciji (takoj po sintezi) ali regulativni sekreciji (kopičenje v citoplazmi in izločanje ob dražljaju).

B) ABSORBCIJSKE CELICESo odgovorne za vnos snovi v organizem. So visokoprizmatične z velikimi ovalnimi jedri. Ker vnos snovi v citosol poteka prek apikalne površine imajo le-to povečano s ščetkastim obrobkom – mikrovili.

C) PREČNO PROGASTE MIŠIČNE CELICESo po obliki vretenaste in nastajajo z združevanjem mioblastov, celica je zato mnogojedrna. Te celice sodelujejo pri gibanju s svojo krčljivostjo, ki pa jo omogoči prepredenost z aktinskimi in miozinskimi filamenti, ki so urejeni v pasove – prečna progavost. Zaradi velike porabe energije na račun ATP so prisotni številni mitohondriji.

D) CELICE VEZIVNEGA TKIVAFibroblasti, adipociti, hondrociti, osteociti, gladke mišične celice.Izločajo večji del zunajceličnega matriksa. Zaradi sinteze kolagena I in II imajo dobro razvit ER. Te celice prilagajajo svojo obliko in tako usmerjajo potek kolagenih vlaken v tkivu. Ko so pritrjeni na podlago so zelo sploščeni, ker pa so fibroblasti diferenciacijsko na nizki stopnji imajo sposbnost, da se pretvorijo v katero koli celico veznega tkiva. Na transformacijo vplivajo hormoni in komponente zunajceličnega matriksa.

5.5. Celične strukture

5.5.1. Endoplazemski retikulumPribližno polovico celotne površine membran v celici zavzema endoplazemski retikulum. Predstavlja neprekinjen labirint prostorov, cistern, ki se nadaljujejo iz zunanje jedrne ovojnice in so omejene z membrano.Glede na prisotnost ribosomov na membrani ločimo:

- gladki ER: aER in- granulirani ER: gER.

28

gER- Sploščene cisterne, zunanjo membrano pokrivajo ribosomi;- Obilo v celicah trebušne slinavke; v celicah z intenzivno metabolno aktivnostjo.- funkcija: sinteza, skladiščenje in regulirano izločanje proteinov. ER je središče reguliranega izločanja

(integralni membranski proteini, topni proteini). Ta pomen je prvič opisan leta 1960. Na območju prehodnih elementov aER se material oblikuje v mešičke, ki se prenesejo v GA.

Na membrani z ribosomi nastanejo proteini, ki se odcepijo od nosilca in se prenašajo po cisternah do nosilca, kjer se lahko odcepijo – področje brez ribosomov. Ustvarijo se brstiči in oddelijo se prenašalni mešički. Izločanje mešičkov je odvisno od funkcije celice.1) sinteza lizosomalnih proteinov2) sinteza sekretov3)sinteza integralnih membran proteinov4) sinteza membranskih lipidov

Proteini, ki nastanejo na vezavnih ribosomih - Ribosomi so s strani citosola pripeti na membrano;- Proteini, ki gradijo membrano – integralni;- Sekreti – izločijo iz celice;- Proteini GA, lizosomov, endosomov, rastlinskih vakuol.

Proteini, ki nastanejo na prostih ribosomih:- izločanje v citosol;- glikolitični encimi;- proteini citoskeleta (aktin, miozin, tubulin…)- periferni proteini notranje površine plazmine membrane; (ovojnice endosomov; spektrini&ankirini –

rahlo vezani);- proteini za jedro;- sestavni deli mitohondrijev, kloroplastov.

Signalna hipoteza (1971)Sekretni proteini vsebujejo posebno signalno sekvenco na n-term na katero se veže SRP – signalna sekvenca sproži signal, da se določen ribosom pripne na ER, kar sproži sintezo polipeptida.

aER- skeletna mišičnina, ledvični tubuli, žlezne, ki proizvajajo steroidne hormone (nadledvična žleza,

leidigove celice v modih, grafovi folikli v jajčnikih);- na membrano od zunaj ne prilegajo ribosomi;- cevkasta organela obdana z membrano;- nepravilna oblika;- različno zavit v celicah;- ločimo: preprost aER, klobučasto urejen aER in sestavljeni aER;- funkcija aER:

o sinteza steroidnih hormonov in lipidov za celično rezervo;o detoksikacija – metabolizem zdravil, strupov;Razgradnja različnih organskih substanc poteka v jetrnih celicah. Membrana aER vsebuje številne encime – oksidaze in citokrom P450S. ti encimi so sposobni oksidirati hidrofobne snovi v hidrofilne, ki se lahko izločijo;o skladiščenje kalcijevih ionov in uravnavanje izločanja;Skeletna mišična celica: V cisterni aER=sarkoplazemski retikulum je uskladiščen kalcij. aER uravnava izločanje kalcija, za to je specifičen celični odgovor, ki se izraža s kontrakcijo gladke mišične celice.o sproščanje glukoze v jetrih;Rezerve glukoze so shranjene v glikogenu v jetrih (1,6`α glikozidna vez). Glikogen je prisoten v obliki zrnc in ko potrebujemo glukozo se vključi encim glukoza 1 fosfataza, ta preide v glukoza 6 fosfatazo, nato pa se iz glikogena lahko sprosti glukoza. GGP odstrani fosfatno skupino, da lahko glukoza preide v kri.o Gm1P GmGP encim – sprosti Gm v jetrih.

PREHOD POLIPEPTIDNE VERIGE V LUMEN ER

29

Ribosome na membrano ER pripenjajo posebni receptorji. Na začetku mRNA, ki se pripne na ribosom na malo podenoto je kodirana signalna sekvenca, zato pri translaciji nastane signalni začetek polipeptidne verige. Tega sestavlja približno 30 aminokislin, več je hidrofobnih. Veriga aminokislin se polžasto zvije (polžasta lasnica) in se zapičiv membrano ER, ter zdrsne v njegovo notranjost. Signalno sekvenco, ki je nujna za vodenje ER odcepi signalna peptidaza (predenj se veriga naredi do konca). Nato se v lumnu ER na protein dodajajo sladkorji.SRP – signal recognition particle je RNA iz cca 300 nukleotidov in 6 različnih proteinskih dodatkov. Ta SRP se pripne na ribosom in zaustavi translacijo in sicer šele, ko je veriga dolga okoli 70 a.k. Pri tej dolžini tudi signalna sekvenca zapusti ribosom. ARP zaustavi le translacijo mRNA, ki nosijo sporočilo za sekrecijo. Ko SRP vzpostavi stik s sidrno beljakovino v membrani ER se translacijski blok prekine.

SRP vodi signalen začetek do membrane ER; SRP kroži okoli membrane in povezuje signalni začetek in SRP in citosola.*receptor – docking protein na ERSRP se veže na signalni peptid takoj ko ta pogleda iz ribosoma. To povzroči pavzo v sintezi proteina, ki da ribosomu dovolj časa, da se veže na membrano ER predenj je sinteza končana in tako zagotovi, da protein ne vdre v citosol – varnost – sekreti lahko vsebujejo KF in hidrolaze, ki bi lizirale celico. Zdaj se kompleks SRP-ribosom veže na docking protein na zunanji strani ER membrane. SRP se zdaj sprosti in proteinski translokacijski aparat v membrani ER prestavi rastočo verigo polipeptida čez membrano. Translacija se nadaljuje do konca, protein se sprosti z release faktorji v času ko je protein translokacije še aktiven. Ta se, ko protein popolnoma vstopi v lumen deaktivira, encim signalne peptidaze na n-terminalnem koncu, peptidaza odcepi signalno frekvenco.

5.5.2. Golgijev aparatS področja prehodnih elementov ER se material, oblikovan v mešičke prenese na cis mrežo GA.GA je iz urejenih kopic disku podobnih struktur – golgijeve cisterne. Je polimorfna struktura, ki jo sestavlja 3-7 gladkih cistern, ki so značilno ukrivljene:

- cis ali nezrelo lice GA;- trans ali zrelo lice GA.

Funkcija: v GA se odvija dozorevanje proteinov. Na osnovno verigo, nastalo v ER, se pripnejo sladkorne skupine.V GA gre torej za glikozilacijo proteinov. V notranjosti se proteini modificirajo, se izločijo na trans mreži in potujejo v razne smeri v celici sinteza glikokaliksa.Potek: Material za obdelavo (iz ER) prispe na cis lice. Po GA se prenaša s pomočjo prenašalnih mešičkov, ki se prenašajo med cisternami. Ko ti mešički dosežejo trans mrežo se proteini (obdelani) sortirajo na različne biosintetske poti na osnovi:

- specifičnega zaporedja AK (signalne sekvence);- fizikalnih/geometrijskih lastnosti;- kombinacije.

Na zrelem licu pride do biogeneze. Tu se ustvarijo sekretorni mešički.

SEKRECIJA – mehanizem nastanka sekreta in njegovega izločanjaSekreti celic so lahko zelo različni: mleko, sluz, solze, hormoni, nevrotransmiterji…V citoplazmi lahko opazimo razvojne oblike mnogih sekretov pa tudi spremembe na organelah, ki pri tem sodelujejo. Sekreti (proteini) nastajajo na polisomih vzdolž ER. Ribosomi se pripnejo na ER s pomočjo SRP na receptor v membrani. Skozi translokatorski protein se nato prestavijo v lumen ER in dokončajo, že med rastjo pa se lahko v ER nanje dodajajo razne sladkorne skupine. Iz ER nato izločki potujejo (v obliki prenašalnih veziklov na cis v GA) proti GA, kjer se snov koncentrira in modificira z raznimi OH.

1) Kondenzacijska vakuola nastane na trans mreži GA, v njej se sekret zgosti. Izbočenje trans mreže GA je osnova za oblikovanje kondenzirajoče vakuole.

2) Nezrelo sekretno zrno nastane z dilatacijo kondenzirajoče vakuole. Pridruževanje raznih mešičkov omogoči nastanek…

3) Zrelega sekretnega zrna/lizosoma. Pri tem se odstranijo komponente, ki omogočajo spajanje mešičkov.

Zrela sekretna zrna se pomikajo na apikalni del celice (npr. epitelij, jetrna celica…), lahko se kopičijo v citoplazmi in čakajo na dražljaj, ki povzroči sprostitev ali pa potujejo proti membrani celice. Vsebino sekretnih zrn obdaja membrana (oddeljena so od GA), ki se ob stiku s celično membrano ob eksocitozi z njo tudi združi.

30

Prenašalni mešičkiSo pomemben element pri poti sekrecije. Na poliribosomih ob ER, ki ga obdaja membrana nastanejo proteini, ki se prenesejo v njegove cisterne, kjer zrnati ER prehaja v gladkega se ti proteini kondenzirajo, nastanejo izboklinice, ki se oddelijo od ER in prenesejo vsebino na cis mrežo GA. So organeli za prenos sekretov z ER na GA.

Združevanje membranOd dela ER, kjer zrnati ER prehaja v gladkega, se oddelijo prenašalni mešički, ki odnejejo s seboj del membrane ER. Ti se združijo z membrano GA na nezrelem licu in se preko novih mešičkov preselijo na zrelo lice GA (združevanje membran v GA). Nato se od GA oddeli kondenzirajoča vakuola, obdana z membrano GA. Ta vsebuje sekretno vsebino, ki potuje do celične membrane, se združi z njo in membrana se odpre tako, da sekreti lahko izstopijo na celično površino po principu eksocitoze. Na GA se membrane pomikajo od cis mreže, kjer so bolj podobne ER do trans mreže, kjer so bolj tipične za GA oz so podobne plazmalemi.

Membrane se zaradi enake sestave lahko združujejo, se ne izgubljajo – sposobnost združevanja in razdruževanja.Membranska organela blizu jedra, obrnjena na stran, v katero celica izloča. Pri živalih je pogosto blizu centrosoma.Sestavljajo ga skupine z membrano obdanih cistern, ki so sploščene (3-7). 1898-GolgiVeč manjših organel (diktiosom) se pojavlja v zelo aktivnih celicah. Večina celic ima GA. lahkos e nahaja na določenem mestu ali povsod po celici. Oblika in stopnja razvoja GA je odvisna od celice same in od faz celičnega metabolizma.

3 membranske sestavine GA KF prikaz1) cisteinske oz saculae (4-8, sploščene, vsebujejo plazmo GA);2) skupki cevčic in mešičkov (premer 60nm);3) večje vakuole (napolnjene z amorfno ali zrnato vsebino).

Cisterne so vzporedne, lahko razmaknjene za 20-30nm. Urejene so v konveksno cis lice in konkavno trans lice. 4-8 cistern.S skladanico GA je povezanih veliko manjših veziklov, ki so pripeti na meji z ER in vzdolž razširjenih robov GA cistern. To so Golgijevi vezikli.

Na poti skozi GA so molekule podvržene številnim kovalentnim modifikacijam. Vstop na nezrelem licu, izstop na zrelem licu. Lici sta povezani s posebnimi pododdelki, ki sestojijo iz mreže povezanih cevčic in cistern. Cis mreža – vmesni pododdelek – trans mreža.

V mrežah cis in trans se proteini sortirajo. Proteini, ki vstopijo v cis mrežo.- potujejo najprej po GA; znotraj GA se določijo, uredijo za katere vrste organel so potrebni (lizosomi, sekretna zrna, celična membrana…)- vračajo de ER; regionalno razliko med cis in trans pokažemo z osmijevim tetraoksidom (cis) in tiamin pirofosftazo (trans).

Razvit GA imajo predvsem celice sekrecije:- vrčaste v črevesnem epiteliju. Te celice izločajo mukus(?) bogat s polisaharidi iz GA;- ogromni vezikli na trans licu pri elektromagnetnem mikroskopiranju.

Sinteza glikoproteinovV Golgijevem aparatu se proteinska osnova glikozilira. Dobi ogljikohidratni dodatek, torej gre za sintezo glikoproteinov.

Selektivno razvrščanjeProteini iz ER so zelo raznovrstni in se šele v trans mreži GA razvrstijo, kar temelji na specifičnih signalih iz primarne strukture beljakovin.

Biosinteza membranJe hitra, membrane se stalno obnavljajo. Večina membranskih proteinov se vstavi v lipide že znotraj ER in se nato dodajajo na verige ogljikovih hidratov. Znotraj GA nastanejo membranski vezikli z glikozilirano površino na notranji strani mešička.Del membrane mešičkov postane sestavni del membrane. Tako se membrana obnavlja. Zaradi transporta ne pride do pomanjkanja membrane.

31

GA tvorba semenčiceGA ima pomembno vlogo pri tvorbi spermija. Iz GA se oblikuje akrosomalna kapa oz akrosom.Akrosom vsebuje encime – hialuronidaza, ki dajo spermiju sposobnost, da pride v jajčece. Z encimi raztopi zono pellucido – proces kapacitacije (sposobnost, da spermij pride v jajčece).

5.5.3. LizosomiOkroglaste organele, ki vsebujejo encime (tudi prebavne) s sposobnostjo razkroja propadlih interceličnih organel, ki jih celica sama razgradi = avtofagija – samožrtje. Lizosomalni encimi lahko sodelujejo pri celični prebavi, razgrajujejo makromolekule in druge delce, ki v celico pridejo z endocitozo. Te delce endosom prenese v lizosom.

Lizosom je celična organela, ki nastane iz GA. Prepoznamo ga po značilni kroglasti obliki.Ločimo primarne, sekundarne lizosome, avtofagosome in residualna telesa.Lizosom je obdan z membrano in vsebuje številne hidrolitične encime za kontrolo celične razgradnje makromolekul.Lizosom meri 0,2-0,8µm.

Hidrolitični encimiPoznamo preko 40 vrst hidrolitičnih encimov. Kisle hidrolaze – pH 5 je potreben za njihovo delovanje (tak je v lizosomih).

- proteaze; dokaz lizosoma je + KF- glukozidaze;- fosfataze;- sulfataze;- lipaze;- fosfolipaze.

Citosol je pred delovanjem encimov dvojno zavarovan:- membrana lizosoma loči encime od citoplazme – citosola;- pH citosola =7,2, zato ob poškodbi membrane encimi ne oz zelo slabo delujejo.

Raznovrstnost lizosomov1) Primarni lizosom vsebuje lizosomalne encime – hidrolaze, ki se vanj vgradijo po procesu na trans licu GA;2) Sekundarni lizosom – digestivna vakuola – heterolizosom;Z endocitozo v celico vstopi tujek (endosom), celica skuša tujek odstraniti z lizosomov – fagosom, heterofagosom. Z endocitozo (pinocitoza) lahko vstopi tudi tekoči material za razgradnjo.3) Rezidualno telo – po razgradnji lahko ostanejo določene strukture, ki so omejene z membrano. Stopnja razgradnje je odvisna od količine in razgradnje fagocitiranega materiala ter od aktivnosti hidrolaz v lizosomu. V lizosomu je lahko premalo specifičnega encima za razgradnjo fagocitiranega telesa. Zaradi kopičenja nerazgrajenega materiala lahko pride do metaboličnih motenj celice.Pri popolni razgradnji celice se razgradi tudi celica sama – avtoliza.4) Avtofagična vakuola – avtofagosom; je primarni lizosom združen z določenim delom ali s celotnim celičnim organelom iz citoplazme – avtofagija.

Lizosom avtofagira kos celice patološko ali fiziološko. Razgradnja organel, ki so nepotrebne ali jih celica ne rabi več.

Edinstvena lizosomalna membrana vsebuje transportne proteine, ki končnim produktom prebave – digestije makromolekul (AK, sladkorji, nukleotidi) omogočijo prehod v citosol. Nato se lahko iz celice izločijo ali pa jih celica reciklira – ponovno uporabi. Večina transmembranskih proteinov je glikoziliranih, kar je še dodatno varovalo pred delovanjem kislih encimov v lizosomu.

5.5.4. Peroksisom - microbodyJajčasta organela z enojno membrano. Vsebuje jedro, zrnato snov, ki je večinoma zgoščena v skupek ekscentrično. Lahko vsebuje kristalni vložek – kristaloid oz nukleoid, pri živalih, ki imajo urikazo.Celica lahko vsebuje več peroksisomov kot lizosomov. Jetra podgan: 70-100prs, 10-20l

32

Peroksisom nastane kot dilatacija ER. Oblikuje se mešiček, organela z membrano. Življenjska doba peroksisoma je 4-5 dni, propade po principu avtofagije.Peroksisom vsebuje encime za metabolizem vodikovega peroksida in sicer:

- uratoksidaza, deaminoksidaza in peroksida za sineto vod. Peroksida;- katalaza – razgradnja vod. Peroksida (zaščitna vloga)

*Liposom - mehurčki z lipidno vsebino;*Glikoksisom – rezervne meščobe. V njih potečejo procesi intermediarnega metabolizma.*Mehurčki peroksisomov – razna vsebina.

5.5.5. MitohondrijiMitos – nit; chondrion – zrnoNahaja se v citoplazmi vseh evkariontskih celic ter tudi v nekaterih prokariontih.Vidni so s svetlobno mikroskopijo: zrnate strukture okoli jedra – zrnata vsebina citoplazme, posebno očiten pri nevronu.Odkrit je bil konec 19. stoletja.

Funkcija:Mitohondriji so prenašalci energije iz hrane, ki jo dobijo iz Krebsovega ciklusa, sodelujejo v respiratorni verigi, s fosforilacijo pretvarjajo energijo iz hrane v visoko energetske vezi molekule ATP. Pomembno vlogo pa imajo tudi pri osmoregulaciji.Mitohondrij tvori energijo za številne naloge v celici. Za svoje delovanje rabi energijo (kisik, OH, lipidi). Proizvede pa ATP za kontrakcijo mišic (gibljivost), biosintezo v celici, aktivni transport, prenos impulzov, za bioluminiscenco-izžarevanje svetlobe.

Pod elektronskim mikroskopom je vidna vzdložna molekula z dvojno membrano, mitohondrialni matriks in cristae mitochondriales (kriste), ki jih oblikuje notranja membrana.

Mitohondrij je zelo občutljiv na zunanje vplive. Pri preparatu se kmalu pojavijo post-mortalne spremembe ob prenehanju dovajanja kisika. Zato mora biti fiksacija takojšnja, saj želimo stabilizirati tudi lipoproteidno membrano mitohondrija.

- za elektronski mikroskop: obarvanje z osmijevim tetraoksidom;- za svetlobni mikroskop: Fe-hematoksilin – črno ali kisli fuksin – rahlo rožnato.

Oblika:Večina mitohondrijev je valjastih, v prečnem prerezu je lahko tudi trikoten ali kroglast. Dolžina pa je različna, nekaj µm, premer pa je 0,5µm.Število mitohondrijev v celicah se razlikuje glede na aktivnost celice – povezano s porabo energije. Veliko mitohondrijev vsebujejo mišične celice za krčenje, živčne, žlezne celice (biosinteza), embrionalne celice. Hepatocit: 1000-1600MH: 30-50% celotne beljakovinske sestave.

Zgradba:Značilna je dvojna membrana. Obe membrani nosita značilnosti membranskih enot oz. plazmine membrane:

- zunanja: 6nm, obdaja citoplazemsko stran;- notranja: 6nm;

o od zunanje membrane jo loči 6-8nm širok vmesni prostor;o navznoter oblikuje cristae mitchohondiales (gremeni, vzviški, sacule); te kriste so lahko

vzdolžne ali prečne; lahko so cevkaste; (prečne: leidigove celice, moške spolne celice, c. žlez z notranjim izločanjem, jajčnik).

Dva prostora, ki ju dobimo z membranama:- zunanji – medmemranski;- notranji – izpolnjuje ga mitohondrialni matriks, omejen z notranjo membrano.

Mitohondialni matriks:- praviloma homogen, enakomerno elektronsko gost;- lahko vsebuje določene delce/posamezna zrnca:

o ribosomi: manjši od prokariontskih;o partikli F1: gosta zrnca ob kristah;

elementarni delci, razmaknjeni za 10nm;

33

mesto encima adenozin trifosfataze; ostala zrnca so mesto vezave bivalentnih kationov (magnezij, kalcij…) proteinski delci, pigmenti z vsebnostjo Fe

Naloga:1)Biološka oksidacija: Sproščena energija se lahko porabi za sintezo ATP.2)Krebsov ciklus:V mitohondrialnem matriksu.3)Transport elektronovZ encimi dihalne verige na notranji membrani.4)Oksidacijsko fosforiliranje

Mitohondriji imajo lastno DNA, ki je kot pri prokariontih krožna molekula. Poleg tega vsebujejo vse vrste RNA in ribosome, kar nam da vedeti, da so vključeni v proteinsko sintezo. Zaradi vsebnosti DNA in RNA pravimo, da so mitohondriji polavtonomne organele.

Nastanek mitohondrijev:Simbiontska hipoteza: mitohondrij naj bi v celico prišli z vključevanjem po principu endocitoze. Celica, ki ni obvladala aerobnega metabolizma, se je odločila obdržati mitohondrije ker ima od tega korist. simbioza

Sarkosomi:So orjaški mitohondriji v skeletnih mišičnih celicah, ki so izjemno občutljivi na osmotske razmere, razne toksine in na pomanjkanje ATP.

Pri motnjah iz okolja lahko mitohondrij spremeni obliko, lahko se poškoduje notranja membrana, kriste se fragmentirajo, v končni fazi pa se lahko fragmentira tudi mitohondrij dam. Če mitohondrij ni preveč poškodovan, ga celica razgradi po principu avtofagije z lizosomom.

Membrani mitohondrija:Razlikujeta se po organizaciji, kemijski sestavi, funkciji in prepustnosti. Zunanja membrana je zelo prepustna, motranja pa je selektivno prepustna (prepusti le določene substrate: citrat, izocitrat, maltat in piruvat).Mg2+ in PO4

3- prehajajo z aktivnim membranskim transportom. Klorovih ionov membrana ne prepušča.

Chondrioplasma – notranja plasma, MH matriks vsebuje encime krebsovega ciklusa. Celica pridobiva energijo v anaerobni fazi v citoplazmi. Aerobna faza poteče zunaj mitohondrija.

5.5.6. CitoskeletCelici daje obliko, da se ne sesuje sama vase. Gre za mrežje nitk – filamentov in cevčic znotraj citoplazme, ki celici nudi ogrodje; zato citoskelet.Ločimo mikrofilamente, mikrotubule in intermediarne filamente.

a) Milrofilamenti So vlakna, premera cca 6-7nm, na periferiji citoplazme. Učinkujejo na celično površino.*Funkcija:- sodelujejo pri celični kontrakciji;- sodelujejo pri celični delitvi;- sodelujejo pri sekreciji;- pri prehajanju citoplazme v sol-gel-sol stanja.

Osnovni element mikrofilamentov je F-aktin (beljakovina) aktinski filamentiNa strukturo in specifično zgradbo aktinskih filamentov vplivajo mnogi drugi proteini: miozin, tropomiozin, α-aktin.

*MIOFIBRILEMiofibrile oz vlakna mišične celice, ki imajo specifičen ER oz sarkoplazemski retukulum. Ta vsebuje kalcijeve ione in jih regulirano izloča. Jedra mipfibril so pomaknjena na periferijo.

*ANIZOTROPIJA

34

Pasovi – prečne proge na skeletnih mišičnih celicah so posledica razporeditve mikrofilamentov v enoti krčenja – sarkomeri. Nahajajo se ob koncih sarkomere.Aktinske niti se vzpenjajo na Z-linijo. Med aktinske niti se vpenjajo debelejše miozinske. Anizotropini – svetlejši pas – samo aktinske Izotropni pas – temnejši – aktinske + miozinske H-linija – samo miozin M-linija – aktin + miozin

*SARKOMERAJe funkcionalna enota skeletne mišične celice in srčne mišične celice med dvema Z-linijama, ki vsebujeta dezmin.Krči se tako, da aktinske niti drsijo ob miozinskih. Celica se skrči za širino H-linije, to je tiste, ki vsebuje le miozin. Za krčenje so potrebni kalcijevi ioni, ki se sprostijo iz sarkoplazemskega retikuluma. Impulz se s sinapse (motorična ploščica) prenese na prečne tubule sarkoplazemskega retikuluma, na preostali SR, sprostijo se kalcijevi ioni, ki sprožijo zdrs aktinskih filamentov ob miozinske. V skeletnih mišičnih celicah tropomiozin omogoči preskok glave miozinskih niti po aktinski niti.

*GLADKA MIŠIČNA CELICAVlakna v njej so drugače razporejena, nitke se vpenjajo v α-aktinske pege, prisotni so tudi intermediarni filamenti, ki se iz pege širijo ob plazmalemi.Pego sestavlja dezmin. Ko se aktinsko-miozinski filamenti skrčijo se skrčijo tudi intermediarni filamenti, ki so vpeti v celično steno. Celica se skrči po širini. Miofilamenti so razporejeni znotraj citoplazme.Aktinsko mizonski filamenti se v raztopini lahko vežejo v aktiomiozin. Ta se krči le ob prisotnosti ATP. Enako se dogaja v srčni mišični celici.

*SRČNA MIŠICAInterkalarni diski povezujejo celice, da se krčenje lahko prenese na ostale celice.

*FUNKCIJA AKTINSKIH FILAMENTOV- Krčenje mišic v sodelovanju z miozinom;- gibanje celic neodvisno od miozina;- tvorba aktinskega obročka, ki povzroči celično brazdo;- uravnavanje transporta ionov.

*RAZPOREDITEV- 2D v citoplazmi – celica je 3D;- cortex tik pod membrano;- mikrovili.

b) Mikrotubuli Ležijo prosto v citoplazmi evkarionta. Poznamo stalne oblike (biček, centriol, migetalka, bazalno telo) ter prehodne oblike (delitveno vreteno in aster).Predstavljajo:

- mesto intraceličnega transporta – tipično pri prenosu impulzov v živčni celici s pomočjo proteinov po aksonu;

- pomembni pri delitvi na dve hčerinski celici – tvorba delitvenega vretena pri mitozi;- gibanje celic – spermij biček;- vzdrževanje oblike celic;- urejajo razporeditev organel v citoplazmi – polarnost celica;- potovanje mešičkov vzdolž mikrotubulov.

Mikrotubuli imajo dinamično strukturo, stalno se jim spreminja dolžina, imajo + in – konec:- tubulin (α in β tubulin);- α in β tubulin polimerizirata, ustvarita protofilament- 11-13 protofilamentov tvori cevko, tvorba cevke MAP-µT pridruženi proteini.Ker je iz dveh enot tubulina – heterodimer.+ dimeri se dodajajo (rast), - dimeri tubulina pa se odcepljajo (krajšanje).

*FUNKCIJA:- sodelujejo v mitozi – delitveno vreteno, aster (ločevanje kromosomov);

35

- vzdržujejo polarnost;- potovanje veziklov s + na -.

*CENTRIOL vs MIGETALKACentriol se nahaja v citoplazmi, migetalka pa na celični površini (apikalno), pokrita z membrano.Migetalka: bazalno telo 9*3, aksonema 9*2+2.Centriol: 9*3.Iz bazalnega telesa zrastejo bički, migetalke, µT z rastjo porivajo plazmino membrano navgor.Mikrovili – stržen niti, obdan z membrano, pokrit z glikokaliksom.

Zgradba stene centriola:Centriol – cilindrično telo mikrotubulov, ki leži približno v sredušču celice.Diplosom, centrosom – centriola, ki ležita približno v celičnem središču in sta pravokotna drug na drugega.Osnova centriola:- tripleti mikrotubulov pod kotom 40°drug na drugega;- 9*3 v periferiji;- Cevčice tripleta A (notranja) je popolna in ima 13 protofilamentov, B (sredinska) in C (zunanja) pa sta

nepopolni in imata po 10 protofilamentov.Centriol je osnova za oblikovanje bička in migetalke.

Migetalke:Značilne so za celice respiratorne sluznice. Nastanek:Centrioli se namnožijo in razporedijo okoli celične membrane oz tik pod njo. Bazalna telesaTa bazalna telesa so zgrajena kot stena centriola iz 9 perifernih tripletov mikrotubulov.V apikalnem delu se ogrodje spremeni, nastane aksonema migetalke. Zunanja C-cevka izgine, pojavita se 2 središčna mikrotubula, 9*2+2. Bazalno telo oddaja rebratse korenine v citoplazmo.

Mikrovili:So specializacija apikalne celične površine, prstasti izrastki, ki povečujejo apikalno površino. Značilni so za celice črevesnega epitelija in proksimalno ledvično cevko – absorbcijska površina.Pokriva jih celična membrana, oporo pa jim nudi stržen 25-30 aktinskih niti, ki so povezane s proteinoma vilinom in fimbrinom. Strežn v celico pritrjueje miozin.Okoli stržena je »puhasta obloga« glikokaliks.Stereociliji so modificirani mikrovili, zreducirano število aktinskih niti, ki so daljše – nadmodkov kanal – semenovod. Biček spermija:

Spermij = glava + biček

GLAVA:Jedro pokrito s celično membrano, ki jo obdaja akrosomalna kapa z encimi, ki razgradijo cono pellucido in omogočijo vstop v jajčece.Na glavi lahko prepoznamo širši apikalni segment, ekvatorialni segment, postakrosomalno regijo in zadnji prstan.

FLAGELOGENEZA:Pri tem sodeluje par centriolov:

- Proksimalni centriol oblikuje zasnovo kapitulum, ki oblikuje sklep z implatacijsko jamo, prečno progasti stebrič, ki nastane ob straneh v vratnem delu in centriolarni adjunkt, ki je 2-3x daljši od centriola. Ta v dokončnem spermiju ni več prisoten.

- Distalni centriol oblikuje aksonemo bička.

BIČEK:- vrat – capitulum, prečno progasti stebrič, proximalni centriol.- Aksonema – osni cilinder:

o Srednji del: devet dupletov mikrotubulov obdaja dva središčna. Okoli je razporejenih 9 vlaken; 1., 5. in 6. so debelejša. Vlakna pokriva mitohondrialni plašč, ki daje energijo za gibanje proti toku v jajcevodu.

o Končni prstan

36

o Glavni sli osnovni del: 9 dupletov mikrotubulov obdaja središčni cevki. Okoli so razporejena vlakna, vendar 3. in 8. manjkata. Namesto njiju sta prisotna stebra fibrozne nožnice, ki povezujeta rebra fibrozne nožnice. Fibrozna nožnica pa nadomesti mitohondrialni plačš.

o Končni del: 9 dupletov mikrotubulov, ki so okoli dveh središčnih.Ves biček obdaja membrana.

c) Intermediarni filamenti Skupaj z mikrotubuli in mikrofilamenti tvorijo citoskelet. Oblikujejo mrežo v celivi, ki ima elastično strukturo (elastičnost dajejo IMF)Ne sodelujejo neposredno pri celičnem gibanju, dajejo pa mehansko trdnost in elastičnost. Med vsemi elementi citoskeleta so najbolj stabilni, njihov premer pa je 10nm.Poleg tega, da sodelujejo pri oblikovanju celične strukture, blažijo tudi mehanske pritiske na celico ali tkivo iz celic.IMF so tkivno specifični, določen tip se nahaja le v določenem tipu celic.

Glede na proteinsko sestavo ločimo 6 tipov intermediarnih filamentov:1)tip 1 in 2 – kreatini: - bazični ali nevtralni.Tip 1 – kisli, tip 2

- V celicah, ki pokrivajo površine – epiteliji in njihovi derivati – rožene tvorbe: lasje, dlake, nohti, rogovi, kopito...

- Vsak tip epitelijskih celic sintetizira vsaj en tip 1 ali 2, ki polimerizira in ustvari vlakno.- Trdi keratin – tisti, ki tvorijo derivate;- Mehki keratin – odvisni od lege epitelija, diferenciacije, količina se izraža glede na vrsto epitelija.

Poznamo več kot 20 tipov keratinov.- Trnasta celica: ena plast večskladnega ploščatega epitelija;

o Citoplazemski podaljški stikajo celice;o Stičnica – desmosom – plazmini membrani se združita, struktura je 6-lamelarna.

- Desmosom je stični kompleks med epitelijskimi celicami, proti apikalni površini je pred njim tesna stičnica (ZO), ki ima 5-lamelarno zgradbo.

- Keratinski IMF učvrstijo medcelični kontakt, po prostih kanalih pa je prisotno nekaj tkivne vlage.

2)tip 3 – vimentin:Celice mezenhimskega izvora – mezenhim je razvojna oblika veziv v embrionalnem tkivu. Razvije se iz srednjega kličnega lista – mezoderma in je osnova vseh veziv – rahlega, vlaknatega, krvi, tolšče, kosti, hrustanca…Celice, ki vsebujejo vimentinske IMF:

- fibroblast;- levkociti (granularni eozinofilci, bozofilcu, agranularni monocit);- gladke mišične celice.

Vimentinski IMF se raztezajo od zunanje površine jedra proti periferiji.

DESMIN – vimentinu podoben proteinGladke mišične celice – α-aktinske pegeV te pege se uprejo aktinski (miozinski) filamenti, odgovorni za krčenje ter prečno vpeti IMF. Dezmin tvori tudi z linijo sarkomere s katero se pripne aktinski filament.- periferin v nevronu;- proteini izraženi v glia celicah živčnega tkiva.*glia celice – podporne celice živčnega tkiva*nevron – funkcionalna enota živčnega tkivaKisli glia proteini:*Astrociti (oporne CŽS – MM, VM, H)*Schwannove celice (periferni živčni sistem; gangliji, živci). = glial fibrillary acidic proteins – glikoproteini

3)tip 4 – nevronski IMFSo proteini v nevrofilamentih – podaljški nevrona. V večini motoričnih nevronov so nevrofilamenti light, medium ali heavy.(akson=nevrit; dendrit=citoplazemski podaljšek)

37

Pri motoričnih nevronih je lahko akson dolg tudi več metrov.Nevrofilamenti vzdržujejo obliko in omogočijo prenos dražljajev.

4)tip 5 – jedrni lamini – nuclear lamins (tipi A, B, C)Gradijo jedrno ovojnico pod katero so vlakna iz laminov A, B in C = lamina fibrosa). Raztezajo se iz periferije v notranjost jedra. So sestavni del skeleta jedra.

5)tip 6 – nestinV embrionalnem razvoju se izrazi pri oblikovanju nevrona. Samo v embrionalnih matičnih celicah za nevrone CŽS. Nato se ne izraža več.

Elementi citoskeleta lahko sodelujejo pri gibanju celice1. Citoplazemsko strujanje – cikloza

Ko je celica na svojem mestu se oblika ne spreminja.

2. Ameboidno gibanjeCelica pošilja podaljške – psevdopodiji – s pomočjo katerih se lahko premika. (eritrociti in levkociti skozi steno kapilare; ameba).

3. Ciliarno in flagelarno gibanjeCelica ima lahko posebne organele, ki omogočajo dve vrsti gibanja. Lahko pa ima specifične fibrile, ki ji omogočajo mišično gibanje.Flagela=biček (flagelum)Cillium=migetalka (cillia-mn.)Bičke imajo protozooji, spermij pa ima le enega.Migetalke so številne, tvorijo migetalčno površino:

- praživali;- epitelijev (respriratorni, genitalni trakt višjih živali – jajcevod in nadmodek). V teh organih se migetalke

prosto gibljejo ter tako ustvarijo utripanje migetalk, ki omogoča transport materialov v določeno smer.o Jajcevod: migetalke pomikajo jajčece po jajcevodu in otežkočajo dostop spermiju;o Nadmodek: spermije potisnejo v nadmodek, kjer se jim oblikuje biček, s katerim lahko

plavajo.o Dihala: z gibanjem migetalke odstranijo prašne delce, da ne morejo priti v pljuča in tam

povzročiti infekcije.o Vrčaste celice: migetalke usmerjajo sluz na površini epitelija. Če je sluzi preveč se migetalke

sesedejo. Mikrobi lahko pridejo v pluča in povzročijo bronhitis ali pljučnico. Kašelj je posledica vdora delcev v pljuča.

Gibanje migetalk je posledica metakroničnih kontrakcij migetalk. Migetalke so usmerjene v smeri vačlovanja in utripajo v smeri ena za drugo v določenem časovnem presledku.Izokronično delovanje: migetalke utripajo v ravnini, pravokotno na smer valovanja.

5.5.7. RibosomJe najmanjša celična organela in meri do 30nm, kar pa je pri prokariontih in evkariontih različno. Sestavljen je iz dveh podenot, velike in male, ki se lahko razdružita. Ti podenoti imata različno maso, obliko, velikost in kemijsko zgradbo. Večja je kroglasta, mala pa krožničasta.V nedejavnem stanju sta podenoti ločeni. Združita se pri prevajanju mRNA v protein. Lahko je več ribosomov povezanih v isto mRNA, nastane struktura, podobna ogrlici – polisom.Ribosomi so lahko vezani na membrano ER, lahko pa so prosti v citoplazmi.Fiziološko aktivne celice imajo bogato razvite ribosome in polisome ter obilen gER. Posebno nediferencirane, mlade celice imajo v citoplazmi veliko polisomov.

Ribosom sestavlja rRNA in protein.- Prokarionti: 2800000 daltonov

70s (mala 30s – 16s RNA + 21proteinov) – 1,6*106 Da (velika 50s – 23s rRNA + 55rRNA+34 proteinov) – 1,8*106 Da

- Evkarionti: 4,5*106 Da80s

38

Mala 40s – 1,5*106 Da (18s rRNA, 30 prot.)Velika 60s – 3*106 Da (28s+8s+55rRNA+45 prot.)

Ribosom je mesto sinteze proteinov.Pomika se vzdolž matrice mRNA, dešifrira kod za pretvorbo nukleotidnega zaporedja v polipeptid oz v AK zaporedje.Do matrice prineso aminokisline molekule tRNA, pri tem so jim v pomoč posebni adapterski proteini, iniciacijski faktor in elongacijski faktor Tu.Nekateri adapterski proteini elongacijski faktor G katalizirajo nastanek peptidne vezi na nastajajočem proteinu.Med sintezo sta podenoti združeni, med njima je matrica mRNA, ki je pripeta na rRNA na mali podenoti. Vzdolž mRNA se pomikajo ribosomi.Mitohondriji imajo sboj krožni kromosom, svojo DNA na podlagi katere se prepiše mRNA in se ustvarijo proteini. Imajo tudi svoje ribosome, ki pa so manjši od prokariontskih.

tRNASodeluje v sintezi beeljakovin. Njen 3 bazni kod je komplementaren kodu na mRNA in določa, katera AK se lahko pripne nanjo. Imamo približno 60 različnih tRNA, kod je degeneriran, saj lahko več različnih tRNA kodira isto AK. AK se po aktivaciji pripne na tRNA.

rRNASodeluje v sintezi beljakovin in je sestavna enota ribosoma. mRNA se med drugim s svojim shine-dalgarno zaporedjem veže na komplementarno na mali podenoti ribosoma.

mRNAJe prepisana z dvojne vijačnice DNA in je matrica za sintezo proteina. Je nosilka informacij za sintezo.

5.6. Biološke membrane* Funkcija:- razmejujejo prostor celice in zunajcelični prostor;- omejujejo pododdelke znotraj celice;- uravnavajo prehod snovi v/iz celice;- zagotavljajo konstantno notranje okolje v celici, ga ohranjajo in omogočajo komunikacijo celice z okoljem.

* Osnovno ogrodje je lipidni dvosloj, ki je nepretrgana biomolekularna plast iz 4 vrst asimetrilno razporejenih fosfolipidov, glikolipidov in holesterola. Fosfolipidni sloj oblikuje stabilno pregrado med dvema vodnima oddelkoma ter predstavlja bazično strukturo vseh bioloških membran.Lipidi naj bi predstavljali 50% celotne mase membrane, kar pa je lahko različno, glede na vrsto organela oz celice.

Plazmina zunanja: 50% lipidov + 50% proteinovPlazmina MH: 25% lipidov + 75% proteinov

Podaljški nevronov so obdani s sfingomielinom. V membrani ne varira le količina lipdov, pač pa tudi fosfolipidov in količina holesterola ter glikolipidov, ki so glavni v živčni celici.

Fosfolipidi:- fosfatidil holin;- fosfatidil etanolamin; (e. coli 80%)- sfingomielin;- fosfatidil serin.

* Osnovni matriks – lipidni dvoslojnikVanj so vložene proteinske molekule, ki so asimetrično oz mozaično razporejene in nekovalentno vezane. Ti integralni proteini, ki so amfipatični so v direktnem kontaktu z alifatskimi hidrofobnimi repi lipidov.

- transmembranski proteini, vgrajeni le z lipidnim delom.

Na citoplazemsko stran lipidnega dvosloja: periferni proteini niso vstavljeni v hidrofobno notranjost. Z ionskimi vezmi se povezujejo z integralnimi proteini.

* Glikokaliks – živalska celica

39

Na lipidne in proteinske molekule se z zunanje površine embrane lahko vežejo razlčni ogljikovi hidrati: heksoze, sialna kislina, fukoza, heksozamini. To plast, ki je značilna pri živalski celici (npr tak je enterocit) imenujemo glikokaliks.Glikokaliks vsebuje molekule za specifično prepoznavanje: glikolipidi in glikoproteidi bi lahko bili emsta po katerih se celice prepoznajo med seboj. To lahko povzroči kontaktno inhibicijo. Lastnost molekularnega razpoznavanja je odvisna od genov in genskih informacij, ki se nahajajo v celičnem jedru.Tako membrani eritrocita in limfocita vsebujeta različne antigene. Od teh antigenov je odvisna histokompatibilnost, ki pogojuje razpoznavanje celic lastenga organizma in zavračanje celic tujka, ki se želi pridružiti. Na tem temelji celična imunost. Na molekularnem razpoznavanju temelji prepoznavanje tujkov in sebi lastnih snovi.

Glikokaliks se nahaja apikalno kot pokrivalo in je še posebno stabilen v enterocitu. Ni ga možno ločiti od mikrovilov. Histokemijsko ga prikažemo z reakcijo na AF v glikokaliksu in na površini mikrovilov.

V glikokaliksu so prisotni tudi encimi, ki delujejo na razgradnjo OH in beljakovin – absorpcija v prebavilih.

Glikokaliks najdemo tudi v ledvicah – ledvični glomerul oz zvita kapilara: za filtracijo krvne plazme. Okoli ledvičnih glomerul deluje glikokaliks kot filter za urejanje prehoda molekul predvsem na osnovi velikosti – velike molekule ostanejo zunaj. Filtrat potuje v ledvično cevko, na osnovi natijeve-kalijeve črpalke se oblikuje primarni seč.

* The fluid mosaic model – fluidni mozaični model oz singer nicholsonov modelMembrana je dinamična, delno tekoča enota, molekule, ki jo gradijo se lahko premikajo v lateralni smeri – bočno premikanje = tekočnost celične membrane. To je bilo dokazano na več načinov:

1. Gibanje protiteles, ki se vežejo na celične receptorje;2. pojav združitve celic z različnimi antigeni.

Molekule se ne morejo gibati v vertikalni smeri.Koncept fluidnega mozaičnega modela temelji na spoznanju, da so glavne membranske sestavine vanjo pritrjene z nekovalentnimi vezmi. Zato membrane razpršijo topila/denaturanti/detergenti, ki sicer ne razlomijo pravih kemijskih vezi.Notranji proteini, lipidi, oligosaharidi, glukoproteidi so amfipatične molekule, ker imajo tako hidrofilne kot fidrofobne repe oz skupine.

Pasivni prehod: zaradi razlike med nabojem v in iz celice je ustvarjen električni potencial, ki je vedno negativen. Difuzija ionov je odvisna od njohove koncentracije in el. potenciala.

Po fluid mosaic modelu so lipidi ter integralni proteini razporejeni asimetrično. Biološke membrane pa so navidez tekoče, lipidi in integralni proteini v njih so sposobni opraviti določena gibanja.

* Plazmalema (10nm)* Notranje membrane (6-7nm)V plazmalemi so kanalčki z integralnimi proteini, ki omogočajo prehod ionov in drugih molekul v celico. Poleg tega imajo lahko vlogo receptorjev, encimov, določajo pa tudi antigene celične površine.

* Endocitoza=Posebna lastnost plazmaleme.Ob stiku s snovmi, za katere celica nosi receptorje, se membrana izviha ali uviha. Celica sprejme snov, ki jo obda membrana in jo nato spusti v notranjost kot endosom. Za to so pomembni posebni proteini. Fagocitoza: celica okoli trdega delca ustvari posebne citoplazemske podaljške – psevdopodije. Pinocitoza: tekoče snovi, membrana se izviha. Mikropinocitoza: membrana se uviha.Z endocitozo celica izgublja svojo površino. Del te površine se reciklira z eksocitozo. Za membrane je značilno, da se stalno obnavljajo. Obnova poteka iz membran celičnih organel, ki se same nadomestijo in sodelujejo pri obnovi plazmine membrane. (ER, GA, sekretna zrna).

* Pasivni prehod – difuzija in osmoza Pasivna prepustnost plazmalemeV citoplazmi je več proteinov kot v medceličnem prostoru. Znotraj je velika koncentracija kalijevih, zunaj pa natrijevih ionov. Koncentracije in napetostne razlike so razlog za elektrokemijske gradiente skozi plazmalemo.

40

5.6.1. Pasivni membranski transport- hidrofobni sloj plazmaleme;Zaradi manjših premikov med alifatskimi repi lipidov lahkoskozi membrano potujejo dušik kisik, voda in vitamin A, lipidne snovi in manjše polarne in nepolarne molekule.Topnost v lipidih in hitrost prehoda sta sorazmerni. Na eni strani se snovi v njej raztapljajo, na drugi strani plazmaleme pa prehajajo nazaj v vodno okolje – razlika v koncentracijskem gradientu.

- hidrofilne pore in ionski kanali;Ionski kanalčki omogočajo prehod manjši polarni snovi. Kalijev ion ima majhen hidratacijski ovoj (manjši od natrija) zato tudi 100x hitrejšo difundira od natrija. Ioni ne smejo neovirnao difundirati skozi kanale, ker se ne sme izenačiti koncentracija na obeh straneh.

- olajšana difuzija s prenašalci;Katalitična difuzija omogoči sorazmerno hiter prehod sladkorjev, aminokislin in glicerola.Permeazni sistemi so genetsko opredeljeni in vključujejo različne specifične membranske proteine, ki zagotavljajo katalitično difuzijo sladkorjev, aminokislin in nukleotidov skozi membrano. Podobno kot encimi, povečajo hitrost prehoda, ampak s to razliko, da transport poteka v smeri koncentracijskega gradienta.

- osmoza;Polprepustne membrane omogočajo prehod topila oz. vode z nižje koncentracije topljenca tja, kjer je koncentracija topljenca višja. Če dosežemo isto koncentracijo na obeh straneh dobimo izotonično raztopino.Celica, ki jo damo v hipotoničen medij nabrekne in nenazadnje poči, v hipertonične mediju pa dehidrira.

5.6.2. Aktivni membranski transportMolekule potujejo v smeri proti koncentracijskemu gradientu, za kar je potrebna energija na račun ATP, ki se pridobi v celičnem dihanju.Prehod snovi skozi membrano je odvisen od encimov, ATP-az (kalcijevi, kalijevi in natrijevi ioni), ki jih aktivirajo magnezijevi ioni. Ena molekula ATP zagotovi vhod dveh kalijevih ionov v celico in izstop treh natrijevih ionov.

Občutljivost na osmozo:Živalske celice v razredčenem hipotoničnem mediju nabreknejo – plazmalema poči, vsebina se razlije = citoliza (pri eritrocitih – hemoliza).V hipertoničnem okolju se celica skrči, dobimo nepravo obliko oz zvezdasti eritrocit pri eritrocitih.Izotonična raztopina – fiziološka za proučevanje celic.

5.6.2. Stičnice* Zonula occludens – tesna stičnicaNajtesnejši stik med dvema celicama , ki omejuje lateralni površini dveh sosednjih celic in se nahaja tik pod apikalno površino. Membrani sosednjih celic sta tako ločeni in tvorita 5-lamelarni skupek. Zonula occludens popolnoma zatesni medcelični prostor in prepreči prehod snovem, ki so namenjene za izločanje skozi apikalno površino, da bi prišle nazaj skozi lateralno.Medcelični prostor je ločen na 2nm, glavna proteinska sestavina pa je okludin, ki je transmembranski protein. Elektronska zgostitev se pojavi zaradi aktinskih filamentov, ki omogočajo povezavo med proteini zonule occludens.

* Zonula adherens – pasasta stičnicaSe nahaja tik pod tesno stičnico v celici in zagotavlja predvsem medcelično vezljivost. Medcelični prostor se po širini bistveno ne spremeni. ZA vsebuje adherin E, ki je vezavno mesto za kalcij, nujen za obstoj celice. Stičnica je okrepljena z aktinskimi filamenti.

* Macula adherens - dezmosomIma obliko pege. Na območju dezmosoma se medcelični prostor nekoliko razširi – 25-30nm. Na sredini tega prostora je elektronsko gosta črta, posledica prekrivanja proteinov desmogleina in desmokolina. Desmosom je značlen za lateralne površine celic v epitelijih. Ima 6-lamelarno zgradbi, ki jo dajeta poleg e- goste črte še celični

41

membrani, okrepljeni z zgostitvijo – desmosomalno ploščo. Ta je okrepljena z IMF, ki se v njej pomikajo in se vračajo se vračajo v citoplazmo. Medcelična vezljivost.

* Punctum adherens (sinapse)Preko sinaps se prenašajo impulzi z eno na drugo živčno celico. Sinapso sestavljata sprejemni in oddajni del. Oddajni sestavlja živčni celico, oz je del na koncu nevrita, sprejemni pa je lahko katera koli celica.V presinaptičnem delu se akson zadebeli v sinaptičnen betič, kjer se povezujejo mikrotubuli in nevrofilamenti, vsebuje pa številne sinaptične mešičke in mitohondrije. Presinaptični del od postsinaptičnega dela ločuje sinaptični kompleks oz sinaptična reža.

* HemidesmosomUčrvrsti celico na bazalni membrani (zunanji del, kolagene fibrile).Je podoben dezmosomu, a zgrajen le polovično, ima torej eno desmosomalno ploščo v katero segajo tonofilamenti. Značilen je za bazalne površine nekateih epitelijskih celic.

* NexusZožitev prostora na 2nm, prehod molekul; za difuzijo ionov in malih molekul; komunikacijska ali posredovalna vloga; koneksoni – lahko odprti ali zaprti.

42

1. BIOLOGIJA CELICE.............................................................................................................12. METODE CELIČNE BIOLOGIJE.........................................................................................1

2.1. Osnove mikroskopiranja in vrste mikroskopov...............................................................23. PREPARATI CELIC..............................................................................................................34. OZNAČEVANJE IN BARVANJE.........................................................................................6

4.1. OZNAČEVANJE MOLEKUL V CELICAH..................................................................64.1.1. Aminokisline (DNA, RNA) 64.1.2. Ogljikovi hidrati 64.1.3. Lipidi 74.1.4. Proteini 7

4.2. SPECIFIČNO OZNAČEVANJE CELIČNIH SESTAVIN.............................................84.2.1. Encimska histokemija 84.2.2. Imunooznačevanje = imunocitokemija 94.2.3. In situ hibridizacija 94.2.4. Metoda tunel 94.2.5. Gelska elektroforeza 94.2.6. Gojenje celic in vitro 9

5. CELICA................................................................................................................................105.1. PROKARIONTSKA CELICA......................................................................................11

5.1.1. Virusi 135.1.2. Prokarionti vs evkarionti 14

5.2. EVKARIONTSKA CELICA.........................................................................................155.2.1. Osnovna klasifikacija višjih evkariontskih celic po dejavnostih 165.2.2. Delitvena sposobnost celic 17

5.3. Celični krog....................................................................................................................185.3.1. Interfaza 185.3.1.1. Interfazno jedro oz nucleus 185.3.2. Mitoza 215.3.2.1. Stopnje mitoze 225.3.3. Mejoza 23

5.4. Odmiranje celic..............................................................................................................255.5. Endomembranski sistem................................................................................................265.5. Celične strukture............................................................................................................28

5.5.1. Endoplazemski retikulum 285.5.2. Golgijev aparat 305.5.3. Lizosomi 325.5.4. Peroksisom - microbody 325.5.5. Mitohondriji 335.5.6. Citoskelet 345.5.7. Ribosom 38

5.6. Biološke membrane.......................................................................................................395.6.1. Pasivni membranski transport 405.6.2. Aktivni membranski transport 415.6.2. Stičnice 41

43