Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE AGRICULTURĂ
Specializarea: Genetica și ameliorarea plantelor
Ing. LAURA ȘTEFANA GANEA
REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT
STUDIUL DIVERSITĂŢII ŞI DISTRIBUŢIEI SPAŢIALE
A FONDULUI GENETIC ÎN POPULAŢII DE PIN SILVESTRU (PINUS
SYLVESTRIS L. ) ÎN VEDEREA AMELIORĂRII
Conducător ştiinţific
Prof. dr. Constantin Botez
CLUJ-NAPOCA
2011
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
CUPRINS
CAPITOLUL 1- IMPORTANŢA ECONOMICĂ ................................................................ 5
1.1 INTRODUCERE ............................................................................................................. 5
1.1.1 Scurt istoric a pădurilor din Europa .................................................................................. 5
1.1.2 Pădurile din România ........................................................................................................ 5
1.1.3 Managementul forestier în România ................................................................................. 5
1.1.4 Pinul Silvestru ................................................................................................................... 6
1.1.4.1 Clasificarea ştiinţifică a speciei Pinus sylvestris după Ciocârlan(CIOCÂRLAN, 2000) 6
1.1.4.2 Varietăţi de Pinus sylvestris ........................................................................................... 6
1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru ............................................................................................... 6
1.1.4.4 Distribuţia geografică şi pe altitudine ............................................................................ 7
1.1.4.5 Limitările topografice şi climatice ale habitatului .......................................................... 7
1.1.5 Utilizări .............................................................................................................................. 7
1.1.6 Genetica spaţială ............................................................................................................... 8
1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra geneticii spaţiale ................................................................ 8
1.1.6.2 Genetica spaţială: pinul .................................................................................................. 8
1.1.7 Genetica spaţială a Pinului silvestru în România .............................................................. 8
1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetică .............................................................................. 9
CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZĂ A DIVERSITĂȚII
GENETICE .............................................................................................................................. 9
2.1. ISTORICUL DEZVOLTĂRII AMELIORĂRII PLANTELOR PE CRITERII
MOLECULARE ....................................................................................................................... 9
2.2 DEFINIŢIA MARKERILOR GENETICI ŞI MOLECULARI ................................... 10
2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI .............................................................................. 10
2.3.1 Markeri morfologici ........................................................................................................ 10
2.3.2 Markeri biochimici .......................................................................................................... 10
2.3.3 Markeri moleculari .......................................................................................................... 10
2.4 IMPORTANŢA MARKERILOR MOLECULARI ...................................................... 10
2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ........................................................ 10
2.5.1 Microsateliții (SSR) ......................................................................................................... 11
2.5.1.1 Evoluţia microsateliţilor: mecanismele de mutaţie și de variaţie SSR ......................... 11
2.5.1.2 Dezvoltarea markerilor microsateliţi ............................................................................ 11
2.5.1.3 Dezvoltarea de microsateliți, transferaea inter-specifică sau inter-genică ................... 11
2
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
2.6 PARAMETRI GENETICI UTILIZAŢI PENTRU EVALUAREA
VARIABILITĂŢII GENETICE INTRAPOPULAŢIONALE. ......................................... 11
2.7 PARAMETRI GENETICI UTILIZAŢI PENTRU EVALUAREA
VARIABILITĂŢII GENETICE INTERPOPULAŢIONALE .......................................... 12
2.8 MOTIVAŢIA CERCETĂRII…………………………………….………….……..….12
2.9 SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI ACTIVITĂŢILE DE CERCETARE
ŞTIINŢIFICĂ………………………………………………………………………………..12
CAPITOLUL 3 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE PE TEREN ........................................ 13
3.1 PARTICULARITĂŢI ŞI ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE .............................. 14
3.1.1 Populaţii de Pinus silvestris din România și Ungaria ..................................................... 14
CAPITOLUL 4 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE ÎN LABORATOR ............................. 15
4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI .......................................................... 15
4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI ŞI PREPARAREA SOLUŢIEI DE AND ..................... 15
4.3 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PURITĂŢII ŞI
CONCENTRAŢIEI DE ADN ............................................................................................... 15
4.3.1 Tehnica PCR ................................................................................................................... 15
4.3.1.1 Caracteristici ................................................................................................................. 15
4.3.1.2 Utilizări ......................................................................................................................... 16
4.4 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13.......................... 16
4.5 SEPARAREA ELECTROFORETICĂ ŞI ANALIZA CROMATOGRAFICĂ ......... 16
4.6 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCAŢI
FLUORESCENT .................................................................................................................... 16
4.7 PCR MULTIPLEX .......................................................................................................... 17
4.8 PACHETE INFORMATICE ŞI METODE STATISTICE APLICATE ÎN ANALIZA
ŞI INTERPRETAREA DATELOR ...................................................................................... 17
CAPITOLUL 5 REZULTATE ŞI DISCUŢII ..................................................................... 17
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII
ŞI CALITĂŢII ACESTUIA .................................................................................................. 17
5.2 REZULTATE OBŢINUTE LA TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA
MARKERILOR SSR M13, PREMARCAŢI FLOURESCENT ŞI ÎN MULTIPLEX .... 17
5.3 DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA ŞI
UNGARIA ............................................................................................................................... 18
5.3.1 Diversitatea genetică intra- şi inter-populaţională .......................................................... 18
5.3.2 Frecvenţele alelice în populaţiile din Romania şi Ungaria ............................................. 18
3
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
5.4STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE DE PIN
SILVESTRU ........................................................................................................................... 19
5.4.1 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice. .................................................... 19
5.4.2 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice şi a domeniilor teritoriale. ........... 22
5.4.3 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza metodelor de coordonare ....................................... 23
5.4.4 Testul Mantel ................................................................................................................... 23
5.4.5 Coeficientul de consangvinizare ..................................................................................... 25
6 CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI ................................................................................... 25
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ............................................................................................ 28
4
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
CAPITOLUL 1- IMPORTANŢA ECONOMICĂ
1.1 INTRODUCERE
1.1.1 Scurt istoric a pădurilor din Europa
La sfârşitul Evul Mediu şi după (secolul al cincisprezecelea-șaptesprezecelea),
suprafeţele împădurite au scăzut drastic datorită modificării modelelor de utilizare a
terenurilor. Mai mult, o exploatare intensivă a pădurilor rămase naturale, a început şi
ca urmare, aceste păduri au devenit mai accesibile datorită tăierilor arbitrare
(KUSTER, 1998). În unele ţări, producţia de cărbune pentru industria fierului,
construcţii navale şi extracţia de sare a dus la despădurirea completă a unor suprafeţe
mari. La începutul secolul al optsprezecelea în unele ţări cerinţele legale au intrat în
vigoare pentru a evita o criză de aprovizionare cu lemn şi de a îmbunătăţi starea
pădurilor degradate (CARLOWITZ, 1713).
1.1.2 Pădurile din România
Datorită varietăţii condiţiilor climatice şi de altitudine, România este ţara cu cea
mai mare variaţie din Europa temperată, în ceea ce priveşte vegetaţia în general,
fondul forestier în special. Condiţiile variază de la climat est-mediteranean (Marea
Neagră) până la climat continental şi de la altitudini joase cum ar fi şesurile inundabile
şi zonele de coastă până la munţi înalţi, cu păduri şi arbuşti de-a lungul lizierei şi mai
sus de ea în Carpaţii Meridionali (OSZLANYI, 2004).
Compoziţia pădurilor româneşti cuprinde Fagus care acoperă cea mai mare
suprafaţă 31,5%, pădurile de Quercus 18%, păduri de răşinoase 29,9%., diverse tari
15,7% şi diverse moi 4,9% (RNP, 2009) în pădurile de conifere Pinus 2,1%.
1.1.3 Managementul forestier în România
În perioada comunistă, România a investit masiv în gestionarea pădurilor,
educând unii dintre cei mai buni silviculturii şi specialişti tehnici din Europa (WORLD
BANK, 2002).
În ultimul deceniu suprafaţa împădurită a fost regenerată cu circa 20000 ha
anual, regenerare naturală, reprezentând aproximativ 50% din total. Regenerarea
naturală a pădurilor este o prioritate şi se aplică în mai mult de 90% din suprafaţa
pădurilor. Suprafeţele exploatate prin tăieri la ras şi alte tăieri care trebuie regenerate,
5
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
reprezintă puţin sub 10% din suprafaţa anuală de împădurit, care este de 10 - 16000 ha.
Activităţile de împădurire au fost reduse după 1990.
1.1.4 Pinul Silvestru
Pinul este un component foarte important al vegetaţiei, ocupând cca. 143
milioane ha (37% din suprafaţa împădurită a globului, 70% din suprafaţa împădurită a
emisferei nordice (MIROV, 1967)). Este cel mai răspândit conifer din lume, după
Juniperus communis.
1.1.4.1 Clasificarea ştiinţifică a speciei Pinus sylvestris după Ciocârlan
(CIOCÂRLAN, 2000)
Regnul: Plantae, Încrengătura: Pinophyta, Clasa: Pinopsida, Ordinul: Pinales,
Familia: Pinaceae, Sub-familia: Pinus, Genul: Pinus, Specia: P. sylvestris.
1.1.4.2 Varietăţi de Pinus sylvestris
Cea mai mare diversitate a genului îl găsim în Mexic şi California. Peste 100 de
varietăţi au fost descrise în literatura botanică, dar numai trei sau patru sunt acum
acceptate. Diferenţele morfologice sunt minime, însă analiza genetică şi a metaboliţilor
secundari (compoziţia răşină) ne dezvăluie diferenţe mai pronunţate.
1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru
Face parte din genul Pinus, un mare gen în cadrul familiei Pinaceae
(Abietineae) din care fac parte arbori şi arbuşti veşnic verzi. Nativ pentru Europa,
Asia, America de Nord, America Centrală, Africa de Nord şi insulele din apropiere
(DALLIMORE, 1948).
Pinul silvestru este un conifer veşnic verde care poate creşte în înălţime până la
25 m, în mod excepţional 35-45m în parcele foarte productive și cu diametrul
trunchiului matur de până la 1 m.
Prezintă două ace în teacă. Este un arbore cu creştere monopoidală, ramurile
sunt dispuse în spirală şi nu prezintă nici un mugure lateral între spirale. Creşterea
monopodială nu este la fel de marcantă ca în cazul Picea abies, iar forma generală
variază de obicei de la coroane înguste spiralate cu ax bine definit până la formaţiuni
stufoase fără nici un ax principal definit. (CARLISLE, 1968).
Arborele este hermafrodit unele exemplare sunt predominant de un anumit sex,
masculin sau feminin.
6
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Pinii sunt specii de arbori cu ciclu de viaţă foarte lung. Longevitate medie,
poate ajunge până la 600 de ani. Cel mai bătrân pin încă în viaţă este considerat a fi
Pinus aristata ce are 2435 ani (BRUNSTEIN, 1992).
1.1.4.4. Distribuţia geografică şi pe altitudine
Pinul silvestru (Pinus sylvestris; familia Pinaceae) prezintă cea mai mare
distribuţie geografică, fiind nativ în cea mai mare parte a emisferei nordice, în Europa
şi Asia.
Limita de nord a distribuţiei pinului silvestru în Europa este la 70°29'N în
Norvegia (CARLISLE, 1958) limita sudică este la 37°N în sudul Spaniei. Limita
continentală în partea de vest fiind la 7° W, în nord-vestul Portugaliei (CARLISLE,
1968) iar limita de est la aproximativ 138°E, existând câţiva arbori mai în est,
ajungând pe coasta Pacificului (MALEV, 1955). Limita insulară a Pinului silvestru
este în Scoţia, la 5°38'W. O descriere mai detaliată a distribuţiei P. sylvestris a fost
realizată de STEVEN în 1959.
1.1.4.5. Limitările topografice şi climatice ale habitatului.
Tolerează o gamă largă de condiţii climatice, de la climatul arctic din nordul
Siberiei până la climatul mediteranean din sudul Spaniei şi de la poalele Alpilor
Liguriei, precum şi climatul oceanic umed, de pe coasta de vest a Scoţiei, până la
climatul continental uscat din Europa Centrală şi Asia. Limita de vest este determinată
de bariera creată de Oceanul Atlantic, iar limita de est de către Oceanul Pacific,
excepţia făcând nord-estul Rusiei, unde Munţii Verhoiansk previn în mod eficient
migraţia spre est. Limita de nord a pin scoţian este probabil determinată de
temperatură, deşi nu este clar până la ce temperaturi acest arbore își desfăşoară ciclul
de viaţă.
1.1.5 Utilizări
Uleiul volatil extras din pin a fost studiat încă din antichitate şi este folosit în
special pentru beneficiile aduse în tratarea afecțiunilor respiratorii, ameliorează stările
de oboseală, este antiseptic şi stimulează circulaţia sanguină. Polenul de asemenea se
folosește în tratamente naturiste ca şi energizant, în tratarea afecțiunilor respiratorii,
este recomandat de asemenea pacienţilor hipertensivi, în cazul afecţiunilor renale sau
articulare. Acele, crengile şi scoarţa tuturor speciilor de pin conţin o răşină lipicioasă,
7
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
cu miros plăcut ce conţine substanţe, cum ar fi colofoniu, terebentină şi uleiuri
esenţiale, care sunt extrase şi folosite cu succes în diferite afecţiuni. Gudronul
medicinal este folosit, în special în medicina veterinară, pentru proprietăţile sale
antiseptice, dar şi ca stimulent, diuretic şi diaforetic. Pinul silvestru este o specie
lemnoasă de mare importanţă comercială în Europa. Lemnul este uşor de prelucrat, cu
proprietăţi mecanice bune şi are multe utilizări. Pădurea boreală, din nordul Europei şi
a Asiei, este zona cu cea mai extinsă pădure de conifere din lume iar pinul este o parte
importantă a ecosistemului său (BONAN et al., 1992). Pinul silvestru este foarte
rezistent la poluare urbană, este predispus la boli parazitare şi a fost folosit ca plantă
pionier pe terenurile degradate, fiind utilizat în reîmpădurirea şi controlul eroziunii,dar
şi ornamental în parcuri și spaţii verzi. (PUPLETT, 2011). Cheresteaua, de asemenea,
este larg întrebuinţată la fabricarea unei game largi de produse, de la bărci la traverse
de cale ferată, mobilier şi jucării. În Statele Unite, din anii 1950 până prin anii 1980,
pinul a fost foarte popular ca şi pom de Crăciun.
1.1.6 Genetica spaţială
1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra genetici spaţiale
Înţelegerea proceselor care determină asemănările şi diferenţele dintre
populaţiile izolate spaţial este impetuos necesară pentru biologia evoluţionistă. Atât
speciile vegetale cât și cele animale au fost şi sunt direct influenţate de condițiile de
mediu, implicit de distribuţia spațială şi barierele geografice care intervin în transferul
genelor de la o populaţie la alta.
1.1.6.2 Genetica spaţială: pinul
Pinus sylvestris L. creşte în condiţii ecologice şi geografice diferite, fapt ce a
dus, în procesul de evoluţie, la formarea unui număr mare de forme, ecotipuri şi
subspecii.
1.1.7 Genetica spaţială a Pinului silvestru în România
Pinul silvestru este întâlnit în Munţii Harghitei şi Ciucului, o specie de
importanţă ecologică (BOSCAIU et al., 1999; BĂNĂRESCU, 1973) A fost, de
asemenea, o specie predomină în această zonă (BĂNĂRESCU, 1973). Structura
populaţiei a suferit schimbări dramatice datorită glaciaţiunii, introducerii speciei Picea
abies şi datorită tăierilor excesive. În prezent doar 0,2% din pădurile naturale de Pinus
8
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
sylvestris mai populează aceeste regiuni. Reducerea drastică a dus la distribuţia
fragmentată a populaţiilor de Pinus sylvestris iar micropopulaţiile izolate au suferit o
scădere a diversităţii genetice, ca urmare a driftului genetic, fluxul genetic redus,
reducerea calităţii habitatului.
1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetică
Au existat numeroase tentative de a subdiviza imensa zonă de distribuție a
pinului în diverse subspecii, care sunt mai degrabă neconvingătoare din cauza lipsei
discontinuităţi clare în distribuţie. În condiţii naturale pinul scoţian nu este infertil în
relaţie cu alte specii de pin, de asemenea, au fost raportaţi hibrizi cu P. nigra, P.
densiflora şi P. mugo. Spre deosebire de alţi taxoni, speciile de pin prezintă o robustă
incompatibilitate de hibridare. Pinul este considerat specia cu cea mai mare
variabilitate genetică din toate speciile, dovedit prin măsuri ale variabilităţii genetice
cantitative (CORNELIUS, 1994) şi diversitatea în studiile aloenzimelor (HAMRICK
et al., 1979).
CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZĂ A DIVERSITĂȚII
GENETICE
2.1. ISTORICUL DEZVOLTĂRII AMELIORĂRII PLANTELOR PE CRITERII
MOLECULARE
În ziua de azi populaţia globală are o rată de creştere numerică mai mare ca
niciodată. Se presupune că până în anul 2050, populaţia mondială se va dubla şi va
ajunge până la 12 miliarde de indivizi. De fapt s-a estimat că pe plan mondial
producţia de hrană va trebui să se dubleze în următorii 45 de ani. Suprafeţele agricole
cât şi cele forestiere sunt limitate. Cel puţin în ceea ce priveşte viitorul apropiat,
ameliorarea plantelor va avea un rol important. Selecţia fenotipurilor superioare din
populaţiile segregante încă stă la baza ameliorării convenţionale. Ameliorarea pe
termen lung mizează programe bazate pe cicluri repetate de recombinare şi selecţie.
Este importantă exploatarea tuturor posibilităţilor disponibile pentru a maximiza
câştigul genetic pe unitatea de timp şi pentru a reduce scăderea diversităţii genetice
(LINDGREN and MULLIN, 1997; ROSVALL et al., 1998). În cazul în care
heritabilitatea juvenilă este destul de mare, selecţia fenotipică poate fi o metodă
eficientă de a reduce costurile de testare ulterioară a descendenţilor în câmp şi
9
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
creşterea generală a câştigului genetic (NAMKOONG, 1970; COTTERILL and
JAMES, 1981; WU, 1998).
2.2 DEFINIŢIA MARKERILOR GENETICI ŞI MOLECULARI
Markerii moleculari pun în evidenţă diferenţele dintre secvenţele nucleotidice,
marcând totodată prezenţa unei anumite gene în ADN-ul extras de la diferiţi indivizi.
Formarea sau dispariţia unui marker molecular este determinată de modificarea unei
singure nucleotide dintr-o genă sau chiar de la nivelul ADN-ului repetitiv.
Markerii genetici evidențiază orice diferenţă genotipică sau fenotipică specifică
unui individ, care se transmite în descendenţă, sunt de fapt alele mutante care pot fii
urmărite de-a lungul generaţiilor.
2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI
2.3.1 Markerii morfologici
Markerii morfologici controlează caractere morfologice uşor de evidenţiat,
controlate genetic de către o singură genă.
2.3.2 Markerii biochimici
Controlează însuşiri biochimice care sunt controlate de mai multe gene şi se
bazează pe proprietatea proteinelor de a fi separate prin electroforeză
2.2.3 Markerii moleculari
Markerii moleculari evidenţiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi
citoplasmatic.
2.4 IMPORTANŢA MARKERILOR MOLECULARI
Caracteristicile markerilor moleculari permit procesul de identificare, selecţie şi
clonare a genelor de interes, precum şi observarea naturii informaţionale a materialului
analizat.
2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI
Cele mai importante utilizări ale markerilor sunt:
• Stabilirea variabilităţii genetice şi caracterizarea colecţiilor de germoplasmă;
• Amprentarea genetică a varietăţilor, identificarea şi accelerarea dezvoltării
indivizilor care combină alelele favorabile, contribuind la performanţele presupuse
ale hibrizilor
• Estimarea distanţelor genetice între populaţii, şi producerea de seminţe;
10
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
• Detecţia QTL(qualitative trait loci ) şi monogene;
• Puritatea şi stabilitatea seminţelor şi a materialului vegetal;
• Identificarea de secvenţe utile, gene candidat etc.
2.5.1. Microsateliții (SSR)
Disponibilitatea unei largi game de tehnici de marcare moleculară a condus la
studii comparative între ele, (POWELL et al., 1996). Dintre toate acestea, markerii
SSR au câştigat considerabil importanţă în genetica şi ameliorarea plantelor ca urmare
având multe atribute de dorit, inclusiv disponibilitate, natura multialelică, moştenire
codominantă, reproductibilitate, abundenţă relativă, acoperire extinsă a genomul
(inclusiv la nivelul organelelor), locaţie specifică pe cromozom, posibilitatea
automatizării şi detalii în genotipizare (PARIDA et al., 2009a)
2.5.1.1 Evoluţia microsateliţilor: mecanismele de mutație și de variaţie SSR
Evoluţia SSR, adică orice modificare, creştere sau descreştere a numărului de
repetări, este asociată cu rata de mutaţie. Geneza microsateliţilor este un proces
evolutiv dinamic care s-a dovedit a fi extrem de complex (ELLEGREN, 2004).
2.5.1.2. Dezvoltarea markerilor microsateliți
În ciuda aplicabilităţii largi a markerilor SSR în genetica plantelor, dezvoltarea
lor rămâne o mare problemă la majoritatea speciilor mai ales în cazul culturilor
minore. Acest lucru se datorează faptului că markerii SSR ar trebui să fie izolaţi de
novo la majoritatea speciilor.
2.5.1.3 Dezvoltarea de microsateliți, transferarea interspecifică sau intergenică
Studiile de genetică comparativă au dovedit că atât genele cât şi ordinea lor în
genom sunt înalt conservate în cadrul speciilor înrudite. Datele obţinute în urma
secvenţierilor realizate la mai multe specii de plante au dovedit suficientă similaritate
între genomurile a două sau mai multe genuri/specii strâns legate. Datorită acestui fapt
markerii SSR pot fi transferaţi la specii din acelaşi gen.
2.6 PARAMETRI GENETICI UTILIZAŢI PENTRU EVALUAREA
VARIABILITĂŢII GENETICE INTRAPOPULAŢIONALE.
Prin populaţie se înţelege un grup de indivizi al unei specii care coexistă în
aceeaşi arie geografică. Pentru fiecare populaţie în parte se calculează separat
parametrii variabilităţii genetice intra-populaţionale. Sunt calculate valori medii ale
11
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
acestor parametri pentru mai multe populaţii, după care acestea se compară între ele cu
ajutorul datelor obţinute.
2.7 PARAMETRI GENETICI UTILIZAŢI PENTRU EVALUAREA
VARIABILITĂŢII GENETICE INTERPOPULAŢIONALE
Distanţa genetică Nei (1972)
Printr-o distanţă genetică se pot cuantifica deosebirile şi asemănările între
structura genetică a două populaţii, atât la nivel genic cât și genomic. Metoda de
calculare a distanţei genetice promovată de Nei presupune că diferențele genetice sunt
datorate atât drift-ului genetic cât şi mutației (NEI et al., 1972).
2.8 MOTIVAŢIA CERCETĂRII
În cadrul acestei lucrări a fost propusă studierea, cu ajutorul tehnicilor de
biologie moleculară (PCR, SSR) a unor populaţii de Pin silvestru din România şi
Ungaria.
2.9 SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI ACTIVITĂŢILE DE CERCETARE ŞTIINŢIFICĂ
Cercetările prezentate au ca scop studierea diversităţii genetice intra- şi inter-
populaționale şi a structurii genetice spaţiale a populaţiilor de pinului silvestru (Pinus
sylvestris L.) în arealul studiat, cu ajutorul markerilor moleculari (nSSR). Aceste
elemente sunt de un interes major în procesul de adaptabilitate climatică, producţie şi
conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. În acest proiect au fost
studiate 15 populaţii provenite din România şi Ungaria de la diferite altitudini şi
latitudini.
Cercetările efectuate au urmărit în primul rând evaluarea diversităţii genetice în
vederea caracterizării structurii genetice şi a identificării modelului de distribuţie a
variaţiei genetice în populaţii naturale de pin silvestru din România şi Ungaria.
Analiza comparativă între populaţiile naturale, precum şi utilizarea unor metode
noi de cuantificare a fluxului de gene a avut ca scop estimarea unui posibil efect al
utilizării de materiale forestiere de reproducere de origine necunoscută asupra
integrităţii genetice a surselor autohtone de pin silvestru.
Obiectivele urmărite şi activităţile desfăşurate în cadrul proiectului de cercetare:
1. Recoltarea materialului vegetal. Pentru aceasta etapă a fost necesară
stabilirea populaţiilor ţintă în arealul luat în studiu, populaţii rezervaţii de seminţe,
12
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
surse genetice, şi recoltarea propriuzisă a probelor biologice (ace şi muguri) de la 20
de indivizi din fiecare populaţie, aflaţi la minim 50 de metri distanţă.
2. Testarea şi transferarea unor markeri SSR disponibili la alte specii de pin la
Pinus sylvestris prin studiul bibliografiei de specialitate în vederea alegerii markerilor
utilizabili, testarea markerilor candidaţi şi optimizarea reacţiei de amplificare.
3. Dezvoltarea sistemului multiplex bazat pe markerii aleşi şi folosirea sondelor
marcate fluorescent în vederea automatizării procesului genotipizare.
4. Caracterizarea locilor luaţi în studiu, utilizând amorse nemarcaţi, marcaţi
fluorescent şi în multiplex.
5. Evaluarea diversităţii genetice intra- şi inter-populaţionale în populaţii
naturale de pin autohton din zona luată în studiu, cu ajutorul markerilor nSSR;
6. Analiza structurii genetice spaţiale, în populaţii naturale reprezentative sub
raportul tipului de ecosistem forestier şi al nivelului altitudinal;
7. Stabilirea coeficientului de consangvinizare a populaţiilor studiate.
8. Formularea de recomandări pentru o conservare eficientă a resurselor
genetice forestiere de pin şi privind controlul transferului materialelor forestiere de
reproducere.
CAPITOLUL 3 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE PE TEREN
În cadrul acestui studiu au fost luate în considerare 13 populaţii naturale de pin
silvestru din România și 2 populaţii din Ungaria. Alegerea populaţiilor a fost făcută în
aşa fel încât să cuprindă o arie de distribuție geografica a pinului cât mai vastă, atât în
interiorul arcului Carpatic cât şi în exterior, conform Catalogului Rezervaţiilor Surse
de Seminţe, catalog întocmit la nivelul Regiei Naţionale a Pădurilor, care cuprinde
întreaga suprafaţă a ţării.
13
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Tab 1
Locațiile alese pentru recoltare. Sites for sampling
Nr. No.
Țara Country
Judeţul County
Localitatea Location
Latitudine Latitude
Longitudi ne Longitude
Altitu dine Altitu de
Nr. probe No. samples
1.1 Romania Alba Baia de Arieş 46°24’33” 23°20’00” 514m 20
1.2 Romania Alba Pianu de Sus 45°53’32” 23°30’09” 426m 20
1.3 Romania Harghita Toplița 46°54’40” 25°20’35” 750m 20
1.4 Romania Mureş Gurghiu 46°46’28” 24°51’16” 609m 20
1.5 Romania Mureş Reghin 46°53’02 24°31’42” 484m 20
1.6 Romania Sibiu Agnita 46°00’53” 24°45’47” 557m 20
2.1 Romania Braşov Zărneşti 45º33’59” 25º19’31” 747m 17
2.2 Romania Caraş-Severin Anina 45º05’60” 21º51’41” 615m 20
2.3 Romania Hunedoara Pui 45º31’24” 23º06’05” 476m 19
2.4 Romania Suceava Poiana Stampei 47º20’59” 21º51’12” 917m 20
2.5 Romania Timişoara Nădragu 45º39’00” 21º11’00” 850m 19
2.6 Romania Vâlcea Voineasa 45º28’12” 23º52’01” 1240m 16
2.7 Romania Vrancea Tulnici 45º55’18” 26º38’57” 702m 20
3.1 Ungaria Győr-Moson-Sopron
Fenyőfő 47º5’20” 17º45’47” 264m 20
3.2 Ungaria Vas Velemér 46º44’04” 16º22’35” 213m 18
3.1 PARTICULARITĂŢI ŞI ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE
3.1.1 Populaţii de Pinus silvestris din România și Ungaria
Recoltarea materialului vegetal s-a desfășurat în doua etape.
Prima etapa s-a desfășurat în aprilie-mai 2010.Aceasta etapa a fost coordonata
de colega mea drd. Ing. Valentina Floran. Populaţiile incluse în aceasta etapa s-au
concentrat în judeţele: Alba, Harghita, Mureş şi Sibiu.
A doua etapă s-a desfășurat în perioada 27 septembrie-20 octombrie 2010.
Recoltarea a fost efectuată în judeţele: Braşov, Caraş-Severin, Hunedoara, Suceava,
Timişoara, Vâlcea şi Vrancea. De asemenea am extins aria de studiu şi în afara ţării,
14
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
luând în considerare doua populaţii de pe teritoriul Ungariei cu scopul desluşirii
distribuţiei spațiale a pinului în zonă şi nu numai pe teritoriul ţării noastre.
CAPITOLUL 4 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE ÎN LABORATOR
4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI
1. Izolarea ADN-ului din probele recoltate în perioada aprilie-mai 2010 a fost
realizată în cadrul Departamentului de Biotehnologii a Universităţii de Științe Agricole
şi Medicină Veterinară, Cluj-Napoca. ADN-ul a fost extras după protocolul publicat de
LODHI şi colaboratorii în 1994 şi modificat de RODICA POP şi colaboratorii în 2003
2. Izolarea ADN-ului din probele recoltate în perioada septembrie-octombrie
2010 a fost realizată în laboratoarul centrului de cercetare Umea Plant Science Center
(UPSC) sub egida Swedish University of Agriculture (SLU Umea, Sweden). În acest
caz protocolul folosit a fost cel dezvoltat de DOYLE și DOYLE în 1987.
4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI ŞI PREPARAREA SOLUŢIEI DE ADN
Din punct de vedere practic, purificarea ADN-ului presupune: îndepărtarea din
lizat a tuturor componenţilor, cu excepţia ADN-ului şi⁄sau fracţionarea ADN-ului,
adică separarea diferitelor specii de ADN în categorii distincte. Au fost efectuate
diluţii la concentraţia de 50 ng/µl.
4.3 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PURITĂŢII ŞI
CONCENTRAŢIEI DE ADN
În cazul probelor luate în studiu a fost folosit Spectrofotometru Nanodrop®
ND-1000 și Fluorometrul Qubit.
4.3.1 Tehnica PCR
Această metodă a fost descoperită în anul 1988 de către Karl Mullis şi
colaboratorii lui, pentru care a primit premiul Nobel pentru Chimie. Tehnica PCR
(Polymerase Chain Reaction), reacţia de polimerizare în lanţ, are la bază o tehnologie
în vitro care imită capacitatea naturală de replicare a ADN-ului şi care constă în
generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenţe nucleotidice ţintă (ADN sau
ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific.
4.3.1.1 Caracteristici
Metoda este foarte sensibilă la "contaminare" cu ADN străin; o cantitate cât de
mică de ADN provenit de la alt individ poate compromite rezultatul analizei genetice.
15
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Amplificarea nespecifică poate constitui o problemă; aceasta este posibilă
datorită faptului că polimeraza poate fi activă şi la temperaturi joase
Amplificarea este posibilă, adesea, utilizând amorse care au fost
"fabricate"pentru alte specii iar lungimea maximă a segmentelor amplificate este de
aproximativ 5000 baze pentru PCR standard şi maximum 35 kb pentru kiturile "Long
PCR".
4.3.1.2 Utilizări
Amplificarea unei anumite secvenţe de ADN cunoscute se realizează prin
tehnica PCR; produşii de amplificare pot fi utilizaţi fie pentru secvenţiere, fie pentru
clonare sau pentru alte utilizări; marcarea PCR se poate utiliza şi în contextul selecţiei
asistate de markeri; markerii PCR sunt de tip codominant - se poate face genotipizarea
indivizilor pentru o anumită genă.
4.4 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13
După studiul articolelor de specialitate în grupul nostru au fost testate peste 300
de perechi de amorse SSR nemarcate fluorescent, transferate la Pinus sylvestris de la
alte specii ale genului Pinus. Au fost alese pentru acest studiu un număr de 9 amorse
SSR M13.
4.5 SEPARAREA ELECTROFORETICĂ ŞI ANALIZA CROMATOGRAFICĂ
Lungimea ampliconilor a fost măsurată cu ajutorul electroforezei capilare
Beckman coulter CEQ 8000 sequencer.
4.6 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCATE
FLUORESCENT
Din colecţia de amorse disponibilă în grupul nostru (peste 300 de amorse testate
iniţial de drd Sara Abrahamsson) am ales un număr de 94 de amorse care au fost
testate din nou în diferite condiţii. Scopul final al acestui test a fost dezvoltarea unui
sistem de amplificare multiplex pentru a reduce costurile de rulare a electroforezei
capilare, şi am decis că folosirea amorselor premarcate fluorescent va reduce
amplificarea nespecifică, astfel cromatogramele putând fi analizate. Au fost alese
pentru acest studiu un număr de 34 de perechi de amorse SSR.
16
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
4.7 PCR MULTIPLEX
După testarea iniţială au fost alese 34 de perechi de amorse, în funcţie de
similaritatea condiţiilor de amplificare (temperatură şi concentraţie de MgCl2) şi de
dimensiunea ampliconului (100pb-350pb). Pe baza dimensiunii ampliconilor au fost
concepute două combinaţii de amplificare multiplex a probelor cu ajutorul amorselor
premarcate fluorescent produse de Sigma. Fluorocromii folosiţi pentru marcarea
acestor amorse au fost: Cy5- semnalul emis este albastru, Cy5.5- semnalul emis este
verde, D2- semnalul emis este negru.
4.8 PACHETE INFORMATICE ŞI METODE STATISTICE APLICATE ÎN
ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR
Datele obţinute în urma interpretării cromatogramelor, au fost prelucrate
statistic, în vederea evidenţierii diversităţii genetice, la nivelul markerilor nucleari, în
populaţiile luate în studiu. Pachetele informatice au cuprins diferite programe de
analiză genetică: FSTAT 2.9.3 (GOUDET, 1995), ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005),
COANCESTRY 1.0 (WANG, 2007), BAPS 5.3 (CORANDER, 2003), TESS
(DURAN et al., 2009) şi AIS (MILLER, 2005), fiind determinați diferiţi parametrii.
CAPITOLUL 5 REZULTATE ŞI DISCUŢII
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA
CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA
În urma procesului de extracţie ADN am obţinut concentraţii cuprinse între
1000 ng/µl şi 6000 ng/µl într-un volum final de 50 µl. Puritatea probelor a fost
estimată cu ajutorul spectrofotometrului. Raportul optim este 1,5-2,0 observat şi în
cazul probelor noastre. Nu a fost observată o fragmentare a ADN-ului în probele
obţinute.
5.2 REZULTATE OBŢINUTE LA TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA
MARKERILOR SSR M13, PREMARCAŢI FLOURESCENT ŞI ÎN MULTIPLEX
Amplificările nespecifice datorate ataşării sondelor fluorescente M13 direct la
ADN-ul genomial şi nu la amorsei specifici au făcut analizarea populaţiilor imposibilă.
Calitatea amplificării a fost net superioară în cazul folosirii kitului de la Qiagen,
comparând cu rezultatele obţinute cu ajutorul reactivilor de la VWR în cazul amorselor
nemarcate fluorescent și a celor premarcate fluorescent.
17
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
În urma acestor experimente a fost observată o transferabilitate de 10% la Pinus
sylvestris în cazul markerilor dezvoltaţi la Pinus taeda.
Pe baza acestor rezultate au fost dezvoltate două complexe multiplex:
(M1):PtTx 3013, PtTx 3016, PtTx 3020, PtTx 4011, PtTx 3049; (M2): Ctg 4363,
SPAC 12:5, Ctg 1376, PtTx 3107, PtTx 4001.
5.3 DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA ŞI
UNGARIA
Diferenţele dintre indivizii unei populaţii/specii pot fi puse în evidenţă cu
ajutorul markerilor moleculari. Secvenţele de ADN amplificate au fost separate în
funcţie de mărimea lor prin electroforeză capilară. Vizualizarea s-a realizat cu ajutorul
senzorului de fluorescenţă deoarece au fost folosite amorse marcate fluorescent.
5.3.1 Diversitatea genetică intra- şi inter-populaţională
Pe baza rezultatelor obţinute au fost calculați parametrii diversităţii şi
diferenţierii genetice. Au fost analizat astfel 10 loci nucleari. Nu toţi locii s-au dovedit
a fi polimorfici pentru toate populaţiile analizate, putând fi observată prezenţa alelelor
nule pentru care este necesară o analiză mai amănunţită în viitor.
5.3.2 Frecvenţele alelice în populaţiile din Romania şi Ungaria
La nivelul celor 10 loci analizaţi în cele 15 populaţii (13 din Romania şi 2 din
Ungaria), au fost identificate un număr de 170 de alele, media de alele pe locus de 17
(numărul total de alele/numărul de loci analizaţi). Numărul maxim de alele per locus
găsit a fost de 45 pentru locusul SPAC 12:5 iar numărul minim de 9 alele pentru
locusul PtTx 3020. Aceste frecvenţe au fost calculate cu ajutorul programelor FSTAT
2.9.3 (GOUDET, 1995) şi ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005).
Diferenţierea genetică între populaţiile din România şi Ungaria, la nivelul
ADN-ului nuclear a înregistrat o valoare de Gst=0,053 ceea ce indică o diferenţiere a
populaţiilor semnificativă. Nivelul diversităţii genetice totale (HT) se situează în jurul
valorii de 62%. Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice a fost găsită în
populaţia din Brașov (71%) iar cea mai scăzută în populația din Sebeș (54%) și Vâlcea
(55%).
Pentru a testa dacă populaţiile au suferit o constrângere (fenomenul de
bottleneck) de-a lungul anilor, indicele Garza-Williamson a fost calculat înregistrând
18
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
valori cuprinse între 0,26 în popluaţia din Agnita şi 0,37 în populaţia din Suceava,
Romania. ). Toate populațiile studiate au prezentat o diversitate genetică substanțială
însă și semene ale unei depresiuni demografice (bottleneck). Indicele FK este apropiat
de 0, evidențiind faptul că toate populațiile sunt în echilibru Hardy-Weinberg, cu un
mic deficit de heterozigoţi.
Indicele de diferențiere FST
Acest indice a fost propus de WEIR și COCKERHAM (1984). Cu cât valoarea
acestuia este mai apropiată de 1, cu atât populațiile respective sunt mai diferențiate
genetic.
Cele mai mici diferențieri genetice (FST) au fost observate între populaţiile
dintre Sebeș și Velemér (-0.00119), cea mai mare diferențiere a fost observată între
populațiile din Baia de Arieș și Agnita (0.15761). Între majoritatea populațiilor a fost
observată o diferențiere semnificativă de peste 0,05.
5.4 STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE DE PIN
SILVESTRU
5.4.1 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice.
Pentru realizarea acestui obiectiv am folosit programul BAPS 5.3 (Bayesian
Analysis of Population Structure) (CORANDER, 2003) care funcționează pe baza
frecvenţei alelelor markerilor moleculari şi numărul de grupuri deviate din punct de
vedere genetic dintr-o populaţie variabile alese aleatoriu. Acest program nu ia în
considerare barierele geografice.
Inițial am rulat programul considerând fiecare individ ca făcând parte dintr-un
singur cluster, grupând astfel indivizi. Au fost calculate 5, 10 şi respective 15 clustere
de indivizi.
Distribuţia indivizilor din clusterul 1 este în majoritatea populaţiilor excepţie
făcând populaţia din Vâlcea. Cea mai mare pondere de indivizi din clusterul 1 fiind
regăsită în populaţia din Suceava. Indivizii aparţinând clusterului 2 sunt răspândiţi în
majoritatea populaţiilor excepţie făcând populaţiile din Agnita, Baia de Arieş,
Hunedoara, Topliţa şi Timiş. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup fiind
observată în cadrul populaţiei din Fenyőfő. Indivizii aparţinând clusterului 3 sunt
distribuiţi în majoritatea populaţiilor, singura excepţie fiind populaţia din Baia de
19
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Arieş. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup poate fi observată în populaţia
din Agnita. Distribuţia indivizilor aparţinând clusterului 4 este observată în 60% din
populaţii, lipsind din populaţiile din Baia de Arieş, Braşov, Caraş-Severin, Reghin,
Vâlcea şi Vrancea. Cea mai mare pondere a indivizilor din acest grup poate fi
observată în populaţia din Hunedoara.
Observând distribuţia indivizilor aparţinând clusterului 5 putem spune ca
aceștia sunt regăsiți în toate populaţiile neexistând excepţie. Cea mai mare pondere a
acestor indivizi se regăseşte în populaţia din Timiş. Inexistența unei structuri clare în
distribuţia indivizilor din clusterele mai sus menţionate se datorează fluxului de gene
puternic. Acesta este datorat polenizării libere existente la pin și nu se poate fi
observată o reducere a variabilităţii în populaţii. De asemenea recombinarea la nivelul
AND-ului nuclear a adus un aport semnificativ în diversitatea populaţiilor, la nivelul
markerilor nucleari.
De departe câteva populaţii se diferenţiază datorită proporțiilor de indivizi din
diferitele clustere. Populaţia din Agnita, care prezintă o proporţie foarte ridicată a
indivizilor din clusterul 3 de indivizi (peste 75%) însă compensează prin prezenţa de
indivizi din alte 3 clustere. Populaţia din Baia de Arieş, datorită lipsei de variabilitate
prin prezenţa indivizilor din doar 2 clustere, însă aceste doua clustere sunt cele mai
răspândite, compensând astfel. Populaţia din Suceava, datorită proporției mari de
indivizi din clusterul 1 (peste 60%) şi variabilitatea mare în populaţie datorită
prezenţei indivizilor din toate clusterele într-o proporţie mai mare sau mai mică. Şi nu
în ultimul rând populaţiile din Vâlcea şi Hunedoara cu o proporţie mare de indivizi din
clusterul 3 (50% şi respectiv 45%) şi prezenţa indivizilor din alte două clustere.
Gruparea indivizilor în 10 sau 15 clustere a dovedit o mare variabilitate în
populaţii fiind observaţi indivizi cu genotipuri unice care formează clustere unice.
Utilizând în analiză, în loc de indivizi unici, populaţiile ca unitate structurală
am obţinut rezultate similare. Cerând gruparea populaţiilor în maxim 5 clustere am
obținut un număr de 3 clustere.
Primul cluster, conţine o singură populaţie, populaţia din Agnita, evidenţiind
diferenţe puternice între această populaţie şi restul. Aceste diferenţe se regăsesc în
frecvenţa genelor (prezentate în subcapitolul anterior) şi mai ales în prezenţa alelelor
20
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
private la nivelul acestei populaţii. Al doilea cluster grupează majoritatea populaţiilor
indicând un flux genetic puternic, între populaţii. Al treilea cluster grupează o singură
populaţie, cea din Vâlcea.
Această populaţie se diferenţiază de toate celelalte datorită provenienţei
indivizilor din doar 3 grupuri, în proporţii total diferite de celelalte populaţii, datorită
frecvenţelor alelelor foarte diferite de media populaţiilor (prezentat în subcapitolul
anterior) şi datorită prezenţei unui număr mare de alele private la nivelul acestei
populaţii. Aceste rezultate sunt susţinute şi de studiul realizat de ROBLEDO-
ARNUNCIO şi ROUSET în 2010 în care a fost dovedită o diferențiere mai mare între
populaţiile aflate pe versanţii opuşi ai aceluiaşi lanţ muntos, faţă de populaţiile aflate
pe versanţi opuși în două lanţuri muntoase diferite, situate în aceeaşi vale. În cazul
nostru populaţiile din Agnita şi Vâlcea se află în aceleaşi condiţii, explicând astfel
diferenţierea şi respective gruparea în clustere diferite.
Forţând gruparea populaţiilor studiate în 2 clustere am observat gruparea
populaţiei din Agnita cu celelalte populaţii, identificând astfel o similaritate genetică
mai ridicată a acestei populaţii cu celelalte comparative cu populaţia din Vâlcea. Acest
lucru se datorează probabil numărului mai mare de clustere dispuse în această
populaţie, comparând-o cu populaţia din Vâlcea.
Datorită faptului că acest program nu ia în considerare datele geografice, care
influențează puternic distribuţia spaţială, am impus separarea populaţiilor în două
grupuri, un grup în partea de centru vest a României, luând în considerare populaţiile
din Transilvania şi Banat, împreună cu populaţia din nord vestul Ungariei, Fenyőfő, şi
un grup al populaţiilor în afara Arcului Carpatic, populaţiile din Vâlcea, Vrancea,
Suceava împreună cu populația din vestul Ungariei, Velemér.
Analizând populaţiile din primul grup, impunând 5 clustere, am obţinut un
maxim de 3 clustere. Primul cluster conţinând populaţia din Agnita, care am observat
din nou ca se diferenţiază de restul populaţiilor, un al doilea cluster conţinând
majoritatea populaţiilor, inclusiv populaţia din Ungaria, care nu se diferenţiază la
nivelul markerilor nucleari de celelalte populaţii, şi un al treilea cluster care conţine
populaţia din Baia de Arieş. Observând frecvenţa indivizilor din analiza grupării pe
indivizi, observăm o lipsă de variabilitate comparativ cu celelalte populaţii. În această
21
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
populaţie fiind incluşi indivizi din doar două clustere. Acest lucru se poate datora
managementului forestier, datorită folosiri de puieți, proveniţi din aceeași sursă de
seminţe, la înființarea acestei suprafeţe forestiere.
Forţând gruparea populaţiilor în două clustere observăm alipirea populaţiei din
Baia de Arieş la clusterul conţinând restul populaţiilor, rămânând un alt cluster
conținând populaţia din Agnita. Acest lucru se datorează faptului ca populaţia din Baia
de Arieş conţine indivizi din cele două cele mai frecvente clustere de indivizi, de aici
şi similaritatea ridicată, comparativ cu populaţia din Agnita.
Analiza grupului de populaţii din exteriorul Arcului Carpatic, impunând
formarea de 5 clustere, am obţinut un maxim de 3 clustere. Primul cluster conţinând
populaţia din Suceava, aceasta datorându-se variabilităţii mari întâlnite la nivelul
acestei populaţii. Acest lucru poate fi observat prin prezenţa în această populaţie a
indivizilor din toate cele 5 clustere de indivizi, dar separarea se datorează şi prezenţei
unui număr mare de indivizi din primul cluster, mai mare comparativ cu populaţia din
Vrancea, acest grup de indivizi neregăsindu-se în populaţia din Vâlcea. Al doilea
cluster grupează populaţiile din Vrancea şi Velemér, datorită similarităţii distribuţiei
alelelor. Al treilea cluster conţine populaţia din Vâlcea, despre diferenţierea căreia am
discutat deja.
Forţând formarea a numai 2 clustere, se observă gruparea populaţiei din
Suceava în clusterul format anterior de populaţiile din Vrancea şi Velemér. Populaţia
din Vâlcea rămâne în continuare în cluster diferit.
Populaţia din Vâlcea pare sa fie cea mai diferită populaţie dintre cele luate în
studiu în cadrul acestei populaţii au fost observate atât frecvenţe alele alelelor mult
diferite faţă de medie cât şi prezenţa unui număr mare de alele private. Următoarea
populaţie care se diferenţiază de restul populaţiilor este cea din Agnita şi este urmată
de populaţiile din Baia de Arieş şi Suceava.
5.4.2 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice şi a domeniilor
teritoriale.
Acest tip de algoritm se bazează pe teselaţia liberă, şi se numește aşa deoarece
poligoanele sunt independente de situl de prelevare a probelor. Ideea centrală este ca
indivizii vecini au o probabilitate mai mare sa fie similari. Analiza datelor prin această
22
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
metodă necesită două etape. Prima, definirea vecinilor, în cazul teselaţiei, vecinătatea
indivizilor se bazează pe vecinătatea poligoanelor de care aparţin. A doua, modelarea
probabilităţii ca indivizii vecini sa fie și similari. Rezultatul analizei este reprezentarea
grafică a poligoanelor în diferite culori. Fiecare culoare reprezintă aparţinerea
populaţiei sau a populaţiilor, din acel poligon, unui cluster. Această metodă este greoi
de interpretat şi necesită experienţă, deoarece fiecare grafic este generat diferit în
funcţie de schema de recoltare a probelor.
Se poate observa lipsa unei structuri, între populaţiile luate în studiu. Clustere
unice au fost observate la nivelul populaţiilor din Timiş, Hunedoara, Sebeş,Vâlcea,
Agnita, Vrancea, Suceava şi Baia de Arieş. Aceste Rezultate susţin rezultatele obţinute
în urma analizei distribuţiei spaţiale cu ajutorul programului BAPS. Populaţiile
menţionate mai sus prezentând diferenţieri profunde la nivelul frecvenţelor alelelor.
5.4.3 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza metodelor de coordonare
Cea mai populară metodă este PCA (principal components analysis). Metoda
transformă un set de observaţii a unor variabile posibil corelate în valori necorelate
numite componente principale care ulterior pot fi ordonate (JOMBART et al., 2009
review).
Analiza PCA a componentelor principale calculate pe baza frecvenței alelelor a
dovedit existența unei zone cu frecvente scăzute, și anume populațiile din Baia de
Arieș, Sebeș, Hunedoara și Vâlcea. În aria de studiu pot fi observate și două zone unde
PCA a determinat o frecvență foarte ridicată, prima zonă fiind în centrul țării și
cuprinde populațiile din Agnita, Gurghiu, Reghin și Toplița, a doua zonă cuprinde
populația din Timiș și Caraș-Severin. Cu valori medii ale frecvenței alelelor s-au
prezentat populațiile din Brașov, Fenyőfő, Velemér, Suceava și Vrancea. În cadrul
acestei analize observam formarea a 5 clustere, două cu frecvențe alelice ridicate, două
cu frecvențe alelice medii, și un cluster cu frecvența alelică scăzută.
5.4.4. Testul Mantel
Testele Mantel (MANTEL, 1967) sunt folosite, de obicei, pentru a evalua
corelaţia dintre asemănările şi diferenţele între matrici (MANTEL 1967; SOKAL şi
ROHLF 1995).
23
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Corelaţia dintre distanţa genetică şi distanţa geografică, a fost determinată prin
testul Mantel în programul AIS “Allele în Space” (MILLER, 2005).
Rezultatele testului Mantel indică o valoare negativă a coeficientului de
corelaţie (r) între distanţa genetică şi distanţa geografică de -0,0582 nesemnificativ
statistic, cum de altfel se aştepta luând în calcul aşezarea geografică şi orografia
regiunii luate în studiu.
Analiza autocorelaţiei spaţiale a fost folosită în vederea evidențierii structurii
genetice spaţiale.
Această analiză a urmărit analiza distribuţiei spaţiale a frecvenţelor alelice
pentru fiecare populaţie. În cazul de faţă, coeficientul de autocorelaţie a fost calculat
ca medie a tuturor locilor polimorfici, pentru 10 clase de distanţă a câte 100 km
fiecare. Calculele privind autocorelaţia spaţială au fost efectuate cu ajutorul
programului AIS (MILLER 2005).
Pentru populaţiile din România şi Ungaria pe baza rezultatelor ADN-ului
nuclear valoarea distanţei genetice calculată pentru fiecare clasă de distanţă Ay a avut
valori cuprinse între 0.53 şi 0.63. Pentru media distanţei genetice s-a înregistrat o
valoare de Ay = 0.5870 ceea ce denotă faptul că indivizii din fiecare clasă de distanţă
sunt diferiţi din punct de vedere genetic.
Se observă însă lipsa autocorelaţiei spaţiale în cazul datelor analizate. Nu există
o izolare a populaţiilor, diferențele dintre populații nu sunt datorate distanței, de
exemplu populaţiile din Ungaria şi cea din Suceava sau Vrancea sunt situate la o
distanţă foarte mare una de cealaltă însă diferențele genetice nu sunt datorate distanței.
Aceste rezultate sunt similare cu rezultatele Testului Mantel, evidențiind
aceeași idee şi anume, lipsa unei corelaţii între distanţa genetică dintre
indivizi/populaţii şi distanţa geografică. Diversitatea dintre indivizi, respectiv populaţii
s-a datorat mai degrabă orografiei, munţilor.
Metoda interpolării a fost folosită pentru vizualizarea modelerelor diversităţii
genetice în conformitate cu terenul/relieful zonei analizate. Am utilizat această metodă
pentru a “întării”, confirma rezultatele obţinute cu ajutorul programului BAPS și
TESS. Cum a fost de așteptat nu există o grupare clară a populațiilor, structura lipsind.
24
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
5.4.5 Coeficientul de consangvinizare
Deși nu există o evidențiere a unei structuri spațiale specifice iar analizele
efectuate au evidențiat o depresiune populațională foarte evidentă în toate populațiile,
aceste lucruri nu sunt datorate consangvinizării.
Folosind programul Coancestry (WANG, 2007), am obținut coeficientul de
înrudire după RIRLAND, 1996. Acesta este, nesemnificativ pentru toate populațiile.
6 CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
Extracţia ADN a dat rezultate satisfăcătoare cu ambele protocoale folosite.
Markerii SSR nucleari sunt markerii ideali pentru determinarea variabilității și
diferențierii în populații de pin silvestru. Deși disponibilitatea de markeri este limitată
la această specie, ei pot fi cu succes transferați de la alte specii ale aceluiași gen.
În cadrul acestui studiu s-a reuşit transferarea de amorse SSR de la Pinus taeda
la Pinus sylvestris.
Amorsei SSR M13 prezintă amplificare nespecifică de aceea nu au putut fi
folosiţi în acest studiu.
S-a reușit dezvoltarea a doua protocoale multiplex la Pinus sylvestris.
În cazul stemelor multiplex, ampliconii cu dimensiuni mici au emis un semnal
fluorescent mult mai puternic decât cei cu dimensiuni mari, datorită timpului necesar
pentru elongaţie diferit. Semnalul ampliconilor mici a fost suficient de puternic sa
inducă o eroare senzorului laser, semnalul fluorocromului albastru fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului verde, semnalul fluorocromului verde fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului albastru iar semnalul fluorocromului negru fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului albastru, datorită absorbanţei similare.
Concentraţia iniţială recomandată de manualul de utilizare a kitului a fost
schimbată, concentraţia amorselor cu ampliconi mici a fost scăzută iar concentraţia
amorselor cu ampliconi mari a fost crescută pentru a putea observa semnalul emis de
aceştia. Balansarea concentraţiilor amorse a fost realizată la fiecare placă în parte
încetând sa obţinem cromatograme cu semnal cât mai curat. De asemenea a fost
observat un semnal mult mai slab al fluorocromului D2, de aceea nu au fost folosiți.
Volumul final al amestecului de amplificare a fost redus şi el la 10 µl (2,5 µl
Master mix, mix de amorse cu volum variabil, apă ultra pură în volum variabil, 0,1 µl
25
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Q, 1 µl ADN 50ng⁄µl) pentru a reduce costurile de analiză, ţinând cont ca pentru
migrarea în electroforeza capilară a fost nevoie de 1 µl de produs PCR.
De asemenea volumul bufferului de încărcare şi volumul de standard intern din
kitul de analiza prin electroforeza capilară au fost reduse pentru reducerea costurilor.
Volumul de Formamida folosit şi volumul de standard intern au fost reduse din acelaşi
considerent. Volumul pentru restul reactivilor a rămas neschimbat pentru buna
funcționare a electroforezei capilare.
După optimizarea sistemului multiplex la pinul silvestru, putem concluziona că
această metodă a crescut eficienţa procesului de genotipizare, a redus substanţial
costurile şi timpul de lucru necesar pentru genotipizarea unui număr mare de probe.
Toate probele prelevate din România şi Ungaria au fost analizate folosind
sistemul multiplex cu amorsei testaţi în multiplexul 1 și 2. A fost observat un
polimorfism crescut în ceea ce privește locusul amplificat de amorsa SPAC 12:5,
locusul amplificat de amorsa PtTx 3020, au prezentat un polimorfism scăzut, iar restul
locilor amplificaţi au prezentat polimorfism mediu.
La locusul SPAC 12:5 au fost observate 45 de alele iar la locusul PtTx 3020 au
fost evidențiate 9 alele.
Markerii nucleari sunt ideali în analiza variabilității în populații, spre deosebire
de markerii mitocondriali și cloroplastici care sunt folosiți în special pentru a evidenția
structura genetica a populațiilor în timp și spațiu.
La nivelul markerilor nuclear nu a fost observată o structură spațială clară.
Acest lucru se datorează atât transmiterii pe cale maternal cât și pe cale paternală a
acestor marker, cât și datorită proceselor de recombinare.
Gruparea anumitor populații în clustere diferite se datorează alelelor private
evidențiate la diferiți loci.
Diferenţierea genetică a populaţiilor de pe teritoriul României nu se datorează
distanţei geografice dintre acestea ci mai degrabă datorită orografiei, munţilor. În acest
sens Munții Carpaţii au funcţionat ca o barieră cu privire la diversitatea genetică dintre
populaţiile de pin silvestru, respectiv în procesul de reproducere, (diseminare a
seminţelor, polenului) şi schimbului de gene între populaţii.
26
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
În toate populațiile studiate pot fi observate, pe baza rezultatelor obținute,
evidențe clare a unei depresiuni genetice anterioare. Declinul populațional își are
originea în era glaciară (acum 1000 de generații, 20000 de ani) și continuă și astăzi.
Rezultatele obținute demonstrează clar că populațiile de pin silvestru din România și
Ungaria au fost timp îndelungat sub influența driftului genetic și a presiunii selective.
Această ipoteză a fost verificată cu ajutorul analizei M-stat propusă de GARZA și
WILLIAMSON în 2001.
Fluctuațiile observate în populații, alelele unice, gruparea populațiilor în
clustere și diferențierea populațiilor pot fi folosite în conturarea strategiilor de
conservare.
Efecte profunde ale acestui proces de depresie explică valori așa de scăzute la
nivelul acestui indice. Simulări realizate de GARZA și WILLIAMSON în 2001 au
arătat că unei populații, care a suferit un declin major și dimensiunea populației
rămâne mică, îi sunt necesare câteva sute de generații pentru ca acest indice a crească
la nivelul normal.
Posibilitatea ca o parte populațiile din România sa fie la rândul lor relict glacial,
împreună cu cele din Ungaria și Bulgaria. În plus față de efectele migrației post
glaciale, istoria și izolarea geografică a putut contribui la depresia populațională
observată din analizele efectuate.
Analizele statistice au dovedit ca nu există consangvinizare între populații.
Se recomandă menținerea resurselor genetice în această distribuție prin
folosirea in repopulare a puieților proveniți din surse de semințe situate în aceeași zonă
geografică.
Recomandăm de asemenea continuarea cercetărilor în ceea ce privește
populațiile de pin silvestru din România, prin intermediul studiilor bazate pe urmărirea
caracterelor fenotipice. Acest lucru poate fi realizat prin înființarea de loturi
experimentale, în diferite regiuni ale țării, cu diferite proveniențe de pin silvestru,
pentru evaluarea acestor caractere.
27
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
Bibliografie selectivă
Selective references
1. AL-RABAB’AH M.A., WILLIAMS C.G. 2004, An ancien bottleneck în the
Lost Pines of central Texas. Mol Ecol 13:1075–1084
2. AUCKLAND L.D., BUI T., ZHOU Y., SHEPHERD M., WILLIAMS C.G.
2002. Conifer Microsatellite Handbook. College Station, TX, USA Texas A & M .
University
3. DOYLE J.J.D. ŞI DOYLE J.L., 1987, A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin of the American
Mathematical Society 19: 1-15.
4. GARZA J.C., WILLIAMSON E. 2001 Detection of reduction in population size
using data from microsatellite DNA. Molecular Ecology 10: 305-318
5. MANTEL, N.A. 1967. The detection of disease clustering and a generalized
regression approach. Cancer Res. 27: 209 – 220
6. MILLER M.P. 2005. Alleles In Space: Computer software for the joint analysis
of interindividual spatial and genetic information. J Hered 96: 722–724.
7. NAYDENOV K.D., M.K. NAYDENOV, F. TREMBLAY, A.
ALEXANDROV, L.D. AUBIN-FOURNIER 2011. Patterns of genetic diversity that
result from bottlenecks în Scots Pine and the implications for local genetic
conservation and management practices în Bulgaria. New Forest 42:179–193
8. NEI M.,1972 Genetic distance between populations. The American Naturalist,
vol.106,pp. 291-296.
9. OSZLANYI J., GRODZINSKA K., BADEA O., SHPARYK Y., 2004, Nature
conservation în Central and Eastern Europe with a special emphasis on the Carpathian
Mountains. Environ Pollut 130: 127-134.
10. ROBLEDO-ARNUNCIO J.J., F. ROUSSET 2010 Isolation by distance în a
continuous population under stochastic demographic fluctuations. J Evol Biol
23(1):53–71
11. WANG J., 2007 Triadic IBD coefficients and applications to estimating parwise
relatedness. Genet. Res. 89:135-153
28
Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat
12. WORLDBANK 2002. Romania-Forest Development Program. Report No.
PID8602. The World Bank,Washington, USA.
29