METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2 ...repository.unair.ac.id/25669/15/15. BAB 3.pdf · METODE PENELITIAN . 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian . Penelitian ini dilakukan

37

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen

Biologi FST Universitas Airlangga pada bulan Maret sampai dengan bulan Juli

2012.

3.2 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris yang

menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga kali ulangan. Penelitian terdiri

dari sembilan perlakuan, yaitu (A, T, B, Ea, Eb, Ec, BEa, BEb, BEc) dengan

rincian perlakuan (A) akuades, (T) surfaktan sintetis Tween-20 sebagai kontrol,

(B) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1), variasi konsentrasi enzim yang

digunakan adalah crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 yang selanjutnya

diberi kode (Ea, Eb, Ec) dengan masing-masing konsentrasi 1 mL (12,5 % (v/v)),

2 mL (25 % (v/v)), 3 mL (37,5 % (v/v)), serta campuran biosurfaktan

Acinetobacter sp. P2(1) dengan crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61

(BEa, BEb, BEc).

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Pengaruh Variasi Konsentrasi Crude Enzyme Lipase Micrococcus sp. L II 61 dan Biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) terhadap Kelarutan Oil Sludge

Intan Ayu Pratiwi

38

Rincian perlakuannya adalah sebagai berikut:

Tabel 3.1Kombinasi perlakuan penelitian

Kode

perlakuan

Oil

sludge

Biosurfaktan

Acinetobacter sp.

P2(1)[=CMC]

Surfaktan sintetis

Tween-20

[=CMC]

Jenis crude enzyme

Lipase

Ea Eb Ec

A + - - - - -

T

(kontrol) + - + - - -

B + + - - - -

Ea + - - + - -

Eb + - - - + -

Ec + - - - - +

Bea + + - + - -

BEb + + - - + -

BEc + + - - - +

Keterangan: (-) tidak ditambahkan

(+) ditambahkan

3.3 Variabel Penelitian

Variabel penelitian meliputi:

(1) variabel bebas : konsentrasi crude enzyme (ekstrak kasar) lipase

Micrococcus sp. L II 61 1 mL (12,5 % (v/v)), 2 mL (25

% (v/v)), 3 mL (37,5 % (v/v))

(2) variabel terikat : persentase kelarutan oil sludge (%).

(3) variabel kendali: volume oil sludge perlakuan (0,20 mL), media, pH

media, kecepatan agitasi (rpm), volume biosurfaktan

Acinetobacter sp. P2(1) (3 mL) dan lama waktu agitasi

(menit).

3.4 Bahan dan Alat Penelitian

3.4.1 Isolat bakteri penelitian

Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Micrococcus sp. L II 61 yang diisolasi oleh Fatimah dan Nurhariyati (2011)



Intan Ayu Pratiwi

39

sebagai sumber penghasil enzim lipase dan Acinetobacter sp. P2(1) yang diisolasi

oleh Ni’matuzahroh dkk. (2009) untuk memproduksi biosurfaktan adalah dari

koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan

Teknologi, Universitas Airlangga.

3.4.2 Bahan penelitian

a. Media pertumbuhan bakteri penghasil biosurfaktan dan crude enzyme

Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), air mineral sintetis (AMS)

komposisi dari Pruthi and Cameotra (1997), akuades, minyak goreng

dan molase 4%.

b. Bahan kimia

(NH4)2 SO4, MgSO4. 7H2O, NaCl, CaCl2, MnSO4. H2O, H3BO3, ZnSO4.

7H2O, CuSO4. 5H2O, CoCl2. 6H2O, dan Na2MoO4. 2H2O, NaOH 10%,

HCl 5%, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4.7H2O, alkohol, dan Tween-20.

c. Bahan uji kelarutan oil sludge

Oil sludge, aluminium foil, cling wrap, kapas, kertas koran, kertas

saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm, label, dan spiritus.

3.4.3 Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave Ogawa

Seiki, bak plastik, botol kultur, botol fial, cawan Petri, Erlenmeyer, gelas ukur,

gelas Beaker, Finn pipet, jarum ose loop, kompor listrik, kuvet, Laminar Air Flow

(LAF), lemari es, mikropipet, magnetic stirrer MG-78-1, neraca analitik

Shimadzu AEL-200, oven, indikator pH fix 1-14 Macherey-Nagel, pinset, pipet

volume, bunsen, rak tabung reaksi, sentrifuge Beckman, shaker incubator, spatula



Intan Ayu Pratiwi

40

besi, spatula kaca, spektrofotometer (spectronic 20 Bausch-Lomb), tabung reaksi,

tensiometer Du-Nouy, tip mikropipet, vortex dan waterbath.

3.5 Prosedur Penelitian

3.5.1 Pembuatan media untuk bakteri

Sebanyak 2,8 gram NA dilarutkan ke dalam 100 mL akuades dan

dipanaskan pada hot plate hingga mendidih. Kemudian media dituang ke dalam

20 tabung reaksi dimana masing-masing tabung diisi 5 mL NA sebagai stock NA

miring. Tabung reaksi yang berisi NA selanjutnya disumbat dengan kapas dan

ditutup dengan aluminium foil. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf

pada suhu 121º C, 1 atm, selama 20 menit. Tabung reaksi berisi NA yang telah

disterilisasi selanjutnya dimiringkan dan didiamkan sampai media memadat

(Renjana, 2011).

3.5.2 Pembuatan media air mineral sintesis

Air Mineral Sintetis (AMS) yang digunakan merupakan komposisi dari

Pruthi and Cameotra (1997). Media AMS dibuat dengan cara melarutkan bahan

(NH4)2 SO4 (3 g), MgSO4. 7H2O (0,2 g), NaCl (10 g), CaCl2 (0,01 g), MnSO4. H2O

(0,001 g), H3BO3 (0,001 g), ZnSO4. 7H2O (0,001 g), CuSO4. 5H2O (0,001 g),

CoCl2. 6H2O (0,005 g), dan Na2MoO4. 2H2O (0,001 g) ke dalam 1000 mL akuades.

Larutan tersebut dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik dan pH larutan

dinetralkan dengan penambahan NaOH 10% atau HCl 5%. Kemudian disterilkan

yang disebut sebagai larutan makro nutrien dan ditambah larutan mikro nutrien

stok KH2PO4 (1 g) dan K2HPO4 (1 g) dalam 50 mL akuades beserta stok

FeSO4.7H2O (1 g) dalam 50 mL akuades setelah disterilkan secara terpisah.



Intan Ayu Pratiwi

41

3.5.3 Pembuatan stok bakteri

Biakan murni Micrococcus sp. L II 61 dan Acinetobacter sp. P2(1)

diperbanyak dalam media Nutrient Agar (NA) miring yang telah disiapkan untuk

stok. Bakteri ditanam dengan metode gores (streak). Biakan bakteri diinkubasi

selama 24 jam pada suhu ruang (27-30oC). Koloni yang tumbuh baik digunakan

sebagai stok bakteri selama penelitian.

Gambar 9. Teknik peremajaan mikroba dengan metode streak (gores) pada

tabung agar miring (Tortora et al., 2010)

3.5.4 Perbanyakan bakteri dalam Nutrient Broth

Media Nutrient Broth (NB) yang dibuat dengan cara melarutkan NB (13

g/L) dalam akuades kemudian disterilkan dengan autoclave. Masing-masing dua

ose biakan bakteri Micrococcus sp. L II 61 dan Acinetobacter sp. P2(1) dari media

agar miring diinokulasikan ke dalam botol 250 mL yang berisi 50 mL media NB.

Kultur bakteri dalam Nutrient Broth diinkubasi pada shaker incubator selama 24

jam pada suhu 27-30oC, selanjutnya kultur dapat dijadikan stock penelitian

(Renjana, 2011).



Intan Ayu Pratiwi

42

3.5.5 Produksi biosurfaktan

Botol kultur ukuran 500 mL diisi dengan 86,4 mL campuran Air Mineral

Sintetis (AMS) dan 4% substrat molase (v/v), pH 7. Media disterilkan dengan

autoclave. Kemudian ditambahkan 4,8 mL stok KH2PO4 dan K2HPO4, 4,8 mL

stok FeSO4. 7H2O dan 4% starter bakteri Acinetobacter sp. P2(1) (4 mL) yang

memiliki nilai OD= 0,5 pada λ= 650 nm sehingga total volume larutan adalah 60

mL. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm

selama 3 hari (Suciastuti, 2011).

3.5.6 Karakterisasi biosurfaktan

Kultur bakteri yang telah diinkubasi selama 3 hari ditanam dengan metode

streak (gores) pada cawan Petri berisi media Nutrient Agar untuk mengetahui ada-

tidaknya kontaminasi dari mikroba lain. Lalu, sel bakteri dipisahkan dari medium

yang mengandung biosurfaktan dengan sentrifugasi (9000 rpm, 4oC, 15 menit).

Supernatan hasil sentrifugasi dipisahkan dari peletnya dan dikarakterisasi dengan

mengukur tegangan permukaan serta aktivitas emulsifikasi supernatan kultur

menggunakan solar.

Pengukuran tegangan permukaan (TP) (mN/m) supernatan kultur bakteri

dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy seperti yang ditunjukkan pada

gambar 10. Sebanyak 10 mL supernatan dari kultur bakteri Acinetobacter sp.

P2(1) dimasukkan ke dalam cawan Petri yang bersih dan bebas lemak. Mula-mula

cawan Petri ditempatkan pada meja sampel yang datar, cincin digantungkan pada

pengait yang terdapat pada alat tersebut dan skala diatur pada angka 0. Kemudian,

cawan Petri berisi sampel dinaikkan perlahan-lahan dengan cara memutar alat



Intan Ayu Pratiwi

43

pengatur dibagian bawah alat hingga cincin dapat tercelup tepat pada permukaan

cairan sampel. Setelah itu, alat pengatur yang ada disisi lain digerakkan hingga

cincin terlepas dari sampel.

Nilai tegangan permukaan yang didapat adalah nilai skala pada saat cincin

terlepas dari sampel (Ni’matuzahroh dkk., 2009). Nilai tegangan permukaan

sampel dihitung menggunakan rumus. Akuades dan molase digunakan sebagai

kontrol, dinyatakan dalam dyne/cm dan dilaporkan sebagai hasil rata-rata dari 3

ulangan, dengan menggunakan rumus:

r = ro x

Dimana:

r = tegangan permukaan sampel

ro = tegangan permukaan akuades pada to C

= tegangan permukaan sampel yang terbaca pada alat

o = tegangan permukaan akuades yang terbaca pada alat

Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri

tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan.

Sedangkan aktivitas emulsifikasi diukur dengan menggunakan metode

Suryatmana dkk. (2006). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 mL supernatan

ditambah dengan 1 mL solar. Setelah divortex selama 2 menit, diamati aktivitas

emulsifikasi (AE) (%) setelah 1 jam dan 24 jam diamati dengan mengukur tinggi

fase emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi and

Cameotra, 1997).

% Emulsifikasi =

100% X cairan totaltinggi

emulsi tinggi



Intan Ayu Pratiwi

44

Gambar 10. Tensiometer du-Nouy (Muna, 2011)

3.5.7 Produksi crude enzyme lipase

Media produksi crude enzyme lipase yang digunakan adalah media

Nutrient Broth (13 g/L) yang ditambahkan dengan substrat minyak goreng

sebanyak 2% (v/v). Sebanyak 100 mL media dimasukkan ke dalam masing-

masing botol kultur ukuran 500 mL dan disterilisasi pada suhu 121o

C selama 15

menit (Suciastuti, 2011).

Sebanyak 5% (v/v) kultur Micrococcus sp. L II 61 dalam Nutrient Broth

dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ650 nm diinokulasikan ke dalam masing-masing

botol kultur berukuran 500 mL yang telah berisi media produksi dengan volume

100 mL. Inkubasi dilakukan dalam shaker pada suhu ruang dengan agitasi 120

rpm selama 16 jam. Supernatan crude enzyme diperoleh dengan cara kultur

disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm dalam suhu 4°C selama 15 menit.

Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude enzyme

(ekstrak kasar enzim). Crude enzyme lipase tersebut diuji aktivitas lipolitik secara

kuantitatif, selain itu juga dilakukan pengukuran nilai tegangan permukaan



Intan Ayu Pratiwi

45

(mN/m) serta aktivitas emulsifikasi (%) pada solar setelah 1 dan 24 jam (Pruthi

and Cameotra, 1997).

3.5.8 Pengukuran aktivitas lipolitik crude enzyme lipase

Pengukuran tegangan permukaan (TP) (mN/m) crude enzyme lipase

Micrococcus sp. L II 61 dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy.

Sedangkan, nilai aktivitas emulsi setelah 1 jam dan 24 jam pada solar diamati

dengan mengukur tinggi fase emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali

100% (Pruthi and Cameotra, 1997).

3.5.9 Persiapan oil sludge dalam tabung reaksi untuk perlakuan

Oil sludge dipipet sebanyak 0,20 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi

yang ditambahkan 7,80 mL larutan uji sehingga konsentrasi oil sludge dalam

larutan uji sebesar 2,5% (v/v). Berat oil sludge ditimbang menggunakan

timbangan analitik dan dicatat sebagai Wop.

3.5.10 Perlakuan

Penelitian ini termasuk ke dalam penelitian eksperimental yang terdiri atas

1 kontrol dan 8 perlakuan dengan rincian sebagai berikut :

Perlakuan 1 (A), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL akuades.

Kontrol (T), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL surfaktan sintetis Tween-20

pada konsentrasi sama dengan CMC.

Perlakuan 2 (B), yaitu 0,20 mL oil sludge + 7,80 mL biosurfaktan

Acinetobacter sp. P2(1)

Perlakuan 3 (Ea), yaitu 0,20 mL oil sludge + 1 mL crude enzyme lipase

Micrococcus sp. L II 61 + 6,80 mL akuades.



Intan Ayu Pratiwi

46

Perlakuan 4 (Eb), yaitu 0,20 mL oil sludge + 2 mL crude enzyme lipase


Perlakuan 5 (Ec), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL crude enzyme lipase


Perlakuan 6 (BEa), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan

Acinetobacter sp. P2(1) + 1 mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61

+ 3,80 mL akuades.

Perlakuan 7 (BEb), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan


+ 2,80 mL akuades.

Perlakuan 8 (BEc), yaitu 0,20 mL oil sludge + 3 mL biosurfaktan


+ 1,80 mL akuades.

Kontrol perlakuan dalam penelitian ini menggunakan surfaktan sintetis Tween-20

yang merupakan surfaktan tandingan dari biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1).

Volume total tiap perlakuan adalah 8 mL sehingga masing-masing penambahan 1

mL crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 setara dengan 12,5% (v/v), 2 mL

25% (v/v), 3 mL 37,5% (v/v) dan pada perlakuan penambahan biosurfaktan

Acinetobacter sp. P2(1) sebesar 37,5% (v/v).



Intan Ayu Pratiwi

47

3.5.11 Uji kelarutan oil sludge

Seluruh kelompok kontrol dan perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3

ulangan, divortex pada suhu ruang (27—30oC) selama 15 menit. Oil sludge yang

terlarut (dalam fase cair) lalu, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm

selama 15 menit pada suhu 4°C sebanyak 5 mL. Kemudian supernatan didiamkan

selama 15 menit sebelum difiltrasi. Pada perlakuan tanpa sentrifugasi, setelah

divortex perlakuan didiamkan selama 15 menit kemudian difiltrasi. Kelarutan oil

sludge diketahui dengan cara melakukan filtrasi atau penyaringan fase cair dari

masing-masing perlakuan.

3.5.12 Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan

Kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm dan disiapkan

untuk filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan. Kertas saring yang

digunakan untuk filtrasi dibungkus dengan aluminium foil. Aluminium foil dan

kertas saring dioven dengan suhu 50—55oC selama satu hari kemudian ditimbang

dengan neraca analitik dan dicatat beratnya sebagai Wo. Sebanyak 1 mL sampel

fase cair dari hasil sentrifugasi dituang ke dalam aluminium foil dengan kertas

saring di dalamnya. Kelarutan oil sludge diukur dari oil sludge yang terpisah dan

terperangkap dikertas saring tersebut.

Kertas saring yang telah ditambahkan 1 mL sampel dikeringkan dengan

cara dioven pada suhu 51—55°C selama enam jam. Kertas saring yang telah

kering kembali ditimbang dan dicatat beratnya sebagai Wt. Berat kering

dinyatakan sebagai berat yang tidak berubah kembali setelah proses pengovenan.



Intan Ayu Pratiwi

48

Semua prosedur yang dilakukan ketika filtrasi fase cair dari kontrol dan perlakuan

ini dilakukan secara bebas lemak.

Setiap perlakuan yang dilakukan dalam uji kelarutan oil sludge, selalu

disertai dengan blanko. Blanko merupakan berat larutan Tween-20, supernatan

biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan crude enzyme Micrococcus sp. L II 61

tanpa penambahan oil sludge yang diperlakukan sama seperti perlakuan lainnya.

Berat kering blanko dari masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb.

3.5.13 Penghitungan nilai persentase kelarutan oil sludge

Nilai persentase kelarutan oil sludge dari masing- masing perlakuan dapat

dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Dimana:

Wot = berat oil sludge terlarut (g)

Wb = berat blanko perlakuan (g)

Wop = berat oil sludge perlakuan (g)

Sedangkan berat oil sludge terlarut dihitung menggunakan rumus berikut:

Dimana:

Wot = berat oil sludge terlarut (g/volume total)

Wt = berat kertas saring + oil sludge terlarut (g/mL)

Wo = berat kertas saring (g)



Intan Ayu Pratiwi

49

3.6 Analisis Data Penelitian

Data yang didapat dalam penelitian ini adalah karakteristik dari

biosurfaktan dalam supernatan kultur Acinetobacter sp. P2(1), larutan produk

kasar biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1), larutan surfaktan sintetis Tween-20

pada konsentrasi sama dengan CMC serta crude enzyme (ekstrak kasar) lipase

Micrococcus sp. L II 61, yaitu nilai tegangan permukaan (TP) (mN/m) serta

aktivitas emulsifikasi (AE) (%) terhadap solar setelah 1 jam dan 24 jam. Aktivitas

enzimatik crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61. Serta data kelarutan oil

sludge (%) oleh biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) konsentrasi sama dengan

CMC dan atau crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61.

Data perolehan produk kasar, nilai tegangan permukaan dan aktivitas

emulsifikasi dari biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) terhadap solar dianalisis

untuk mengetahui adanya produk biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1). Data

kelarutan oil sludge (%) dianalisis secara statistik, langkah pertama data diuji

berdistribusi normal dengan menggunakan uji One sample Kolmogorov-Smirnov.

Pengujian selanjutnya untuk mengetahui asumsi data memiliki varians bersifat

homogen digunakan uji Levene test. Data kelarutan oil sludge (%) berdistribusi

normal dan memiliki varians homogen, dilanjutkan dengan uji One-way Analysis

of Varians (ANOVA) (derajat signifikasi 5%) pada program Statistical Package

For Social Science (SPSS) menunjukkan beda nyata maka dilanjutkan dengan uji

Duncan karena datanya homogen yang bertujuan untuk mengetahui pasangan

kelompok perlakuan mana yang memiliki nilai kelarutan oil sludge berbeda

signifikan.



Intan Ayu Pratiwi

Documents

METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2 ...repository.unair.ac.id/25669/15/15. BAB 3.pdf · METODE PENELITIAN . 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian . Penelitian ini dilakukan