Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PROTEOMSKA ANALIZA EPITELNOGA I VEZIVNOGATKIVA PARODONTA KOD PACIJENATA S AGRESIVNIMPARODONTITISOM
Badovinac, Ana
Doctoral thesis / Disertacija
2013
Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: University of Zagreb, School of Dental Medicine / Sveučilište u Zagrebu, Stomatološki fakultet
Permanent link / Trajna poveznica: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:127:469233
Rights / Prava: In copyright
Download date / Datum preuzimanja: 2021-11-03
Repository / Repozitorij:
University of Zagreb School of Dental Medicine Repository
Sveučilište u Zagrebu
STOMATOLOŠKI FAKULTET
Ana Badovinac
PROTEOMSKA ANALIZA EPITELNOGA I
VEZIVNOGA TKIVA PARODONTA KOD
PACIJENATA S AGRESIVNIM
PARODONTITISOM
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2013.
University of Zagreb
SCHOOL OF DENTAL MEDICINE
Ana Badovinac
PROTEOMIC ANALYSIS OF THE
EPITHELIAL AND CONNECTIVE
PERIODONTAL TISSUE IN PATIENTS WITH
AGGRESSIVE PERIODONTITIS
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2013
Sveučilište u Zagrebu
STOMATOLOŠKI FAKULTET
Ana Badovinac
PROTEOMSKA ANALIZA EPITELNOGA I
VEZIVNOGA TKIVA PARODONTA KOD
PACIJENATA S AGRESIVNIM
PARODONTITISOM
DOKTORSKI RAD
Mentori:
Doc.dr.sc. Darko Božić
Doc.dr.sc. Lovorka Grgurević
Zagreb, 2013.
University of Zagreb
SCHOOL OF DENTAL MEDICINE
Ana Badovinac
PROTEOMIC ANALYSIS OF THE
EPITHELIAL AND CONNECTIVE
PERIODONTAL TISSUE IN PATIENTS WITH
AGGRESSIVE PERIODONTITIS
DOCTORAL THESIS
Supervisors:
Doc.dr.sc. Darko Božić
Doc.dr.sc. Lovorka Grgurević
Zagreb, 2013
Rad je izrađen na Zavodu za parodontologiju Stomatološkog fakulteta Sveučilišta u
Zagrebu i u Centru za proteomiku Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
Istraživanje je provedeno uz potporu Ministarstva znanosti, obrazovanja i sporta pri
znanstvenom projektu “Sistemni aspekti u etiologiji parodontnih bolesti“ (065-0650444-0415)
voditelja prof.dr.sc. Darija Plančaka.
Mentor: Doc.dr.sc. Darko Božić, docent na Zavodu za parodontologiju Stomatološkog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
Komentor: Doc.dr.sc. Lovorka Grgurević, docent na Katedri za anatomiju i kliničku
anatomiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
Lektor hrvatskog jezika: Tanja Ratković, prof. hrvatskog jezika i književnosti, Zabočka 3,
10000 Zagreb, Hrvatska; telefon: +385915690344
Lektor engleskog jezika: Mirjana Travar Pugelnik, mr.sc. engleskog jezika, Huzjanova 10,
10000 Zagreb, Hrvatska; telefon: +385955605733
Rad sadrži: 107 stranica
9 slika
8 tablica
1 CD
Zahvaljujem se roditeljima na svemu što su mi omogućili i pružili u životu, posebno na
neizmjernoj podršci, brizi i ljubavi. Biti vaše dijete prava je privilegija pa se nadam da ću
vam uspjeti uzvratiti jednako lijepim osjećajima i životnim trenucima.
Zahvaljujem se mentoru doc.dr.sc. Darku Božiću na ideji istraživanja, uloženom vremenu,
trudu i živcima, te nesebično podijeljenom znanju i iskustvu, komentorici doc.dr.sc. Lovorki
Grgurević na pomoći u ključnim trenucima pripreme i izvedbe istraživanja, te prof.dr.sc.
Dariju Plančaku koji mi je omogućio da tjedne i tjedne provedem u laboratoriju i što je uvijek
tu kad ga zatrebam.
Veliko hvala Nikoli na razumijevanju i strpljenju za ''moju znanost'' i podršci koju mi je
pružio za vrijeme izrade doktorskog rada. Također hvala mom Cvrčku koji mi je dao snage,
volje i mira da dovršim pisanje rada.
I za kraj hvala Genadiju, kolegama i sestrama Zavoda za parodontologiju, Luki, Noni, te svim
dragim prijateljima na pomoći i podršci u ostvarivanju ovog rada.
SAŽETAK
Proteomske analize omogućuju iscrpan prikaz ekspresije proteina u različitim biološkim
uzorcima te predstavljaju napredan pristup u istraživanjima proteoma. Svrha ovog istraživanja
bila je dokazati da epitelno i vezivno tkivo parodonta zdravih ispitanika (kontrolna skupina) i
zdravog mjesta, mjesta s gingivitisom, parodontitisom i mjesta s parodontitisom nakon
terapije kod pacijenata s generaliziranim agresivnim parodontitisom (ispitivane skupine)
pokazuju različitu ekspresiju proteina.
U istraživanju je sudjelovalo osam pacijenata. Ispitivanu skupinu činila su četiri pacijenta s
dijagnozom generaliziranog agresivnog parodontitisa (dva muškarca i dvije žene), dok su
kontrolnu skupinu činila četiri ispitanika bez znakova parodontne bolesti kojima je razlog
dolaska bio kirurško produljenje krune zuba (dva muškarca i dvije žene). Uzorci epitelnog i
vezivnog parodontnog tkiva uzeti su pri provođenju inicijalne parodontološke terapije u
ispitivanoj skupini, a u kontrolnoj skupini tijekom indiciranog kirurškog zahvata. Uzorci su
pohranjeni u RNAlater tekućinu prema uputama proizvođača do analiza. Proteini tkivnog
lizata razdvojeni su 1D gel elektroforezom nakon koje je uslijedila digestija u gelu tripsinom
te mjerenje proteina pomoću nano-skale HPLC sistema preko nano-elektrospreja
ionizacijskog izvora i spektrometra mase. Dobiveni podaci obrađeni su u MaxQuant
programu.
Ukupan broj identificiranih proteina u istraživanju iznosio je 3420. Nakon statističke obrade
podataka izdvojena su 193 proteina koji su identificirani i kvantificirani u svim uzorcima, te
su u svim ispitivanim skupinama pokazali statistički značajnu promjenu ekspresije u odnosu
na kontrolnu skupinu. Proteini koji bi mogli biti obilježje zdravog parodonta jesu:
Multimerin-1, aneksini, 14-3-3 protein gamma; gingivitisa: Dedicator of cytokinesis protein
2, Band 3 anion transport protein; parodontitisa: Azurocidin, Myeloid cell nuclear
differentiation antigen, histoni, imunoglobulini, Prolargin; stanja poslije terapije:
Oligosaccharyltransferase complex subunit i Mimecan. Najzanimljiviji protein istraživanja je
Azurocidin koji pokazuje jaku ekspresiju u gingivitisu i parodontitisu. Rezultati istraživanja
pokazali su različitu ekspresiju proteina u ispitivanim skupinama te potvrdili da bi proteomske
analize parodontnog tkiva mogle pridonijeti boljem razumijevanju patogeneze parodontnih
bolesti, možda čak i napretku u dijagnostici i prognozi ovih bolesti.
Ključne riječi: agresivni parodontitis; gingivitis; proteomika; spektrometrija mase, biopsija,
identifikacija proteina, proteini
SUMMARY
Proteomic analyses enable large scale descriptions of protein expression in a variety of
biological samples, and provide an advanced approach in proteome research. The aim of this
study was to establish the changes in protein expression between the epithelial and connective
periodontal tissues samples in healthy subjects (control group) and healthy sites, sites with
gingivitis, periodontitis, and post treatment sites in patients suffering from generalized
aggressive periodontitis (test groups).
The study was conducted on eight patients divided into two groups. The test group consisted
of four patients with generalized aggressive periodontitis (two male, two female), and the
control group consisted of four subjects (two male, two female) with no signs of periodontal
disease, referred to the Department of Periodontology for crown lengthening procedure. The
epithelial and connective periodontal tissue samples in the test group were harvested during
initial periodontal treatment, and in the control group during the surgical procedure. Tissue
samples were stored in the RNAlater reagent according to the manufacturer’s instructions
until further analyses. Proteins from tissue lysate were separated by 1D gel electrophoresis, in
gel digested with trypsin, and measured by nano-scale HPLC system coupled to a mass
spectrometer through a nano-electrospray ionization source. The obtained raw data was
processed by MaxQuant software.
A total number of proteins identified in the study was 3420. After statistical processing of
data, a total of 193 proteins were identified and quantified in all samples, and showed
statistically significant changes in expression level between the control group and test groups.
Proteins that could possibly be a mark of periodontal health are: Multimerin-1, annexins, 14-
3-3 protein gamma; of gingivitis: Dedicator of cytokinesis protein 2, Band 3 anion transport
protein; of parodontitis: Azurocidin, Myeloid cell nuclear differentiation antigen, histones,
immunoglobulins, Prolargin; and of post treatment condition: Oligosaccharyltransferase
complex subunit and Mimecan. The most interesting protein in the study was Azurocidin,
showing the highest fold change in periodontitis and gingivitis. The results showed different
protein expressions in tested groups and confirmed that proteomic analyses of periodontal
tissue could contribute to a better understanding of the pathogenesis of periodontal diseases,
and might even contribute to the improvements in diagnosis and prognosis of these diseases.
Key words: aggressive periodontitis; gingivitis; proteomics; mass spectrometry; biopsy,
protein identification, proteins
Ana Badovinac, Disertacija
1
SADRŽAJ
1. UVOD ................................................................................................................................. 1
1.1. Građa parodonta .............................................................................................................. 2
1.1.1. Gingiva ........................................................................................................................ 3
1.1.2. Spojni epitel ................................................................................................................. 5
1.1.3. Parodontalni ligament, cement i alveolarna kost ......................................................... 8
1.2. Patogeneza parodontne bolesti i odgovor domaćina ..................................................... 10
1.2.1. Patohistološke promjene parodonta tijekom upale .................................................... 11
1.2.2. Karakteristike domaćina koje sprečavaju nastanak parodontitisa ............................. 13
1.2.3. Odgovor domaćina koji dovodi do destrukcije parodonta ......................................... 14
1.2.3.1. Prirođeni odgovor domaćina .................................................................................. 14
1.2.3.2. Stečeni odgovor domaćina ..................................................................................... 16
1.3. Agresivni parodontitis ................................................................................................... 19
1.3.1. Obilježja agresivnog parodontitisa ............................................................................ 19
1.3.2. Učestalost agresivnog parodontitisa .......................................................................... 20
1.3.3. Etiologija agresivnog parodontitisa ........................................................................... 21
1.3.4. Destrukcija parodontnih tkiva ................................................................................... 22
1.4. Proteomska istraživanja u parodontologiji .................................................................... 24
1.4.1. Proteomske analize i spektrometrija mase ................................................................. 24
1.4.2. Dosadašnja proteomska istraživanja u stomatologiji i parodontologiji ..................... 27
2. SVRHA ISTRAŽIVANJA ................................................................................................ 30
3. ISPITANICI I METODE .................................................................................................. 32
3.1. Odabir ispitanika ........................................................................................................... 33
3.2. Provođenje terapije i uzimanje uzoraka tkiva ............................................................... 33
3.3. Homogenizacija uzoraka ............................................................................................... 34
3.4. Gel elektroforeza ........................................................................................................... 35
3.5. Digestija u gelu .............................................................................................................. 36
3.6. Mikropročišćavanje i odsoljavanje peptida ................................................................... 37
3.7. Tekućinska kromatografija – Spektrometrija mase (LC-MS/MS) ................................ 38
3.8. Analiza podataka i statistička obrada ............................................................................ 38
4. REZULTATI ..................................................................................................................... 39
Ana Badovinac, Disertacija
2
4.1. Demografski podaci i klinički parametri ....................................................................... 40
4.2. Rezultati proteomskih analiza ....................................................................................... 41
4.2.1. Ukupan broj identificiranih proteina ......................................................................... 42
4.2.2. Zastupljenost proteina u ispitivanim skupina ............................................................ 43
4.2.3. Stupnjevi promjene proteina u ispitivanim skupinama ............................................. 45
4.2.4. Usporedba kontrolne skupine i zdravog mjesta ispitivane skupine ........................... 53
4.2.5. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s gingivitisom ispitivane skupine ................. 58
4.2.6. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom ispitivane skupine ............. 63
4.2.7. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom nakon terapije ispitivane
skupine .......................................................................................................................... 68
4.2.8. Analiza identificiranih proteina genskom ontologijom (GO) .................................... 73
5. RASPRAVA ..................................................................................................................... 74
6. ZAKLJUČCI ..................................................................................................................... 84
7. LITERATURA ................................................................................................................. 86
8. ŽIVOTOPIS .................................................................................................................... 104
Ana Badovinac, Disertacija
1
Popis oznaka i kratica
1D gel elektroforeza jednodimenzionalna gel elektroforeza
A. actinomycetemcomitans Aggregatibacter actinomycetemcomitans
ACN acetonitril
CEACAM1 od engl. Carcino-embryonic Ag-related cell adhesion
molecule 1
ELAM-1 endotelna leukocitna adhezijska molekula 1
FDR od engl. false discovery rate
GO genska ontologija
HPLC od engl. high pressure liquid chromatography
ICAM-1 intercelularna adhezijska molekula 1
Ig imunoglobulin
IL interleukin
INF interferon
LAP lokalizirani agresivni parodontitis
LC-MS/MS tekućinska kromatografija-spektrometrija mase
LFA-3 od engl. Lymphocyte function antigen-3
LFQ od engl. Label-free quantification
LPS lipopolisaharid
MaxQuant ID MaxQuant broj
MIF od engl. Macrophage migration inhibitory factor
MMP matriksna metaloproteinaza
Ana Badovinac, Disertacija
2
MS spektrometrija mase
P. gingivalis Porphyromonas gingivalis
PGE2 prostaglandin E2
PMN polimorfonuklearni leukocit
RANKL nuklearni faktor-κB lingand
SDS od engl. Sodium dodecyl sulphate
SDS-PAGE od engl. Sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel
electrophoresis
Th1 Th1-limfocit
Th2 Th2-limfocit
TNF-α faktor nekroze tumora α
TRY tripsin
Uniprot ID Uniprot identifikacijski broj
Ana Badovinac, Disertacija
1
1. UVOD
Ana Badovinac, Disertacija
2
1.1. Građa parodonta
Parodont (grč. peri - okolo, odontos - zub), kako i sama riječ govori, potporno je tkivo oko
zuba. Glavna mu je uloga pričvršćivanje zuba uz koštano tkivo čeljusti i zadržavanje
integriteta površine mastikatorne sluznice usne šupljine. Osnovni su dijelovi parodonta:
gingiva, parodontalni ligament, cement i alveolarna kost (Slika 1.). Gingiva štiti tkiva ispod
nje dok cement, parodontalni ligament i alveolarna kost predstavljaju pričvrsni aparat
parodonta. Parodont nije tkivo koje miruje, već podliježe čestim funkcionalnim i morfološkim
promjenama, te promjenama koje su povezane s promjenama u oralnoj okolini (1).
Slika 1. Osnovni dijelovi parodonta: gingiva, parodontalni ligament, cement i alveolarna kost.
(Preuzeto iz Medical-dictionary.thefreedictionary.com [homepage on the Internet]. [posjećeno
4. ožujka 2013.]. Available from: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com
/periodontium)
Ana Badovinac, Disertacija
3
1.1.1. Gingiva
Gingiva je dio mastikatorne mukoze koji prekriva alveolarni nastavak čeljusti i okružuje
cervikalni dio zuba. Makroskopski gledano, gingiva se dijeli na slobodnu i pričvrsnu gingivu.
Iako oba tipa gingive pokazuju varijacije u diferencijaciji, histologiji i debljini, zajednička im
je specifična struktura koja omogućava odgovarajuće funkcioniranje protiv mehaničkih i
mikrobima izazvanih oštećenja (2). Osim toga, takva struktura pruža i dobru obranu protiv
prodiranja mikroorganizama i štetnih tvari u dublje dijelove tkiva. Slobodna gingiva obuhvaća
gingivna tkiva vestibularno i oralno od zuba te interdentalnu gingivu. Široka je oko 1 mm, a
proteže se od slobodnoga gingivnog ruba do gingivne brazde koja se nalazi na mjestu koje
odgovara razini caklinsko-cementnog spojišta (3). Slobodna gingiva formira gingivni sulkus
prosječne dubine od 0.69 do 1.5 mm (4). To je prostor koji se nalazi oko zuba i čija je dubina
izuzetno važan klinički i dijagnostički parametar. Na slobodnu gingivu se prema apikalno
nastavlja pričvrsna gingiva koja seže sve do mukogingivnog spojišta. Pričvrsna gingiva je
vezivnim vlaknima čvrsto vezana za alveolarnu kost i cement, a širina joj pokazuje varijacije
ovisno o različitim dijelovima usta i o dobi ispitanika (5).
Mikroskopski gledano gingiva je sastavljena od višeslojnoga skvamoznog keratiniziranog
epitela i vezivnog tkiva. Ovisno o stupnju diferencijacije stanica koje proizvode keratin, epitel
je podijeljen na četiri glavna sloja: bazalni sloj, sloj šiljatih stanica, sloj granuloznih stanica i
površinski sloj keratiniziranih stanica. Osim stanica koje proizvode keratin u epitelu se
pojavljuju i bistre stanice. Taj naziv dobile su zbog svjetlije obojene jezgre. Uloga bistrih
stanica vrlo je raznolika, Merkelove stanice imaju senzoričku funkciju, Langerhansove
sudjeluju u obrani oralnog epitela, a melanociti su zaduženi za sintezu melanina. Uz njih u
području epitela nalaze se i brojne upalne stanice (6).
Ana Badovinac, Disertacija
4
Slika 2. Shematski prikaz koji opisuje sastav gingive i kontaktnog područja između gingive i
cakline zuba (preuzeto iz: Lindhe J, Lang NP, Karring T. Clinical Periodontology and Implant
Dentistry. 5th ed. Oxford: Blackwell Publishing Ltd; 2008.)
Epitel koji pokriva područje slobodne gingive dijeli se na: oralni epitel, oralni sulkusni epitel i
spojni epitel (Slika 2.). Oralni epitel je dio epitela slobodne gingive koji je okrenut prema
usnoj šupljini, dok je oralni sulkusni epitel okrenut prema zubu, ali nije u dodiru s njim.
Spojni epitel je epitel koji osigurava čvrst kontakt između gingive i zuba. Morfološki se
razlikuje od prethodna dva, a na granici s vezivnim tkivom nema karakterističnih zupca pile.
Budući da spojni epitel ima slobodnu površinu koja se nalazi na dnu gingivnog sulkusa, u
stalnom je kontaktu s različitim štetnim čimbenicima (1). Stanice spojnog epitela zaslužne su
za sintezu mnogobrojnih molekula uključenih u obranu protiv bakterija i njihovih produkata.
Osim toga, dolazi i do ekspresije mnogobrojnih molekula koje potiču migraciju
polimorfonuklearnih leukocita prema dnu gingivnog sulkusa (7).
Ana Badovinac, Disertacija
5
1.1.2. Spojni epitel
Spojni epitel je komponenta dento-gingivnog kompleksa koji je u kontaktu s površinom zuba.
Razvija se prilikom erupcije zuba kada se susretnu reducirani caklinski epitel i oralni gingivni
epitel. Proces transformacije reduciranoga caklinskog epitela u stanice spojnog epitela vrlo je
spor. Reducirane caklinske stanice transformiraju se tako da iz kubičnog oblika prelaze u
spljoštene stanice paralelne s caklinom zuba. Rezultat transformacije je višeslojni
nekeratinizirani skvamozni epitel, tj. spojni epitel. On se sastoji od dva sloja: bazalnog sloja s
kubičnim stanicama i suprabazalnog sloja gdje su stanice već izduženog oblika. Za razliku od
drugih vrsta epitela, stanice spojnog epitela povezane su sa samo nekoliko dezmosoma i
ponekom spojnom pukotinom (8). Takva građa dovodi do značajne permeabilnosti spojnog
epitela. Međustanični prostor također je bitan jer omogućava prolazak gingivne tekućine i
leukocita. Prema istraživanju Shiötta i Löea, otprilike 30 000 polimorfonuklearnih neutrofila
migrira kroz klinički zdrav spojni epitel u minuti (9). Takav je protok izuzetno bitan jer
predstavlja način na koji se domaćin brani od stalnog bakteriološkog izazova i ovisan je o
stupnju upale. U intersticijskom prostoru spojnog epitela nalaze se antigen prezentirajuće
stanice, Langerhansove stanice, dendritične stanice i mononuklearni leukociti. Neutrofilni
granulociti mogu se pronaći u središnjem dijelu spojnog epitela blizu površine zuba, dok se
limfociti i makrofagi nalaze dublje u epitelu blizu bazalnog sloja (10).
Spojni epitel nalazi se između gingivnog sulkusa nastanjenog različitim mikroorganizmima i
mineraliziranoga vezivnog tkiva koje zahtijeva zaštitu od moguće izloženosti bakterijama i
njihovim proizvodima (6). Takav položaj čini ovaj epitel vrlo specifičnom i strateški vrlo
važnom površinom koja se strukturalnom i funkcionalnom prilagodbom odupire stalnom
mikrobiološkom izazovu. Za razliku od ostalih vrsta epitela spojni epitel nema sloj
keratiniziranih stanica koje bi činile fizičku barijeru te taj nedostatak nadopunjava posebnom
strukturom, i suradnjom epitelnih i ostalih stanica. Unatoč navedenim specifičnostima
obrambeni mehanizmi spojnog epitela ponekad nisu dovoljni te dolazi do razvoja gingivne i
parodontne lezije. Parodontopatogene bakterije, posebice Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) i Porphyromonas gingivalis (P.
gingivalis), razvili su način kojim uspijevaju narušiti strukturalni i funkcionalni integritet
spojnog epitela. Spojni epitel tada prelazi u epitel džepa i postaje predmetom mnogobrojnih
istraživanja i obilježjem progresije gingivitisa u parodontitis (7). Način na koji tkivo održava
integritet također se smatra pitanjem čiji bi odgovori mogli pridonijeti razjašnjavanju mnogih
Ana Badovinac, Disertacija
6
nepoznatih faktora u inicijaciji parodontne bolesti. U prilog tome govori i činjenica da stanice
spojnog epitela pokazuju ekspresiju mnogobrojnih adhezivnih molekula, prije svega integrina
i kadherina (11).
Integrini su površinski receptori koji posreduju u kontaktu stanica i ekstracelularnog matriksa
te pridonose međustaničnoj adheziji (12). Promijenjena ekspresija tih molekula mogla bi
upućivati na promijenjen integritet tkiva budući da pokazuje mogućnost interakcije s
matriksnim komponentama spojnog epitela. Osim njih od značajnog su interesa i kadherini.
Oni su odgovorni za uski međustanični kontakt koji je iznimno važan aspekt parodontne
bolesti budući da dolazi do patoloških promjena spojnog epitela prilikom stvaranja
parodontnog džepa. E-kadherini su epitelno specifične adhezivne molekule koje igraju važnu
ulogu u održavanju tkivnog integriteta (11, 13). Prema studiji Ye i sur. E-kadherin se
pojavljivao u manjem intenzitetu u tkivu spojnog epitela nego u oralnom epitelu gingive, dok
Heymanna i sur. njegovu ekspresiju u spojnom epitelu nisu identificirali (14, 15). Druga
zanimljiva molekula je Carcino-embryonic Ag-related cell adhesion molecule 1
(CEACAM1). Ta molekula pokazuje veću ekspresiju u spojnom epitelu, nego u oralnom
sulkularnom epitelu te se eksprimira na polimorfonuklearnim leukocitima (PMN), epitelu i
endotelu krvnih žila. Budući da u svakoj minuti velik broj PMN-a prolazi kroz spojni epitel,
Hyman i sur. smatraju da je upravo ekspresija CEACAM1 na površini PMN-a odgovorna za
prolazak i vođenje PMN-a kroz spojni epitel (15). Osim toga, CEACAM1 sudjeluje u
regulaciji stanične proliferacije, stimulacije i koregulacije aktiviranih T-limfocita (16, 17). Još
jedna zanimljiva uloga CEACAM1 molekule je njezina funkcija da služi kao stanični receptor
za različite bakterije (18).
Osim navedenih adhezivnih molekula ekspresiju u spojnom epitelu pokazuju i druge
molekule. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) i Lymphocyte function antigen-3
(LFA-3) su adhezivne molekule, pripadaju obitelji imunoglobulina i pokazuju ekspresiju u
tkivu spojnog epitela. ICAM-1 je imunoglobulinu sličan transmembranski glikoprotein koji
posreduje u međustaničnim interakcijama prilikom upalnih događaja. Svoju funkciju obavlja
kao ligand za β2 integrine prisutne na leukocitima kontrolirajući tako migraciju leukocita u
upalnom tkivu (19-21). Tonetti smatra da je uspostavljanje gradijenta ICAM-1 unutar spojnog
epitela važan mehanizam za vođenje PMN-a prema dnu gingivnog sulkusa gdje se PMN
mogu suprotstaviti bakterijskom izazovu (21). U spojnom epitelu visoku ekspresiju pokazuje i
kemotaktični citokin Interleukin-8 (IL-8) koji svojom prisutnošću ukazuje na još jedan
mehanizam kojim se PMN usmjeravaju prema mjestima bakterijskog izazova (21, 22).
Ana Badovinac, Disertacija
7
Citokini Interleukin-1α (IL-1α), Interleukin-1β (IL-1β) i Tumor necrosis factor-α (TNF-α)
također pokazuju jaku ekspresiju u koronalnom dijelu spojnog epitela, te je u gotovo svim
stanicama spojnog epitela dokazana jaka ekspresija navedenih citokina nakon izlaganja
lipopolisaharidima (LPS) (23). Stvaranje citokina od strane stanica spojnog epitela i
makrofaga, koji se nalaze u površinskom dijelu spojnog epitela, potvrđuju njihovu ulogu u
obrani od bakterija prisutnih u gingivnom sulkusu. Time se vidi da spojni epitel nije samo
epitel koji pruža pričvršćivanje za površinu zuba, već je i vrlo aktivno mjesto u kojem se
događa cijeli niz interakcija na razini domaćin-mikroorganizam.
Čimbenici rasta i odgovarajući receptori, tkivni plazminogeni, antimikrobni peptidi i proteini,
također su bili predmet istraživanja u spojnom epitelu. Epidermalni čimbenik rasta (engl.
Epidermal growth factor, EGF) je potentni mitogen koji sudjeluje u rastu epitela,
diferencijaciji i cijeljenju rana, djelujući preko EGF-receptora na površini stanice. Ekspresija
EGF-receptora u spojnom epitelu zdrave humane gingive vrlo je slaba ili čak neprimjetna,
dok je kod pacijenata s kroničnim parodontitisom vrlo jaka (24). U spojnom epitelu prisutan
je i Tissue plasminogen activator, serinska proteinaza koja pretvara plazminogen u plazmin.
Plazmin degradira mnoge izvanstanične matriksne proteine i aktivira matriksne
metaloproteinaze (MMP). Proteolitički enzim Matrilizin (Matrix metalloproteinase-7, MMP-
7) pokazuje ekspresiju u suprabazalnim stanicama spojnog epitela (25, 26). Antimikrobne
molekule koje se povezuju s parodontnim zdravljem su α i β defenzini, Katlicidin LL-37 i
Kalprotektin, međutim ekspresiju u spojnom epitelu prokazuju jedino LL-37 i α-defenzin.
Razlog tomu mogao bi biti u njihovu podrijetlu, naime i LL-37 i α-defenzin produkti su PMN-
a, koji i na taj način štite spojni epitel (27).
Prema gore navedenom vidljivo je da spojni epitel pokazuje nekoliko jedinstvenih
strukturalnih i funkcionalnih obilježja koji sprečavaju kolonizaciju patološke mikrobne flore u
dublje slojeve parodonta (28). Čvrsta veza spojnog epitela s površinom zuba stvara epitelnu
barijeru bakterijama prisutnima u zubnom plaku. Spojni epitel omogućuje prolazak gingivne
tekućine, upalnih stanica i obrambenih stanica od strane domaćina u prostor ruba gingive. I
završno, stanice spojnog epitela karakterizira brza izmjena koja pridonosi ravnoteži između
domaćina i mikroorganizama te brzom oporavku oštećenog tkiva (29). Prema navedenim
karakteristikama jasno je zašto je spojni epitel razlog brojnih istraživanja i zašto se
promatranjem njegove strukture i sadržaja pokušava doći do pojašnjenja mnogih nepoznanica
u patogenezi parodontnih bolesti.
Ana Badovinac, Disertacija
8
1.1.3. Parodontalni ligament, cement i alveolarna kost
Četiri glavne komponente parodonta, gingiva, parodontalni ligament, cement i alveolarna
kost, zaslužni su za održavanje zuba u funkciji. Iako se nalaze na različitim područjima oko
zuba, i iako su im arhitektura tkiva i biokemijski sastav različiti, zajedno funkcioniraju kao
jedna jedinica. Dokazuje to i Bartoldovo istraživanje u kojem je uočeno da komponente
izvanstaničnog matriksa jedne parodontne strukture mogu utjecati na staničnu aktivnost
susjednih parodontnih struktura (30).
Parodontalni ligament je mekano vezivno tkivo bogato stanicama i krvnim žilama, okružuje
zub i spaja cement korijena zuba s alveolarnom kosti. Prostor ligamenta ima oblik pješčanog
sata i prosječna mu je širina oko 0,25 mm, međutim širina prostora nije konstantna tijekom
cijeloga životnog vijeka, već ovisi o opterećenju zuba. Kod zuba koji nisu u funkciji širina se
prostora smanjuje, dok se kod preopterećenih zuba prostor parodontalnog ligamenta sve više
širi (31). Glavna je funkcija ligamenta raspodjela i resorpcija sila koje se javljaju prilikom
žvakanja i ostalih pokreta prilikom kojih dolazi do kontakata sa zubima. Takvu funkciju
ligamenta omogućavaju glavna vlakna sastavljena od kolagena koja su ujedno i glavni
gradivni element. Osim kolagenih, parodontalni ligament sadržava i nekolicinu elastičnih
vlakana koja su u vezi s krvnim žilama, te oksitalanska vlakna još uvijek nepoznate funkcije.
Od stanica prevladavaju fibroblasti, osteoblasti, cementoblasti, osteoklasti, živčane i epitelne
stanice (1).
Cement je mineralizirano, avaskularno mezenhimalno tkivo koje prekriva korijen zuba.
Postoje dva glavna tipa cementa, a to su: acelularni (primarni) i celularni (sekundarni). Oba
tipa cementa sastoje se od kolagenih vlakana i kalcificiranog organskog matriksa. Zreli
cement pokazuje ekspresiju različitih proteina koji promiču migraciju i pričvršćivanje stanica,
te potiču sintezu proteina u stanicama gingivnih fibroblasta i stanica parodontalnog ligamenta
(32). Najčešće spominjani adhezivni proteini pronađeni u cementu su koštani Sialoprotein,
Osteopontin i Osteonectin (33, 34). Osim navedenih proteina, u cementu se pojavljuju i tkivno
specifični proteini Cementum attachment protein (CAP) i Cementum-derived growth factor
(CGF). CAP je zadužen za promoviranje adhezije i podjelu mezenhimalnih stanica, dok CGF
pojačava proliferaciju gingivnih fibroblasta i stanica parodontnog ligamenta (35, 36).
Kolagena vlakna cementa nastaju od fibroblasta i zovu se Sharpeyeva vlakna (ekstrinzična) ili
od cementoblasta pa se zovu unutarnja (intrinzična) vlakna. Osim podjele na acelularni i
Ana Badovinac, Disertacija
9
celularni, cement se dijeli i na acelularni cement sastavljen od ekstrinzičnih vlakana, celularni
miješani slojeviti cement i celularni cement sastavljen od intrinzičnih vlakana. Cement je
tvrdo zubno tkivo koje ne podliježe fiziološkoj resorpciji i pregradnji, ali pod utjecajem
lokalnih i sistemskih čimbenika može doći do tih procesa (1).
Alveolarna kost je dio maksile i mandibule koja tvori i podupire zubne alveole. Sastoji se od
tri glavna dijela: vanjske ploče (kortikalne kosti), unutarnjeg zida (kompaktne kosti) i
spongioznog dijela između. Kompaktna kost se na rendgenogramu vidi kao tanka bijela linija,
nazvana kao lamina dura. U kompaktnoj kosti postoji niz Volkmannovih kanala kroz koje iz
alveolarne kosti u parodontni ligament prolaze krvne i limfne žile te živčana vlakna (1).
Alveolarna kost stvara se prilikom nicanja zuba, ali se isto tako i resorbira nakon gubitka
zuba. Budući da je alveolarna kost struktura koja ovisi o zubu, veličina, oblik, lokacija i
funkcija zuba određuju njezinu morfologiju (37). Kost se sastoji od anorganskog i organskog
dijela, a stanice koje prevladavaju su osteoblasti i osteoklasti. Prilikom remodelacije i obnove
koštanog tkiva osteoblasti stvaraju novu kost, dok su osteoklasti zaduženi za resorpciju (38).
Iako se unutarnja organizacija koštanog tkiva stalno mijenja, tkivo ostaje vrlo slično kroz
cijeli život.
Ana Badovinac, Disertacija
10
1.2. Patogeneza parodontne bolesti i odgovor domaćina
Glavna zbivanja koja se događaju u parodontu tijekom gingivitisa i parodontitisa upalne su i
imunološke reakcije na mikroorganizme biofilma na površini zuba i na njihove produkte. Cilj
je takvih zbivanja sprečavanje mikroorganizama da se prošire i invadiraju u tkiva, međutim
prilikom obrane domaćina često dođe i do oštećenja susjednih stanica i tkiva. Napredovanjem
bolesti upala se širi u vezivno tkivo te se sve više približava alveolarnoj kosti (Slika 3.).
Slika 3. Prikaz širenja upale u parodontnom tkivu (Preuzeto iz Journaloforalmicrobiology.net
[homepage on the Internet]. [posjećeno 4. ožujka 2013.]. Available from:
http://www.journaloforalmicrobiology.net/index.php/jom/rt/printerFriendly/5304/6699.
Zanimljivo je da parodontna bolest ne predstavlja homogeno stanje koje podjednako zahvaća
sve zube i sve površine određenog zuba, već je svaka zahvaćena površina mikrookolina za
sebe. Tako je u ustima istog pacijenta moguće dijagnosticirati i gingivitis i parodontitis, ali i
pronaći zdravo mjesto. Do danas još nije poznato zašto kod nekih pacijenata, ili kod istog
pacijenta, upala ostaje ograničena na rubni dio gingive, a kod nekih napreduje u apikalnom
smjeru. Sigurno je tek da se narušava ravnotežno stanje domaćina i mikroorganizama (39).
Kad govorimo o zdravom parodontu, gingivi, valja napomenuti da je pravi naziv zapravo
klinički zdrava gingiva, odnosno parodont. Naime, gingiva je u stalnom doticaju s
Ana Badovinac, Disertacija
11
mikroorganizmima i njihovim produktima u području sulkusa te je kao takva tkivo u kojem je
stalno prisutan upalni infiltrat. Neutrofili prevladavaju u području spojnog epitela, dok se
limfociti nalaze u vezivnom tkivu (40). Prava upalna reakcija razvija se kada produkti
mikroorganizama nadvladaju obranu domaćina. Među najčešće spominjanim sintetiziranim
produktima mikroorganizama spominju se kolagenaze, hijaluronidaze, proteinaze, endotoksini
i hondroitin sulfataze (41). Svi oni dovode do oštećenja epitela i vezivnog tkiva, te do
proširivanja međustaničnog prostora spojnog epitela. U tim trenucima upala je smještena na
području gingive i izaziva bolest koja se zove gingivitis (42). Prilikom gingivitisa naglašen je
gubitak kolagena te počinju i imunološke reakcije domaćina na mikroorganizme. Upala može
ostati ograničena na područje gingive dugi niz godina te biti bez gubitka parodontnog
pričvrstka, ligamenta ili alveolarne kosti, ali isto tako u nekom trenutku upala može početi sa
širenjem u dublje slojeve parodonta te dovesti do prijelaza gingivitisa u parodontitis (43).
1.2.1. Patohistološke promjene parodonta tijekom upale
Na osnovi kliničkih i histopatoloških podataka Page i Schroeder su 1976. klasificirali
progresiju gingivne i parodontne upalne lezije u četiri faze: inicijalnu, ranu, uspostavljenu i
uznapredovalu (40). Iako postoje četiri vrste lezija, treba napomenuti kako ne postoji jasna
granica između napredovanja jedne vrste lezije u drugu. Unatoč brojnim istraživanjima i
razvoju tehnologije, i dan danas nije se otkrila jasna razlika između normalnog gingivnog
tkiva i inicijalne faze gingivitisa. Većina biopsijskih uzoraka klinički zdrave gingive sadrži
upalne stanice koje ne uzrokuju oštećenje gingive, već su ondje samo kao odgovor organizma
na stalni mikrobni izazov kojem je izložena gingiva (42).
Inicijalna lezija nema kliničkih simptoma, ali zato se na mikroskopskoj razini vide klasični
znakovi akutne upale u području vezivnog tkiva ispod spojnog epitela. Vaskularna dilatacija i
povećan protok krvi postaju glavna karakteristika ove faze. Kao posljedica toga dolazi do
povećanja hidrostatskog tlaka, porasta permeabilnosti kapilara te do izlučivanja tekućina i
proteina u tkiva (44). Polimorfonuklearni neutrofili migriraju kroz endotel kapilara i odlaze u
vezivo, spojeni epitel i sulkus. Migraciju im znatno olakšavaju adhezijske molekule ICAM-1 i
endotelna leukocitna adhezijska molekula 1 (ELAM-1) (45). Inicijalna lezija nastaje dva do
četiri dana nakon početka akumulacije plaka te oko sedmog dana prelazi u ranu leziju. U fazi
Ana Badovinac, Disertacija
12
rane lezije javljaju se i klinički znakovi upale. Zbog dilatacije krvnih žila dentogingivnog
pleksusa i otvaranja dotad inaktivnih kapilarnih tokova javlja se blago crvenilo marginalne
gingive, te takva gingiva ujedno i krvari pri sondiranju (46). Mikroskopska analiza tkiva
pokazuje limfocitnu infiltraciju spojnog epitela, uglavnom T-limfocitima, ali u tkivu se mogu
vidjeti i neutrofili, makrofagi te plazma stanice (47). Budući da brojne nove stanice ulaze u
tkivo dolazi do sve veće destrukcije kolagena te im je na taj način osiguran prostor. Bazalne
stanice spojnog i sulkusnog epitela pokazuju povećanu proliferaciju ne bi li pojačali
obrambenu barijeru, a pojava se histološki očituje u tkivu kao zupci pile na strani sulkusnog i
spojnog epitela (48). Koronalni spojni epitel popušta na granici s caklinom zuba i upravo to
mjesto omogućava stvaranje subgingivnog biofilma. Trajanje faza rane lezije nije točno
određeno jer ponajviše ovisi o osjetljivosti domaćina. Nakon otprilike četrnaest dana od
početka akumulacije plaka dolazi do stvaranja uspostavljene lezije koju karakteriziraju
prisutnost plazma stanica i B-limfocita, te klinički znakovi kao što su crvenilo gingive i
promjena njezine konzistencije. Aktivnost kolagenaza raste, a gubitak kolagena nije više
smješten samo oko infiltrata upalnih stanica, već napreduje prema dubljim slojevima (49).
Zupci pile sve su naglašeniji, raste međustanični prostor spojnog epitela, a na pojedinim
mjestima dolazi i do oštećenja bazalne lamine. Sve ove promjene dovode do stvaranja epitela
džepa koji pokazuje veću propustljivost i znatnu infiltraciju leukocitima. Uspostavljena lezija
je reverzibilno stanje koje može postojati dugi niz mjeseci pa čak i godina. Poboljšanom
higijenom i uklanjanjem drugih modificirajućih faktora dolazi do promjene patogene
mikrobne flore u nepatogenu, te kao posljedica toga, i do smanjenja broja plazma stanica,
odnosno povećanja broja limfocita (50). Ako uspostavljena lezija postane još aktivnija
pretvara se u uznapredovalu leziju. Iako te dvije lezije imaju mnogo sličnih karakteristika,
imaju i jednu bitnu razliku, a to je gubitak alveolarne kosti i vezivnotkivnog pričvrstka.
Napredovanjem lezije prema apikalno pomiče se i epitel, gingiva poprima fibrozni izgled,
udio plazma stanica prelazi 50%, a u tkivu se manifestiraju upalna i imunopatološka oštećenja
(51). Prilikom nastanka parodontitisa, oštećenja koja nastaju u tkivu događaju se ne samo
zbog virulentnosti određenih mikroorganizama i njihovih proizvoda, već i zbog reakcije
domaćina na njih. Neki čimbenici virulentnosti djeluju izravno na stanice, dok ostali izazivaju
odgovor domaćina koji je zapravo štetniji za tkivo nego sam mikroorganizam. Upravo zbog
toga događaji se gledaju s aspekta međudjelovanja domaćina i mikroorganizma, te s aspekta
reakcija koje se pripisuju obrani domaćina. Budući da su pojedinci različito podložni
destruktivnim događajima prilikom parodontne infekcije, jasno je da varijabilnost u odgovoru
domaćina uvelike pridonosi incidenciji parodontne bolesti u populaciji (52).
Ana Badovinac, Disertacija
13
1.2.2. Karakteristike domaćina koje sprečavaju nastanak parodontitisa
Polimorfonuklearni leukociti (PMN) podvrsta su bijelih krvnih stanica koje
karakteriziraju segmentirana jezgra i prisutnost citoplazmatskih granula. Glavna im je
funkcija zaštita domaćina od mikroorganizama koju obavljaju fagocitozom uz pomoć brojnih
enzima. Najvažniji predstavnici PMN-a su neutrofili koji čine čak 90% granulocita u
perifernoj krvi, a ujedno su i najbrojnije stanične komponente u akutnom upalnom odgovoru
koje na mjesto upale stižu privučeni različitim kemotaktičnim tvarima. Histološki nalazi tkiva
zahvaćenih gingivitisom i parodontitisom potvrđuju njihovu prisutnost i govore u prilog
važnoj ulozi u održavanju parodontnog zdravlja (53). U području spojnog epitela kao da
stvaraju zid koji štiti dublje parodontne strukture od bakterijskog biofilma, a prisutnost u tkivu
rezultat je kemotaktičnih faktora iz područja gingivnog sulkusa i dubljih struktura (54, 55).
Zaštitnu ulogu PMN-a potvrđuju i brojna istraživanja koja opisuju sindrome vezane za
disfunkciju leukocita, npr. kemotaktične disfunkcije i poremećaje u adheziji. Osobe s takvim
poremećajima imaju teže oblike parodontitisa, bolest počinje u ranijoj životnoj dobi te je sami
tijek bolesti puno brži nego kod osoba s normalnom funkcijom leukocita (56, 57).
Protutijela su proteini koji se stvaraju kao reakcija na strane supstancije, tvari i
organizme (antigene) koji su prodrli u organizam domaćina. Nastaju u B-limfocitima i
zapravo su topljivi oblik receptora za antigene na njima. Svako protutijelo može vezati samo
jednu vrstu antigena i kao takvo pokazuje visok stupanj specifičnosti. Pacijenti s
parodontitisom proizvode različita lokalna i sistemska protutijela koja reagiraju s različitim
parodontopatogenima (58, 59). Međutim, značajniji porast titra protutijela pojavljuje se tek
nakon što je destrukcija parodontnog tkiva već počela, a parodontno zdrave osobe vrlo rijetko
imaju povišene razine protutijela (58, 60). Protutijela perzistiraju i dugo nakon parodontne
terapije pa se postavlja pitanje jesu li protutijela stvorena tijekom bolesti funkcionalna ili
samo služe kao markeri prošle infekcije (61). Iako se u početku smatralo da klinička slika
parodontitisa ima veze s titrom protutijela novija istraživanja naglašavaju da uloga zaštitnog
odgovora putem protutijela još uvijek nije utvrđena (62, 63).
Oralni epitel, posebice spojni i sulkusni, predstavlja fizičku i kemijsku barijeru
mikroorganizmima koji se nalaze u samoj blizini ovih anatomskih struktura. O ulozi i
svojstvima spojnog epitela bilo je već riječi, ali treba još jedanput istaknuti kako epitelno
tkivo ne sadržava samo epitelne stanice, već i stanice koje pomažu u upalno-imunološkim
Ana Badovinac, Disertacija
14
zbivanjima (dendritičke stanice, PMN leukocite, limfocite i mononuklearne fagocite) (10).
Citokini koji su posljedica prirođenoga imunološkog odgovora također pokazuju ekspresiju u
spojnom epitelu (IL-8, IL-1 i TNF-α ). Novija istraživanja pokazuju da parodontopatogene
bakterije potiču i stvaranje β-defenzina i IL-8 od strane PMN leukocita, te da je ekspresija
defenzina pojačana u tkivu pacijenata s kroničnim parodontitisom (64, 65). Osim u bolesnom
tkivu, defenzini pokazuju ekspresiju i u zdravom tkivu podupirući njihov značaj u održavanju
homeostaze (66).
1.2.3. Odgovor domaćina koji dovodi do destrukcije parodonta
Temelj svake imunološke reakcije prepoznavanje je strane tvari te njezino neutraliziranje,
odnosno uklanjanje iz organizma. Imunološki odgovor može biti prirođen (nespecifičan) i
stečen (specifičan, adaptivan). Prirođena imunost djeluje bez prethodnog susreta domaćina sa
stranom tvari i usmjerena je protiv gotovo svih antigena koji ulaze u organizam domaćina.
Nasuprot njoj, stečena imunost razvija se kasnije i djeluje protiv točno određenog antigena, ali
tek nakon prethodnog susreta s njim. Tijekom patoloških zbivanja u parodontnoj leziji vrlo je
teško razdvojiti i individualizirati utjecaj prirođenog i stečenog imunološkog odgovora.
Histopatološke analize mjesta zahvaćenih parodontitisom potvrdile su da u tkivu postoje
elementi, odnosno stanice oba tipa imunološkog i upalnog odgovora (61).
1.2.3.1. Prirođeni odgovor domaćina
Otprije je poznato da su PMN leukociti odgovorni za održavanje zdravlja parodontnih
struktura koje su u stalnom doticaju s dentalnim plakom bogatim različitim
mikroorganizmima, ali također je poznato da igraju i veliku ulogu u imunološkim i
patološkim zbivanjima tijekom parodontitisa. Visoke koncentracije protutijela karakterističnih
za parodontitis u serumu i sulkusnoj tekućini, obilje opsoniziranih bakterija u subgingivnom
prostoru i interakcija fagocita s bakterijama, samo su neki od argumenata koji idu u prilog
destruktivnoj ulozi PMN leukocita (45, 53). Osim spomenutog, PMN leukociti sintetiziraju i
otpuštaju različite lizosomalne enzime, među kojima su možda najvažnije tkivno-destruktivne
proteaze koje se povezuju s kolapsom parodontnog tkiva (67, 68). Prilikom interakcije s
Ana Badovinac, Disertacija
15
bakterijama dolazi do oštećenja fibroblasta, endotelnih stanica i keratinocita (69). Prisutnost
proteolitičkih enzima, lipida odgovornih za resorpciju kosti i drugih medijatora upale koji se
otpuštaju tijekom susreta s bakterijama pridonose upalnom odgovoru i gubitku pričvrstka.
Kantarci i sur. smatraju da je hiperaktivnost PMN leukocita kod pacijenata s agresivnim
parodontitisom odgovorna za većinu tkivne destrukcije, a rezultat je pojačane proizvodnje
upalnih i koštano-resorbirajućih lipida (70).
Monociti su mononuklearni fagociti koji nastaju iz mijeloidnog progenitora u koštanoj
srži i odlaze u krvotok. Iz krvotoka zatim odlaze u organe i tkiva te prelaze u makrofage koji
imaju dvije osnovne zadaće: fagocitozu i predočavanje antigena. Makrofagi u citoplazmi
imaju brojne granule među kojima su i lizosomi s perokisdazama i hidrolazama, važni enzimi
za unutarstanično ubijanje fagocitiranih mikroba. Osim fagocitoze, makrofagi imaju bitnu
ulogu u kontroli imunološkog odgovora koju postižu kontaktom s ostalim imunocitima ili
lučenjem topljivih posrednika. Među najvažnijim tvarima su hidrolitički enzimi, komponente
komplementa, metaboliti kisika, dušikov oksid, bioaktivni lipidi (prostaglandini, leukotrieni),
citokini (IL-1, IL-6, TNF-α) i čimbenici rasta. Pomoću uloge i funkcije makrofaga može se
objasniti kako Gram-negativna infekcija parodontne lezije dovodi do destrukcije vezivnog i
koštanog parodontnog tkiva. U područjima kronične upale bakterije privlače leukocite
direktnom ekspresijom kemotaktičnih peptida ili stimulacijom produkcije i sekrecije
kemotaktičnih citokina i upalnih lipida od strane stanica domaćina (45, 54, 71). Bakterijski
LPS reagiraju s makrofagima ili receptorima na dendritičkim stanicama i stimuliraju
proizvodnju upalnih citokina i ostalih medijatora. Tatakis ističe da proizvodnja IL-1 ima
ključnu ulogu u destrukciji tkiva pokrećući razgradnju kosti i kolagena (72). Interakcijom
makrofaga i LPS dolazi i do stvaranja prostaglandina, prije svega prostaglandina E2 (PGE2)
koji se na mjestima zahvaćenim destrukcijom parodontnog tkiva nalazi u visokim
koncentracijama. PGE2 je lipidni upalni medijator koji vodi resorpciji kosti (73, 74). Klinička
istraživanja na pacijentima s parodontitisom, kao i istraživanja na životinjskim modelima,
pokazala su da se lokalnom ili sistemskom primjenom nesteroidnih protuupalnih lijekova
značajno smanjuje koncentracija PGE2 i gubitak kosti (75, 76).
Ana Badovinac, Disertacija
16
1.2.3.2. Stečeni odgovor domaćina
Mehanizmi prve linije obrane, nespecifični ili prirođeni odgovori, često nisu dovoljni za
eliminaciju patogena te se tada aktiviraju stečeni ili adaptivni imunosni odgovori s ciljem
poboljšanja sposobnosti domaćina za prepoznavanje patogena. Stečeni odgovor domaćina
koristi se pamćenjem, prepoznavanjem i vezanjem antigena s ciljem njihove eliminacije (39).
Trenutačne teze o patogenezi parodontitisa glavninu mehanizama koji su odgovorni za
destrukciju tkiva pripisuju prirođenoj imunosti. Međutim, histopatološki nalazi parodontne
lezije i sistemski učinci parodontnih bakterija na imunološke faktore, kao što su protutijela i
citokini, upućuju i na bitnu ulogu stečene imunosti u patogenezi ove bolesti.
U ranoj parodontnoj leziji prevladavaju makrofagi i T-limfociti, dok u uznapredovalim
lezijama B-limfociti i plazma stanice čine veći dio staničnog infiltrata (61). Teng te Yamazaki
i sur. ističu kako su histološke karakteristike, profil citokina, priroda i specifičnost lokalnog
imunološkog odgovora u parodontnoj leziji određeni prisutnošću i funkcijom podklasa
regulatornih T-stanica koje su inducirane mikrobnim biofilmom (77, 78). Tako se npr. za
vrijeme rane lezije, dakle kliničke dijagnoze gingivitisa, najčešće nalaze Th1-limfociti (Th1)
kao odgovor na unutarstanične patogene (79). Uznapredovale lezije pak najčešće
karakteriziraju Th2-limfociti (Th2) koji su zaduženi za borbu protiv izvanstaničnih patogena.
Važno je napomenuti da i sam patogen određuje tip odgovora domaćina putem interakcije s
posredničkim stanicama koje dovode do proizvodnje citokina karakterističnih za taj odgovor
(80, 81). Th1 odgovor je najčešće karakteriziran stvaranjem interleukina-12 (IL-12) koji
potiče stvaranje interferona-γ (INF-γ) vodeći aktivaciji makrofaga i fagocitozi. Odgovor
putem Th2 znači stvaranje citokina i to IL-4, IL-10 i IL-13 te produkciju protutijela.
Zanimljivo je da najpoznatiji parodontni patogen A.actinomycetemcomitans potiče stvaranje
IgG2 protutijela ovisnih o Th1, a ne o Th2 citokinima (82). Tijekom imunološkog odgovora
dominirat će ili citokini od Th1 ili od Th2 limfocita upućujući na polarizaciju imunološkog
odgovora. Rezultati istraživanja daju konfliktne rezultate, ali najčešće upućuju na prisutnost i
Th1 i Th2 citokina ili dominaciju jednih u odnosu prema drugima (77-79, 83). Takvi rezultati
zapravo i nisu čudni jer je u parodontnoj leziji prisutan cijeli niz bakterijskih vrsta koje
dovode do imunološkog odgovora. Osim toga, na heterogenost citokinskog odgovora utječe i
različit histološki stadij bolesti, drugačiji oblik parodontne bolesti, ali i aktivnost same bolesti.
Onaj parodontitis koji bi se ipak mogao povezati sa samo jednim tipom odgovora je
lokalizirani agresivni parodontitis. Pacijenti s lokaliziranim agresivnim parodontitisom imaju
Ana Badovinac, Disertacija
17
povišene koncentracije IgG2 proteina u serumu i povišena protutijela specifična za Th1 (84,
85). U prilog toj teoriji ide i činjenica da je serumski IgG2 genetski kontroliran, a lokalizirani
agresivni parodontitis često se pojavljuje unutar obitelji (86).
Nedavno je opisana i nova podvrsta Th-stanica, Th17-stanice, koje daju novu
dimenziju imunološkoj regulaciji parodontne bolesti. Razvoj Th17-stanica ovisan je o
prisutnosti IL-23, IL-6 i transformirajućeg čimbenika rasta beta, a same stvaraju IL-17,
citokin koji se povezuje s nekolicinom kroničnih sistemskih upalnih bolesti, kao primjerice s
reumatoidnim artritisom, Chronovom bolesti, multiplom sklerozom i psorijazom (87).
Navedenim bolestima i parodontitisu zajednička je lokalna kronična upala zbog koje dolazi do
stvaranja upalnih citokina i posljedične tkivne destrukcije. Tkivna destrukcija se vjerojatno
događa zbog ekspresije gena Th17-stanica koja dovodi do produkcije metaloproteinaza i
povećane ekspresije aktivator receptora za nuklearni faktor-κB lingand (RANKL) na
osteoklastima (88).
Prema tradicionalnim konceptima imunologije B-limfociti djeluju kao dobro kontroliran dio
adaptivnog odgovora domaćina reguliran T-limfocitima, no novija istraživanja navode da uz
dobro poznatu ulogu stvaranja imunoglobulina B-limfociti sudjeluju i u drugim aspektima
odgovora domaćina sudjelujući u aktivaciji imunološkog sustava (89, 90). Stvaraju se u
koštanoj srži, a aktivacijom i diferencijacijom, posredstvom citokina IL-4, IL-5, IL-6 od
strane Th2-limfocita B-limfociti postaju plazma stanice, odnosno plazmociti (91). Uloga B
limfocita je višestruka, osim što stvaraju protutijela nakon transformacije u plazma stanice,
služe i kao stanice za prezentiranje antigena, stvaraju citokine, sudjeluju u autoimunim
reakcijama, ali i u destrukciji tkiva (92).
B-limfociti, odnosno plazma stanice, igraju značajnu ulogu u parodontitisu. Koliko su
plazma stanice bitne u parodontnoj leziji govori i činjenica da je njihova zastupljenost u leziji
čak oko 50%, dok je zastupljenost B-limfocita oko 18% u odnosu na druge stanice adaptivnog
imunološkog odgovora. T-limfocita je manje nego B-limfocita te su Th-limfociti zastupljeniji
od Tc-limfocita, dok zastupljenost polimorfonuklearnih leukocita i makrofaga iznosi samo
oko 5% (51). U radu Berglundha i sur. vidljivo je da lezije agresivnog i kroničnog
parodontitisa imaju podjednak stanični sastav, ali i da je jačina bolesti povezana s gustoćom
plazma i B-stanica. Njihov je udio veći što je teži oblik parodontitisa (93).
U tkivima zahvaćenim parodontnom bolesti, protutijela stvorena od plazma stanica usmjerena
su protiv antigena prisutnih u subgingivnom biofilmu pa je tako kod pacijenata s agresivnim
Ana Badovinac, Disertacija
18
parodontitisom uočena povećana proizvodnja IgG2 u odnosu na IgG1 (94), a istraživanja
dolaze i do zaključka da se titar IgG na glavne parodontne patogene (P. gingivalis i A.
actinomycetemcomitans) smanjuje nakon provedene parodontne terapije (95). Osim toga,
razina IgG u sulkusnoj tekućini (96) i razina IgA i IgG u slini također se smanjuju nakon
provedenog liječenja (97, 98). Navedeni podaci podržavaju hipotezu da odgovor protutijelima
usmjerenima na antigene oralnih patogena smanjuje jačinu bolesti, te da se ovakav odgovor
domaćina može smatrati zaštitnim odgovorom organizma na patološka zbivanja tijekom
parodontne bolesti. Međutim, u daljnjem tekstu bit će vidljivo da odgovor domaćina putem B-
limfocita također ima i negativan učinak na parodontna tkiva.
Uz proizvodnju protutijela usmjerenih protiv antigena, moguća je i pojava autoantitijela koja
su proizvod autoreaktivnih B-limfocita (B1-limfociti). Berglundh i sur. te Afar i sur. opisuju
velik broj B1-limfocita u perifernoj krvi pacijenata s uznapredovalim parodontitisom (99,
100). Osim toga, plazma stanice proizvode i različite citokine, primjerice TNF-α, IL-6, IL-10 i
transformirajući faktor rasta β (TGF-β). Stvaranje i sekrecija TNF-α potiču ekspresiju
matriksnih metaloproteinaza (MMP), te se tom činjenicom plazma stanice povezuju s tkivnom
destrukcijom. Ekspresija MMP-a u normalnim je tkivima niska, ali povećava se kako
napreduju patološki procesi koji dovode do destrukcije tkiva (93). Aktivnost MMP-a je
povećana kod eksperimentalnog gingivitisa (101), korelira s težinom parodontne bolesti
(102), te se koncentracija MMP-a smanjuje nakon provedenog parodontološkog liječenja
(103). Iako postoje brojni dokazi o povezanosti tkivne destrukcije i MMP-a, Sorsa i sur.
predlažu da se njihova uloga ne smije tumačiti samo kao takva, već da postoje i obrambene i
zaštitne funkcije tih molekula (104, 105).
Na temelju navedenog vidljivo je da T-limfociti djeluju kao glavna grupa regulatornih stanica
tijekom parodontitisa, ali i da je njihov udio u tkivima zahvaćenim parodontitisom manji nego
udio B-limfocita. B-limfociti i plazma stanice dominiraju u parodontnoj leziji, a budući da je
destrukcija tkiva glavni znak parodontitisa, čini se da te stanice pridonose degradaciji
vezivnog tkiva i da je zaštitna uloga manje istaknuta. Navedene činjenice potvrđuju da upalna
i imunološka zbivanja štite domaćina od lokalnog napada mikroorganizama, ali i da takve
obrambene reakcije pridonose oštećenju parodonta kod gingivitisa i parodontitisa.
Ana Badovinac, Disertacija
19
1.3. Agresivni parodontitis
Parodontitis je upalna bolest koja zahvaća potporno tkivo zuba, a uzrokovana je specifičnim
anaerobnim patogenima koji se nalaze na površini zuba. Karakterizira ga upala gingive, te
destrukcija potporne kosti i parodontalnog ligamenta koji napredovanjem bolesti dovode do
povećane pomičnosti zuba i u konačnici do gubitka zuba (106). Svaki parodontitis počinje
gingivitisom koji je definiran kao reverzibilno upalno stanje koje ne dovodi do destrukcije
potpornih struktura, već je isključivo lokaliziran na područje gingive. Ako se takvo upalno
stanje ne liječi, dolazi do sekrecije proteaza i drugih upalnih komponenti koje u nekim
slučajevima dovode do destrukcije parodontnog tkiva i do bolesti zvane parodontitis (107).
Dva su najčešća oblika parodontitisa agresivni i kronični parodontitis. Agresivni oblik češće
zahvaća mlađe osobe, destrukcija parodontnog tkiva je brza, postoji nerazmjer između stupnja
uznapredovalosti bolesti i količine tvrdih i mekih bakterijskih naslaga na površini zuba, te ima
tendenciju pojavljivanja unutar iste obitelji (108). Nasuprot agresivnom obliku, kronični
parodontitis karakterizira sporije napredovanje bolesti i starija životna dob.
1.3.1. Obilježja agresivnog parodontitisa
Agresivni parodontitis definiran je na međunarodnoj radionici za klasifikaciju parodontnih
bolesti 1999. Dotadašnja podjela parodontitisa temeljila se na dobi pacijenta što se prema
novim spoznajama ispostavilo nepravilnim kriterijem za donošenje dijagnoze. Agresivni oblik
parodontitisa može se javiti u bilo kojoj dobi, a primarne osobine za klasifikaciju postale su
medicinska anamneza bez osobitosti, brz gubitak pričvrstka i kosti, te tendencija javljanja
bolesti unutar obitelji. Sekundarne osobine za koje se smatra da se obično, ali ne i obvezatno,
javljaju su nerazmjer između količina mikrobnih naslaga i težine destrukcije, povišena razina
A. actinomycetemcomitansa, a kod nekih pacijenata i P. gingivalisa, abnormalnosti fagocita,
hiperreaktivni fenotip makrofaga, povišene razine PGE2 i IL-1, te spontani prestanak
napredovanja bolesti (109). Da bi se postavila dijagnoza agresivnog parodontitisa, ne trebaju
biti prisutne i dokazane sve navedene karakteristike, već ju je moguće temeljiti i na kliničkim,
radiološkim i anamnestičkim podacima. Laboratorijska testiranja svakako su dobrodošla, no
nisu ključan korak u određivanju bolesti.
Ana Badovinac, Disertacija
20
Budući da se grupa stručnjaka složila da postoji dovoljan broj specifičnih obilježja za podjelu
te bolesti na lokalizirani i generalizirani oblik, 1999. je definirana i podklasifikacija
agresivnog parodontitisa. Lokalizirani oblik karakteriziraju početak oko i za vrijeme
puberteta, jak odgovor serumskog protutijela na uzročnike i interproksimalni gubitak
pričvrstka na prvom kutnjaku/sjekutiću te najmanje još dva trajna zuba od kojih je jedan prvi
kutnjak, i da zahvaća ne više od dva zuba a da nisu samo prvi kutnjak i sjekutić.
Generalizirani oblik obično zahvaća osobe mlađe od 30 godina (mogu biti i starije), epizodna
priroda destrukcije pričvrstka i alveolarne kosti, slab odgovor serumskog protutijela na
uzročnike i generaliziran interproksimalni gubitak pričvrstka na najmanje tri trajna zuba a da
nisu samo prvi kutnjak i sjekutić.
1.3.2. Učestalost agresivnog parodontitisa
Budući da definicija agresivnog parodontitisa iz 1999. nema dugu povijest i da ona nije samo
novi termin ranije definiranog parodontitisa koji počinje u mlađoj životnoj dobi (engl. early-
onset periodontitis, EOP) i juvenilnog parodontitisa, epidemiološka istraživanja većinom se
odnose na te dvije dijagnoze, a tek će budućnost donijeti znatniji broj epidemioloških
istraživanja vezanih za agresivni parodontitis. Prevalencija agresivnog parodontitisa, EOP i
juvenilnog parodontitisa u populaciji pokazuje velike razlike u literaturi, a kao glavni razlog
tih varijacija navode se rasna pripadnost, razvijenost zemlje i dob pregledane populacije (110-
113). Studija Melvina i sur. pokazuje da je prevalencija bolesti manja od 0,1% kod razvijenih
nacija, a čak 5% u nerazvijenim zemljama (114). Godine 2010. Demmer i Papapanou imali su
cilj prikazati pregled literature o prevalenciji kroničnog i agresivnog parodontitisa prema
klasifikaciji iz 1999., no došli su do zaključka da nema dovoljno znanstvenih studija koje bi
pridonijele donošenju zaključaka o globalnoj prevalenciji agresivnog, odnosno kroničnog
parodontitisa (115).
Ana Badovinac, Disertacija
21
1.3.3. Etiologija agresivnog parodontitisa
Parodontne bolesti uzrokovane su mikroorganizmima koji koloniziraju površinu zuba iznad i
ispod gingivnog ruba. Pretpostavka je da oko petsto različitih vrsta kolonizira usta, te da u
zdravom sulkusu broj bakterija iznosi oko 103, a u dubokim parodontnim džepovima taj broj
prelazi i 108. Bakterija koja se najčešće povezuje s agresivnim parodontitisom je A.
actinomycetemcomitans. Taj Gram-negativni, fakultativno anaerobni nepokretni štapić smatra
se ključnim mikroorganizmom kod lokaliziranog agresivnog parodontitisa (LAP) (116). Tom
zaključku pridonose činjenice da je A. actinomycetemcomitans izoliran u parodontnim
lezijama kod više od 90% pacijenata oboljelih od LAP-a, da proizvodi leukotoksin i da je u
stanju izazvati bolest kod eksperimentalnih životinja (117, 118). Također su povišena
serumska protutijela na A. actinomycetemcomitans kod pacijenata oboljelih od LAP-a, te je
utvrđena povezanost neuspjelog liječenja parodontitisa s neuspjehom smanjenja razina A.
actinomycetemcomitansa (119, 120). A. actinomycetemcomitans svoju patogenost ostvaruje
različitim mehanizmima i sposobnostima. Karakteriziraju ga lako prianjanje uz različita tkiva
domaćina, lučenje bakteriocina, inhibiranje rasta bakterija koje pogoduju obrani domaćina, te
lagano razvijanje rezistencije na tetraciklinske antibiotike (121). Također posjeduje toksin
koji ubija fibroblaste (122) i izdašan je izvor leukotoksina koji ubija neutrofile i makrofage
(123). Osim A. actinomycetemcomitans u etiologiji agresivnog parodontitisa često se još
spominje i P. gingivalis. P. gingivalis je Gram-negativni, anaerobni, nepokretni štapić koji
proizvodi različite štetne enzime, kao npr. kolagenaze i peptidaze, endotoksin i masne kiseline
(124). Često se pojavljuje u refraktornim lezijama, a pacijenti s generaliziranim
parodontitisom koji počinje u mlađoj životnoj dobi imaju jake lokalne i imunološke reakcije
protiv ove bakterije (125, 126). Svoju patogenost postiže proizvodnjom širokog spektra
proteinaza, uključujući i one koje su u stanju cijepati imunoglobuline domaćina vezane za
površinu mikroorganizma (127). Sposoban je ući u stanicu domaćina i umnožavati se što ga
čini pravim unutarstaničnim patogenom (128), te je uz to prema in vitro istraživanjima
sposoban prelaziti iz inficirane stanice u susjednu zdravu stanicu (129). Nadalje, P. gingivalis
u svojoj vanjskoj membrani ima jak endotoksin (LPS) i proizvodi razne nisko-molekularne
iritanse poput amonijaka, hidrogen-sulfida, indola i kratko-lančanih masnih kiselina (127). Još
jedna bitna karakteristika pridonosi patogenosti ove bakterije, a to je stvaranje
proteoliposoma. Proteoliposomi su malene vezikule u vanjskoj membrani bakterije koje
olakšavaju interakciju s drugim bakterijama (130) te inaktiviraju ili suprimiraju odgovor
domaćina (131). Sve navedene karakteristike čine A. actinomycetemcomitans i P. gingivalis
Ana Badovinac, Disertacija
22
jakim parodontnim patogenima sa širokim repertoarom faktora virulencije koji im pomažu u
izbjegavanju obrane domaćina, izazivanju upalnih i imunoloških zbivanja koja vode
destrukciji tkiva domaćina.
1.3.4. Destrukcija parodontnih tkiva
Kao što je već prije spomenuto, imunološka i upalna zbivanja vođena su velikim brojem
različitih molekula koja dovode do destrukcije parodontnih tkiva. Zaštitni odgovor organizma
postaje nadjačan, koncentracija patogena u subgingivnom području raste, a upalna zbivanja
prodiru u sve dublje slojeve parodonta.
Direktan patološki učinak bakterija na parodont odvija se u ranijim stadijima bolesti. Analize
plaka pacijenata s rastućom težinom upale gingive otkrivaju bakterijske vrste koje su
sposobne izazvati upalni odgovor. Tako npr. prisutnost bakterije Fusobacterium nucleatum i
njezinih metaboličkih produkata direktno utječe na vaskularizaciju gingive, dolazi do edema i
pojačanog stvaranja sulkusne tekućine, stvarajući tako pogodnu okolinu i za druge
mikroorganizme (132). P. gingivalis je pak poznat po stvaranju enzima (proteaza, kolagenaza,
fibrinolizina, fosfolipaze A) koji dovode do degradacije okolnih tkiva, metaboličkih produkta
kao NH3, H2S i masne kiseline, koji su pak toksični za okolne stanice (133-135), te LPS-a koji
su in vitro sposobni potaknuti resorpciju kosti (136).
Indirektan patološki učinak bakterija počinje kada obrambeni elementi parodontnog tkiva
bivaju nadjačani virulentnošću mikroorganizama. Tada počinje odgovor domaćina koji
pokreće destruktivne događaje u tkivu. PMN stvaraju enzime koji imaju sposobnost
degradacije kolagena i bazalne membrane, te dolazi do aktivacije monocita, limfocita,
fibroblasta i drugih stanica domaćina. Bakterijski LPS-i stimuliraju stvaranje citokina i
prostaglandina E2 (PGE2) koji potiču oslobađanje matriksnih metaloproteinaza (MMP) (137,
138).
Citokini i upalni medijatori koji se najčešće povezuju s parodontitisom su IL-1, IL-6, TNF-α i
PGE2. IL-1 je upalni citokin s mnogobrojnim funkcijama, a povišene razine u tkivu i
sulkusnoj tekućini uočene su kod pacijenata s parodontnim bolestima. Svoju ulogu u
patološkim događanjima tijekom parodontitisa ponajprije ostvaruje stimulacijom monocita i
fibroblasta na oslobađanje PGE2 te MMP (72). IL-6 stvaraju limfociti, monociti i fibroblasti, a
Ana Badovinac, Disertacija
23
primarno djeluje na proliferaciju plazma stanica zaslužnih za stvaranje protutijela. Uz to
dokazana je i stimulativna aktivnost u stvaranju osteoklasta što direktno povezuje IL-6 s
resorpcijom kosti (139). Njegove razine također su povišene kod pacijenata s parodontitisom i
to u većoj mjeri nego kod osoba s gingivitisom (140, 141). IL-8 kemotaksijski djeluje na
neutrofile i potiče stvaranje MMP-a. Stvaraju ga monociti stimulirani LPS-om, IL-1 i TNF-α,
a zanimljivo je da ga se u lezijama parodontitisa ponajprije povezuje s makrofagima i spojnim
epitelom (142, 143). TNF-α je citokin koji je po biološkim aktivnostima i funkciji vrlo sličan
IL-1 (produkcija PGE2, stimulacija MMP-a i resorpcija kosti), ali ono što ga čini drugačijim je
činjenica da ga izlučuju monociti i fibroblasti nakon stimulacije bakterijskim LPS-om (144).
PGE2, vazoaktivni upalni medijator iz grupe eikosanoida, u mnogim istraživanjima pokazuje
povišene razine u sulkusnoj tekućini i tkivima, i to kod osoba s gingivitisom i aktivnim
parodontitisom (145). Stvaraju ga fibroblasti i makrofagi, a uloga u destrukciji parodonta
objašnjava se indukcijom MMP-a i resorpcijom kosti putem osteoklasta.
Ana Badovinac, Disertacija
24
1.4. Proteomska istraživanja u parodontologiji
1.4.1. Proteomske analize i spektrometrija mase
Proteomika je znanost koja se bavi proučavanjem proteina, njihovom strukturom i funkcijom,
s ciljem sveobuhvatne kvalitativne i kvantitativne deskripcije proteinske ekspresije, ali i
njezinih promjena pod utjecajem bioloških promjena koje se događaju primjerice za vrijeme
bolesti i liječenja (146).
Proteomske analize omogućuju iscrpan prikaz ekspresije proteina u različitim biološkim
uzorcima te predstavljaju napredniji pristup u istraživanjima proteoma (proteom je cjelokupni
proteinski sastav jedinice promatranja) (147). Budući da su proteini sastavni dijelovi
organizma i da sudjeluju u gotovo svim unutarstaničnim i međustaničnim procesima,
proteomika značajno pridonosi trenutačnim spoznajama o proteinima koji su vezani za
zdravlje, odnosno bolest (148).
Istraživanja u području proteomike provode se pomoću različitih tehnoloških i metodoloških
pristupa, međutim ne postoji ni jedna tehnologija koja bi bila prikladna za jedinstvenu
primjenu. Analize se sastoje od niza koraka koji zahtijevaju različitu tehnologiju, a
organizacija i integracija analitičkih koraka ključ su uspjeha. U prošlom desetljeću razvoj
spektrometrije mase doveo nas je u novo doba analize proteina, ali i potrage za biomarkerima
koji bi mogli imati velik utjecaj u dijagnostici, terapiji i prognozi različitih bolesti. Analize
proteina u uzorcima rade se do najsitnijih detalja. Osim što se detektira prisutnost,
zastupljenost i količina proteina, moguće je čak i određivanje posttranslacijskih modifikacija
različitih proteina u analiziranom uzorku (149, 150).
Spektrometrija mase (MS) je tehnika kojom se analiziraju molekule na temelju njihove mase i
naboja. Radi na principu ioniziranja kemijskih komponenti promatranog uzorka stvarajući
nabijene molekule ili fragmente molekula, te zatim mjeri omjer mase i naboja. Upotrebljava
se za određivanje masa čestica, sastava uzorka ili molekule i za pojašnjavanje kemijskih
struktura molekula, primjerice peptida. Strojevi u kojima se odvija MS zovu se spektrometri
masa i sastoje se od tri glavna dijela: ionizatora (ionizira molekule), masenog analizatora
(raspoređuje ione prema njihovim masama uz pomoć elektromagnetskog polja) i detektora
(detektira signal i pruža podatke za mjerenje zastupljenosti pojedinih iona) (Slika 4.).
Ana Badovinac, Disertacija
25
Slika 4. Spektrometar mase (Preuzeto iz Planetorbitrap.com [homepage on the Internet].
[posjećeno 4. ožujka 2013.]. Available from: http://planetorbitrap.com/q-exactive.
Ana Badovinac, Disertacija
26
Standardna procedura MS-a sastoji se od niza koraka (Slika 5.). Prvi korak je nanošenje
uzorka u spektrometar masa, zatim slijedi ionizacija molekula u ionizatoru koja rezultira
stvaranjem nabijenih čestica (iona). Nastali ioni provode se kroz analizator koji ih zatim
razdvaja prema omjeru mase i naboja. Iz analizatora ioni idu na detektor gdje proizvode
električni signal koji se može registrirati na računalu (151).
Slika 5. Shematski prikaz koraka spektrometrije masa pomoću spektrometra mase (Preuzeto
iz Commons.wikimedia.org [homepage on the Internet]. [posjećeno 4. ožujka 2013.].
Available from: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ms_block_schematic.gif.
Da bi se željeni uzorci proteomski analizirali potrebna je njihova priprema kojoj je cilj
separacija proteina prije ulaska u spektrometar mase. Takvim pristupom omogućava se
identifikacija većeg broja proteina jer se zastupljeniji proteini odvajaju od onih koji su prisutni
u malim količinama te se povećava dinamički raspon detekcije. Frakcioniranje uzoraka, npr.
gel elektroforezom ili kromatografijom, pokazuje znatno veći broj detektiranih peptida u
odnosu na uzorke koji nisu frakcionirani (152). Gel elektroforeza je metoda kojom se pomoću
jednosmjerne struje razdvajaju pojedine komponente uzorka na temelju veličine i naboja. U
proteomskim istraživanjima cilj je razdvojiti smjese proteina u određenom uzorku. U te svrhe
često se primjenjuje metoda gel elektroforeze u poliakrilamidnom gelu, SDS-PAGE (engl.
Sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis). Kod SDS poliakrilamid gel
Ana Badovinac, Disertacija
27
elektroforeze proteini su tretirani anionskim deterdžentom, natrijevim dodecilsulfatom (SDS),
koji razmata proteinske molekule u polipeptidne lance i daje im negativan naboj. Budući da se
proteini istoga naboja razlikuju po svojoj veličini, separacija se događa na osnovi veličine
molekula. Kraće molekule putuju brže kroz pore gela te je na taj način osigurano separiranje
proteina određenog uzorka.
1.4.2. Dosadašnja proteomska istraživanja u stomatologiji i parodontologiji
Proteomska istraživanja pružaju iscrpne informacije o proteinima u različitim tkivima i
organima, a budući da su proteini funkcijske molekule, metode koje omogućavaju određivanje
njihove ekspresije smatraju se bitnima za detaljnije razumijevanje funkcije tkiva. Proteomika
je već pronašla mjesto u stomatologiji. Što se tiče mikroorganizama, rađena je proteomska
analiza oralnih patogena (153), funkcionalnog proteoma Streptococcus mutans-a (154) i
proteoma vanjske membrane P. gingivalis-a (155). Od stanica koje su važne za funkcioniranje
parodontnih tkiva istraživani su fibroblasti (156), osteoblasti (157), osteoklasti (158) i
cementoblasti (159). Također su istraživane bolesti zuba i usne šupljine kao što su karijes
(160, 161), Sjögrenov sindrom (162) i oralni karcinomi (161).
Dosadašnja istraživanja parodontnih bolesti vezana su uglavnom za analize sline i sulkusne
tekućine, međutim postoji niz drugih uzoraka koji bi se mogli upotrijebiti. Uzorci dostupni za
in vivo proteomska istraživanja parodontnih bolesti uključuju sulkusnu tekućinu,
mikroorganizme, slinu, biopsijske uzorke tkiva te uzorke krvi (163) (Slika 6).
Slika 6. Biološki uzorci dostupni za proteomska istraživanja parodontnih bolesti
Ana Badovinac, Disertacija
28
Ngo i sur. analizirali su sulkusnu tekućinu upaljenih parodontnih džepova 12 pacijenata koji
su završili s parodontnom terapijom i bili u fazi održavanja. Autori su po prvi put identificirali
33 peptida i 66 proteina koji se nalaze u sulkusnoj tekućini upaljenog parodonta i istaknuli
kako će to otkriće pridonijeti u razumijevanju sudbine serumskih proteina u sulkusnoj
tekućini (164). Bostanci i sur. također su proteomski analizirali sulkusnu tekućinu. Oni su za
usporedbu uzeli 5 pacijenata s agresivnim parodontitisom i 5 parodontno zdravih pojedinaca.
U navedenom istraživanju identificirano je ukupno 154 proteina ljudskog, bakterijskog i
virusnog podrijetla. Proporcija mikrobnih proteina bila je veća kod pacijenata s
parodontitisom, a proteini vezani za obranu domaćina, kao Cistatin-B i defenzini, pokazali su
ekspresiju samo u zdravim uzorcima. Budući da je uzorak malen i da se tek krenulo s
proteomskim analizama u parodontologiji, autori ne ističu ni jedan protein kao mogući
biomarker, već napominju da su za takve pretpostavke potrebne veće kohortne studije (165).
U želji da se identificiraju promjene proteinskog sastava sline s obzirom na aktivnost bolesti,
Haigh i sur. proveli su istraživanje na 9 pacijenata s uznapredovalim parodontitisom prije i
poslije terapije. Učinjena je kvantitativna proteomska analiza sline te je utvrđeno da od 126
identificiranih proteina njih 15 pokazuje različitu zatupljenost u slini prije i poslije terapije.
Rezultati su istaknuli dominantnu ulogu S100 proteina u odgovoru domaćina tijekom
parodontitisa, te su naveli da bi upravo ti proteini mogli biti potencijalni biomarkeri pri
praćenju aktivnosti ove bolesti (166).
U želji da se analiziraju proteini u fazi nastanka i smirivanja gingivitisa, Grant i sur. napravili
su istraživanje pomoću 21 dnevnog modela. Sulkusna tekućina od 10 pacijenata skupljana je
na početku istraživanja te 7., 14., 21. i 35. dan. Ukupan broj identificiranih proteina
eksperimentalno izazvanoga gingivitisa bio je 186 humanih i 16 bakterijskih. Bakterijski
proteini pokazali su male varijacije tijekom trajanja eksperimenta, 170 humanih proteina nije
pokazalo nikakve promjene, dok se zastupljenost 16 proteina mijenjala od nultog do 35. dana.
Neki od istaknutih proteina bili su Annexin A1 i A3, Cistatin B, IgG3, Apolipoprotein B-100 i
Histone 4 i 1.2. Zanimljivo je da citokini, koji su često istraživani kao mogući biomarkeri
parodontnih bolesti u sulkusnoj tekućini, uopće nisu bili detektirani (167). Jednako se
pokazalo i u istraživanju Bostancija i sur., a kao mogući razlog izostanka detekcije navode se
jako niske koncentracije citokina u uzorcima (165). U posljednjem istraživanju
eksperimentalnoga gingivitisa identificirano je 287 proteina, od kojih je 101 protein pokazao
različitu ekspresiju. Među izdvojenim proteinima našli su se ponovno Annexin A1, IgG3,
Histon 1.2, S100-A8, ali i neki novi poput citokeratina 1 i 2, Cistatin S, Katepsin G i Alfa-
Ana Badovinac, Disertacija
29
amilaza 1. U istraživanju također nisu detektirani citokini, a autori navode da će detekcija
molekula koje su u malim koncentracijama prisutne u uzorcima biti moguća tek s napretkom
u pripremi uzoraka, ponajprije misleći na bolju separaciju proteina prije masene
spektrometrije kako bi se povećao dinamički raspon detekcije (168).
Navedena istraživanja samo su dio proteomskih istraživanja provedenih u parodontologiji, a
iz navedenog se vidi da broj identificiranih proteina raste kroz istraživanja. Napredak u
izolaciji tkiva, separaciji proteina, kvantifikaciji, analizama sekvenca, te strukturalna i
interakcijska proteomika otvaraju nova vrata u istraživanju fizioloških i patoloških zbivanja
unutar parodonta (151). Spoznaja cjelokupne ekspresije staničnih i matriksnih proteina
predstavlja dobar početak i potpuno novu eru u razumijevanju događaja u parodontu, a nove
spoznaje o molekulama i molekularnim zbivanjima koje se događaju u patogenezi
parodontitisa mogle bi pomoći u razjašnjavanju još uvijek nepoznatih činjenica koje se
događaju tijekom razvoja ove bolesti.
Ana Badovinac, Disertacija
30
2. SVRHA ISTRAŽIVANJA
Ana Badovinac, Disertacija
31
Svrha istraživanja bila je dokazati da uzorci epitelnog i vezivnog parodontnog tkiva zdravih
ispitanika (kontrolne skupine) i zdravog mjesta, mjesta s gingivitisom, parodontitisom i
mjesta s parodontitisom nakon terapije pacijenata s generaliziranim agresivnim
parodontitisom (ispitivane skupine) pokazuju različitu ekspresiju proteina.
Ciljevi istraživanja bili su:
1. identificirati i kvantificirati proteine u uzorcima epitelnog i vezivnog parodontnog
tkiva zdravih ispitanika
2. identificirati i kvantificirati proteine u uzorcima epitelnog i vezivnog parodontnog
tkiva zdravog mjesta pacijenata s generaliziranim agresivnim parodontitisom
3. identificirati i kvantificirati proteine u uzorcima epitelnog i vezivnog parodontnog
tkiva mjesta s gingivitisom pacijenata s generaliziranim agresivnim parodontitisom
4. identificirati i kvantificirati proteine u uzorcima epitelnog i vezivnog parodontnog
tkiva mjesta s parodontitisom pacijenata s generaliziranim agresivnim parodontitisom
5. identificirati i kvantificirati proteine u uzorcima epitelnog i vezivnog parodontnog
tkiva mjesta s parodontitisom nakon terapije pacijenata s generaliziranim agresivnim
parodontitisom
6. odrediti proteine koji pokazuju ekspresiju u svim istraživanim skupinama, odnosno
zajedničke proteine svih uzoraka, te izračunati stupnjeve promjena ekspresije proteina
u ispitivanim skupinama u odnosu na kontrolnu skupinu
Hipoteza istraživanja bila je da ne postoji razlika u ekspresiji proteina između kontrolne
skupine i ispitivanih skupina.
Ana Badovinac, Disertacija
32
3. ISPITANICI I METODE
Ana Badovinac, Disertacija
33
3.1. Odabir ispitanika
U istraživanju je sudjelovalo osam pacijenata Zavoda za parodontologiju Stomatološkog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Istraživanje je odobreno od Etičkog povjerenstva
Stomatološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Sudionici istraživanja dobili su informacije za
sudionike u pisanom obliku te su potpisali Informirani pristanak za sudjelovanje u
istraživanju.
Sve sudionike istraživanja pogledala je, odabrala i obradila ista doktorica. Za dijagnostiku
parodontne bolesti koristilo se stomatološko ogledalo, UNC-15 parodontna sonda i
ortopantomografske snimke. Pacijentima su mjereni parodontološki parametri, a oni su
uključivali dubinu sondiranja, recesiju gingive i razinu kliničkog pričvrstka, te parodontni
indeksi: aproksimalni plak indeks i indeks krvarenja pri sondiranju. Ovisno o kliničkom
nalazu i anamnestičkim podacima pacijentima je dijagnosticirano stanje prema klasifikaciji
parodontnih bolesti iz 1999. (109)
Ispitivanu skupinu činila su četiri pacijenta s dijagnozom generaliziranog agresivnog
parodontitisa, i to dva muškarca i dvije žene kako bi se isključio utjecaj spola na rezultate.
Kontrolnu skupinu činila su četiri pojedinca, također dva muškarca i dvije žene, bez znakova
parodontne bolesti, tj. oni pacijenti Zavoda za parodontologiju kojima je razlog dolaska na
zavod bio zahvat kliničkog produljenja krune zuba.
Isključujući kriteriji za sudjelovanje u istraživanju bili su: maloljetne osobe, osobe koje
trebaju skrbnika, pušači, sistemne bolesti (npr. dijabetes, autoimune bolesti), nedavna ili
aktualna akutna ili kronična infekcija, trudnoća, laktacija, ovisnost o alkoholu ili opojnim
drogama, parodontološko liječenje u posljednjih šest mjeseci, uzimanje antibiotika unutar
zadnjih šest mjeseci.
3.2. Provođenje terapije i uzimanje uzoraka tkiva
Kod pacijenata s agresivnim parodontitisom prije početka inicijalne parodontološke terapije
pomoću skalpela 15-C (Aesculap AG, Njemačka) uzeo se uzorak mekoga parodontnog tkiva
(epitel i vezivo). Kod svakog pacijenta uzeti su uzorci sa zdravog mjesta (mjesto bez kliničkih
znakova parodontne bolesti i bez gubitka kosti), mjesta s gingivitisom i mjesta s
Ana Badovinac, Disertacija
34
parodontitisom. Nakon toga provedena je inicijalna terapija. Tri mjeseca nakon inicijalne
terapije ponovno su uzeti uzorci tkiva s mjesta gdje je na početku uzet uzorak s dijagnozom
parodontitisa. Kod pacijenata koji čine kontrolnu skupinu uzorci tkiva uzimali su se tijekom
kirurškog zahvata kliničkoga produljenja krune zuba. Uzorci tkiva, svaki zasebno,
pohranjivali su se u epruvete volumena 2,5 mL (Eppendorf, Njemačka) u kojima je bio
stabilizacijski reagens RNAlater® (Qiagen, SAD). Prema uputama proizvođača uzorci su se
tijekom prve noći pohranili na temperaturu od +4°C do +8°C, a nakon toga na temperaturu od
-20°C do sljedećih koraka.
3.3. Homogenizacija uzoraka
Priprema uzoraka radila se u laboratoriju Centra za proteomska istraživanja Medicinskog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Budući da veličine i mase uzoraka tkiva nisu bile jednake
najprije se odredila težina svakog uzorka kako bi se dodavale jednake količine pufera za lizu i
homogenizaciju stanica. Nakon što su uzorci izvagani uslijedila je homogenizacija uzoraka
pomoću tekućeg dušika u keramičkom tarioniku.
Prije same homogenizacije uzoraka odredili smo način spajanja dva uzorka u jedan kako bi
uzorci bili reprezentativniji (Tablica 1 i 2).
Tablica 1. Spajanje uzoraka ispitivane skupine
Ime spojenog
uzorka
Uzorci za spajanje Ime spojenog
uzorka
Uzorci za spajanje
Pool 1A Pacijent 1 i 2 zdravo mjesto Pool 5E Pacijent 3 i 4 zdravo mjesto
Pool 2B Pacijent 1 i 2 mjesto s
gingivitisom Pool 6F
Pacijent 3 i 4 mjesto s
gingivitisom
Pool 3C Pacijent 1 i 2 mjesto s
parodontitisom Pool 7G
Pacijent 3 i 4 mjesto s
parodontitisom
Pool 4D
Pacijent 1 i 2 mjesto s
parodontitisom nakon
terapije
Pool 8H
Pacijent 3 i 4 mjesto s
parodontitisom nakon
terapije
Ana Badovinac, Disertacija
35
Tablica 2. Spajanje uzoraka kontrolne skupine
Ime spojenog uzorka Uzorci za spajanje
Pool 9I Pacijent 5 i 6 zdravo mjesto
Pool 10J Pacijent 7 i 8 zdravo mjesto
Svaki uzorak tkiva izrezan je na manje komadiće, smrznut tekućim dušikom i usitnjen do
praškaste konzistencije. Usitnjeni uzorci tkiva stavljeni su u epruvete volumena 2,5 mL prema
rasporedu spajanja uzoraka. Pufer za lizu stanica (4% natrijev dodecil sulfat (SDS), 0.1 M
dithiothretiol u 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6) dodan je usitnjenim uzorcima u istom odnosu pufera
prema tkivu, grijan na 96°C 10 minuta i centrifugiran 15 minuta na 12000x g. Centrifuga
supernatanta ponovljena je, ali ovaj put u trajanju od 30 minuta. Ukupna koncentracija
proteina u uzorcima procijenjena je prema UV-metodi na 280 nm. Doprinos nukleinskih
kiselina umanjen je korištenjem apsorpcije na 260 nm (1.55 A280 – 0.76 A260 = ukupno
proteina mg/mL) (169). Uzorci su izjednačeni krajnje čistom vodom do jednakih proteinskih
koncentracija i pomiješani s SDS-PAGE puferom uzorka 4x (Life Technologies, SAD).
3.4. Gel elektroforeza
Separacija proteina elektroforezom napravljena je pomoću poliakrilamidnog gela (Nu PAGE
4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm X 12 well, Life Technologies, SAD) u X Cell Sure Mini-Cell
(Invitrogen Corporation Carlsbad, SD) uređaju za elektroforezu na 180V i 120mA otprilike 45
minuta.
Uzorci su inkubirani na 70C tijekom 3 minute te naneseni u jažice gela. U svaku jažicu
naneseno je 75 l uzorka. Za SDS elektroforezu upotrijebljen je MOPS SDS pufer (Life
Technologies, SAD) pH 7,7 koji sadrži MOPS (3-N-morpholino propan-sulfonska kiselina),
Tris bazu, natrijev dodecilsulfat, etilendiamin tetraoctenu kiselinu i deioniziranu vodu.
Nakon gel elektroforeze uslijedilo je bojenje i odbojavanje gelova u mikrovalnoj pećnici
prema uputama proizvođača.
Ana Badovinac, Disertacija
36
Prvi korak bio je ispiranje gelova. Gelovi su potopljeni u plastične posudice u 100 ml krajnje
čiste vode, lagano prekriveni plastičnim poklopcem i grijani u mikrovalnoj pećnici na 1 000W
1 minutu. Nakon toga plastične posudice s gelovima stavljene su 2 minute na treskalicu, a
potom je voda odstranjena. Ovaj korak napravljen je tri puta.
Drugi korak bilo je bojenje gelova SimplyBlue™ SafeStain bojom (Life Technologies, SAD).
U svaku posudicu s gelom stavljeno je 20 ml boje te su gelovi grijani u mikrovalnoj pećnici 1
minutu na 1000W. Nakon toga posudice s gelovima izvađene su iz mikrovalne pećnice i
stavljene na treskalicu kroz 5 minuta. Boja je potom odstranjena iz posudica, te je dodano 100
ml krajnje čiste vode, a posudice su ponovno stavljene na treskalicu 10 minuta.
Treći korak bilo je odbojavanje gelova. U plastične posudice stavljeno je po 20 ml 20%
otopine natrijeva-klorida. U toj otopini gelovi su se odbojali za desetak minuta, te su
pohranjeni u hladnjak na temperaturu od +4°C do +8°C do idućeg koraka.
3.5. Digestija u gelu
Postupak digestije u gelu radio se prema protokolu Shevchenka i sur. (170).
Svaki gel izrezan je na vrpce koje su dodatno podijeljene na 6 dijelova. Svaki od tih 6 dijelova
dodatno je izrezan na kockice veličine od oko 2 mm2. Usitnjeni komadići gela stavljeni su u
epruvete volumena 2,5 ml, te je uslijedila digestija u gelu.
Komadići gela inkubirani su sa 1 ml acetonitrila (ACN) tijekom 10 minuta, zatim je izvađena
tekućina. Nakon svakog daljnjeg dodavanja ACN-a iz epruveta je odstranjena sva tekućina
kako bi u epruvetama ostali samo komadići gela. Disulfidni mostovi proteina koji se nalaze
zarobljeni u gelu reducirani su i alkilirani na sljedeći način: komadićima gela najprije je
dodano 300 µl ditiotreitola (DDT) te su uzorci stavljeni 30 minuta na temperaturu od 56°C.
Komadićima je dodan 1 ml ACN-a te su ponovno inkubirani tijekom 10 minuta. Nakon toga u
svaku je epruvetu dodano 300 µl jodoacetamida (IAA) te su uzorci ostavljeni na sobnoj
temperaturi 20 minuta, ali u zamračenom prostoru. U svaku epruvetu ponovno je dodan 1 ml
ACN-a na 10 minuta. Komadići gela odbojani su pomoću 300 µl otopine 100mM amonij-
bikarbonat/acetonitril u omjeru 1:1 v/v tijekom 30 minuta. Komadići gela ponovno su
inkubirani u 1 ml ACN-a tijekom 10 minuta.
Ana Badovinac, Disertacija
37
Tako pripremljeni proteini u gelu su enzimski pocijepani na sljedeći način. Komadići gela
osušeni su u vakuum centrifugi (30 minuta, sobna temperatura) te su ponovno rehidrirani s
300 µl TRY (100 ng/ml tripsina u 9,4 ml 50 mM amonij-bikarbonat) u razdoblju od 30 minuta
na 4°C. Nakon toga provjereno je treba li dodati još TRY kako bi se komadići gela u
potpunosti rehidrirali. Poslije provjere uzorci su stavljeni na 4°C kroz daljnjih 90 minuta.
Poslije digestije TRY tekućina iz epruveta izvađena je, a komadićima gela dodano je 300 µl
50mM amonij-bikarbonata te su uzorci inkubirani preko noći na 37°C.
Nakon inkubacije peptidi su ekstrahirani iz gelova te je u idućim koracima sva tekućina iz
epruveta s komadićima gelova skupljana u nove epruvete od 2,5 ml. Najprije je dodano 100 µl
pufera za ekstrakciju (30% ACN, 3% triflouroctena kiselina) na 20-30 minuta. Nakon toga se
tekućina pokupila i premjestila u nove epruvete. U epruvete s komadićima gela dodano je 200
µl pufera za ekstrakciju (80% ACN, 0.5% octena kiselina) tijekom 20-30 minuta. Tekućina se
ponovno pokupila i premjestila u epruvete. Na kraju se dodalo 200 µl ACN-a u razdoblju od
20-30 minuta te se tekućina ponovno pokupila. Prikupljena tekućina, tj. uzorci, stavljeni su na
uparavanje u vakuumsku centrifugu (2 sata, sobna temperatura) kako bi ACN ispario i ostao
čist uzorak. Ovim korakom završen je protokol digestije u gelu, peptidi u uzorcima su
razmotani te slijedi pročišćavanje uzoraka za spektrometriju mase.
3.6. Mikropročišćavanje i odsoljavanje peptida
Peptidi iz uzoraka ukoncentrirani su, odsoljeni i pročišćeni uz pomoć nastavaka pod imenom
stop and go extraction tips (StageTips) prema uputama Rappsilbera i sur. (171). Ukratko,
„Stage tipsovi” napravljeni su od C18 Empore ekstrakcijskih diskova (3M, SAD), namočeni
su metanolom i uravnoteženi otopinom A (0,5% CH3COOH). Ekstrahirani peptidi zakiseljeni
su solucijom A i naneseni na uravnotežene tipsove. Soli su isprane otopinom A te su peptidi
eluirani s tipsova otopinom B. Na kraju, ACN je uparen s odsoljenih i pročišćenih peptida
centrifugiranjem u vakuumu.
Ana Badovinac, Disertacija
38
3.7. Tekućinska kromatografija – Spektrometrija mase (LC-MS/MS)
Peptidi su razdvojeni i nakon toga izmjereni pomoću HPLC-sistema nano skale Easy-nLC
(Proxeon Biosystems) (engl. high pressure liquid chromatography, HPLC) vezanog za LTQ-
Orbitrap Discovery spektrometar mase (Thermo Scientific) kroz nano-elektrosprej
ionizacijski izvor (Proxeon Biosystems) (172). Ukratko, peptidi su naneseni na C18 nano
kolonu kućne izrade napravljene pakiranjem picofrit kapilare (New Objective, promjera 75
μm i promjera vrha od 10 μm) s kašom od Luna 3 μm C18(2) faze (Phenomenex) u metanolu.
Nakon toga peptidi su eluirani s kolone primjenom linearnog gradijenta otopine B u otopini A
(od 3% do 35% B otopine kroz 4.5 sati). Spektrometar mase mjerio je peptide u orbitrap
analizatoru (106 iona pri rezoluciji 30 000) i istovremeno je fragmentirano top 20 peptida u
linearnoj ionskoj stupini (3 000 iona) koristeći se dinamičkim isključenjem kako bi se
spriječila ponavljajuća fragmentacija istaknutih peptida.
3.8. Analiza podataka i statistička obrada
Neobrađeni podaci procesuirani su MaxQuant programom razvijenom na Max Planck
Institutu za biokemiju u Njemačkoj prema opisu Coxa i Manna (173). Liste iona za
pretraživanje baze proteinskih sekvenci sastavljene su primjenom programa MaxQuant.
Uniprotov kompletan humani proteomski set bio je pretražen koristeći se postavljenim
parametrima MaxQuanta. Pogoci obrnutih sljedova omogućili su kontrolu broja lažno
pozitivnih identifikacija. Konačna lista proteina dobivena je odbacivanjem proteina s visokim
E bodom tako da je mjera lažnog otkrića (engl. False Discovery Rate, FDR) zadržana na oko
10%. Svim identificiranim proteinima dodijeljen je Uniprot pristupni broj.
Nakon obrade podataka u MaxQuant programu napravljena je statistička analiza varijance
(ANOVA) uz Benjamini–Hochberg kontrolu višestrukog testiranja.
Analiza genske ontologije (GO) provedena je primjenom DAVID bioinformatičkog programa
(174).
Ana Badovinac, Disertacija
39
4. REZULTATI
Ana Badovinac, Disertacija
40
4.1. Demografski podaci i klinički parametri
U istraživanju je sudjelovalo osam ispitanika. Četiri ispitanika (dvije žene, dva muškarca) s
dijagnozom generaliziranog agresivnog parodontitisa činila su ispitivanu skupinu, a prosječna
dob bila je 34,5 ± 3,7 godina (raspon 30-38 godina). Kontrolnu skupinu činila su četiri
ispitanika (dvije žene, dva muškarca) bez kliničkih znakova parodontne bolesti, prosječna dob
bila je 33,3 ± 3,8 godina (raspon 28-37 godina). Vrijednosti demografskih podataka i
kliničkih parametara ispitanika prikazane su u Tablici 3.
Tablica 3. Demografski podaci i klinički parametri ispitanika
Agresivni parodontitis Kontrolna skupina
Broj sudionika 4 4
Žene 2 2
Muškarci 2 2
Dob (prosjek ± sd) 34,5 ± 3,7 33,3 ± 3,9
Dob (raspon) 30 - 38 28 - 37
Dubina sondiranja (mm)
(prosjek ± sd) 4,0 ± 2,2 1,9 ± 0,1
Dubina sondiranja
poslije terapije (mm)
(prosjek ± sd)
3,42 ± 1,83 -
Recesije (mm)
(prosjek ± sd) 0,29 ± 0,29 0,06 ± 0,09
Recesije
poslije terapije (mm)
(prosjek ± sd)
0,53 ± 0,18 -
Krvarenje pri sondiranju (%)
(prosjek ± sd) 85,7 ± 13,2 11,0 ± 8,1
Krvarenje pri sondiranju poslije
terapije (%)
(prosjek ± sd)
43,6 ± 19,3 -
Aproksimalni plak indeks (%)
(prosjek ± sd) 45,8 ± 24,9 19,0 ± 2,6
Aproksimalni plak indeks poslije
terapije (%)
(prosjek ± sd)
16,1 ± 4,6 -
sd : standardna devijacija
Ana Badovinac, Disertacija
41
4.2. Rezultati proteomskih analiza
Label-free kvantifikacija i LC-MS/MS analiza (engl. Liquid chromatography–mass
spectrometry, LC-MS/MS) korištene su za identifikaciju i kvantifikaciju proteina u uzorcima
epitelnog i vezivnog tkiva parodonta prikupljenih od zdravih ispitanika (kontrolna skupina) i
ispitanika s dijagnozom generaliziranog agresivnog parodontitisa (ispitivana skupina). Takav
pristup analize zajedno s pripremom uzoraka, 1D gel elektroforezom (jednodimenzionalan,
1D) i digestijom proteina u gelu, pokazao se kao učinkovita metoda za proteomsku analizu
epitelnog i vezivnog tkiva parodonta (Slika 7).
Slika 7. Tijek eksperimentalnih procedura. Uzorci tkiva su homogenizirani, proteini iz lizata
su odvojeni 1D gel elektroforezom te je nakon toga uslijedila digestija proteina u gelu
tripsinom. Peptidi su zatim analizirani LC-MS/MS nakon čega su bioinformatički obrađeni.
Ana Badovinac, Disertacija
42
4.2.1. Ukupan broj identificiranih proteina
Proteomskom analizom uzoraka identificirano je ukupno 3420 proteina. Nakon što su
izbačeni reverzni hitovi (proteini iz baze obrnutih aminokiselinskih sekvenci koji služe za
kontrolu FDR-a, engl. False discovery rate) broj proteina smanjio se na 3350. Među 3350
identificiranih proteina našli su se i proteini koji nisu kvantificirani (intenzitet im je bio
jednak 0) te su morali biti uklonjeni. Time se došlo do broja od 3155 proteina.
Proteinima s jednom neizmjerenom vrijednosti LFQ kolone (engl. Label-free quantification,
LFQ) ili više njih pristupilo se na sljedeći način. S popisa od 3155 proteina izbačeni su svi
proteini s više od jedne LFQ kolone jednake vrijednosti 0, a oni koji su imali u samo jednoj
LFQ koloni vrijednost 0 zamijenjeni su za srednju vrijednost pojedinog proteina. Time je
ukupan broj proteina pao je na brojku 1564.
Statističkom analizom varijance (ANOVA) uz kontrolu zbog višestrukog testiranja došlo se
do konačnog broja od 193 proteina uz FDR od 10%. Ti proteini pronađeni su u svim
uzorcima, te su pokazali statistički značajne promjene u ekspresiji između kontrolne grupe i
ispitivanih grupa.
Ana Badovinac, Disertacija
43
4.2.2. Zastupljenost proteina u ispitivanim skupina
Slika 8 prikazuje usporedbu u promjenama zastupljenosti 193 proteina kod pacijenata s
generaliziranim agresivnim parodontitisom i to zdravog mjesta, mjesta s gingivitisom,
parodontitisom i mjesta s parodontitisom nakon terapije (ispitivane skupine) kada se usporede
s kontrolnom skupinom. Ekspresija proteina je normalizirana prema kontrolnoj skupini.
Proteini su grupirani i poredani metodom klasteriranja hijerarhijskom aglomerativnom
metodom koristeći metriku kosinusne korelacije.
Vrijednosti promjena izražene su bojama te je vidljiva jasna razlika između obojenosti
skupine parodontitis i ostale tri ispitivane skupine. Takva obojenost ukazuje da je u skupini
parodontitis učestalost proteina s većim stupnjem promjene veća nego u ostalim ispitivanim
skupinama. U ispitivanoj skupini parodontitis vidljiva je grupa proteina (od 20. do 90. mjesta,
plavkasto obojeni) čija je zastupljenost manja nego u ostale tri ispitivane skupine (zdravo,
gingivitis i poslije terapije), te grupa proteina (157. do 193. mjesto, narančasto-crveno
obojeni) čija je zastupljenost veća nego u ostale tri ispitivane skupine (zdravo, gingivitis i
poslije terapije). Također je zanimljivo pratiti stupanj promjene određenog proteina kroz
ispitivane skupine. Tako npr. protein pod rednim brojem 139 na Slici 8
(Oligosaccharyltransferase complex subunit, redni broj 139) pokazuje slabiju ekspresiju u
skupini zdravo i poslije terapije, a povećanu u parodontitisu. Protein pod rednim brojem 102
na slici 8 (Azurocidin) znatno je povećan u skupini gingivitis i parodontitis dok je u skupini
zdravo i poslije terapije njegova ekspresija znatno manja. Zanimljiva je i ekspresija proteina
pod redim brojem 84 i 85 (Cadherin-1 i Transgelin-2), oni su samo u skupini parodontitis
smanjeni dok im je ekspresija u ostale tri ispitivane skupine povećana.
Ovo je samo kratak uvod u praćenje promjena proteina kroz ispitivane skupine. Tablice koje
slijede dat će detaljnije informacije o stupnju promjene određenog proteina u ispitivanim
skupinama.
Ana Badovinac, Disertacija
44
Slika 8. Prikaz promjena zastupljenosti proteina ovisno o ispitivanoj skupini (zdravo,
gingivitis, parodontitis, poslije terapije). Redovi predstavljaju individualan protein, a stupci
ispitivanu skupinu. Stupanj promjene je predočen kao logaritam baze 2 omjera intenziteta
ispitivanih skupina i kontrolne skupine. Raspon gradijenta boje toplinske mape prikazan je uz
mapu. Spektar od zelene boje prema crvenoj označava longitudinalan porast u zastupljenosti,
a spektar od zelene boje prema plavoj označava pad zastupljenosti.
Ana Badovinac, Disertacija
45
4.2.3. Stupnjevi promjene proteina u ispitivanim skupinama
193 proteina pokazala su različitu zastupljenost u uzorcima ispitivanih skupina kada su se
usporedili s kontrolnom skupinom. Popis proteina i stupnjevi promjena prikazani su u Tablici
4.
Svaki protein određen je Uniprot identifikacijskim brojem (Uniprot ID), MaxQuant brojem
(MaxQuant ID) te proteinskim imenom. Stupac Redni br odnosi se na redni broj pod kojim se
određeni protein može pronaći na Slici 8. Stupci pod imenom Stupanj promjene pokazuju u
kojoj mjeri je određeni protein povećan ili smanjen (predznak ''-'') u ispitivanoj skupini
(zdravo, gingivitis, parodontitis, poslije terapije) u odnosu na isti protein u kontrolnoj skupini.
Tablica 4. Popis 193 proteina (posloženi prema rednom broju) i stupnjevi promjene
zastupljenosti proteina u ispitivanim skupinama. Predznak ''-'' označava da je određeni protein
smanjen u ispitivanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu.
Stupanj promjene
Uniprot ID
Ime proteina MaxQuant ID
Redni br
Zdravo Gingivitis Parodontitis Poslije terapije
H0YBZ2 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (Fragment)
1535 0 2,83 1,23 1,32 1,04
P51531 Probable global transcription activator SNF2L2
2152 1 1,42 2,93 -1,18 -1,59
P06703 Protein S100-A6 1574 2 6,31 4,9 -3,29 2,93
Q13201 Multimerin-1 574 3 7,56 4,42 -2,21 -1,36
Q12797 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase
844 4 1,02 1,06 1,07 -1,53
Q06830 Peroxiredoxin-1 2398 5 -1,23 1,1 -1,1 1,17
Q9H2U2-2
Isoform 2 of Inorganic pyrophosphatase 2, mitochondrial
534 6 -1,68 1,17 -1,41 1,47
P62191 26S protease regulatory subunit 4
2264 7 -1,09 -1,00 -1,23 1,96
P54577 Tyrosine--tRNA ligase, cytoplasmic
2192 8 1,01 1,07 -1,19 1,24
G3XAF6 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1
980 9 2,41 1,18 -1,00 -1,99
P05452 Tetranectin 705 10 1,81 -1,15 -1,04 -2,34
O95865 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2
1416 11 2,46 -1,4 -1,06 -1,32
P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase
38 12 1,84 -1,53 -1,32 -1,01
Ana Badovinac, Disertacija
46
subunit beta-1
P05783 Keratin, type I cytoskeletal 18
896 13 -1,11 -2,92 -1,72 -1,29
P52630 Signal transducer and activator of transcription 2
954 14 -1,13 -4,32 -1,91 -1,4
P17050 Alpha-N-acetylgalactosaminidase
1771 15 -1,34 -2,2 -1,71 -1,99
Q12768 WASH complex subunit strumpellin
2427 16 -1,26 -2,71 -1,43 -3,29
P29590 Protein PML 1921 17 -1,34 -1,89 -1,11 -1,35
P50453 Serpin B9 2141 18 -1,42 -2,38 -1,3 -1,92
P49368 T-complex protein 1 subunit gamma
2118 19 -1,11 -1,0 -1,22 1,08
P10768 S-formylglutathione hydrolase
1663 20 -2,26 1,01 -2,73 -1,16
Q12959-2 Isoform 2 of Disks large homolog 1
2440 21 -2,68 -1,07 -3,89 1,23
Q14134 Tripartite motif-containing protein 29
2501 22 -1,88 -1,72 -3,15 -1,13
Q6IBS0 Twinfilin-2 2708 23 -1,41 -2,64 -4,27 1,45
Q9BWD1 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic
3042 24 -1,25 -4,07 -3,03 1,34
P51149 Ras-related protein Rab-7a
2148 25 -1,96 1,02 -1,45 -1,44
P48047 ATP synthase subunit O, mitochondrial
2097 26 -1,23 1,27 -1,3 -1,3
P00734 Prothrombin 1436 27 -1,17 1,4 -1,24 -1,37
E7ESP4 Integrin alpha-2 554 28 1,3 -1,42 -2,14 1,75
J3KN62 Cadherin-13 1127 29 2,39 1,43 -2,7 -1,55
G8JLA8 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3
998 30 -1,93 -1,08 -2,11 -3,04
P50148 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
2133 31 -1,57 1,01 -1,47 -1,76
B7Z468 Calpastatin 301 32 1,67 -1,09 -2,31 1,32
Q96FQ6 Protein S100-A16 2953 33 1,47 -1,73 -4,28 1,67
P09525 Annexin A4 1638 34 1,54 -1,07 -1,64 -1,15
O95274 Ly6/PLAUR domain-containing protein 3
1390 35 2,1 -1,63 -5,32 1,23
Q99729-2 Isoform 2 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B
505 36 1,47 -1,09 -1,87 -1,01
H0YK83 Signal peptidase complex catalytic subunit SEC11A
1040 37 -1,92 1,59 -3,31 -1,78
Q13283 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1
2460 38 -1,12 -1,18 -3,05 1,17
P32455 Interferon-induced guanylate-binding protein 1
1971 39 -1,05 -1,3 -3,22 1,53
P61981 14-3-3 protein gamma 2260 40 2,12 -1,2 -1,35 -1,55
P29622 Kallistatin 1922 41 1,56 1,16 -1,44 -1,64
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
3256 42 -1,01 1,15 -4,32 1,01
O14786 Neuropilin-1 636 43 1,09 -1,3 -3,53 -1,46
Q9NVI7 ATPase family AAA domain-containing protein
3162 44 1,02 -1,0 -1,96 -1,09
Ana Badovinac, Disertacija
47
3A
Q16698 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial
306 45 -1,01 -1,02 -2,07 -1,28
P09661 U2 small nuclear ribonucleoprotein A
1642 46 1,06 1,04 -3,19 -1,37
O75718 Cartilage-associated protein
1350 47 1,15 -1,4 -2,15 -1,18
P01040 Cystatin-A 1452 48 1,39 -1,57 -3,53 -1,63
P35052 Glypican-1 1984 49 1,75 -1,47 -4,05 -2,07
P35232 Prohibitin 1987 50 1,01 1,11 -1,6 -1,3
Q9Y224 UPF0568 protein C14orf166
3277 51 1,04 1,18 -2,37 -1,78
P20774 Mimecan 1816 52 2,02 -1,1 -4,34 -7,92
P36955 Pigment epithelium-derived factor
2017 53 2,39 1,02 -1,57 -2,06
P51884 Lumican 2167 54 2,19 1,09 -3,56 -3,74
E9PIE3 Protein kinase C delta-binding protein
712 55 1,33 -1,0 -4,62 -3,22
P08758 Annexin A5 1629 56 1,15 -1,07 -2,32 -2,13
P51888 Prolargin 2168 57 1,64 -1,44 -8,57 -5,74
P07585 Decorin 1594 58 1,98 -1,11 -2,89 -2,45
P02545 Prelamin-A/C 1496 59 1,36 -1,09 -2,43 -2,4
P21810 Biglycan 51 60 1,86 -1,16 -3,91 -3,06
P39060 Collagen alpha-1(XVIII) chain
2031 61 1,35 -1,05 -2,13 -1,93
Q8IUX7 Adipocyte enhancer-binding protein 1
2800 62 2,05 -1,19 -2,28 -2,65
P08670 Vimentin 1624 63 1,65 -1,02 -1,43 -1,88
Q9Y6C2 EMILIN-1 3338 64 2,02 1,06 -2,14 -3,36
P07355-2 Isoform 2 of Annexin A2 1591 65 1,46 -1,35 -1,44 -1,3
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain
2315 66 2,2 -1,77 -2,1 -1,35
H3BMK9 Tryptase alpha/beta-1 913 67 -1,21 -1,53 -3,57 -3,28
O94826 Mitochondrial import receptor subunit TOM70
1374 68 -1,13 -1,44 -2,32 -1,73
Q14683 Structural maintenance of chromosomes protein 1A
2524 69 -1,52 -1,11 -2,78 -2,48
P39019 40S ribosomal protein S19
2028 70 -1,5 1,18 -3,77 -1,34
Q5T9B7 Adenylate kinase H 1435 71 -1,53 1,35 -3,61 -1,18
Q14112 Nidogen-2 2499 72 -1,24 1,06 -1,44 -1,37
P08708 40S ribosomal protein S17
1626 73 -1,95 1,04 -3,28 -2,05
P00403 Cytochrome c oxidase subunit 2
1426 74 -1,4 1,02 -2,91 -1,58
Q9NP72 Ras-related protein Rab-18
3127 75 -1,35 -1,07 -1,94 -1,35
H3BP20 Beta-hexosaminidase subunit alpha
1059 76 1,44 -1,8 -2,71 -3,61
Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1
2405 77 1,25 -1,42 -1,55 -2,24
P36269-3 Isoform 3 of Gamma-glutamyltransferase 5
2006 78 1,54 -1,66 -1,9 -3,13
Q7L2H7 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M
2761 79 1,3 -1,46 -1,37 -1,45
Q9UNH7 Sorting nexin-6 185 80 1,55 -1,79 -1,64 -2,25
O75531 Barrier-to-autointegration factor
1340 81 1,17 -4,22 -7,05 -2,66
Ana Badovinac, Disertacija
48
B7Z6H3 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9
308 82 1,43 -3,02 -5,99 -3,93
P12830 Cadherin-1 1706 83 1,52 1,18 -2,2 1,63
P37802 Transgelin-2 2022 84 1,43 1,32 -2,47 1,22
P02652 Apolipoprotein A-II 1500 85 2,06 2,48 -5,29 -1,28
P30043 Flavin reductase (NADPH)
1929 86 -1,58 3,36 -4,17 1,45
P13716 Delta-aminolevulinic acid dehydratase
296 87 -1,83 2,0 -2,33 1,23
P00918 Carbonic anhydrase 2 1443 88 -1,54 4,03 -1,44 1,39
P32119 Peroxiredoxin-2 1969 89 -1,06 2,52 -1,52 1,18
P00915 Carbonic anhydrase 1 1442 90 -1,42 3,87 -1,79 1,1
P02671 Fibrinogen alpha chain 1501 91 -1,35 3,94 1,76 1,79
P69905 Hemoglobin subunit alpha 2326 92 1,11 2,73 1,04 1,22
P02730 Band 3 anion transport protein
1503 93 1,65 10,25 1,63 3,66
P00558 Phosphoglycerate kinase 1
1434 94 -1,1 -1,31 1,15 1,16
Q9UBG3 Cornulin 3208 95 -1,61 -1,69 1,77 2,77
O14936 Peripheral plasma membrane protein CASK
919 96 -2,29 -1,49 1,32 2,01
P07384 Calpain-1 catalytic subunit
1592 97 -2,33 -1,41 -1,53 1,25
Q6IN85 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A
976 98 -2,05 -1,64 -1,29 1,3
O75874 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic
1356 99 -1,34 -1,54 -1,0 1,34
Q9NYL4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11
3172 100 -2,38 2,18 2,12 -2,11
P52209 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating
206 101 -1,19 1,11 1,35 1,76
P20160 Azurocidin 1806 102 -1,14 9,39 9,59 2,2
P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1
1871 103 1,03 1,48 1,51 1,47
P00450 Ceruloplasmin 1428 104 -1,05 2,29 2,54 1,95
P26373 60S ribosomal protein L13
1888 105 -1,23 2,59 3,28 2,65
P83731 60S ribosomal protein L24
400 106 -2,62 1,51 1,69 1,38
P31939 Bifunctional purine biosynthesis protein PURH
647 107 -1,91 1,69 2,1 1,89
J3QQ67 60S ribosomal protein L18 (Fragment)
891 108 -2,34 1,87 2,04 1,86
P62241 40S ribosomal protein S8 2266 109 -1,71 1,41 1,71 1,27
Q99459 Cell division cycle 5-like protein
2992 110 -2,35 1,31 2,21 1,52
Q16822 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial
2597 111 -1,14 -1,67 2,03 -1,26
P20042 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2
1805 112 -1,26 -1,04 1,52 -1,89
H7C2I1 Protein arginine N-methyltransferase 1
724 113 1,14 -1,85 1,14 -1,48
P62854 40S ribosomal protein S26
2292 114 -1,92 1,08 1,08 1,14
Ana Badovinac, Disertacija
49
P20618 Proteasome subunit beta type-1
1811 115 -1,85 -1,07 -1,07 -1,1
B5ME19 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C
278 116 -2,05 1,18 1,33 -1,28
A8MUS3 60S ribosomal protein L23a
77 117 -2,13 -1,03 1,47 -1,34
P38159 RNA-binding motif protein, X chromosome
1014 118 -4,07 -1,29 1,68 -1,02
Q15046 Lysine--tRNA ligase 2540 119 -1,76 -1,34 1,16 1,09
E7EPK6 40S ribosomal protein S24
577 120 -2,92 -1,25 -1,03 1,54
Q14008-3 Isoform 3 of Cytoskeleton-associated protein 5
2496 121 -2,88 -1,21 -1,01 1,14
P10644 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit
1662 122 -4,22 -1,57 1,09 1,25
P13010 X-ray repair cross-complementing protein 5
1710 123 -1,62 -1,47 1,17 -1,13
Q13620 Cullin-4B 2483 124 -2,33 -2,4 1,04 1,05
Q7L014 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46
2759 125 1,41 -1,99 1,66 -1,72
Q9H2M9 Rab3 GTPase-activating protein non-catalytic subunit
3087 126 1,42 -1,22 1,2 -1,26
Q14240-2 Isoform 2 of Eukaryotic initiation factor 4A-II
585 127 1,59 -1,54 1,26 -1,2
P30520 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2
1946 128 1,26 -1,32 1,17 -1,19
O95470 Sphingosine-1-phosphate lyase 1
1399 129 1,39 -2,35 1,11 1,39
F5H098 Malate dehydrogenase B 806 130 1,01 -1,75 1,11 1,14
Q16537 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit epsilon isoform
326 131 -1,03 -1,96 1,58 -1,88
Q92797 Symplekin 2912 132 -1,01 -1,96 1,23 -1,09
P68363 Tubulin alpha-1B chain 2319 133 -1,1 -1,57 1,11 -1,18
E5RJD8 Tubulin-specific chaperone A
549 134 -1,21 -2,01 1,49 -1,38
Q6PGP7 Tetratricopeptide repeat protein 37
2726 135 -1,36 -2,33 1,41 -1,35
Q9UBV2 Protein sel-1 homolog 1 3214 136 -1,75 -2,03 2,22 -2,43
O76094 Signal recognition particle 72 kDa protein
1371 137 -2,17 -1,65 1,52 -1,93
Q8NBS9 Thioredoxin domain-containing protein 5
135 138 -2,4 -1,87 1,46 -3,0
Q9NRP0 Oligosaccharyltransferase complex subunit OSTC
3145 139 -4,77 -2,45 2,39 -12,03
J3KN10 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha
1123 140 -1,79 -1,06 1,16 -2,41
Q00341 Vigilin 2346 141 -1,92 -1,12 1,26 -1,94
J3KNB4 Antibacterial protein FALL-39
1130 142 -2,01 -1,08 1,18 -1,77
O00291 Huntingtin-interacting protein 1
602 143 1,76 1,89 1,89 -1,1
P0C0S5 Histone H2A.Z 1650 144 1,11 1,44 1,79 -1,42
P18085 ADP-ribosylation factor 4 401 145 1,55 1,79 1,95 -1,64
Ana Badovinac, Disertacija
50
O14907 Tax1-binding protein 3 1225 146 1,97 -1,13 1,75 1,12
P01625 Ig kappa chain V-IV region Len
1468 147 -1,82 -2,16 3,0 1,77
Q13315 Serine-protein kinase ATM
2461 148 -1,01 -1,26 1,6 -1,57
Q9Y3B4 Pre-mRNA branch site protein p14
3300 149 1,32 -2,02 2,15 -1,12
Q01469 Fatty acid-binding protein, epidermal
2359 150 1,46 -1,55 1,41 1,34
Q9Y6Y8 SEC23-interacting protein 810 151 1,35 -1,69 1,74 1,17
E9PEN8 Exportin-7 678 152 1,36 -1,44 1,57 1,41
Q02543 60S ribosomal protein L18a
2374 153 1,27 -1,71 1,62 1,47
P51812 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3
168 154 1,08 -1,36 1,34 1,15
P48735 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial
2109 155 -1,65 -1,15 1,69 -1,06
Q92616 Translational activator GCN1
2905 156 -1,87 -1,23 1,72 -1,03
Q04837 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial
416 157 1,76 1,17 2,84 -1,52
P05387 60S acidic ribosomal protein P2
1562 158 1,12 -1,02 1,68 -1,62
Q3SY69 Mitochondrial 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase
2616 159 1,01 1,23 2,83 -2,7
Q96KP4 Cytosolic non-specific dipeptidase
2970 160 -1,51 1,13 2,81 1,43
O75955 Flotillin-1 1366 161 -1,15 -1,25 2,63 -1,22
P99999 Cytochrome c 381 162 1,06 -1,12 2,61 1,05
P01834 Ig kappa chain C region 1485 163 2,51 -1,76 5,32 1,62
Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2
2904 164 1,69 -1,74 3,41 1,46
J3KN16 Protein KIAA0368 1124 165 1,01 -1,26 1,81 1,03
Q06210 Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1
2395 166 1,3 -1,47 3,59 -1,07
O95834-2 Isoform 2 of Echinoderm microtubule-associated protein-like 2
1415 167 1,25 -1,66 3,28 1,14
P04839 Cytochrome b-245 heavy chain
1545 168 1,64 -1,44 4,73 2,9
P57740 Nuclear pore complex protein Nup107
2222 169 1,55 -1,12 2,27 1,59
P61970 Nuclear transport factor 2 2257 170 1,37 -1,03 2,04 -1,07
P54886 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase
2198 171 1,85 1,18 2,92 1,09
A3KMH1 von Willebrand factor A domain-containing protein 8
21 172 1,72 -1,03 2,23 1,25
Q86UE4 Protein LYRIC 2782 173 -2,59 -1,36 3,13 1,47
P01861 Ig gamma-4 chain C region
1489 174 -1,74 -1,55 5,54 1,82
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein
2144 175 -1,34 -1,32 5,32 1,88
P62805 Histone H4 2287 176 -1,37 -1,15 3,42 1,07
P14550 Alcohol dehydrogenase 1735 177 -1,33 -1,09 1,71 1,06
Ana Badovinac, Disertacija
51
[NADP(+)]
P49588 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic
2122 178 -1,44 -1,11 2,17 -1,03
P26885 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2
1895 179 -1,43 1,19 2,68 -1,93
Q8N5K1 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2
2832 180 -1,25 -1,07 3,57 -2,39
Q16706 Alpha-mannosidase 2 2591 181 -1,13 1,2 3,16 -1,07
P02766 Transthyretin 1512 182 1,04 1,15 2,15 -1,16
P29762 Cellular retinoic acid-binding protein 1
1924 183 1,12 1,79 4,69 -1,24
P18077 60S ribosomal protein L35a
1785 184 1,46 -1,02 4,75 1,56
P62942 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A
2299 185 1,6 1,51 4,61 1,54
P01620 Ig kappa chain V-III region SIE
1466 186 1,11 1,35 4,54 1,58
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen
2045 187 1,19 1,42 6,72 1,81
Q9UKK3 Poly [ADP-ribose] polymerase 4
3249 188 1,07 1,23 2,06 1,08
O00232 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12
1190 189 1,23 1,19 2,35 1,08
B5MCQ5 Protein disulfide-isomerase A6
272 190 -1,16 1,07 2,95 -1,54
P62244 40S ribosomal protein S15a
1115 191 -1,2 1,4 1,95 -1,33
O75396 Vesicle-trafficking protein SEC22b
1332 192 -1,18 1,27 2,07 -1,3
U Tablici 4. vidljivi su iznosi stupnjeva promjene 193 proteina u određenoj ispitivanoj
skupini, a izdvojeni su sljedeći.
U zdravoj ispitivanoj skupini proteini vrijedni razmatranja su Mimecan (P20774, Redni br
52), Decorin (P07585, Redni br 146), 14-3-3 protein gamma (P61981, Redni br 40), Vimentin
(P08670, Redni br 63), Annexin A4 (P09525, Redni br 34), Isoform 2 of Annexin A2 (P07355-
2, Redni br 65), Annexin A5 (P08758, Redni br 56) i Cystatin-A (P01040, Redni br 48). Kada
se pogleda njihov stupanj promjene, vidljivo je da je ekspresija tih proteina u zdravoj skupini
pojačana, dok je u skupinama gingivitis, parodontitis i poslije terapije snižena. Nasuprot tome,
protein Ceruloplasmin (P00450, Redni br 104) pokazuje smanjenu ekspresiju u zdravoj u
odnosu na ostale tri skupine.
Band 3 anion transport protein (P02730, Redni br 93), Nidogen-2 (Q14112, Redni br 73) i
Prothrombin (P00734, Redni br 27) su proteini čija je ekspresija povišena u gingivitisu.
Njihova ekspresija u ostalim ispitivanim skupinama je snižena te bi zbog te činjenice mogli
Ana Badovinac, Disertacija
52
biti proteini koji obilježavaju ovo stanje. Dedicator of cytokinesis protein 2 (Q92608, Redni
br 164) također bi mogao biti zanimljiv budući da je samo u stanju gingivitisa njegova
ekspresija smanjena.
U ispitivanoj skupini parodontitis mnogi proteini su pokazali zanimljive promjene u
ekspresiji, a izdvojeni su sljedeći. Protein S100-A6 (P06703, Redni br 2) i Cadherin-1
(P12830, Redni br 83) sniženi su samo u stanju parodontitisa, dok je Cadherin-13 (J3KN62,
Redni br 29) snižen i u stanju poslije terapije, a protein S100-A16 (Q96FQ6, Redni br 33) u
stanju parodontitisa i gingivitisa. Annexin A5 (P08758, Redni br 56) pokazuje najnižu
ekspresiju u stanju parodontitisa dok protein Azurocidin (P20160, Redni br 102) pokazuje
najjaču ekspresiju u parodontitisu, ali je njegova ekspresija u gingivitisu također vrlo jaka.
Protein Vigilin (Q00341, Redni br 141) povišen je samo u parodontitisu, a proteini Histon H4
(P62805, Redni br 176) i Protein LYRIC (Q86UE4, Redni br 173) u parodontitisu i poslije
terapije.
Za stanje poslije terapije istaknuti su sljedeći proteini. Protein S100-A16 (Q96FQ6, Redni br
33) mogao bi biti zanimljiv za ovo stanje jer je njegova ekspresija povišena u zdravome,
snižena u gingivitisu i parodontitisu, a onda opet povišena u stanju poslije terapije. Protein
imena Oligosaccharyltransferase complex subunit (Q9NRP0, Redni br 139) pokazuje
iznimno nisku ekspresiju u stanju poslije terapije, snižen je također u zdravoj skupini i
gingivitisu, dok je povišen u parodontitisu. I završno, proteini čija je ekspresija povišena
jedino u stanju poslije terapije su Twinfilin-2 (Q6IBS0, Redni br 23), Calpain-1 catalytic
subunit (P07384, Redni br 97), Isoform 2 of Disks large homolog 1 (Q12959-2, Redni br 21) i
Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase (Q12797, Redni br 4).
Ana Badovinac, Disertacija
53
4.2.4. Usporedba kontrolne skupine i zdravog mjesta ispitivane skupine
Usporedba zastupljenosti proteina zdravog mjesta kontrolne skupine i zdravog mjesta
ispitivane skupine. Rezultati usporedbe prikazani su u Tablici 5. Svaki protein određen je
Uniprot identifikacijskim brojem (Uniprot ID), MaxQuant brojem (MaxQuant ID) te
proteinskim imenom. Stupac Redni br odnosi se na redni broj pod kojim se određeni protein
može pronaći na Slici 8. Stupac pod imenom Stupanj promjene u zdravom mjestu ispitivane
skupine pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen (predznak ''-'') u
zdravom uzorku ispitivane skupine u odnosu na isti protein kontrolne skupine.
Tablica 5. Prikaz proteina prema stupnju promjene u zdravom mjestu ispitivane skupine u
odnosu na kontrolnu skupinu. Predznak ''-'' označava da je određeni protein smanjen u
ispitivanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu.
Uniprot ID Ime proteina MaxQuant ID
Redni br Stupanj promjene u zdravom mjestu ispitivane skupine
Q13201 Multimerin-1 574 3 7,56
P06703 Protein S100-A6 1574 2 6,31
H0YBZ2 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (Fragment)
1535 0 2,83
P01834 Ig kappa chain C region 1485 163 2,51
O95865 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2
1416 11 2,46
G3XAF6 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 980 9 2,41
J3KN62 Cadherin-13 1127 29 2,39
P36955 Pigment epithelium-derived factor 2017 53 2,39
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain 2315 66 2,20
P51884 Lumican 2167 54 2,19
P61981 14-3-3 protein gamma 2260 40 2,12
O95274 Ly6/PLAUR domain-containing protein 3 1390 35 2,10
P02652 Apolipoprotein A-II 1500 85 2,06
Q8IUX7 Adipocyte enhancer-binding protein 1 2800 62 2,05
P20774 Mimecan 1816 52 2,02
Q9Y6C2 EMILIN-1 3338 64 2,02
P07585 Decorin 1594 58 1,98
O14907 Tax1-binding protein 3 1225 146 1,97
P21810 Biglycan 51 60 1,86
P54886 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 2198 171 1,85
P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1
38 12 1,84
P05452 Tetranectin 705 10 1,81
O00291 Huntingtin-interacting protein 1 602 143 1,76
Q04837 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial 416 157 1,76
P35052 Glypican-1 1984 49 1,75
A3KMH1 von Willebrand factor A domain-containing protein 8 21 172 1,72
Ana Badovinac, Disertacija
54
Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 2904 164 1,69
B7Z468 Calpastatin 301 32 1,67
P08670 Vimentin 1624 63 1,65
P02730 Band 3 anion transport protein 1503 93 1,65
P51888 Prolargin 2168 57 1,64
P04839 Cytochrome b-245 heavy chain 1545 168 1,64
P62942 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A 2299 185 1,60
Q14240-2 Isoform 2 of Eukaryotic initiation factor 4A-II 585 127 1,59
P29622 Kallistatin 1922 41 1,56
P18085 ADP-ribosylation factor 4 401 145 1,55
Q9UNH7 Sorting nexin-6 185 80 1,55
P57740 Nuclear pore complex protein Nup107 2222 169 1,55
P36269-3 Isoform 3 of Gamma-glutamyltransferase 5 2006 78 1,54
P09525 Annexin A4 1638 34 1,54
P12830 Cadherin-1 1706 83 1,52
Q96FQ6 Protein S100-A16 2953 33 1,47
Q99729-2 Isoform 2 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B
505 36 1,47
P07355-2 Isoform 2 of Annexin A2 1591 65 1,46
Q01469 Fatty acid-binding protein, epidermal 2359 150 1,46
P18077 60S ribosomal protein L35a 1785 184 1,46
H3BP20 Beta-hexosaminidase subunit alpha 1059 76 1,44
P37802 Transgelin-2 2022 84 1,43
B7Z6H3 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 308 82 1,43
Q9H2M9 Rab3 GTPase-activating protein non-catalytic subunit 3087 126 1,42
P51531 Probable global transcription activator SNF2L2 2152 1 1,42
Q7L014 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46 2759 125 1,41
P01040 Cystatin-A 1452 48 1,39
O95470 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 1399 129 1,39
P61970 Nuclear transport factor 2 2257 170 1,37
E9PEN8 Exportin-7 678 152 1,36
P02545 Prelamin-A/C 1496 59 1,36
Q9Y6Y8 SEC23-interacting protein 810 151 1,35
P39060 Collagen alpha-1(XVIII) chain 2031 61 1,35
E9PIE3 Protein kinase C delta-binding protein 712 55 1,33
Q9Y3B4 Pre-mRNA branch site protein p14 3300 149 1,32
Q7L2H7 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M 2761 79 1,30
E7ESP4 Integrin alpha-2 554 28 1,30
Q06210 Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1
2395 166 1,30
Q02543 60S ribosomal protein L18a 2374 153 1,27
P30520 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 1946 128 1,26
O95834-2 Isoform 2 of Echinoderm microtubule-associated protein-like 2
1415 167 1,25
Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 2405 77 1,25
O00232 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12 1190 189 1,23
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen 2045 187 1,19
O75531 Barrier-to-autointegration factor 1340 81 1,17
P08758 Annexin A5 1629 56 1,15
O75718 Cartilage-associated protein 1350 47 1,15
H7C2I1 Protein arginine N-methyltransferase 1 724 113 1,14
P29762 Cellular retinoic acid-binding protein 1 1924 183 1,12
P05387 60S acidic ribosomal protein P2 1562 158 1,12
P0C0S5 Histone H2A.Z 1650 144 1,11
P01620 Ig kappa chain V-III region SIE 1466 186 1,11
P69905 Hemoglobin subunit alpha 2326 92 1,11
O14786 Neuropilin-1 636 43 1,09
P51812 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 168 154 1,08
Ana Badovinac, Disertacija
55
Q9UKK3 Poly [ADP-ribose] polymerase 4 3249 188 1,07
P99999 Cytochrome c 381 162 1,06
P09661 U2 small nuclear ribonucleoprotein A 1642 46 1,06
Q9Y224 UPF0568 protein C14orf166 3277 51 1,04
P02766 Transthyretin 1512 182 1,04
P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1 1871 103 1,03
Q9NVI7 ATPase family AAA domain-containing protein 3A 3162 44 1,02
Q12797 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase 844 4 1,02
F5H098 Malate dehydrogenase B 806 130 1,01
P54577 Tyrosine--tRNA ligase, cytoplasmic 2192 8 1,01
Q3SY69 Mitochondrial 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase
2616 159 1,01
P35232 Prohibitin 1987 50 1,01
J3KN16 Protein KIAA0368 1124 165 1,01
Q16698 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial 306 45 -1,01
Q92797 Symplekin 2912 132 -1,01
Q13315 Serine-protein kinase ATM 2461 148 -1,01
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
3256 42 -1,01
Q16537 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit epsilon isoform
326 131 -1,03
P32455 Interferon-induced guanylate-binding protein 1 1971 39 -1,05
P00450 Ceruloplasmin 1428 104 -1,05
P32119 Peroxiredoxin-2 1969 89 -1,06
P62191 26S protease regulatory subunit 4 2264 7 -1,09
P68363 Tubulin alpha-1B chain 2319 133 -1,10
P00558 Phosphoglycerate kinase 1 1434 94 -1,10
P49368 T-complex protein 1 subunit gamma 2118 19 -1,11
P05783 Keratin, type I cytoskeletal 18 896 13 -1,11
Q13283 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 2460 38 -1,12
O94826 Mitochondrial import receptor subunit TOM70 1374 68 -1,13
P52630 Signal transducer and activator of transcription 2 954 14 -1,13
Q16706 Alpha-mannosidase 2 2591 181 -1,13
P20160 Azurocidin 1806 102 -1,14
Q16822 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial
2597 111 -1,14
O75955 Flotillin-1 1366 161 -1,15
B5MCQ5 Protein disulfide-isomerase A6 272 190 -1,16
P00734 Prothrombin 1436 27 -1,17
O75396 Vesicle-trafficking protein SEC22b 1332 192 -1,18
P52209 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating 206 101 -1,19
P62244 40S ribosomal protein S15a 1115 191 -1,20
H3BMK9 Tryptase alpha/beta-1 913 67 -1,21
E5RJD8 Tubulin-specific chaperone A 549 134 -1,21
P48047 ATP synthase subunit O, mitochondrial 2097 26 -1,23
P26373 60S ribosomal protein L13 1888 105 -1,23
Q06830 Peroxiredoxin-1 2398 5 -1,23
Q14112 Nidogen-2 2499 72 -1,24
Q8N5K1 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2 2832 180 -1,25
Q9BWD1 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 3042 24 -1,25
Q12768 WASH complex subunit strumpellin 2427 16 -1,26
P20042 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2 1805 112 -1,26
P14550 Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] 1735 177 -1,33
O75874 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic 1356 99 -1,34
P17050 Alpha-N-acetylgalactosaminidase 1771 15 -1,34
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein 2144 175 -1,34
P29590 Protein PML 1921 17 -1,34
P02671 Fibrinogen alpha chain 1501 91 -1,35
Ana Badovinac, Disertacija
56
Q9NP72 Ras-related protein Rab-18 3127 75 -1,35
Q6PGP7 Tetratricopeptide repeat protein 37 2726 135 -1,36
P62805 Histone H4 2287 176 -1,37
P00403 Cytochrome c oxidase subunit 2 1426 74 -1,40
Q6IBS0 Twinfilin-2 2708 23 -1,41
P50453 Serpin B9 2141 18 -1,42
P00915 Carbonic anhydrase 1 1442 90 -1,42
P26885 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 1895 179 -1,43
P49588 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic 2122 178 -1,44
P39019 40S ribosomal protein S19 2028 70 -1,50
Q96KP4 Cytosolic non-specific dipeptidase 2970 160 -1,51
Q14683 Structural maintenance of chromosomes protein 1A 2524 69 -1,52
Q5T9B7 Adenylate kinase H 1435 71 -1,53
P00918 Carbonic anhydrase 2 1443 88 -1,54
P50148 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
2133 31 -1,57
P30043 Flavin reductase (NADPH) 1929 86 -1,58
Q9UBG3 Cornulin 3208 95 -1,61
P13010 X-ray repair cross-complementing protein 5 1710 123 -1,62
P48735 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial 2109 155 -1,65
Q9H2U2-2 Isoform 2 of Inorganic pyrophosphatase 2, mitochondrial
534 6 -1,68
P62241 40S ribosomal protein S8 2266 109 -1,71
P01861 Ig gamma-4 chain C region 1489 174 -1,74
Q9UBV2 Protein sel-1 homolog 1 3214 136 -1,75
Q15046 Lysine--tRNA ligase 2540 119 -1,76
J3KN10 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 1123 140 -1,79
P01625 Ig kappa chain V-IV region Len 1468 147 -1,82
P13716 Delta-aminolevulinic acid dehydratase 296 87 -1,83
P20618 Proteasome subunit beta type-1 1811 115 -1,85
Q92616 Translational activator GCN1 2905 156 -1,87
Q14134 Tripartite motif-containing protein 29 2501 22 -1,88
P31939 Bifunctional purine biosynthesis protein PURH 647 107 -1,91
P62854 40S ribosomal protein S26 2292 114 -1,92
Q00341 Vigilin 2346 141 -1,92
H0YK83 Signal peptidase complex catalytic subunit SEC11A 1040 37 -1,92
G8JLA8 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 998 30 -1,93
P08708 40S ribosomal protein S17 1626 73 -1,95
P51149 Ras-related protein Rab-7a 2148 25 -1,96
J3KNB4 Antibacterial protein FALL-39 1130 142 -2,01
B5ME19 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C 278 116 -2,05
Q6IN85 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A
976 98 -2,05
A8MUS3 60S ribosomal protein L23a 77 117 -2,13
O76094 Signal recognition particle 72 kDa protein 1371 137 -2,17
P10768 S-formylglutathione hydrolase 1663 20 -2,26
O14936 Peripheral plasma membrane protein CASK 919 96 -2,29
P07384 Calpain-1 catalytic subunit 1592 97 -2,33
Q13620 Cullin-4B 2483 124 -2,33
J3QQ67 60S ribosomal protein L18 (Fragment) 891 108 -2,34
Q99459 Cell division cycle 5-like protein 2992 110 -2,35
Q9NYL4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 3172 100 -2,38
Q8NBS9 Thioredoxin domain-containing protein 5 135 138 -2,40
Q86UE4 Protein LYRIC 2782 173 -2,59
P83731 60S ribosomal protein L24 400 106 -2,62
Q12959-2 Isoform 2 of Disks large homolog 1 2440 21 -2,68
Q14008-3 Isoform 3 of Cytoskeleton-associated protein 5 2496 121 -2,88
E7EPK6 40S ribosomal protein S24 577 120 -2,92
Ana Badovinac, Disertacija
57
P38159 RNA-binding motif protein, X chromosome 1014 118 -4,07
P10644 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit
1662 122 -4,22
Q9NRP0 Oligosaccharyltransferase complex subunit OSTC 3145 139 -4,77
10 proteina koji pokazuju najveći stupanj promjene između ove dvije skupine su:
1. Multimerin-1 (Q13201), 7,56
2. Protein S100-A6 (P06703), 6,31
3. HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (H0YBZ2), 2,83
4. Ig kappa chain C region (P01834), 2,51
5. N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (O95865), 2,46
6. Cytoskeleton-associated protein 5 (Q14008-3), -2,88
7. 40S ribosomal protein S24 (E7EPK6), -2,92
8. RNA-binding motif protein, X chromosome (P38159), -4,07
9. cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit (P10644), -4,22
10. Oligosaccharyltransferase complex subunit (Q9NRP0), -4,77
Decimalni broj iza zagrade pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen
(predznak ''-'') u zdravom mjestu ispitivane skupine u odnosu na kontrolnu skupinu.
Ana Badovinac, Disertacija
58
4.2.5. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s gingivitisom ispitivane skupine
Usporedba zastupljenosti proteina zdravog mjesta kontrolne skupine i mjesta s gingivitisom
ispitivane skupine. Rezultati usporedbe prikazani su u Tablici 6. Svaki protein određen je
Uniprot identifikacijskim brojem (Uniprot ID), MaxQuant brojem (MaxQuant ID) te
proteinskim imenom. Stupac Redni br odnosi se na redni broj pod kojim se određeni protein
može pronaći na Slici 8. Stupac pod imenom Stupanj promjene u mjestu s gingivitisom
ispitivane skupine pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen (predznak ''-
'') u uzorku mjesta s gingivitisom ispitivane skupine u odnosu na isti protein u kontrolnoj
skupini.
Tablica 6. Prikaz proteina prema stupnju promjene u mjestu s gingivitisom ispitivane skupine
u odnosu na kontrolnu skupinu. Predznak ''-'' označava da je određeni protein smanjen u
ispitivanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu.
Uniprot ID Ime proteina MaxQuant ID
Redni br
Stupanj promjene u mjestu s gingivitisom
ispitivane skupine P02730 Band 3 anion transport protein 1503 93 10,25
P20160 Azurocidin 1806 102 9,39
P06703 Protein S100-A6 1574 2 4,90
Q13201 Multimerin-1 574 3 4,42
P00918 Carbonic anhydrase 2 1443 88 4,03
P02671 Fibrinogen alpha chain 1501 91 3,94
P00915 Carbonic anhydrase 1 1442 90 3,87
P30043 Flavin reductase (NADPH) 1929 86 3,36
P51531 Probable global transcription activator SNF2L2 2152 1 2,93
P69905 Hemoglobin subunit alpha 2326 92 2,73
P26373 60S ribosomal protein L13 1888 105 2,59
P32119 Peroxiredoxin-2 1969 89 2,52
P02652 Apolipoprotein A-II 1500 85 2,48
P00450 Ceruloplasmin 1428 104 2,29
Q9NYL4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 3172 100 2,18
P13716 Delta-aminolevulinic acid dehydratase 296 87 2,00
O00291 Huntingtin-interacting protein 1 602 143 1,89
J3QQ67 60S ribosomal protein L18 (Fragment) 891 108 1,87
P18085 ADP-ribosylation factor 4 401 145 1,79
P29762 Cellular retinoic acid-binding protein 1 1924 183 1,79
P31939 Bifunctional purine biosynthesis protein PURH 647 107 1,69
H0YK83 Signal peptidase complex catalytic subunit SEC11A 1040 37 1,59
P83731 60S ribosomal protein L24 400 106 1,51
P62942 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A 2299 185 1,51
P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1 1871 103 1,48
Ana Badovinac, Disertacija
59
P0C0S5 Histone H2A.Z 1650 144 1,44
J3KN62 Cadherin-13 1127 29 1,43
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen 2045 187 1,42
P62241 40S ribosomal protein S8 2266 109 1,41
P00734 Prothrombin 1436 27 1,40
P62244 40S ribosomal protein S15a 1115 191 1,40
Q5T9B7 Adenylate kinase H 1435 71 1,35
P01620 Ig kappa chain V-III region SIE 1466 186 1,35
P37802 Transgelin-2 2022 84 1,32
Q99459 Cell division cycle 5-like protein 2992 110 1,31
O75396 Vesicle-trafficking protein SEC22b 1332 192 1,27
P48047 ATP synthase subunit O, mitochondrial 2097 26 1,27
H0YBZ2 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (Fragment)
1535 0 1,23
Q9UKK3 Poly [ADP-ribose] polymerase 4 3249 188 1,23
Q3SY69 Mitochondrial 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase
2616 159 1,23
Q16706 Alpha-mannosidase 2 2591 181 1,20
P26885 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 1895 179 1,19
O00232 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12 1190 189 1,19
Q9Y224 UPF0568 protein C14orf166 3277 51 1,18
P54886 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 2198 171 1,18
B5ME19 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C 278 116 1,18
P39019 40S ribosomal protein S19 2028 70 1,18
P12830 Cadherin-1 1706 83 1,18
G3XAF6 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 980 9 1,18
Q9H2U2-2 Isoform 2 of Inorganic pyrophosphatase 2, mitochondrial
534 6 1,17
Q04837 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial 416 157 1,17
P29622 Kallistatin 1922 41 1,16
P02766 Transthyretin 1512 182 1,15
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
3256 42 1,15
Q96KP4 Cytosolic non-specific dipeptidase 2970 160 1,13
P52209 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating
206 101 1,11
P35232 Prohibitin 1987 50 1,11
Q06830 Peroxiredoxin-1 2398 5 1,10
P51884 Lumican 2167 54 1,09
P62854 40S ribosomal protein S26 2292 114 1,08
B5MCQ5 Protein disulfide-isomerase A6 272 190 1,07
P54577 Tyrosine--tRNA ligase, cytoplasmic 2192 8 1,07
Q12797 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase 844 4 1,06
Q9Y6C2 EMILIN-1 3338 64 1,06
Q14112 Nidogen-2 2499 72 1,06
P08708 40S ribosomal protein S17 1626 73 1,04
P09661 U2 small nuclear ribonucleoprotein A 1642 46 1,04
P00403 Cytochrome c oxidase subunit 2 1426 74 1,02
P51149 Ras-related protein Rab-7a 2148 25 1,02
P36955 Pigment epithelium-derived factor 2017 53 1,02
P10768 S-formylglutathione hydrolase 1663 20 1,01
P50148 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
2133 31 1,01
P62191 26S protease regulatory subunit 4 2264 7 -1,00
Q9NVI7 ATPase family AAA domain-containing protein 3A 3162 44 -1,00
P49368 T-complex protein 1 subunit gamma 2118 19 -1,00
E9PIE3 Protein kinase C delta-binding protein 712 55 -1,00
P05387 60S acidic ribosomal protein P2 1562 158 -1,02
Ana Badovinac, Disertacija
60
P08670 Vimentin 1624 63 -1,02
P18077 60S ribosomal protein L35a 1785 184 -1,02
Q16698 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial 306 45 -1,02
A3KMH1 von Willebrand factor A domain-containing protein 8 21 172 -1,03
P61970 Nuclear transport factor 2 2257 170 -1,03
A8MUS3 60S ribosomal protein L23a 77 117 -1,03
P20042 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2 1805 112 -1,04
P39060 Collagen alpha-1(XVIII) chain 2031 61 -1,05
J3KN10 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 1123 140 -1,06
P08758 Annexin A5 1629 56 -1,07
P09525 Annexin A4 1638 34 -1,07
Q8N5K1 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2 2832 180 -1,07
Q12959-2 Isoform 2 of Disks large homolog 1 2440 21 -1,07
P20618 Proteasome subunit beta type-1 1811 115 -1,07
Q9NP72 Ras-related protein Rab-18 3127 75 -1,07
G8JLA8 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3
998 30 -1,08
J3KNB4 Antibacterial protein FALL-39 1130 142 -1,08
B7Z468 Calpastatin 301 32 -1,09
P02545 Prelamin-A/C 1496 59 -1,09
Q99729-2 Isoform 2 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B
505 36 -1,09
P14550 Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] 1735 177 -1,09
P20774 Mimecan 1816 52 -1,10
P07585 Decorin 1594 58 -1,11
P49588 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic 2122 178 -1,11
Q14683 Structural maintenance of chromosomes protein 1A 2524 69 -1,11
Q00341 Vigilin 2346 141 -1,12
P99999 Cytochrome c 381 162 -1,12
P57740 Nuclear pore complex protein Nup107 2222 169 -1,12
O14907 Tax1-binding protein 3 1225 146 -1,13
P62805 Histone H4 2287 176 -1,15
P05452 Tetranectin 705 10 -1,15
P48735 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial 2109 155 -1,15
P21810 Biglycan 51 60 -1,16
Q13283 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 2460 38 -1,18
Q8IUX7 Adipocyte enhancer-binding protein 1 2800 62 -1,19
P61981 14-3-3 protein gamma 2260 40 -1,20
Q14008-3 Isoform 3 of Cytoskeleton-associated protein 5 2496 121 -1,21
Q9H2M9 Rab3 GTPase-activating protein non-catalytic subunit 3087 126 -1,22
Q92616 Translational activator GCN1 2905 156 -1,23
E7EPK6 40S ribosomal protein S24 577 120 -1,25
O75955 Flotillin-1 1366 161 -1,25
J3KN16 Protein KIAA0368 1124 165 -1,26
Q13315 Serine-protein kinase ATM 2461 148 -1,26
P38159 RNA-binding motif protein, X chromosome 1014 118 -1,29
P32455 Interferon-induced guanylate-binding protein 1 1971 39 -1,30
O14786 Neuropilin-1 636 43 -1,30
P00558 Phosphoglycerate kinase 1 1434 94 -1,31
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein 2144 175 -1,32
P30520 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 1946 128 -1,32
Q15046 Lysine--tRNA ligase 2540 119 -1,34
P07355-2 Isoform 2 of Annexin A2 1591 65 -1,35
P51812 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 168 154 -1,36
Q86UE4 Protein LYRIC 2782 173 -1,36
O75718 Cartilage-associated protein 1350 47 -1,40
O95865 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2
1416 11 -1,40
Ana Badovinac, Disertacija
61
P07384 Calpain-1 catalytic subunit 1592 97 -1,41
E7ESP4 Integrin alpha-2 554 28 -1,42
Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 2405 77 -1,42
P51888 Prolargin 2168 57 -1,44
E9PEN8 Exportin-7 678 152 -1,44
O94826 Mitochondrial import receptor subunit TOM70 1374 68 -1,44
P04839 Cytochrome b-245 heavy chain 1545 168 -1,44
Q7L2H7 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M 2761 79 -1,46
P13010 X-ray repair cross-complementing protein 5 1710 123 -1,47
P35052 Glypican-1 1984 49 -1,47
Q06210 Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1
2395 166 -1,47
O14936 Peripheral plasma membrane protein CASK 919 96 -1,49
H3BMK9 Tryptase alpha/beta-1 913 67 -1,53
P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1
38 12 -1,53
Q14240-2 Isoform 2 of Eukaryotic initiation factor 4A-II 585 127 -1,54
O75874 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic 1356 99 -1,54
Q01469 Fatty acid-binding protein, epidermal 2359 150 -1,55
P01861 Ig gamma-4 chain C region 1489 174 -1,55
P10644 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit
1662 122 -1,57
P68363 Tubulin alpha-1B chain 2319 133 -1,57
P01040 Cystatin-A 1452 48 -1,57
O95274 Ly6/PLAUR domain-containing protein 3 1390 35 -1,63
Q6IN85 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A
976 98 -1,64
O76094 Signal recognition particle 72 kDa protein 1371 137 -1,65
O95834-2 Isoform 2 of Echinoderm microtubule-associated protein-like 2
1415 167 -1,66
P36269-3 Isoform 3 of Gamma-glutamyltransferase 5 2006 78 -1,66
Q16822 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial
2597 111 -1,67
Q9UBG3 Cornulin 3208 95 -1,69
Q9Y6Y8 SEC23-interacting protein 810 151 -1,69
Q02543 60S ribosomal protein L18a 2374 153 -1,71
Q14134 Tripartite motif-containing protein 29 2501 22 -1,72
Q96FQ6 Protein S100-A16 2953 33 -1,73
Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 2904 164 -1,74
F5H098 Malate dehydrogenase B 806 130 -1,75
P01834 Ig kappa chain C region 1485 163 -1,76
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain 2315 66 -1,77
Q9UNH7 Sorting nexin-6 185 80 -1,79
H3BP20 Beta-hexosaminidase subunit alpha 1059 76 -1,80
H7C2I1 Protein arginine N-methyltransferase 1 724 113 -1,85
Q8NBS9 Thioredoxin domain-containing protein 5 135 138 -1,87
P29590 Protein PML 1921 17 -1,89
Q92797 Symplekin 2912 132 -1,96
Q16537 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit epsilon isoform
326 131 -1,96
Q7L014 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46 2759 125 -1,99
E5RJD8 Tubulin-specific chaperone A 549 134 -2,01
Q9Y3B4 Pre-mRNA branch site protein p14 3300 149 -2,02
Q9UBV2 Protein sel-1 homolog 1 3214 136 -2,03
P01625 Ig kappa chain V-IV region Len 1468 147 -2,16
P17050 Alpha-N-acetylgalactosaminidase 1771 15 -2,20
Q6PGP7 Tetratricopeptide repeat protein 37 2726 135 -2,33
O95470 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 1399 129 -2,35
Ana Badovinac, Disertacija
62
P50453 Serpin B9 2141 18 -2,38
Q13620 Cullin-4B 2483 124 -2,40
Q9NRP0 Oligosaccharyltransferase complex subunit OSTC 3145 139 -2,45
Q6IBS0 Twinfilin-2 2708 23 -2,64
Q12768 WASH complex subunit strumpellin 2427 16 -2,71
P05783 Keratin, type I cytoskeletal 18 896 13 -2,92
B7Z6H3 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 308 82 -3,02
Q9BWD1 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 3042 24 -4,07
O75531 Barrier-to-autointegration factor 1340 81 -4,22
P52630 Signal transducer and activator of transcription 2 954 14 -4,32
10 proteina koji pokazuju najveće promjene između ove dvije skupine su:
1. Band 3 anion transport protein (P02730), 10,25
2. Azurocidin (P20160), 9,39
3. Protein S100-A6 (P06703), 4,90
4. Multimerin-1 (Q13201), 4,42
5. Carbonic anhydrase 2 (P00918), 4,03
6. Keratin, type I cytoskeletal 18 (P05783), -2,92
7. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 (B7Z6H3), -3,02
8. Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic (Q9BWD1), -4,07
9. Barrier-to-autointegration factor (O75531), -4,22
10. Signal transducer and activator of transcription 2 (P52630), -4,32
Decimalni broj iza zagrade pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen
(predznak ''-'') u mjestu s gingivitisom ispitivane skupine u odnosu na kontrolnu skupinu.
Ana Badovinac, Disertacija
63
4.2.6. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom ispitivane skupine
Usporedba zastupljenosti proteina zdravog mjesta kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom
ispitivane skupine. Rezultati usporedbe prikazani su u Tablici 7. Svaki protein određen je
Uniprot identifikacijskim brojem (Uniprot ID), MaxQuant brojem (MaxQuant ID) te
proteinskim imenom. Stupac Redni br odnosi se na redni broj pod kojim se određeni protein
može pronaći na Slici 8. Stupac pod imenom Stupanj promjene u mjestu s parodontitisom
ispitivane skupine pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen (predznak ''-
'') u uzorku mjesta s parodontitisom ispitivane skupine u odnosu na isti protein u kontrolnoj
skupini.
Tablica 7. Prikaz proteina prema stupnju promjene u mjestu s parodontitisom ispitivane
skupine u odnosu na kontrolnu skupinu. Predznak ''-'' označava da je određeni protein
smanjen u ispitivanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu.
Uniprot ID Ime proteina MaxQuant ID
Redni br
Stupanj promjene u mjestu s
parodontitisom ispitivane skupine
P20160 Azurocidin 1806 102 9,59
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen 2045 187 6,72
P01861 Ig gamma-4 chain C region 1489 174 5,54
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein 2144 175 5,32
P01834 Ig kappa chain C region 1485 163 5,32
P18077 60S ribosomal protein L35a 1785 184 4,75
P04839 Cytochrome b-245 heavy chain 1545 168 4,73
P29762 Cellular retinoic acid-binding protein 1 1924 183 4,69
P62942 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A 2299 185 4,61
P01620 Ig kappa chain V-III region SIE 1466 186 4,54
Q06210 Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1
2395 166 3,59
Q8N5K1 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2 2832 180 3,57
P62805 Histone H4 2287 176 3,42
Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 2904 164 3,41
O95834-2 Isoform 2 of Echinoderm microtubule-associated protein-like 2
1415 167 3,28
P26373 60S ribosomal protein L13 1888 105 3,28
Q16706 Alpha-mannosidase 2 2591 181 3,16
Q86UE4 Protein LYRIC 2782 173 3,13
P01625 Ig kappa chain V-IV region Len 1468 147 3,00
B5MCQ5 Protein disulfide-isomerase A6 272 190 2,95
P54886 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 2198 171 2,92
Q04837 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial 416 157 2,84
Q3SY69 Mitochondrial 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase
2616 159 2,83
Q96KP4 Cytosolic non-specific dipeptidase 2970 160 2,81
Ana Badovinac, Disertacija
64
P26885 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 1895 179 2,68
O75955 Flotillin-1 1366 161 2,63
P99999 Cytochrome c 381 162 2,61
P00450 Ceruloplasmin 1428 104 2,54
Q9NRP0 Oligosaccharyltransferase complex subunit OSTC 3145 139 2,39
O00232 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12 1190 189 2,35
P57740 Nuclear pore complex protein Nup107 2222 169 2,27
A3KMH1 von Willebrand factor A domain-containing protein 8 21 172 2,23
Q9UBV2 Protein sel-1 homolog 1 3214 136 2,22
Q99459 Cell division cycle 5-like protein 2992 110 2,21
P49588 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic 2122 178 2,17
P02766 Transthyretin 1512 182 2,15
Q9Y3B4 Pre-mRNA branch site protein p14 3300 149 2,15
Q9NYL4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 3172 100 2,12
P31939 Bifunctional purine biosynthesis protein PURH 647 107 2,10
O75396 Vesicle-trafficking protein SEC22b 1332 192 2,07
Q9UKK3 Poly [ADP-ribose] polymerase 4 3249 188 2,06
J3QQ67 60S ribosomal protein L18 (Fragment) 891 108 2,04
P61970 Nuclear transport factor 2 2257 170 2,04
Q16822 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial
2597 111 2,03
P18085 ADP-ribosylation factor 4 401 145 1,95
P62244 40S ribosomal protein S15a 1115 191 1,95
O00291 Huntingtin-interacting protein 1 602 143 1,89
J3KN16 Protein KIAA0368 1124 165 1,81
P0C0S5 Histone H2A.Z 1650 144 1,79
Q9UBG3 Cornulin 3208 95 1,77
P02671 Fibrinogen alpha chain 1501 91 1,76
O14907 Tax1-binding protein 3 1225 146 1,75
Q9Y6Y8 SEC23-interacting protein 810 151 1,74
Q92616 Translational activator GCN1 2905 156 1,72
P62241 40S ribosomal protein S8 2266 109 1,71
P14550 Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] 1735 177 1,71
P48735 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial 2109 155 1,69
P83731 60S ribosomal protein L24 400 106 1,69
P05387 60S acidic ribosomal protein P2 1562 158 1,68
P38159 RNA-binding motif protein, X chromosome 1014 118 1,68
Q7L014 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46 2759 125 1,66
P02730 Band 3 anion transport protein 1503 93 1,63
Q02543 60S ribosomal protein L18a 2374 153 1,62
Q13315 Serine-protein kinase ATM 2461 148 1,60
Q16537 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit epsilon isoform
326 131 1,58
E9PEN8 Exportin-7 678 152 1,57
O76094 Signal recognition particle 72 kDa protein 1371 137 1,52
P20042 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2 1805 112 1,52
P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1 1871 103 1,51
E5RJD8 Tubulin-specific chaperone A 549 134 1,49
A8MUS3 60S ribosomal protein L23a 77 117 1,47
Q8NBS9 Thioredoxin domain-containing protein 5 135 138 1,46
Q01469 Fatty acid-binding protein, epidermal 2359 150 1,41
Q6PGP7 Tetratricopeptide repeat protein 37 2726 135 1,41
P52209 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating 206 101 1,35
P51812 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 168 154 1,34
B5ME19 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C 278 116 1,33
O14936 Peripheral plasma membrane protein CASK 919 96 1,32
H0YBZ2 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (Fragment)
1535 0 1,32
Ana Badovinac, Disertacija
65
Q14240-2 Isoform 2 of Eukaryotic initiation factor 4A-II 585 127 1,26
Q00341 Vigilin 2346 141 1,26
Q92797 Symplekin 2912 132 1,23
Q9H2M9 Rab3 GTPase-activating protein non-catalytic subunit 3087 126 1,20
J3KNB4 Antibacterial protein FALL-39 1130 142 1,18
P30520 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 1946 128 1,17
P13010 X-ray repair cross-complementing protein 5 1710 123 1,17
Q15046 Lysine--tRNA ligase 2540 119 1,16
J3KN10 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 1123 140 1,16
P00558 Phosphoglycerate kinase 1 1434 94 1,15
H7C2I1 Protein arginine N-methyltransferase 1 724 113 1,14
O95470 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 1399 129 1,11
F5H098 Malate dehydrogenase B 806 130 1,11
P68363 Tubulin alpha-1B chain 2319 133 1,11
P10644 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit
1662 122 1,09
P62854 40S ribosomal protein S26 2292 114 1,08
Q12797 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase 844 4 1,07
Q13620 Cullin-4B 2483 124 1,04
P69905 Hemoglobin subunit alpha 2326 92 1,04
G3XAF6 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 980 9 -1,00
O75874 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic 1356 99 -1,00
Q14008-3 Isoform 3 of Cytoskeleton-associated protein 5 2496 121 -1,01
E7EPK6 40S ribosomal protein S24 577 120 -1,03
P05452 Tetranectin 705 10 -1,04
O95865 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2
1416 11 -1,06
P20618 Proteasome subunit beta type-1 1811 115 -1,07
Q06830 Peroxiredoxin-1 2398 5 -1,10
P29590 Protein PML 1921 17 -1,11
P51531 Probable global transcription activator SNF2L2 2152 1 -1,18
P54577 Tyrosine--tRNA ligase, cytoplasmic 2192 8 -1,19
P49368 T-complex protein 1 subunit gamma 2118 19 -1,22
P62191 26S protease regulatory subunit 4 2264 7 -1,23
P00734 Prothrombin 1436 27 -1,24
Q6IN85 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A
976 98 -1,29
P48047 ATP synthase subunit O, mitochondrial 2097 26 -1,30
P50453 Serpin B9 2141 18 -1,30
P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1
38 12 -1,32
P61981 14-3-3 protein gamma 2260 40 -1,35
Q7L2H7 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M 2761 79 -1,37
Q9H2U2-2 Isoform 2 of Inorganic pyrophosphatase 2, mitochondrial
534 6 -1,41
Q12768 WASH complex subunit strumpellin 2427 16 -1,43
P08670 Vimentin 1624 63 -1,43
Q14112 Nidogen-2 2499 72 -1,44
P00918 Carbonic anhydrase 2 1443 88 -1,44
P07355-2 Isoform 2 of Annexin A2 1591 65 -1,44
P29622 Kallistatin 1922 41 -1,44
P51149 Ras-related protein Rab-7a 2148 25 -1,45
P50148 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
2133 31 -1,47
P32119 Peroxiredoxin-2 1969 89 -1,52
P07384 Calpain-1 catalytic subunit 1592 97 -1,53
Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 2405 77 -1,55
P36955 Pigment epithelium-derived factor 2017 53 -1,57
Ana Badovinac, Disertacija
66
P35232 Prohibitin 1987 50 -1,60
Q9UNH7 Sorting nexin-6 185 80 -1,64
P09525 Annexin A4 1638 34 -1,64
P17050 Alpha-N-acetylgalactosaminidase 1771 15 -1,71
P05783 Keratin, type I cytoskeletal 18 896 13 -1,72
P00915 Carbonic anhydrase 1 1442 90 -1,79
Q99729-2 Isoform 2 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B
505 36 -1,87
P36269-3 Isoform 3 of Gamma-glutamyltransferase 5 2006 78 -1,90
P52630 Signal transducer and activator of transcription 2 954 14 -1,91
Q9NP72 Ras-related protein Rab-18 3127 75 -1,94
Q9NVI7 ATPase family AAA domain-containing protein 3A 3162 44 -1,96
Q16698 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial 306 45 -2,07
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain 2315 66 -2,10
G8JLA8 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 998 30 -2,11
P39060 Collagen alpha-1(XVIII) chain 2031 61 -2,13
E7ESP4 Integrin alpha-2 554 28 -2,14
Q9Y6C2 EMILIN-1 3338 64 -2,14
O75718 Cartilage-associated protein 1350 47 -2,15
P12830 Cadherin-1 1706 83 -2,20
Q13201 Multimerin-1 574 3 -2,21
Q8IUX7 Adipocyte enhancer-binding protein 1 2800 62 -2,28
B7Z468 Calpastatin 301 32 -2,31
P08758 Annexin A5 1629 56 -2,32
O94826 Mitochondrial import receptor subunit TOM70 1374 68 -2,32
P13716 Delta-aminolevulinic acid dehydratase 296 87 -2,33
Q9Y224 UPF0568 protein C14orf166 3277 51 -2,37
P02545 Prelamin-A/C 1496 59 -2,43
P37802 Transgelin-2 2022 84 -2,47
J3KN62 Cadherin-13 1127 29 -2,70
H3BP20 Beta-hexosaminidase subunit alpha 1059 76 -2,71
P10768 S-formylglutathione hydrolase 1663 20 -2,73
Q14683 Structural maintenance of chromosomes protein 1A 2524 69 -2,78
P07585 Decorin 1594 58 -2,89
P00403 Cytochrome c oxidase subunit 2 1426 74 -2,91
Q9BWD1 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 3042 24 -3,03
Q13283 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 2460 38 -3,05
Q14134 Tripartite motif-containing protein 29 2501 22 -3,15
P09661 U2 small nuclear ribonucleoprotein A 1642 46 -3,19
P32455 Interferon-induced guanylate-binding protein 1 1971 39 -3,22
P08708 40S ribosomal protein S17 1626 73 -3,28
P06703 Protein S100-A6 1574 2 -3,29
H0YK83 Signal peptidase complex catalytic subunit SEC11A 1040 37 -3,31
O14786 Neuropilin-1 636 43 -3,53
P01040 Cystatin-A 1452 48 -3,53
P51884 Lumican 2167 54 -3,56
H3BMK9 Tryptase alpha/beta-1 913 67 -3,57
Q5T9B7 Adenylate kinase H 1435 71 -3,61
P39019 40S ribosomal protein S19 2028 70 -3,77
Q12959-2 Isoform 2 of Disks large homolog 1 2440 21 -3,89
P21810 Biglycan 51 60 -3,91
P35052 Glypican-1 1984 49 -4,05
P30043 Flavin reductase (NADPH) 1929 86 -4,17
Q6IBS0 Twinfilin-2 2708 23 -4,27
Q96FQ6 Protein S100-A16 2953 33 -4,28
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
3256 42 -4,32
P20774 Mimecan 1816 52 -4,34
Ana Badovinac, Disertacija
67
E9PIE3 Protein kinase C delta-binding protein 712 55 -4,62
P02652 Apolipoprotein A-II 1500 85 -5,29
O95274 Ly6/PLAUR domain-containing protein 3 1390 35 -5,32
B7Z6H3 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 308 82 -5,99
O75531 Barrier-to-autointegration factor 1340 81 -7,05
P51888 Prolargin 2168 57 -8,57
10 proteina koji pokazuju najveće promjene između ove dvije skupine su:
1. Azurocidin (P20160), 9,59
2. Myeloid cell nuclear differentiation antigen (P41218), 6,72
3. Ig gamma-4 chain C region (P01861), 5,54
4. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (P50552), 5,32
5. Ig kappa chain C region (P01834), 5,32
6. Apolipoprotein A-II (P02652), -5,29
7. Ly6/PLAUR domain-containing protein 3 (O95274), -5,32
8. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 (B7Z6H3), -5,99
9. Barrier-to-autointegration factor (O75531), -7,05
10. Prolargin (P51888), -8,57
Decimalni broj iza zagrade pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen
(predznak ''-'') u mjestu s gingivitisom ispitivane skupine u odnosu na kontrolnu skupinu.
Ana Badovinac, Disertacija
68
4.2.7. Usporedba kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom nakon terapije ispitivane
skupine
Usporedba zastupljenosti proteina zdravog mjesta kontrolne skupine i mjesta s parodontitisom
poslije terapije ispitivane skupine. Rezultati usporedbe prikazani su u Tablici 8. Svaki protein
određen je Uniprot identifikacijskim brojem (Uniprot ID), MaxQuant brojem (MaxQuant ID)
te proteinskim imenom. Stupac Redni br odnosi se na redni broj pod kojim se određeni
protein može pronaći na Slici 8. Stupac pod imenom Stupanj promjene u mjestu s poslije
terapije ispitivane skupine pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen
(predznak ''-'') u uzorku mjesta poslije terapije ispitivane skupine u odnosu na isti protein u
kontrolnoj skupini.
Tablica 8. Prikaz proteina prema stupnju promjene u mjestu poslije terapije ispitivane
skupine u odnosu na kontrolnu skupinu. Predznak ''-'' označava da je određeni protein
smanjen u ispitivanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu.
Uniprot ID Ime proteina MaxQuant ID
Redni br
Stupanj promjene u mjestu nakon
terapije ispitivane skupine
P02730 Band 3 anion transport protein 1503 93 3,66
P06703 Protein S100-A6 1574 2 2,93
P04839 Cytochrome b-245 heavy chain 1545 168 2,90
Q9UBG3 Cornulin 3208 95 2,77
P26373 60S ribosomal protein L13 1888 105 2,65
P20160 Azurocidin 1806 102 2,20
O14936 Peripheral plasma membrane protein CASK 919 96 2,01
P62191 26S protease regulatory subunit 4 2264 7 1,96
P00450 Ceruloplasmin 1428 104 1,95
P31939 Bifunctional purine biosynthesis protein PURH 647 107 1,89
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein 2144 175 1,88
J3QQ67 60S ribosomal protein L18 (Fragment) 891 108 1,86
P01861 Ig gamma-4 chain C region 1489 174 1,82
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen 2045 187 1,81
P02671 Fibrinogen alpha chain 1501 91 1,79
P01625 Ig kappa chain V-IV region Len 1468 147 1,77
P52209 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating
206 101 1,76
E7ESP4 Integrin alpha-2 554 28 1,75
Q96FQ6 Protein S100-A16 2953 33 1,67
P12830 Cadherin-1 1706 83 1,63
P01834 Ig kappa chain C region 1485 163 1,62
P57740 Nuclear pore complex protein Nup107 2222 169 1,59
P01620 Ig kappa chain V-III region SIE 1466 186 1,58
P18077 60S ribosomal protein L35a 1785 184 1,56
E7EPK6 40S ribosomal protein S24 577 120 1,54
P62942 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A 2299 185 1,54
P32455 Interferon-induced guanylate-binding protein 1 1971 39 1,53
Ana Badovinac, Disertacija
69
Q99459 Cell division cycle 5-like protein 2992 110 1,52
Q86UE4 Protein LYRIC 2782 173 1,47
Q9H2U2-2 Isoform 2 of Inorganic pyrophosphatase 2, mitochondrial
534 6 1,47
P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1 1871 103 1,47
Q02543 60S ribosomal protein L18a 2374 153 1,47
Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 2904 164 1,46
P30043 Flavin reductase (NADPH) 1929 86 1,45
Q6IBS0 Twinfilin-2 2708 23 1,45
Q96KP4 Cytosolic non-specific dipeptidase 2970 160 1,43
E9PEN8 Exportin-7 678 152 1,41
O95470 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 1399 129 1,39
P00918 Carbonic anhydrase 2 1443 88 1,39
P83731 60S ribosomal protein L24 400 106 1,38
O75874 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic 1356 99 1,34
Q9BWD1 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 3042 24 1,34
Q01469 Fatty acid-binding protein, epidermal 2359 150 1,34
B7Z468 Calpastatin 301 32 1,32
Q6IN85 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A
976 98 1,30
P62241 40S ribosomal protein S8 2266 109 1,27
A3KMH1 von Willebrand factor A domain-containing protein 8
21 172 1,25
P07384 Calpain-1 catalytic subunit 1592 97 1,25
P10644 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit
1662 122 1,25
P54577 Tyrosine--tRNA ligase, cytoplasmic 2192 8 1,24
O95274 Ly6/PLAUR domain-containing protein 3 1390 35 1,23
Q12959-2 Isoform 2 of Disks large homolog 1 2440 21 1,23
P13716 Delta-aminolevulinic acid dehydratase 296 87 1,23
P37802 Transgelin-2 2022 84 1,22
P69905 Hemoglobin subunit alpha 2326 92 1,22
P32119 Peroxiredoxin-2 1969 89 1,18
Q9Y6Y8 SEC23-interacting protein 810 151 1,17
Q13283 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 2460 38 1,17
Q06830 Peroxiredoxin-1 2398 5 1,17
P00558 Phosphoglycerate kinase 1 1434 94 1,16
P51812 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 168 154 1,15
F5H098 Malate dehydrogenase B 806 130 1,14
P62854 40S ribosomal protein S26 2292 114 1,14
O95834-2 Isoform 2 of Echinoderm microtubule-associated protein-like 2
1415 167 1,14
Q14008-3 Isoform 3 of Cytoskeleton-associated protein 5 2496 121 1,14
O14907 Tax1-binding protein 3 1225 146 1,12
P00915 Carbonic anhydrase 1 1442 90 1,10
P54886 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 2198 171 1,09
Q15046 Lysine--tRNA ligase 2540 119 1,09
Q9UKK3 Poly [ADP-ribose] polymerase 4 3249 188 1,08
P49368 T-complex protein 1 subunit gamma 2118 19 1,08
O00232 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12 1190 189 1,08
P62805 Histone H4 2287 176 1,07
P14550 Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] 1735 177 1,06
Q13620 Cullin-4B 2483 124 1,05
P99999 Cytochrome c 381 162 1,05
H0YBZ2 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (Fragment)
1535 0 1,04
J3KN16 Protein KIAA0368 1124 165 1,03
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing 3256 42 1,01
Ana Badovinac, Disertacija
70
a CARD
Q99729-2 Isoform 2 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B
505 36 -1,01
P05026 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1
38 12 -1,01
P38159 RNA-binding motif protein, X chromosome 1014 118 -1,02
Q92616 Translational activator GCN1 2905 156 -1,03
P49588 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic 2122 178 -1,03
P48735 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial 2109 155 -1,06
P61970 Nuclear transport factor 2 2257 170 -1,07
Q06210 Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1
2395 166 -1,07
Q16706 Alpha-mannosidase 2 2591 181 -1,07
Q92797 Symplekin 2912 132 -1,09
Q9NVI7 ATPase family AAA domain-containing protein 3A 3162 44 -1,09
P20618 Proteasome subunit beta type-1 1811 115 -1,10
O00291 Huntingtin-interacting protein 1 602 143 -1,10
Q9Y3B4 Pre-mRNA branch site protein p14 3300 149 -1,12
Q14134 Tripartite motif-containing protein 29 2501 22 -1,13
P13010 X-ray repair cross-complementing protein 5 1710 123 -1,13
P09525 Annexin A4 1638 34 -1,15
P10768 S-formylglutathione hydrolase 1663 20 -1,16
P02766 Transthyretin 1512 182 -1,16
Q5T9B7 Adenylate kinase H 1435 71 -1,18
O75718 Cartilage-associated protein 1350 47 -1,18
P68363 Tubulin alpha-1B chain 2319 133 -1,18
P30520 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 1946 128 -1,19
Q14240-2 Isoform 2 of Eukaryotic initiation factor 4A-II 585 127 -1,20
O75955 Flotillin-1 1366 161 -1,22
P29762 Cellular retinoic acid-binding protein 1 1924 183 -1,24
Q16822 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial
2597 111 -1,26
Q9H2M9 Rab3 GTPase-activating protein non-catalytic subunit
3087 126 -1,26
B5ME19 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C 278 116 -1,28
Q16698 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial 306 45 -1,28
P02652 Apolipoprotein A-II 1500 85 -1,28
P05783 Keratin, type I cytoskeletal 18 896 13 -1,29
P35232 Prohibitin 1987 50 -1,30
P07355-2 Isoform 2 of Annexin A2 1591 65 -1,30
P48047 ATP synthase subunit O, mitochondrial 2097 26 -1,30
O75396 Vesicle-trafficking protein SEC22b 1332 192 -1,30
O95865 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2
1416 11 -1,32
P62244 40S ribosomal protein S15a 1115 191 -1,33
A8MUS3 60S ribosomal protein L23a 77 117 -1,34
P39019 40S ribosomal protein S19 2028 70 -1,34
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain 2315 66 -1,35
Q9NP72 Ras-related protein Rab-18 3127 75 -1,35
Q6PGP7 Tetratricopeptide repeat protein 37 2726 135 -1,35
P29590 Protein PML 1921 17 -1,35
Q13201 Multimerin-1 574 3 -1,36
P09661 U2 small nuclear ribonucleoprotein A 1642 46 -1,37
Q14112 Nidogen-2 2499 72 -1,37
P00734 Prothrombin 1436 27 -1,37
E5RJD8 Tubulin-specific chaperone A 549 134 -1,38
P52630 Signal transducer and activator of transcription 2 954 14 -1,40
P0C0S5 Histone H2A.Z 1650 144 -1,42
Ana Badovinac, Disertacija
71
P51149 Ras-related protein Rab-7a 2148 25 -1,44
Q7L2H7 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M 2761 79 -1,45
O14786 Neuropilin-1 636 43 -1,46
H7C2I1 Protein arginine N-methyltransferase 1 724 113 -1,48
Q04837 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial 416 157 -1,52
Q12797 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase 844 4 -1,53
B5MCQ5 Protein disulfide-isomerase A6 272 190 -1,54
J3KN62 Cadherin-13 1127 29 -1,55
P61981 14-3-3 protein gamma 2260 40 -1,55
Q13315 Serine-protein kinase ATM 2461 148 -1,57
P00403 Cytochrome c oxidase subunit 2 1426 74 -1,58
P51531 Probable global transcription activator SNF2L2 2152 1 -1,59
P05387 60S acidic ribosomal protein P2 1562 158 -1,62
P01040 Cystatin-A 1452 48 -1,63
P18085 ADP-ribosylation factor 4 401 145 -1,64
P29622 Kallistatin 1922 41 -1,64
Q7L014 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46 2759 125 -1,72
O94826 Mitochondrial import receptor subunit TOM70 1374 68 -1,73
P50148 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
2133 31 -1,76
J3KNB4 Antibacterial protein FALL-39 1130 142 -1,77
H0YK83 Signal peptidase complex catalytic subunit SEC11A
1040 37 -1,78
Q9Y224 UPF0568 protein C14orf166 3277 51 -1,78
Q16537 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit epsilon isoform
326 131 -1,88
P08670 Vimentin 1624 63 -1,88
P20042 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2 1805 112 -1,89
P50453 Serpin B9 2141 18 -1,92
P39060 Collagen alpha-1(XVIII) chain 2031 61 -1,93
P26885 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 1895 179 -1,93
O76094 Signal recognition particle 72 kDa protein 1371 137 -1,93
Q00341 Vigilin 2346 141 -1,94
G3XAF6 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 980 9 -1,99
P17050 Alpha-N-acetylgalactosaminidase 1771 15 -1,99
P08708 40S ribosomal protein S17 1626 73 -2,05
P36955 Pigment epithelium-derived factor 2017 53 -2,06
P35052 Glypican-1 1984 49 -2,07
Q9NYL4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 3172 100 -2,11
P08758 Annexin A5 1629 56 -2,13
Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1
2405 77 -2,24
Q9UNH7 Sorting nexin-6 185 80 -2,25
P05452 Tetranectin 705 10 -2,34
Q8N5K1 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2 2832 180 -2,39
P02545 Prelamin-A/C 1496 59 -2,40
J3KN10 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 1123 140 -2,41
Q9UBV2 Protein sel-1 homolog 1 3214 136 -2,43
P07585 Decorin 1594 58 -2,45
Q14683 Structural maintenance of chromosomes protein 1A 2524 69 -2,48
Q8IUX7 Adipocyte enhancer-binding protein 1 2800 62 -2,65
O75531 Barrier-to-autointegration factor 1340 81 -2,66
Q3SY69 Mitochondrial 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase
2616 159 -2,70
Q8NBS9 Thioredoxin domain-containing protein 5 135 138 -3,00
G8JLA8 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3
998 30 -3,04
P21810 Biglycan 51 60 -3,06
Ana Badovinac, Disertacija
72
P36269-3 Isoform 3 of Gamma-glutamyltransferase 5 2006 78 -3,13
E9PIE3 Protein kinase C delta-binding protein 712 55 -3,22
H3BMK9 Tryptase alpha/beta-1 913 67 -3,28
Q12768 WASH complex subunit strumpellin 2427 16 -3,29
Q9Y6C2 EMILIN-1 3338 64 -3,36
H3BP20 Beta-hexosaminidase subunit alpha 1059 76 -3,61
P51884 Lumican 2167 54 -3,74
B7Z6H3 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 308 82 -3,93
P51888 Prolargin 2168 57 -5,74
P20774 Mimecan 1816 52 -7,92
Q9NRP0 Oligosaccharyltransferase complex subunit OSTC 3145 139 -12,03
10 proteina koji pokazuju najveće promjene između ove dvije skupine su:
1. Band 3 anion transport protein (P02730), 3,66
2. Protein S100-A6 (P06703), 2,93
3. Cytochrome b-245 heavy chain (P04839), 2,9
4. Cornulin (Q9UBG3), 2,77
5. 60S ribosomal protein L13 (P26373), 2,65
6. Lumican (P51884), -3,74
7. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (B7Z6H3), -3,93
8. Prolargin (P51888), -5,74
9. Mimecan (P20774), -7,92
10. Oligosaccharyltransferase complex subunit (Q9NRP0), -12,03
Decimalni broj iza zagrade pokazuje koliko je puta određeni protein povećan ili smanjen
(predznak ''-'') u mjestu s gingivitisom ispitivane skupine u odnosu na kontrolnu skupinu.
Ana Badovinac, Disertacija
73
4.2.8. Analiza identificiranih proteina genskom ontologijom (GO)
GO analiza pokazuje distribuciju identificiranih proteina ispitivane i kontrolnih skupina
prema molekularnoj funkciji, staničnoj komponenti i biološkom procesu (Slika 9). Iz rezultata
analize vidljivo je da su postoci distribucije identificiranih proteina podjednaki u svih pet
uzorka.
Slika 9. Genska ontologija (GO) identificiranih proteina u svih pet analiziranih skupina
(kontrola, zdravo, gingivitis, parodontitis i poslije terapije). Prikazano je deset najistaknutijih
grupa prema tri različita kriterija GO: molekularna funkcija, stanična komponenta i biološki
proces.
0 5 10 15 20 25 30
establishment of protein localization
intracellular transport
macromolecular complex assembly
macromolecular complex subunit …
oxidation reduction
protein localization
protein transport
proteolysis
response to organic substance
vesicle-mediated transport
cytoskeleton
cytosol
intracellular non-membrane-bounded …
intracellular organelle lumen
membrane-enclosed lumen
mitochondrion
non-membrane-bounded organelle
nuclear lumen
organelle lumen
organelle membrane
adenyl nucleotide binding
adenyl ribonucleotide binding
ATP binding
nucleoside binding
nucleotide binding
purine nucleoside binding
purine nucleotide binding
purine ribonucleotide binding
ribonucleotide binding
RNA binding
Bio
logic
al
Pro
cess
Cellu
lar
Com
ponen
t M
ole
cula
r F
unction
postotak (%)
Kontrola Zdravo Gingivitis Parodontitis Poslije terapije
Ana Badovinac, Disertacija
74
5. RASPRAVA
Ana Badovinac, Disertacija
75
Parodontne bolesti su jedne od najčešćih bolesti u populaciji. Oko 90% ljudi tijekom života
razvije gingivitis, dok 7-13% ljudi oboli od teškog oblika parodontitisa (175). Novije
istraživanje o prevalenciji parodontitisa provedeno u Sjedinjenim Američkim Državama na
3742 osobe starije od 30 godina pokazalo je da čak 47% ispitanika ima parodontitis (8,7%
početni, 30% umjereni i 8,5% uznapredovali oblik bolesti) (176). Agresivni parodontitis
predstavlja vrlo ozbiljan oblik parodontne bolesti te bi zbog intenziteta, brzine napredovanja
bolesti i posljedica rano otkrivanje bolesti trebala biti jedna od glavnih zadaća doktora
dentalne medicine.
Tijekom posljednjeg desetljeća potraga za biomarkerima parodontne bolesti postaje sve
zanimljivija. Traže se specifični biomarkeri koji bi bili važni za dijagnosticiranje, prognozu i
praćenje bolesti, ali i za odgovor na terapiju (177). Do danas je istraživan velik broj citokina,
proteolitičkih enzima, produkata tkivne destrukcije i bakterijskih metabolita koji bi se mogli
povezati s aktivnošću bolesti te služiti kao indikatori ili prediktori stanja, no i dalje ne postoje
klinički testovi koji bi se upotrebljavali u te svrhe (178-180). Velik izazov u kliničkoj
parodontologiji predstavlja pronalazak pouzdanih molekularnih markera koji bi obilježavali
destrukciju parodontnog tkiva. Međutim, još se uvijek čeka njihov pronalazak i potvrđivanje,
a parodontni parametri i indeksi, te klinički pregled pacijenta, i dalje su najpouzdaniji znak
parodontnih bolesti (181).
Proteomske analize imaju sve veću primjenu u identifikaciji proteina kod pacijenata s
parodontnim bolestima, a svoje mjesto također pronalaze i u istraživanjima koja se bave
otkrivanjima mogućih biomarkera. Neka istraživanja koriste se tehnikama spektrometrije
mase koje su usmjerene ciljanim proteinima, npr. defenzinima, međutim u novije vrijeme sve
su češće opsežne proteomske analize (182, 183). Osnovni cilj opsežnih proteomskih
istraživanja u području parodontologije jest izdvajanje liste proteina koji bi mogli biti
specifični za određeno stanje te pratiti promjene u zastupljenosti tih proteina ovisno o stadiju,
fazi bolesti ili pak odgovoru na terapiju. Uvođenje takvih analiza kliničkih uzoraka (serum,
slina ili sulkusna tekućina) pacijenata s parodontitisom pokazao se kao odličan pristup koji bi
mogao značajno utjecati na znanje o proteinima vezanih za zdravlje, odnosno bolest (148).
Većina dosadašnjih istraživanja u području parodontologije bila je usredotočena na
analiziranje proteomskog sastava sulkusne tekućine, dok su se neki istraživači opredijelili za
analizu sline (164, 166, 167, 184-186). Međutim, proteomske analize parodontnog tkiva kod
pacijenata koji boluju od neke vrste parodontne bolesti još nisu objavljene.
Ana Badovinac, Disertacija
76
U ovom istraživanju korištena je label-free LC-MS/MS tehnologija za identifikaciju i
kvantifikaciju proteina epitelnog i vezivnog tkiva parodonta kod pacijenata s generaliziranim
agresivnim parodontitisom i zdravih kontrola. Takav pristup u proteomskoj analizi tkiva
pokazao se kao dobra metoda izbora što potvrđuje i činjenica da je ukupan broj identificiranih
proteina iznosio čak 3420. Jednakom tehnologijom za svoje istraživanje koristili su se
Bostanci i sur. u želji da analiziraju i usporede proteom sulkusne tekućine pacijenata s
agresivnim parodontitisom i onom zdravih ispitanika. Autori su također bili zadovoljni
rezultatima koje su dobili, 154 identificirana proteina među kojima su neki identificirani prvi
put, te su zaključili da bi korištena tehnologija mogla olakšati karakterizaciju proteoma
sulkusne tekućine i pridonijeti dijagnostici i prognoziranju parodontnih bolesti (165). Iako se
brojka od 154 proteina čini malom u usporedbi s 3420 proteina koji su identificirani u našem
istraživanju, valja napomenuti da je naše istraživanje analiziralo tkivo koje ima veći broj
različitih stanica, a samim tim i različitih proteina.
Ukupan broj identificiranih proteina u našem istraživanju iznosio je 3420, međutim tijekom
analize rezultata i statističke obrade podataka došlo se do broja od 193 proteina. Ti proteini
pronađeni su u svim uzorcima te su njihove promjene u ekspresiji bile statistički značajne u
svakoj ispitivanoj skupini (zdravo, gingivitis, parodontitis, poslije terapije) kada se usporedila
s kontrolnom skupinom. Ovakav pristup u odabiru proteina omogućio je stvaranje liste
zajedničkih proteina za sve uzorke te je time omogućeno praćenje ekspresije određenog
proteina u sve četiri ispitivane skupine.
U zdravoj ispitivanoj skupini najjaču ekspresiju pokazali su proteini Multimerin-1, Protein
S100-A6, HLA class II histocompatibility antigen gamma chain, Ig kappa chain C region i 14-
3-3 protein gamma.
Multimerin-1 je protein koji pokazuje ekspresiju u megakariocitima, trombocitima i stanicama
endotela. Po svojoj strukturi ima karakteristike adhezivnog proteina te in vitro podržava
adheziju različitih tipova stanica, uključujući aktivirane trombocite, neutrofile i stanice
endotela. Osim toga, pokazuje mogućnost stvaranja velikih, razgranatih vlakana matriksa, a
vjerojatno najvažniju funkciju pokazuje u alfa-granulama trombocita gdje funkcionira kao
protein za koji se veže koagulacijski faktor V, poznat kao glavni regulator koagulacije (187).
Multimerin-1 još nije istraživan i povezivan s parodontnim bolestima, ali njegova
identifikacija i stupnjevi promjene u našem istraživanju pokazuju zanimljivosti.
Najzastupljeniji je u zdravoj ispitivanoj skupini, zatim mu ekspresija pada u gingivitisu, u
Ana Badovinac, Disertacija
77
parodontitisu mu je čak i snižena, da bi mu opet malo porasla u skupini poslije terapije.
Moguće objašnjenje takvog ponašanja jest u njegovoj ulozi poticanja adhezije različitih
stanica, a od posebnog interesa su neutrofili koji su sastavni dio parodontnih lezija. Histološki
nalazi tkiva zahvaćenih gingivitisom i parodontitisom potvrđuju prisutnost neutrofila i govore
u prilog važne uloge u održavanju parodontnog zdravlja (53). Nadalje, kod pacijenata koji
boluju od upalnih parodontnih bolesti povećani su indeksi krvarenja u odnosu na zdrave
pojedince te bi i ta činjenica mogla objasniti zašto Multimerin-1, protein koji sudjeluje u
koagulaciji, pokazuje najjaču ekspresiju u zdravoj skupini, odnosno najnižu u parodontitisu.
Smanjena količina Multimerin-1 vjerojatno dovodi do slabijeg vezanja koagulacijskog faktora
V u trombocitima, a kao posljedica toga dolazi do poremećaja u mehanizmu zgrušavanja krvi
i do jačeg krvarenja gingive.
Među statistički značajno promijenjenim proteinima našla su se i dva pripadnika obitelji S100
proteina, Protein S100-A6 i A16. Gledajući njihovu ekspresiju u ispitivanim skupinama
vidljivo je da u zdravom tkivu i tkivu nakon terapije pokazuju jaču ekspresiju dok im je
ekspresija u tkivu s parodontitisom znatno manja. U dosadašnjim proteomskim istraživanjima
sulkusne tekućine pacijenata s parodontitisom i gingivitisom uglavnom su identificirani
protein S100-A8 i A9 (165, 168, 188). Njih karakterizira mala molekularna masa i dva mjesta
na koja se mogu vezati kalcijevi ioni, a u akutno upaljenom tkivu eksprimirani su u
makrofagima i epitelnim stanicama (189). Smatra se da igraju važnu ulogu u regulaciji
upalnog i imunološkog odgovora potičući kemotaksiju i adheziju neutrofila (190). Osim što
potiču kemotaksiju neutrofila i makrofaga, S100A8/A9 proteini inhibiraju produkciju H2O2 od
strane makrofaga i pokazuju antimikrobnu aktivnost (191). Za razliku od S100-A8/A9
proteina, S100-A6 protein identificiran je samo u istraživanju Haigha i sur. U tom istraživanju
protein je pokazao jaču ekspresiju u slini pacijenata s parodontitisom prije terapije, nego u
uzorcima sline nakon terapije ukazujući na moguću povezanost s upalnim stanjem. Naše
istraživanje pokazalo je suprotno ponašanje tog proteina, a budući da je malo dokaza o
povezanosti S100-A6 proteina i upale potrebna su daljnja istraživanja i više dokaza koji bi
govorili o funkciji spomenutog proteina. Poznato je tek da na životinjskom modelu astme
pokazuje pojačanu ekspresiju nakon stimulacije TNF-α i aktivacije NF-κB, te da mu je kod
nekih tumora pojačana ekspresija (192-194).
Protein HLA class II histocompatibility antigen gamma chain poznat još i kao CD74 protein,
pokazao je najjaču ekspresiju u uzorcima zdravog tkiva pacijenata s generaliziranim
agresivnim parodontitisom. Do danas još nema istraživanja koje je povezalo parodontitis i
Ana Badovinac, Disertacija
78
CD74 protein, ali ono što je poznato jest to da protein CD74 sudjeluje u nekoliko ključnih
procesa imunološkog odgovora kao što su prezentacija antigena, diferencijacija B-stanica i
signalizacija tijekom upale, a kao najznačajnija uloga često se ističe njegova interakcija s
katepsinima i s proteinom imena Macrophage migration inhibitory factor (MIF) (195).
Njegova uloga u patogenezi parodontitisa mogla bi biti zanimljiva zato što je protein CD74 u
interakciji s MIF-om. Naime, bakterijski antigeni stimuliraju leukocite na otpuštanje MIF-a,
cirkulirajući MIF se veže na CD74 drugih stanica imunološkog odgovora te potiče akutni
imunološki odgovor (196). Na temelju te činjenice MIF se klasificira kao upalni citokin koji
igra ulogu u sistemskom i lokalnom upalnom i imunološkom odgovoru, a dosadašnja
istraživanja povezuju ga s reumatoidnim artritisom i sepsom (197, 198). U istraživanju
Morimote i sur. istraživani su prisutnost i lokalizacija MIF-a u uzorcima gingive. MIF je
pokazao ekspresiju u citoplazmi keratinocita i to posebno u epitelu slobodne gingive i spojnog
epitela, a autori su došli do zaključka da bi MIF mogao igrati važnu ulogu u homeostatskom
procesu parodontne upale (199). Tek objavljeno istraživanje Lija i sur. o ekspresiji MIF-a u
tkivu gingive pacijenata s kroničnim parodontitisom i zdravih ispitanika pokazalo je da bi
MIF mogao biti povezan sa stanjem parodonta i da bi ekspresiju MIF-a mogao modulirati
lipopolisaharide P.gingivalisa (200). Iz ovih činjenica vidljivo je da bi proteini CD74 i MIF
mogli imati potencijalnu ulogu biomarkera parodontne bolesti, no za takve tvrdnje potrebno je
više dokaza.
14-3-3 protein gamma pokazao se zanimljivim zato što mu je ekspresija bila povećana samo u
zdravim uzorcima ispitivane skupine. U proteomskom istraživanju sline Wu i sur. pronašli su
snižene razine 14-3-3 proteina sigma u slini pacijenata s generaliziranim agresivnim
parodontitisom u odnosu na zdrave ispitanike (186). Iako je riječ o dva različita proteina
vidljivo je da bi 14-3-3 obitelj proteina mogla biti važno obilježje zdravog parodonta.
Funkcija tih proteina prilično je raznolika jer sudjeluju u širokom spektru općih i
specijaliziranih signalnih puteva vežući se za fosfoserine ili fosfotronine (201).
Četiri imunoglobulina Ig gamma-4 chain C region, Ig kappa chain C region, Ig kappa chain
V-III region SIE i Ig kappa chain V-IV region Len identificirani su i kvantificirani u svim
skupinama uzoraka. Zanimljivo je da su sva četiri imunoglobulina pokazala najjaču ekspresiju
u parodontitisu. Ig su proteini koje stvaraju plazma stanice nakon transformacije iz B-stanica,
a imunološki sustav ih stvara i koristi se njima za identifikaciju i neutralizaciju stranih
antigena. (93). Koliko su plazma stanice, odnosno B-stanice, važne u patogenezi parodontitisa
govori i podatak da je udio B-stanica u leziji zahvaćenoj parodontitisom oko 18%, a udio
Ana Badovinac, Disertacija
79
plazma stanica čak oko 50% (51). Budući da plazma stanice stvaraju Ig, naše istraživanje
potvrđuje važnu ulogu tih stanica, ali i Ig-a u patogenezi parodontitisa. U proteomskim
istraživanjima sulkusne tekućine pacijenata s parodontitisom Ig su se uz keratine i albumin
pokazali kao jedna od najzastupljenijih vrsta proteina (165, 202). Zanimljivo je da u oba
prethodno navedena istraživanja, kao i u našem, nisu identificirani IgG i IgA koji se često
spominju u istraživanjima agresivnog parodontitisa. Naš nalaz potvrđuje važnu ulogu koju bi
Ig mogli igrati u lokalnom obrambenom odgovoru i pokazuje da bi proteomska istraživanja
mogla biti korisna u analizi odgovora domaćina u parodontnim bolestima.
Među proteinima koji su pokazali zanimljivo ponašanje kroz sve četiri ispitivane skupine su i
pripadnici obitelji Annexina: Annexin A4, A5 i Isoform Annexin A2. Annexini su skupina
proteina koji vežu kalcij, funkcija im je još uvijek nepoznata, a samo se Annexin A1 povezuje
s upalnim stanjima i obrambenim odgovorom organizma (203). Naime, u istraživanjima
endotoksemije i artritisa na životinjskim modelima nedostatak Annexina A1 doveo je do
povišenih razina citokina i egzacerbacije akutne upale (204, 205). Ekspresija Annexina u
našem istraživanju bila je snižena u uzorcima gingivitisa, parodontitisa i poslije terapije, dok
je u uzorcima zdrave ispitivane skupine pokazala pojačanu ekspresiju. Istraživanje Bostancija
i sur. također je pokazalo da je ekspresija Annexina jača u zdravim uzorcima sulkusne
tekućine, nego u uzorcima pacijenata koji boluju od agresivnog parodontitisa (165), dok u
proteomskom istraživanju sulkusne tekućine eksperimentalnog gingivitisa Annexini nisu
pokazali značajne promjene u zastupljenosti tijekom razvoja upale. Iako funkcija i uloga
Annexina identificiranih u našem istraživanju (A4, A5 i Isoform A2) još nisu poznate čini se
da bi povišene razine tih proteina mogle biti povezane s parodontnim zdravljem, odnosno da
bi njihov nedostatak ili smanjena razina mogli pomoći u objašnjavanju upalnih zbivanja
tijekom razvoja parodontitisa. Zbog navedenih karakteristika ova obitelj proteina ističe se kao
jedna od najzanimljivijih u našem istraživanju i svakako zaslužuje daljnja istraživanja kako u
parodontologiji tako i u ostalim biomedicinskim znanostima.
Protein imena Oligosaccharyltransferase complex subunit pokazao je zanimljive stupnjeve
promjene unutar ispitivane skupine posebice u skupini poslije terapije gdje se istaknuo kao
protein najjačeg stupnja promjene kad se usporedio s kontrolnom skupinom. Koje su
karakteristike i funkcija tog proteina još nije poznato, poznato je samo da je riječ o
membranskom proteinu. Band 3 anion transport protein pokazao je najjaču ekspresiju u
gingivitisu. Riječ je o glikoproteinu membrane eritrocita, no koja je poveznica njega i upalnih
stanja također još nije poznato.
Ana Badovinac, Disertacija
80
U uzorcima parodontitisa protein koji je pokazao najjači stupanj promjene bio je Azurocidin.
Osim u parodontitisu, pokazao je visok stupanj promjene i u uzorcima gingivitisa. Azurocidin
još je poznat i pod imenom Cationic antimicrobial protein (CAP37) ili Heparin-binding
protein (HBP). Nalazi se u citoplazmatskim granulama neutrofila, pokazuje antimikrobnu
aktivnost posebice protiv Gram-negativnih bakterija, sudjeluje u aktivaciji imunološkog
odgovora te pojačava permeabilnost endotela i stvaranje edema. Nakon oslobađanja iz
sekretornih granula neutrofila, izazvanih vezanjem neutrofilnih beta (2)-integrina kao odgovor
na prisutne bakterije, Azurocidin djeluje kemotaktički na monocite i makrofage te pojačava
oslobađanje citokina i fagocitozu. Osim što ga se povezuje s upalom i imunološkim
odgovorom navedeni protein ima sposobnost vezanja heparina (206, 207). Jaka ekspresija tog
proteina uočena je u plazmi pacijenata u stanju teške sepse i to neposredno prije razvijanja
hipotenzije, te u patofiziološkim zbivanjima tijekom infekcije mekih tkiva, a autori navode da
bi upravo taj protein mogao biti dijagnostički marker i ciljna molekula liječenja (206).
Proteomsko istraživanje Choija i sur. identificiralo je 305 proteina u sulkusnoj tekućini
pacijenata s parodontitisom, od kojih je 45 pokazalo različitu ekspresiju u odnosu na
kontrolnu skupinu (188). Azurocidin je, kao i u našem istraživanju, pokazao jaču ekspresiju
kod ispitanika s parodontitisom nego kod zdravih kontrola. Iako još nema puno dokaza o
povezanosti Azurocidina i parodontne upale, autori ga izdvajaju kao mogući biomarker za
ranu detekciju parodontne destrukcije. Razlog tome je in vitro eksperiment kojim su pokazali
da Azurocidin inhibira osteoklastogenezu u stanicama koštane srži miša. Na temelju te
spoznaje zaključuju da bi Azurocidin mogao imati inhibitornu ulogu u diferencijaciji
osteoklasta i zaštitnu ulogu u gubitku alveolarne kosti tijekom ranih faza parodontitisa. Iz
navedenih podataka vidljivo je da je Azurocidin protein koji bi svakako trebalo povezati s
parodontitisom i označiti ga kao potencijalan biomarker za tu bolest.
Proteini koji su se također pokazali zanimljivim zbog visokih stupnjeva promjene u
parodontitisu su Myeloid cell nuclear differentiation antigen, Apolipoprotein A-II i Prolargin.
Myeloid cell nuclear differentiation antigen (MNDA) je protein koji je prisutan samo u
stanicama granulocitne i monocitne linije, a vjeruje se da bi mogao djelovati kao
transkripcijski aktivator, odnosno supresor mijeloičkih stanica (208) i da igra ulogu u
staničnom odgovoru granulocita i monocita na interferon (209). U dosadašnjim proteomskim
istraživanjima parodontitisa nije bio identificiran, međutim u našem istraživanju identificiran
je u svim uzorcima te je pokazao statistički značajne promjene u svim ispitivanim skupinama.
Najjaču ekspresiju pokazao je u parodontitisu, a budući da se monociti/makrofagi povezuju s
Ana Badovinac, Disertacija
81
mehanizmima gubitka potporne kosti tijekom parodontitisa, ovaj protein svakako treba biti
istaknut. Glavno obilježje upalom izazvanog gubitka kosti u parodontitisu pojačana je
aktivnost osteoklasta, stanica koje nastaju iz monocita/makrofaga i koje se smatraju glavnim
odgovornim stanicama za resorpciju kosti tijekom parodontitisa (210). Pri stvaranju
osteoklasta posreduju različiti citokini, među kojima su najpoznatiji RANKL i faktor
stimulacije makrofaga (engl. Macrophage colony stimulating factor, M-CSF) (211). Poznato
je da u mehanizmu resorpcije kosti postoji niz kaskadnih reakcija pa bi dodatna istraživanja
MNDA proteina, koji možda predstavlja sam početak tih procesa, bila potrebna za
pojašnjavanje njegove uloge u parodontitisu.
Protein imena Apolipoprotein A-II (APOA2) pronađen je u svim uzorcima, a najnižu
ekspresiju pokazao je u uzorcima parodontitisa. Analizom sulkusne tekućine kod modela
eksperimentalnog gingivitisa spomenuti protein identificiran je samo u fazi smirivanja upale,
dok u uzorcima indukcijske faze upale nije pronađen (168). Funkcija i uloga APOA2 u
parodontnim bolestima još se ne zna, a identifikacija različitih apoliproteina (A1, A1.3, J, B,
L) u drugim proteomskim istraživanjima parodontitisa i gingivitisa upućuje na potencijalno
zanimljivu proteinsku obitelj (165, 202, 212). Apolipoproteini su proteini koji se vežu za
lipide stvarajući lipoproteine te na taj način sudjeluju u transportu lipida kroz limfni i
cirkulacijski sustav. Osim uloge u transportu lipida, spominje ih se i kao sudionike
imunološkog odgovora domaćina. Naime, istraživanje Kallioa i sur. pokazalo je da bi upala i
endotoksemija kod teškog parodontitisa mogle povećati aktivaciju makrofaga posredovanu
lipoproteinima i nakupljanje kolesterola u stanicama (213). Vidljivo je da postoje poveznice
apolipoproteina i parodontitisa, no potrebna su daljnja istraživanja za točnije činjenice i
tvrdnje.
Posljednji protein zanimljiv zbog visokog stupnja promjene u uzorcima parodontitisa je
Prolargin. Njegova ekspresija karakteristična je za izvanstanični matriks vezivnog tkiva, a
funkcija mu je sidrenje kolagena tipa I za bazalne membrane vezivnog tkiva (214). Ovaj
protein nije posrednik upalnih ili imunoloških zbivanja, već je bitan u organizaciji vezivnog
tkiva parodonta. Ekspresija Prolargina u uzorcima parodontitisa bila je jako snižena u odnosu
na zdrave uzorke potvrđujući dobro znan podatak o destrukciji i razgradnji vezivnog tkiva u
lezijama parodontitisa. Ubrzana razgradnja vezivnog tkiva tijekom parodontitisa može se
smatrati i neuspjehom normalnih regulatornih mehanizama u održavanju molekularne
organizacije izvanstaničnog matriksa (215). Tu tezu podržava i rezultat našeg istraživanja.
Naime, stalna pregradnja vezivnog tkiva vjerojatno uključuje stvaranje Prolargina koji mu
Ana Badovinac, Disertacija
82
pomaže u sidrenju kolagenih vlakana te mu je zbog toga pojačana ekspresija u uzorcima
klinički zdrave gingive.
U ispitivanoj skupini poslije terapije zanimljivim su se pokazali Band 3 anion transport
protein, Protein S100-A6, Prolargin, Oligosaccharyltransferase complex subunit i Mimecan.
Od navedenih proteina posebno zanimljivim proteinom pokazao se Mimecan. Protein
Mimecan, zove se još i Osteoglycin, malen je proteoglikan bogat leucinom koji vjerojatno
potiče stvaranje kosti zajedno s beta 1 i 2 transformirajućim faktorima rasta (216). Povezuje
ga se i s koštanim morfogenetskim proteinom-1 koji vjerojatno potiče Mimecan na stvaranje
kolagenih vlakana i s lipopolisaharidima koji u hondrocitima štakora pojačavaju stvaranje
Mimecana (217, 218). Stupnjevi promjena ekspresije navedenog proteina pokazali su da je
ekspresija u tkivu poslije terapije oko osam puta niža nego u tkivu kontrolne skupine, oko
četiri puta niža u parodontitisu i oko jedan put niža u uzorcima gingivitisa. Jasno je vidljivo da
ekspresija proteina pokazuje tendenciju pada u ispitivanim skupinama, no zašto je to tako
može se tek nagađati jer još ne postoje podaci o povezanosti parodontitisa i Mimecana, a i
uloga i funkcija samog proteina u biološkim procesima još nisu potpuno razjašnjene.
Uzorci gingivitisa pokazali su zanimljivu ekspresiju proteina poput: Band 3 anion transport
protein, Azurocidina, Proteina S100-A6, Multimerin-1 i Dedicator of cytokinesis proteina 2.
Dedicator of cytokinesis protein 2 (DOCK2) sudjeluje u preuređenju citoskeleta potrebnog za
migraciju limfocita (219). U proteomskim istraživanjima parodontnih bolesti još nije bio
identificiran, no budući da se njegova funkcija povezuje s limfocitima, važim stanicama
parodontnih lezija, možda bi upravo praćenje ekspresije tog proteina moglo pomoći u
razjašnjavanju imunoloških događaja u patogenezi parodontitisa.
Naše istraživanje otkrilo je i pojačanu ekspresiju Histona H4 i H2A u uzorcima parodontitisa.
Histoni su jezgreni proteini koji igraju ulogu u mnogobrojnim biološkim procesima, npr.
apoptozi, antimikrobnom djelovanju, organizaciji strukture DNA, regulaciji transkripcije,
popravcima i replikaciji DNA, te u stabilizaciji kromosoma. Povišene razine histona
zabilježene su u serumu osoba s traumatskim ozljedama i sepsom (220), a u proteomskom
istraživanju eksperimentalnoga gingivitisa histoni su pokazali slabiju ekspresiju pri kraju
rezolucijskog perioda (167). Pojačana ekspresija histona u uzorcima parodontitisa našeg
istraživanja mogla bi upućivati na povezanost tih proteina s bakterijskom aktivnosti, te su
svakako potrebna daljnja istraživanja koja bi objasnila njihovu ulogu u parodontitisu.
Ana Badovinac, Disertacija
83
Kao i druga proteomska istraživanja, ni naše istraživanje nije identificiralo citokine poznate
da sudjeluju u patogenezi parodontne bolesti (167, 168, 202). Razlog tome mogao bi biti u
činjenici da su citokini prisutni u rasponu pikograma/mililitru i da ih zaklanjaju veći proteini
prisutni u mikrogramima/mililitru, primjerice albumin. Kako bi se nadvladali ovi problemi
identifikacije proteina, potrebne su nove metode pripreme uzoraka, prikupljanja podataka i
novi analitički koraci koji se koriste analitičkim algoritmima potrebnima za poticanje
otkrivanja proteina i pretvorbu detektiranih signala u identificiranu molekulu. Osim toga,
korištenjem sadašnjih tehnologija za analizu većeg broj uzoraka trebat će mjeseci ili godine
kako bi se diferencirali proteini vezani za bolesti od varijacija humanih uzoraka (221, 222).
Naše je istraživanje po prvi put prikazalo usporedbu ekspresije proteina u uzorcima epitelnog
i vezivnog parodontnog tkiva zdravih ispitanika i pacijenata s generaliziranim agresivnim
parodontitisom. Rezultati pokazuju širok spektar proteina koji bi mogli pridonijeti
razumijevanju patoloških promjena koje se događaju tijekom parodontitisa, no daljnja
istraživanja s većim brojem uzoraka potrebna su za eventualni pronalazak biomarkera.
Proteomski pristup u analizi uzoraka zasigurno otvara nova vrata za razumijevanje patogeneze
parodontitisa, a vjerojatno pridonosi i razvoju novih načina dijagnosticiranja i liječenja ove
bolesti.
Ana Badovinac, Disertacija
84
6. ZAKLJUČCI
Ana Badovinac, Disertacija
85
Zaključci ovog istraživanja su sljedeći:
1. Label-free LC-MS/MS tehnologija korištena za identifikaciju i kvantifikaciju proteina
epitelnog i vezivnog tkiva parodonta kod pacijenata s generaliziranim agresivnim
parodontitisom i zdravih kontrola pokazala se kao dobra metoda izbora za proteomsku
analizu parodontnog tkiva.
2. Proteini koji bi se mogli povezivati s parodontnim zdravljem su: Multimerin-1,
Prolargin, Protein S100-A6, HLA class II histocompatibility antigen gamma chain
protein, 14-3-3 protein gamma i Annexin A4, A5 te Isoform A2.
3. Stanje gingivitisa obilježavaju proteini: Dedicator of cytokinesis protein 2, Azurocidin
i Band 3 anion transport protein.
4. U uzorcima parodontitisa najzanimljivijim proteinima pokazali su se: imunoglobulini
(Ig gamma-4 chain C region, Ig kappa chain C region, Ig kappa chain V-III region
SIE i Ig kappa chain V-IV region Len), Histoni H4 i H2A, Azurocidin i Myeloid cell
nuclear differentiation antigen.
5. Proteini Band 3 anion transport protein, Oligosaccharyltransferase complex subunit i
Mimecan pokazali su najzanimljivije ponašanje u ispitivanoj skupini poslije terapije.
6. Azurocidin bi se mogao izdvojiti kao najzanimljiviji protein ovog istraživanja i
mogući biomarker parodontitisa. Razlog tome je izuzetno visok stupanj promjene
ekspresije u uzorcima gingivitisa i parodontitisa u odnosu na kontrolnu skupinu.
7. Multimerin-1 bio mogao biti protein čija ekspresija obilježava zdrav parodont.
8. S100 obitelj proteina, aneksini i histoni pokazuju zanimljivo ponašanje u našem
istraživanju i u drugim proteomskim istraživanjima parodontnih bolesti, te se time
ističu kao proteini koji bi mogli biti potencijalni biomarkeri parodontnih bolesti.
Ana Badovinac, Disertacija
86
7. LITERATURA
Ana Badovinac, Disertacija
87
1. Lindhe J, Karring T, Araujo M. The anatomy of periodontal tissues. In: Lindhe J, Lang
NP, Karring T, editors. Clinical periodontology and implant dentistry. 5th ed. Oxford:
Blackwell Munksgaard; 2008. p. 3-50.
2. Ainamo J, Talari A. The increase with age of the width of attached gingiva. J
Periodontal Res. 1976 Jul;11(4):182-8.
3. Ainamo J, Loe H. Anatomical characteristics of gingiva. A clinical and microscopic
study of the free and attached gingiva. J Periodontol. 1966 Jan-Feb;37(1):5-13.
4. Gargiulo AW, Wentz FM, Orban B. Dimensions and relations of the dentogingival
junction in humans. J Periodontol. 1961;32(3):1.
5. Bowers GM, Moffitt WC, Williams JE, Jr. Tooth position and the periodontium. Dent
Clin North Am. 1972 Jul;16(3):597-602.
6. Schroeder HE, Listgarten MA. The gingival tissues: the architecture of periodontal
protection. Periodontol 2000. 1997 Feb;13:91-120.
7. Bosshardt DD, Lang NP. The junctional epithelium: from health to disease. J Dent
Res. 2005 Jan;84(1):9-20.
8. Schroeder HE. Ultrastructure of the junctional epithelium of the human gingiva. Helv
Odontol Acta. 1969 Oct;13(2):65-83.
9. Schiott CR, Loe H. The origin and variation in number of leukocytes in the human
saliva. J Periodontal Res. 1970;5(1):36-41.
10. Schroeder HE. Transmigration and infiltration of leucocytes in human junctional
epithelium. Helv Odontol Acta. 1973 Apr;17(1):6-18.
11. Juliano RL. Signal transduction by cell adhesion receptors and the cytoskeleton:
functions of integrins, cadherins, selectins, and immunoglobulin-superfamily members. Annu
Rev Pharmacol Toxicol. 2002;42:283-323.
12. Graber HG, Conrads G, Wilharm J, Lampert F. Role of interactions between integrins
and extracellular matrix components in healthy epithelial tissue and establishment of a long
junctional epithelium during periodontal wound healing: a review. J Periodontol. 1999
Dec;70(12):1511-22.
13. Ivanov DB, Philippova MP, Tkachuk VA. Structure and functions of classical
cadherins. Biochemistry (Mosc). 2001 Oct;66(10):1174-86.
14. Ye P, Chapple CC, Kumar RK, Hunter N. Expression patterns of E-cadherin,
involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva. J
Pathol. 2000 Sep;192(1):58-66.
Ana Badovinac, Disertacija
88
15. Heymann R, Wroblewski J, Terling C, Midtvedt T, Obrink B. The characteristic
cellular organization and CEACAM1 expression in the junctional epithelium of rats and mice
are genetically programmed and not influenced by the bacterial microflora. J Periodontol.
2001 Apr;72(4):454-60.
16. Singer BB, Scheffrahn I, Obrink B. The tumor growth-inhibiting cell adhesion
molecule CEACAM1 (C-CAM) is differently expressed in proliferating and quiescent
epithelial cells and regulates cell proliferation. Cancer Res. 2000 Mar 1;60(5):1236-44.
17. Kammerer R, Hahn S, Singer BB, Luo JS, von Kleist S. Biliary glycoprotein (CD66a),
a cell adhesion molecule of the immunoglobulin superfamily, on human lymphocytes:
structure, expression and involvement in T cell activation. Eur J Immunol. 1998
Nov;28(11):3664-74.
18. Hauck CR, Meyer TF, Lang F, Gulbins E. CD66-mediated phagocytosis of Opa52
Neisseria gonorrhoeae requires a Src-like tyrosine kinase- and Rac1-dependent signalling
pathway. EMBO J. 1998 Jan 15;17(2):443-54.
19. Crawford JM. Distribution of ICAM-1, LFA-3 and HLA-DR in healthy and diseased
gingival tissues. J Periodontal Res. 1992 Jul;27(4 Pt 1):291-8.
20. Crawford JM, Hopp B. Junctional epithelium expresses the intercellular adhesion
molecule ICAM-1. J Periodontal Res. 1990 Jul;25(4):254-6.
21. Tonetti MS, Imboden MA, Lang NP. Neutrophil migration into the gingival sulcus is
associated with transepithelial gradients of interleukin-8 and ICAM-1. J Periodontol. 1998
Oct;69(10):1139-47.
22. Tonetti MS, Gerber L, Lang NP. Vascular adhesion molecules and initial development
of inflammation in clinically healthy human keratinized mucosa around teeth and
osseointegrated implants. J Periodontal Res. 1994 Nov;29(6):386-92.
23. Miyauchi M, Sato S, Kitagawa S, Hiraoka M, Kudo Y, Ogawa I, et al. Cytokine
expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of
lipopolysaccharide. Histochem Cell Biol. 2001 Jul;116(1):57-62.
24. Nordlund L, Hormia M, Saxen L, Thesleff I. Immunohistochemical localization of
epidermal growth factor receptors in human gingival epithelia. J Periodontal Res. 1991
Jul;26(4):333-8.
25. Uitto VJ, Salonen JI, Firth JD, Jousimies-Somer H, Saarialho-Kere U. Matrilysin
(matrix metalloproteinase-7) expression in human junctional epithelium. J Dent Res. 2002
Apr;81(4):241-6.
Ana Badovinac, Disertacija
89
26. Schmid J, Cohen RL, Chambers DA. Plasminogen activator in human periodontal
health and disease. Arch Oral Biol. 1991;36(3):245-50.
27. Dale BA. Periodontal epithelium: a newly recognized role in health and disease.
Periodontol 2000. 2002;30:70-8.
28. Pollanen MT, Salonen JI, Uitto VJ. Structure and function of the tooth-epithelial
interface in health and disease. Periodontol 2000. 2003;31:12-31.
29. Cho MI, Garant PR. Development and general structure of the periodontium.
Periodontol 2000. 2000 Oct;24:9-27.
30. Bartold PM, Walsh LJ, Narayanan AS. Molecular and cell biology of the gingiva.
Periodontol 2000. 2000 Oct;24:28-55.
31. McCulloch CA, Lekic P, McKee MD. Role of physical forces in regulating the form
and function of the periodontal ligament. Periodontol 2000. 2000 Oct;24:56-72.
32. Saygin NE, Giannobile WV, Somerman MJ. Molecular and cell biology of cementum.
Periodontol 2000. 2000 Oct;24:73-98.
33. McKee MD, Zalzal S, Nanci A. Extracellular matrix in tooth cementum and mantle
dentin: localization of osteopontin and other noncollagenous proteins, plasma proteins, and
glycoconjugates by electron microscopy. Anat Rec. 1996 Jun;245(2):293-312.
34. Bosshardt DD, Schroeder HE. Cementogenesis reviewed: a comparison between
human premolars and rodent molars. Anat Rec. 1996 Jun;245(2):267-92.
35. Saito M, Narayana AS. Signaling reactions induced in human fibroblasts during
adhesion to cementum-derived attachment protein. J Bone Miner Res. 1999 Jan;14(1):65-72.
36. Ikezawa K, Hart CE, Williams DC, Narayanan AS. Characterization of cementum
derived growth factor as an insulin-like growth factor-I like molecule. Connect Tissue Res.
1997;36(4):309-19.
37. Sodek J, McKee MD. Molecular and cellular biology of alveolar bone. Periodontol
2000. 2000 Oct;24:99-126.
38. Ogasawara T, Yoshimine Y, Kiyoshima T, Kobayashi I, Matsuo K, Akamine A, et al.
In situ expression of RANKL, RANK, osteoprotegerin and cytokines in osteoclasts of rat
periodontal tissue. J Periodontal Res. 2004 Feb;39(1):42-9.
39. Kinane DF, Berglundh T, Lindhe J. Pathogenesis of periodontitis. In: Lindhe J, Lang
NP, Karring T, editors. Clinical periodontology nad implant dentistry. 5th ed. Oxford:
Blackwell Munksgaard; 2008. p. 285-387.
40. Page RC, Schroeder HE. Pathogenesis of inflammatory periodontal disease. A
summary of current work. Lab Invest. 1976 Mar;34(3):235-49.
Ana Badovinac, Disertacija
90
41. Caffesse RG, Nasjleti CE. Enzymatic penetration through intact sulcular epithelium. J
Periodontol. 1976 Jul;47(7):391-7.
42. Page RC. Gingivitis. J Clin Periodontol. 1986 May;13(5):345-59.
43. Saglie R, Newman MG, Carranza FA, Jr., Pattison GL. Bacterial invasion of gingiva
in advanced periodontitis in humans. J Periodontol. 1982 Apr;53(4):217-22.
44. Hock J, Niki K. A vital microscopy study of the morphology of normal and inflamed
gingiva. J Periodontal Res. 1971;6(2):81-8.
45. Attstrom R, Egelberg J. Emigration of blood neutrophils and monocytes into the
gingival crevices. J Periodontal Res. 1970;5(1):48-55.
46. Lindhe J, Rylander H. Experimental gingivitis in young dogs. Scand J Dent Res. 1975
Nov;83(6):314-26.
47. Seymour GJ, Powell RN, Cole KL, Aitken JF, Brooks D, Beckman I, et al.
Experimental gingivitis in humans. A histochemical and immunological characterization of
the lymphoid cell subpopulations. J Periodontal Res. 1983 Jul;18(4):375-85.
48. Schroeder HE. Quantitative parameters of early human gingival inflammation. Arch
Oral Biol. 1970 May;15(5):383-400.
49. Hancock EB, Cray RJ, O'Leary TJ. The relationship between gingival crevicular fluid
and gingival inflammation. A clinical and histologic study. J Periodontol. 1979 Jan;50(1):13-
9.
50. Lindhe J, Parodi R, Liljenberg B, Fornell J. Clinical and structural alterations
characterizing healing gingiva. J Periodontal Res. 1978 Sep;13(5):410-24.
51. Berglundh T, Donati M. Aspects of adaptive host response in periodontitis. J Clin
Periodontol. 2005;32 Suppl 6:87-107.
52. Van Dyke TE, Sheilesh D. Risk factors for periodontitis. J Int Acad Periodontol. 2005
Jan;7(1):3-7.
53. Miyasaki KT. The neutrophil: mechanisms of controlling periodontal bacteria. J
Periodontol. 1991 Dec;62(12):761-74.
54. Hellden L, Ericson T, Lindhe J. Neutrophil chemotactic substances in different
fractions of soluble dental plaque material. Scand J Dent Res. 1973;81(4):276-84.
55. Tempel TR, Snyderman R, Jordan HV, Mergenhagen SE. Factors from saliva and oral
bacteria, chemotactic for polymorphonuclear leukocytes: their possible role in gingival
inflammation. J Periodontol. 1970 Feb;41(2):71-80.
56. Anderson DC, Schmalsteig FC, Finegold MJ, Hughes BJ, Rothlein R, Miller LJ, et al.
The severe and moderate phenotypes of heritable Mac-1, LFA-1 deficiency: their quantitative
Ana Badovinac, Disertacija
91
definition and relation to leukocyte dysfunction and clinical features. J Infect Dis. 1985
Oct;152(4):668-89.
57. Van Dyke TE, Vaikuntam J. Neutrophil function and dysfunction in periodontal
disease. Curr Opin Periodontol. 1994:19-27.
58. Albandar JM, DeNardin AM, Adesanya MR, Diehl SR, Winn DM. Associations
between serum antibody levels to periodontal pathogens and early-onset periodontitis. J
Periodontol. 2001 Nov;72(11):1463-9.
59. Ebersole JL. Systemic humoral immune responses in periodontal disease. Crit Rev
Oral Biol Med. 1990;1(4):283-331.
60. Mouton C, Hammond PG, Slots J, Genco RJ. Serum antibodies to oral Bacteroides
asaccharolyticus (Bacteroides gingivalis): relationship to age and periondontal disease. Infect
Immun. 1981 Jan;31(1):182-92.
61. Schenkein HA. Host responses in maintaining periodontal health and determining
periodontal disease. Periodontol 2000. 2006;40:77-93.
62. Gunsolley JC, Burmeister JA, Tew JG, Best AM, Ranney RR. Relationship of serum
antibody to attachment level patterns in young adults with juvenile periodontitis or
generalized severe periodontitis. J Periodontol. 1987 May;58(5):314-20.
63. Darby IB, Mooney J, Kinane DF. Changes in subgingival microflora and humoral
immune response following periodontal therapy. J Clin Periodontol. 2001 Aug;28(8):796-805.
64. Vankeerberghen A, Nuytten H, Dierickx K, Quirynen M, Cassiman JJ, Cuppens H.
Differential induction of human beta-defensin expression by periodontal commensals and
pathogens in periodontal pocket epithelial cells. J Periodontol. 2005 Aug;76(8):1293-303.
65. Lu Q, Jin L, Darveau RP, Samaranayake LP. Expression of human beta-defensins-1
and -2 peptides in unresolved chronic periodontitis. J Periodontal Res. 2004 Aug;39(4):221-7.
66. Bissell J, Joly S, Johnson GK, Organ CC, Dawson D, McCray PB, Jr., et al.
Expression of beta-defensins in gingival health and in periodontal disease. J Oral Pathol Med.
2004 May;33(5):278-85.
67. Lah TT, Babnik J, Schiffmann E, Turk V, Skaleric U. Cysteine proteinases and
inhibitors in inflammation: their role in periodontal disease. J Periodontol. 1993 May;64(5
Suppl):485-91.
68. McCulloch CA. Host enzymes in gingival crevicular fluid as diagnostic indicators of
periodontitis. J Clin Periodontol. 1994 Aug;21(7):497-506.
69. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 1989 Feb 9;320(6):365-76.
Ana Badovinac, Disertacija
92
70. Kantarci A, Oyaizu K, Van Dyke TE. Neutrophil-mediated tissue injury in periodontal
disease pathogenesis: findings from localized aggressive periodontitis. J Periodontol. 2003
Jan;74(1):66-75.
71. Hellden L, Lindhe J. Enhanced emigration of crevicular leukocytes mediated by
factors in human dental plaque. Scand J Dent Res. 1973;81(2):123-9.
72. Tatakis DN. Interleukin-1 and bone metabolism: a review. J Periodontol. 1993
May;64(5 Suppl):416-31.
73. Goodson JM, Dewhirst FE, Brunetti A. Prostaglandin E2 levels and human
periodontal disease. Prostaglandins. 1974 Apr 10;6(1):81-5.
74. Offenbacher S, Farr DH, Goodson JM. Measurement of prostaglandin E in crevicular
fluid. J Clin Periodontol. 1981 Aug;8(4):359-67.
75. Offenbacher S, Williams RC, Jeffcoat MK, Howell TH, Odle BM, Smith MA, et al.
Effects of NSAIDs on beagle crevicular cyclooxygenase metabolites and periodontal bone
loss. J Periodontal Res. 1992 May;27(3):207-13.
76. Zhou J, Zou S, Zhao W, Zhao Y. Prostaglandin E2 level in gingival crevicular fluid
and its relation to the periodontal pocket depth in patients with periodontitis. Chin Med Sci J.
1994 Mar;9(1):52-5.
77. Teng YT. The role of acquired immunity and periodontal disease progression. Crit
Rev Oral Biol Med. 2003;14(4):237-52.
78. Yamazaki K, Yoshie H, Seymour GJ. T cell regulation of the immune response to
infection in periodontal diseases. Histol Histopathol. 2003 Jul;18(3):889-96.
79. Seymour GJ, Gemmell E. Cytokines in periodontal disease: where to from here? Acta
Odontol Scand. 2001 Jun;59(3):167-73.
80. Jankovic D, Liu Z, Gause WC. Th1- and Th2-cell commitment during infectious
disease: asymmetry in divergent pathways. Trends Immunol. 2001 Aug;22(8):450-7.
81. Kapsenberg ML. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat
Rev Immunol. 2003 Dec;3(12):984-93.
82. Kikuchi T, Hahn CL, Tanaka S, Barbour SE, Schenkein HA, Tew JG. Dendritic cells
stimulated with Actinobacillus actinomycetemcomitans elicit rapid gamma interferon
responses by natural killer cells. Infect Immun. 2004 Sep;72(9):5089-96.
83. Gemmell E, Yamazaki K, Seymour GJ. Destructive periodontitis lesions are
determined by the nature of the lymphocytic response. Crit Rev Oral Biol Med.
2002;13(1):17-34.
Ana Badovinac, Disertacija
93
84. Lu H, Wang M, Gunsolley JC, Schenkein HA, Tew JG. Serum immunoglobulin G
subclass concentrations in periodontally healthy and diseased individuals. Infect Immun. 1994
May;62(5):1677-82.
85. Tanaka S, Barbour SE, Best AM, Schenkein HA, Tew JG. Prostaglandin E2-mediated
regulation of immunoglobulin G2 via interferon gamma. J Periodontol. 2003 Jun;74(6):771-9.
86. Diehl SR, Wu T, Burmeister JA, Califano JV, Brooks CN, Tew JG, et al. Evidence of
a substantial genetic basis for IgG2 levels in families with aggressive periodontitis. J Dent
Res. 2003 Sep;82(9):708-12.
87. Miossec P. IL-17 and Th17 cells in human inflammatory diseases. Microbes Infect.
2009 Apr;11(5):625-30.
88. Weaver CT, Harrington LE, Mangan PR, Gavrieli M, Murphy KM. Th17: an effector
CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties. Immunity. 2006 Jun;24(6):677-88.
89. Lund FE, Garvy BA, Randall TD, Harris DP. Regulatory roles for cytokine-producing
B cells in infection and autoimmune disease. Curr Dir Autoimmun. 2005;8:25-54.
90. Porakishvili N, Mageed R, Jamin C, Pers JO, Kulikova N, Renaudineau Y, et al.
Recent progress in the understanding of B-cell functions in autoimmunity. Scand J Immunol.
2001 Jul-Aug;54(1-2):30-8.
91. Gemmell E, Seymour GJ. Cytokine profiles of cells extracted from humans with
periodontal diseases. J Dent Res. 1998 Jan;77(1):16-26.
92. Mauri C, Bosma A. Immune regulatory function of B cells. Annu Rev Immunol.
2012;30:221-41.
93. Berglundh T, Donati M, Zitzmann N. B cells in periodontitis: friends or enemies?
Periodontol 2000. 2007;45:51-66.
94. Wilson ME, Bronson PM, Hamilton RG. Immunoglobulin G2 antibodies promote
neutrophil killing of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun. 1995
Mar;63(3):1070-5.
95. Papapanou PN, Neiderud AM, Disick E, Lalla E, Miller GC, Dahlen G. Longitudinal
stability of serum immunoglobulin G responses to periodontal bacteria. J Clin Periodontol.
2004 Nov;31(11):985-90.
96. Johnson V, Johnson BD, Sims TJ, Whitney CW, Moncla BJ, Engel LD, et al. Effects
of treatment on antibody titer to Porphyromonas gingivalis in gingival crevicular fluid of
patients with rapidly progressive periodontitis. J Periodontol. 1993 Jun;64(6):559-65.
97. Hagewald SJ, Fishel DL, Christan CE, Bernimoulin JP, Kage A. Salivary IgA in
response to periodontal treatment. Eur J Oral Sci. 2003 Jun;111(3):203-8.
Ana Badovinac, Disertacija
94
98. Reiff RL. Serum and salivary IgG and IgA response to initial preparation therapy. J
Periodontol. 1984 May;55(5):299-305.
99. Berglundh T, Liljenberg B, Tarkowski A, Lindhe J. The presence of local and
circulating autoreactive B cells in patients with advanced periodontitis. J Clin Periodontol.
2002 Apr;29(4):281-6.
100. Afar B, Engel D, Clark EA. Activated lymphocyte subsets in adult periodontitis. J
Periodontal Res. 1992 Mar;27(2):126-33.
101. Kowashi Y, Jaccard F, Cimasoni G. Increase of free collagenase and neutral protease
activities in the gingival crevice during experimental gingivitis in man. Arch Oral Biol.
1979;24(9):645-50.
102. Ohlsson K, Olsson I, Tynelius-Bratthall G. Neutrophil leukocyte collagenase, elastase
and serum protease inhibitors in human gingival crevicles. Acta Odontol Scand.
1974;32(1):51-9.
103. Haerian A, Adonogianaki E, Mooney J, Manos A, Kinane DF. Effects of treatment on
gingival crevicular collagenase, stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases and
their ability to predict response to treatment. J Clin Periodontol. 1996 Feb;23(2):83-91.
104. Sorsa T, Tjaderhane L, Salo T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases.
Oral Dis. 2004 Nov;10(6):311-8.
105. Sorsa T, Tjaderhane L, Konttinen YT, Lauhio A, Salo T, Lee HM, et al. Matrix
metalloproteinases: contribution to pathogenesis, diagnosis and treatment of periodontal
inflammation. Ann Med. 2006;38(5):306-21.
106. Savage A, Eaton KA, Moles DR, Needleman I. A systematic review of definitions of
periodontitis and methods that have been used to identify this disease. J Clin Periodontol.
2009 Jun;36(6):458-67.
107. Socransky SS, Haffajee AD, Goodson JM, Lindhe J. New concepts of destructive
periodontal disease. J Clin Periodontol. 1984 Jan;11(1):21-32.
108. Albandar JM, Rams TE. Risk factors for periodontitis in children and young persons.
Periodontol 2000. 2002;29:207-22.
109. Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and
conditions. Ann Periodontol. 1999 Dec;4(1):1-6.
110. Barnett ML, Baker RL, Yancey JM. The prevalence of juvenile periodontitis
("periodontosis") in a dental school patient population. J Dent Res. 1982 Feb;61(2):391-2.
111. Harley AF, Floyd PD. Prevalence of juvenile periodontitis in schoolchildren in Lagos,
Nigeria. Community Dent Oral Epidemiol. 1988 Oct;16(5):299-301.
Ana Badovinac, Disertacija
95
112. Levin L, Baev V, Lev R, Stabholz A, Ashkenazi M. Aggressive periodontitis among
young Israeli army personnel. J Periodontol. 2006 Aug;77(8):1392-6.
113. Saxen L. Prevalence of juvenile periodontitis in Finland. J Clin Periodontol. 1980
Jun;7(3):177-86.
114. Melvin WL, Sandifer JB, Gray JL. The prevalence and sex ratio of juvenile
periodontitis in a young racially mixed population. J Periodontol. 1991 May;62(5):330-4.
115. Demmer RT, Papapanou PN. Epidemiologic patterns of chronic and aggressive
periodontitis. Periodontol 2000. 2010 Jun;53:28-44.
116. Socransky SS, Haffajee AD. The bacterial etiology of destructive periodontal disease:
current concepts. J Periodontol. 1992 Apr;63(4 Suppl):322-31.
117. Slots J, Reynolds HS, Genco RJ. Actinobacillus actinomycetemcomitans in human
periodontal disease: a cross-sectional microbiological investigation. Infect Immun. 1980
Sep;29(3):1013-20.
118. Zambon JJ, Umemoto T, De Nardin E, Nakazawa F, Christersson LA, Genco RJ.
Actinobacillus actinomycetemcomitans in the pathogenesis of human periodontal disease.
Adv Dent Res. 1988 Nov;2(2):269-74.
119. Genco RJ, Zambon JJ, Murray PA. Serum and gingival fluid antibodies as adjuncts in
the diagnosis of Actinobacillus actinomycetemcomitans-associated periodontal disease. J
Periodontol. 1985 Nov;56(11 Suppl):41-50.
120. Haffajee AD, Socransky SS, Ebersole JL, Smith DJ. Clinical, microbiological and
immunological features associated with the treatment of active periodontosis lesions. J Clin
Periodontol. 1984 Oct;11(9):600-18.
121. Fives-Taylor PM, Meyer DH, Mintz KP, Brissette C. Virulence factors of
Actinobacillus actinomycetemcomitans. Periodontol 2000. 1999 Jun;20:136-67.
122. Henderson B, Nair SP, Ward JM, Wilson M. Molecular pathogenicity of the oral
opportunistic pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. Annu Rev Microbiol.
2003;57:29-55.
123. Kachlany SC, Fine DH, Figurski DH. Secretion of RTX leukotoxin by Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Infect Immun. 2000 Nov;68(11):6094-100.
124. Shah HN, Gharbia SE. Biochemical and chemical analyses of black-pigmented gram-
negative anaerobes. FEMS Immunol Med Microbiol. 1993 Mar;6(2-3):89-96.
125. Murray PA, Burstein DA, Winkler JR. Antibodies to Bacteroides gingivalis in patients
with treated and untreated periodontal disease. J Periodontol. 1989 Feb;60(2):96-103.
Ana Badovinac, Disertacija
96
126. Ebersole JL, Taubman MA, Smith DJ, Frey DE. Human immune responses to oral
microorganisms: patterns of systemic antibody levels to Bacteroides species. Infect Immun.
1986 Feb;51(2):507-13.
127. Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA. Virulence factors of Porphyromonas
gingivalis. Periodontol 2000. 1999 Jun;20:168-238.
128. Dorn BR, Dunn WA, Jr., Progulske-Fox A. Bacterial interactions with the autophagic
pathway. Cell Microbiol. 2002 Jan;4(1):1-10.
129. Yilmaz O, Verbeke P, Lamont RJ, Ojcius DM. Intercellular spreading of
Porphyromonas gingivalis infection in primary gingival epithelial cells. Infect Immun. 2006
Jan;74(1):703-10.
130. Kuehn MJ, Kesty NC. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen
interaction. Genes Dev. 2005 Nov 15;19(22):2645-55.
131. Duncan L, Yoshioka M, Chandad F, Grenier D. Loss of lipopolysaccharide receptor
CD14 from the surface of human macrophage-like cells mediated by Porphyromonas
gingivalis outer membrane vesicles. Microb Pathog. 2004 Jun;36(6):319-25.
132. Moore WE, Moore LV. The bacteria of periodontal diseases. Periodontol 2000. 1994
Jun;5:66-77.
133. Holt SC, Bramanti TE. Factors in virulence expression and their role in periodontal
disease pathogenesis. Crit Rev Oral Biol Med. 1991;2(2):177-281.
134. Birkedal-Hansen H, Taylor RE, Zambon JJ, Barwa PK, Neiders ME. Characterization
of collagenolytic activity from strains of Bacteroides gingivalis. J Periodontal Res. 1988
Jul;23(4):258-64.
135. Singer RE, Buckner BA. Butyrate and propionate: important components of toxic
dental plaque extracts. Infect Immun. 1981 May;32(2):458-63.
136. Hausmann E, Raisz LG, Miller WA. Endotoxin: stimulation of bone resorption in
tissue culture. Science. 1970 May 15;168(3933):862-4.
137. Offenbacher S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1996
Nov;1(1):821-78.
138. Birkedal-Hansen H. Role of cytokines and inflammatory mediators in tissue
destruction. J Periodontal Res. 1993 Nov;28(6 Pt 2):500-10.
139. Lotz M. Interleukin-6: a comprehensive review. Cancer Treat Res. 1995;80:209-33.
140. Reinhardt RA, Masada MP, Kaldahl WB, DuBois LM, Kornman KS, Choi JI, et al.
Gingival fluid IL-1 and IL-6 levels in refractory periodontitis. J Clin Periodontol. 1993
Mar;20(3):225-31.
Ana Badovinac, Disertacija
97
141. Geivelis M, Turner DW, Pederson ED, Lamberts BL. Measurements of interleukin-6
in gingival crevicular fluid from adults with destructive periodontal disease. J Periodontol.
1993 Oct;64(10):980-3.
142. Bickel M. The role of interleukin-8 in inflammation and mechanisms of regulation. J
Periodontol. 1993 May;64(5 Suppl):456-60.
143. Fitzgerald JE, Kreutzer DL. Localization of interleukin-8 in human gingival tissues.
Oral Microbiol Immunol. 1995 Oct;10(5):297-303.
144. Rink L, Kirchner H. Recent progress in the tumor necrosis factor-alpha field. Int Arch
Allergy Immunol. 1996 Nov;111(3):199-209.
145. Offenbacher S, Odle BM, Van Dyke TE. The use of crevicular fluid prostaglandin E2
levels as a predictor of periodontal attachment loss. J Periodontal Res. 1986 Mar;21(2):101-
12.
146. Anderson NL, Anderson NG. Proteome and proteomics: new technologies, new
concepts, and new words. Electrophoresis. 1998 Aug;19(11):1853-61.
147. Silva JC, Denny R, Dorschel CA, Gorenstein M, Kass IJ, Li GZ, et al. Quantitative
proteomic analysis by accurate mass retention time pairs. Anal Chem. 2005 Apr
1;77(7):2187-200.
148. Loo JA, Yan W, Ramachandran P, Wong DT. Comparative human salivary and
plasma proteomes. J Dent Res. 2010 Oct;89(10):1016-23.
149. Good DM, Thongboonkerd V, Novak J, Bascands JL, Schanstra JP, Coon JJ, et al.
Body fluid proteomics for biomarker discovery: lessons from the past hold the key to success
in the future. J Proteome Res. 2007 Dec;6(12):4549-55.
150. Hu S, Loo JA, Wong DT. Human saliva proteome analysis and disease biomarker
discovery. Expert Rev Proteomics. 2007 Aug;4(4):531-8.
151. McCulloch CA. Proteomics for the periodontium: current strategies and future
promise. Periodontol 2000. 2006;40:173-83.
152. Righetti PG, Castagna A, Antonioli P, Boschetti E. Prefractionation techniques in
proteome analysis: the mining tools of the third millennium. Electrophoresis. 2005
Jan;26(2):297-319.
153. Macarthur DJ, Jacques NA. Proteome analysis of oral pathogens. J Dent Res. 2003
Nov;82(11):870-6.
154. Len AC, Cordwell SJ, Harty DW, Jacques NA. Cellular and extracellular proteome
analysis of Streptococcus mutans grown in a chemostat. Proteomics. 2003 May;3(5):627-46.
Ana Badovinac, Disertacija
98
155. Veith PD, Talbo GH, Slakeski N, Reynolds EC. Identification of a novel
heterodimeric outer membrane protein of Porphyromonas gingivalis by two-dimensional gel
electrophoresis and peptide mass fingerprinting. Eur J Biochem. 2001 Sep;268(17):4748-57.
156. Boraldi F, Bini L, Liberatori S, Armini A, Pallini V, Tiozzo R, et al. Normal human
dermal fibroblasts: proteomic analysis of cell layer and culture medium. Electrophoresis. 2003
Apr;24(7-8):1292-310.
157. Conrads KA, Yu LR, Lucas DA, Zhou M, Chan KC, Simpson KA, et al. Quantitative
proteomic analysis of inorganic phosphate-induced murine MC3T3-E1 osteoblast cells.
Electrophoresis. 2004 May;25(9):1342-52.
158. Chang EJ, Kwak HB, Kim H, Park JC, Lee ZH, Kim HH. Elucidation of CPX-1
involvement in RANKL-induced osteoclastogenesis by a proteomics approach. FEBS Lett.
2004 Apr 23;564(1-2):166-70.
159. Bozic D, Grgurevic L, Erjavec I, Brkljacic J, Orlic I, Razdorov G, et al. The proteome
and gene expression profile of cementoblastic cells treated by bone morphogenetic protein-7
in vitro. J Clin Periodontol. 2012 Jan;39(1):80-90.
160. Vitorino R, de Morais Guedes S, Ferreira R, Lobo MJ, Duarte J, Ferrer-Correia AJ, et
al. Two-dimensional electrophoresis study of in vitro pellicle formation and dental caries
susceptibility. Eur J Oral Sci. 2006 Apr;114(2):147-53.
161. Hu S, Yu T, Xie Y, Yang Y, Li Y, Zhou X, et al. Discovery of oral fluid biomarkers
for human oral cancer by mass spectrometry. Cancer Genomics Proteomics. 2007 Mar-
Apr;4(2):55-64.
162. Peluso G, De Santis M, Inzitari R, Fanali C, Cabras T, Messana I, et al. Proteomic
study of salivary peptides and proteins in patients with Sjogren's syndrome before and after
pilocarpine treatment. Arthritis Rheum. 2007 Jul;56(7):2216-22.
163. Grant MM. What do 'omic technologies have to offer periodontal clinical practice in
the future? J Periodontal Res. 2012 Feb;47(1):2-14.
164. Ngo LH, Veith PD, Chen YY, Chen D, Darby IB, Reynolds EC. Mass spectrometric
analyses of peptides and proteins in human gingival crevicular fluid. J Proteome Res. 2010
Apr 5;9(4):1683-93.
165. Bostanci N, Heywood W, Mills K, Parkar M, Nibali L, Donos N. Application of label-
free absolute quantitative proteomics in human gingival crevicular fluid by LC/MS E
(gingival exudatome). J Proteome Res. 2010 May 7;9(5):2191-9.
Ana Badovinac, Disertacija
99
166. Haigh BJ, Stewart KW, Whelan JR, Barnett MP, Smolenski GA, Wheeler TT.
Alterations in the salivary proteome associated with periodontitis. J Clin Periodontol. 2010
Mar;37(3):241-7.
167. Grant MM, Creese AJ, Barr G, Ling MR, Scott AE, Matthews JB, et al. Proteomic
analysis of a noninvasive human model of acute inflammation and its resolution: the twenty-
one day gingivitis model. J Proteome Res. 2010 Sep 3;9(9):4732-44.
168. Bostanci N, Ramberg P, Wahlander A, Grossman J, Jonsson D, Barnes VM, et al.
Label-Free Quantitative Proteomics Reveals Differentially Regulated Proteins in
Experimental Gingivitis. J Proteome Res. 2013 Jan 4.
169. Aitken A, Learmonth MP. Protein Determination by UV Absorption. In: Walker JM,
editor. The Protein Protocols Handbook. 2nd ed: Humana Press; 2002. p. 3-6.
170. Shevchenko A, Tomas H, Havlis J, Olsen JV, Mann M. In-gel digestion for mass
spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 2006;1(6):2856-60.
171. Rappsilber J, Mann M, Ishihama Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-
fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc.
2007;2(8):1896-906.
172. Gatlin CL, Kleemann GR, Hays LG, Link AJ, Yates JR, 3rd. Protein identification at
the low femtomole level from silver-stained gels using a new fritless electrospray interface for
liquid chromatography-microspray and nanospray mass spectrometry. Anal Biochem. 1998
Oct 1;263(1):93-101.
173. Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized
p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008
Dec;26(12):1367-72.
174. Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large
gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 2009;4(1):44-57.
175. Brown LJ, Loe H. Prevalence, extent, severity and progression of periodontal disease.
Periodontol 2000. 1993 Jun;2:57-71.
176. Eke PI, Dye BA, Wei L, Thornton-Evans GO, Genco RJ. Prevalence of periodontitis
in adults in the United States: 2009 and 2010. J Dent Res. 2012 Oct;91(10):914-20.
177. Loos BG, Tjoa S. Host-derived diagnostic markers for periodontitis: do they exist in
gingival crevice fluid? Periodontol 2000. 2005;39:53-72.
178. Champagne CM, Buchanan W, Reddy MS, Preisser JS, Beck JD, Offenbacher S.
Potential for gingival crevice fluid measures as predictors of risk for periodontal diseases.
Periodontol 2000. 2003;31:167-80.
Ana Badovinac, Disertacija
100
179. Uitto VJ, Overall CM, McCulloch C. Proteolytic host cell enzymes in gingival crevice
fluid. Periodontol 2000. 2003;31:77-104.
180. Lamster IB, Ahlo JK. Analysis of gingival crevicular fluid as applied to the diagnosis
of oral and systemic diseases. Ann N Y Acad Sci. 2007 Mar;1098:216-29.
181. Buduneli N, Kinane DF. Host-derived diagnostic markers related to soft tissue
destruction and bone degradation in periodontitis. J Clin Periodontol. 2011 Mar;38 Suppl
11:85-105.
182. Lundy FT, Orr DF, Shaw C, Lamey PJ, Linden GJ. Detection of individual human
neutrophil alpha-defensins (human neutrophil peptides 1, 2 and 3) in unfractionated gingival
crevicular fluid--a MALDI-MS approach. Mol Immunol. 2005 Mar;42(5):575-9.
183. Dommisch H, Acil Y, Dunsche A, Winter J, Jepsen S. Differential gene expression of
human beta-defensins (hBD-1, -2, -3) in inflammatory gingival diseases. Oral Microbiol
Immunol. 2005 Jun;20(3):186-90.
184. Baliban RC, Sakellari D, Li Z, Guzman YA, Garcia BA, Floudas CA. Discovery of
biomarker combinations that predict periodontal health or disease with high accuracy from
GCF samples based on high-throughput proteomic analysis and mixed-integer linear
optimization. J Clin Periodontol. 2013 Feb;40(2):131-9.
185. Carneiro LG, Venuleo C, Oppenheim FG, Salih E. Proteome data set of human
gingival crevicular fluid from healthy periodontium sites by multidimensional protein
separation and mass spectrometry. J Periodontal Res. 2012 Apr;47(2):248-62.
186. Wu Y, Shu R, Luo LJ, Ge LH, Xie YF. Initial comparison of proteomic profiles of
whole unstimulated saliva obtained from generalized aggressive periodontitis patients and
healthy control subjects. J Periodontal Res. 2009 Oct;44(5):636-44.
187. Jeimy SB, Tasneem S, Cramer EM, Hayward CP. Multimerin 1. Platelets. 2008
Mar;19(2):83-95.
188. Choi YJ, Heo SH, Lee JM, Cho JY. Identification of azurocidin as a potential
periodontitis biomarker by a proteomic analysis of gingival crevicular fluid. Proteome Sci.
2011;9:42.
189. Marenholz I, Heizmann CW, Fritz G. S100 proteins in mouse and man: from evolution
to function and pathology (including an update of the nomenclature). Biochem Biophys Res
Commun. 2004 Oct 1;322(4):1111-22.
190. Gebhardt C, Nemeth J, Angel P, Hess J. S100A8 and S100A9 in inflammation and
cancer. Biochem Pharmacol. 2006 Nov 30;72(11):1622-31.
Ana Badovinac, Disertacija
101
191. Yui S, Nakatani Y, Mikami M. Calprotectin (S100A8/S100A9), an inflammatory
protein complex from neutrophils with a broad apoptosis-inducing activity. Biol Pharm Bull.
2003 Jun;26(6):753-60.
192. Balluff B, Rauser S, Meding S, Elsner M, Schone C, Feuchtinger A, et al. MALDI
imaging identifies prognostic seven-protein signature of novel tissue markers in intestinal-
type gastric cancer. Am J Pathol. 2011 Dec;179(6):2720-9.
193. Nipp M, Elsner M, Balluff B, Meding S, Sarioglu H, Ueffing M, et al. S100-A10,
thioredoxin, and S100-A6 as biomarkers of papillary thyroid carcinoma with lymph node
metastasis identified by MALDI imaging. J Mol Med (Berl). 2012 Feb;90(2):163-74.
194. Calvo FQ, Fillet M, de Seny D, Meuwis MA, Maree R, Crahay C, et al. Biomarker
discovery in asthma-related inflammation and remodeling. Proteomics. 2009 Apr;9(8):2163-
70.
195. Borghese F, Clanchy FI. CD74: an emerging opportunity as a therapeutic target in
cancer and autoimmune disease. Expert Opin Ther Targets. 2011 Mar;15(3):237-51.
196. Shan ZX, Lin QX, Deng CY, Tan HH, Kuang SJ, Xiao DZ, et al. [Identification of the
interactions between the truncated fragments of macrophage migration inhibitory factor and
CD74 using a yeast two-hybrid system]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009
Dec;29(12):2383-6, 90.
197. Lue H, Kleemann R, Calandra T, Roger T, Bernhagen J. Macrophage migration
inhibitory factor (MIF): mechanisms of action and role in disease. Microbes Infect. 2002
Apr;4(4):449-60.
198. Lin X, Sakuragi T, Metz CN, Ojamaa K, Skopicki HA, Wang P, et al. Macrophage
migration inhibitory factor within the alveolar spaces induces changes in the heart during late
experimental sepsis. Shock. 2005 Dec;24(6):556-63.
199. Morimoto T, Nishihira J, Kohgo T. Immunohistochemical localization of macrophage
migration inhibitory factor (MIF) in human gingival tissue and its pathophysiological
functions. Histochem Cell Biol. 2003 Oct;120(4):293-8.
200. Li X, Lan HY, Huang XR, Zhang C, Jin LJ. Expression profile of macrophage
migration-inhibitory factor in human gingiva and reconstituted human gingival epithelia
stimulated by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. J Periodontal Res. 2013 Jan 9.
201. Autieri MV, Carbone CJ. 14-3-3Gamma interacts with and is phosphorylated by
multiple protein kinase C isoforms in PDGF-stimulated human vascular smooth muscle cells.
DNA Cell Biol. 1999 Jul;18(7):555-64.
Ana Badovinac, Disertacija
102
202. Baliban RC, Sakellari D, Li Z, DiMaggio PA, Garcia BA, Floudas CA. Novel protein
identification methods for biomarker discovery via a proteomic analysis of periodontally
healthy and diseased gingival crevicular fluid samples. J Clin Periodontol. 2012
Mar;39(3):203-12.
203. Perretti M, D'Acquisto F. Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the
resolution of inflammation. Nat Rev Immunol. 2009 Jan;9(1):62-70.
204. Yang Y, Hutchinson P, Morand EF. Inhibitory effect of annexin I on synovial
inflammation in rat adjuvant arthritis. Arthritis Rheum. 1999 Jul;42(7):1538-44.
205. Damazo AS, Yona S, D'Acquisto F, Flower RJ, Oliani SM, Perretti M. Critical
protective role for annexin 1 gene expression in the endotoxemic murine microcirculation.
Am J Pathol. 2005 Jun;166(6):1607-17.
206. Linder A, Soehnlein O, Akesson P. Roles of heparin-binding protein in bacterial
infections. J Innate Immun. 2010;2(5):431-8.
207. Soehnlein O, Lindbom L. Neutrophil-derived azurocidin alarms the immune system. J
Leukoc Biol. 2009 Mar;85(3):344-51.
208. Burrus GR, Briggs JA, Briggs RC. Characterization of the human myeloid cell nuclear
differentiation antigen: relationship to interferon-inducible proteins. J Cell Biochem. 1992
Feb;48(2):190-202.
209. Briggs R, Dworkin L, Briggs J, Dessypris E, Stein J, Stein G, et al. Interferon alpha
selectively affects expression of the human myeloid cell nuclear differentiation antigen in late
stage cells in the monocytic but not the granulocytic lineage. J Cell Biochem. 1994
Feb;54(2):198-206.
210. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature.
2003 May 15;423(6937):337-42.
211. Bartold PM, Cantley MD, Haynes DR. Mechanisms and control of pathologic bone
loss in periodontitis. Periodontol 2000. 2010 Jun;53:55-69.
212. Tsuchida S, Satoh M, Umemura H, Sogawa K, Kawashima Y, Kado S, et al.
Proteomic analysis of gingival crevicular fluid for discovery of novel periodontal disease
markers. Proteomics. 2012 Jul;12(13):2190-202.
213. Kallio KA, Hyvarinen K, Kovanen PT, Jauhiainen M, Pussinen PJ. Very low density
lipoproteins derived from periodontitis patients facilitate macrophage activation via
lipopolysaccharide function. Metabolism. 2012 Dec 3.
214. Lewis M. PRELP, collagen, and a theory of Hutchinson-Gilford progeria. Ageing Res
Rev. 2003 Jan;2(1):95-105.
Ana Badovinac, Disertacija
103
215. Reynolds JJ, Meikle MC. Mechanisms of connective tissue matrix destruction in
periodontitis. Periodontol 2000. 1997 Jun;14:144-57.
216. Hamajima S, Hiratsuka K, Kiyama-Kishikawa M, Tagawa T, Kawahara M, Ohta M, et
al. Effect of low-level laser irradiation on osteoglycin gene expression in osteoblasts. Lasers
Med Sci. 2003;18(2):78-82.
217. Haglund L, Bernier SM, Onnerfjord P, Recklies AD. Proteomic analysis of the LPS-
induced stress response in rat chondrocytes reveals induction of innate immune response
components in articular cartilage. Matrix Biol. 2008 Mar;27(2):107-18.
218. Ge G, Seo NS, Liang X, Hopkins DR, Hook M, Greenspan DS. Bone morphogenetic
protein-1/tolloid-related metalloproteinases process osteoglycin and enhance its ability to
regulate collagen fibrillogenesis. J Biol Chem. 2004 Oct 1;279(40):41626-33.
219. Fukui Y, Hashimoto O, Sanui T, Oono T, Koga H, Abe M, et al. Haematopoietic cell-
specific CDM family protein DOCK2 is essential for lymphocyte migration. Nature. 2001
Aug 23;412(6849):826-31.
220. Margraf S, Logters T, Reipen J, Altrichter J, Scholz M, Windolf J. Neutrophil-derived
circulating free DNA (cf-DNA/NETs): a potential prognostic marker for posttraumatic
development of inflammatory second hit and sepsis. Shock. 2008 Oct;30(4):352-8.
221. Veenstra TD. Where are all the biomarkers? Expert Rev Proteomics. 2011
Dec;8(6):681-3.
222. Lubec G, Afjehi-Sadat L. Limitations and pitfalls in protein identification by mass
spectrometry. Chem Rev. 2007 Aug;107(8):3568-84.
Ana Badovinac, Disertacija
104
8. ŽIVOTOPIS
Ana Badovinac, Disertacija
105
Ana Badovinac rođena je 13. listopada 1982. u Zagrebu gdje je završila osnovnu školu Ivana
Gorana Kovačića 1997., te V. gimnaziju 2001. Godine 2001. upisuje Stomatološki fakultet
Sveučilišta u Zagrebu. Diplomski rad izradila je na Zavodu za parodontologiju te ga obranila
2007. Jednogodišnji pripravnički staž odradila je u Stomatološkoj poliklinici Zagreb. Državni
ispit položila je 2009.
U travnju 2009. počinje raditi na Zavodu za parodontologiju Stomatološkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu. Iste godine upisuje poslijediplomski doktorski studij. 2010. počinje
specijalizaciju iz parodontologije te upisuje poslijediplomski specijalistički studij Dentalne
medicine. Autorica je i koautorica nekoliko znanstvenih i stručnih radova. Aktivno je
sudjelovala na međunarodnim i domaćim znanstvenim skupovima i kongresima. Služi se
engleskim i talijanskim jezikom. Majka je jednog djeteta.
Popis objavljenih radova
1. Badovinac A, Razdorov G, Grgurević L, Puhar I, Plančak D, Božić D. The application of
LC-MS/MS technology for proteomic analysis of gingival tissue: a pilot study. Acta Stomatol
Croat. 2013;47(1):10-20.
2. Badovinac A, Božić D, Vučinac I, Vešligaj J, Vražić D, Plančak D. Oral health attitudes
and behavior of dental students at the University of Zagreb, Croatia. J Dent Educ.
2013;77(9):1171-8.
Kongresna priopćenja
1. Badovinac A, Božić D, Vešligaj J, Vučinac I, Vražić D, Plančak D. Preclinical and clinical
differences in oral health attitudes and behaviour of dental students in Zagreb, Croatia. J Clin
Periodontol. 2012;39 Suppl 13:152.
2. Bradvica I, Badovinac A, Brailo V, Vučičević-Boras V, Božić D, Puhar I, Andabak-Rogulj
A, Ladika-Davidović B. Salivary interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in patients
with chronic and aggressive periodontitis. J Clin Periodontol. 2012;39 Suppl 13:97.
Ana Badovinac, Disertacija
106
3. Božić D, Badovinac A, Puhar I, Vražić D, Plančak D. Horizontal ridge augmentation
utilizing platelet derived growth factor (rhPDGF-BB) and demineralized bovine bone graft
without the use of membranes. J Clin Periodontol. 2012;39 Suppl 13:217.
4. Vražić D, Čimić S, Kraljević-Šimunković S, Puhar I, Božić D, Badovinac A, Plančak D.
Impact of occlusal scheme on gingival recession – a pilot study. J Clin Periodontol. 2012;39
Suppl 13:154.
5. Paliska J, Par M, Kovačević A, Sabalić M, Badovinac A, Plančak D. Oral hygiene practice
in Croatian intensive care units. J Clin Periodontol. 2012;39 Suppl 13:160.
6. Lončar S, Puhar I, Štrkalj-Ivezić S, Srdjak S, Vražić D, Badovinac A, Božić D. Periodontal
status in patient with posttraumatic stress disorder. J Clin Periodontol. 2012;39 Suppl 13:281-
2.
7. Puhar I, Lovrenčić-Huzjan A, Šodec-Šimičević D, Strineka M, Badovinac A, Vražić D,
Božić D, Illeš D, Plančak D, Demarin V. Arterial elastic properties in chronic periodontitis
patients. J Clin Periodontol. 2012;39 Suppl 13:68-9.
8. Badovinac A, Božić D, Vražić D, Puhar I, Plančak D. Self-Reported Oral Hygiene Habits
of Patients Referred to the Periodontist. J Dent Res. 2011;90 Spec Iss A:2714.
9. Božić D, Vražić D, Puhar I, Badovinac A, Plančak D. Hydrogel Containing Type-I
Collagen and VEGF in Treating Intrabony Defects. J Dent Res. 2011;90 Spec Iss A:2842.
10. Božić D, Badovinac A, Vražić D, Puhar I, Plančak D. Augmentacija bezubog grebena
pomoću trombocitnog faktora rasta (rhPDGF-bb) i goveđe demineralizirane kosti. Acta
Stomatol Croat. 2011;45(2):149.
11. Božić D, Vražić D, Badovinac A, Puhar I, Plančak D. Terapija intrakoštanog defekta s
humanim trombocitnim čimbenikom rasta i beta trikalcijevim fosfatom. Acta Stomatol Croat.
2011;45(2):147.
12. Badovinac A, Vražić D, Puhar I, Božić D, Plančak D. Use of antiseptic mouthwashes in
patients reffered to the periodontist. Periodicum Biol. 2010;112 Suppl 1:111.
13. Brailo V, Badovinac A, Vučićević-Boras V, Božić D, Vidović Juras D, Andabak A, Cigić
L, Lukač J. Salivary cytokines as possible biomarkers of periodontal disease. Oral Dis. 2010;
16(6):528.
Ana Badovinac, Disertacija
107
14. Puhar I, Badovinac A, Vražić D, Plančak D. Protetski aspekti biološke širine. Acta
Stomatol Croat. 2009;43(4):355.