Ispitivanje metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu ... · U zavisnosti od molekulske mase oni se u atmosferi mogu zadržavati ili ne, pa tako se teški PAH-ovi adsorbuju na

Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Ispitivanje metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu organskih zagađivača

~ Master rad ~

Mentor: Student: dr Violeta Mitić Jelena Đorđević

Niš, 2014.

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u labaratorijama Departmana za

hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta u Nišu. Želim da se zahvalim svojoj mentorki, profesorki dr Violeti Mitić, vanrednom profesoru

na Departmanu za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu, na ukazanoj pomoći prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i tokom organizovanja izvođenja

eksperimentalnog rada. Takođe, zahvalila bih se i profesorki dr Vesni Stankov Jovanović na savetima i sugestijama pri pisanju rada.

Neizmernu zahvalnost dugujem i doktorantima Jeleni Cvetković, Mariji Dimitrijević, Mariji Ilić i Strahinji Simonivuću, na nesebičnoj pomoći prilikom izrade eksperimentalnog dela

ovog diplomskog rada. Srdačno se zahvaljujem i svojoj porodici i prijateljima na bezgraničnoj podršci tokom

studija i izrade masetr rada.

Sadržaj

Uvod ............................................................................................................................................................. 1 I TeorIjskI deo ......................................................................................................................................... 3

1.1. PAH – ovi ..................................................................................................................................... 4 1.1.1. Hemijske osobine PAH-ova .................................................................................................. 5 1.1.2. Uticaj PAH-ova na ljudsko zdravlje ..................................................................................... 8 1.1.3. Metabolizam PAH-ova ....................................................................................................... 10

1.2. Validacija analitičkih metoda...................................................................................................... 11 1.2.1. Specifičnost / selektivnost ................................................................................................... 11 1.2.2. Linearnost ........................................................................................................................... 12 1.2.4. Preciznost ............................................................................................................................ 13 1.2.5. Tačnost ................................................................................................................................ 14 1.2.6. Granica detekcije / kvantifikacije........................................................................................ 15 1.2.7. Robusnost ............................................................................................................................ 16

1.3. Metode pripreme uzorka ............................................................................................................. 18 1.4. Gasna hromatografija (GC) ......................................................................................................... 19 1.5. Masena spektrometrija ................................................................................................................ 20

1.5.1. Operacije unutar Triple quadrupole MS ............................................................................. 23 1.5.2. Metode snimanja masenih spektara .................................................................................... 24

1.6. Pregled literature ......................................................................................................................... 25 2.1. Aparatura ..................................................................................................................................... 28 2.2. Reagensi ...................................................................................................................................... 28 2.3. Pribor........................................................................................................................................... 28 2.4. Priprema uzoraka ........................................................................................................................ 29

2.4.1. Ultrazvučna ekstrakcija ....................................................................................................... 29 2.4.2. QuEChERS ekstrakcija ....................................................................................................... 29 2.5. Prečišćavanje uzorka ............................................................................................................... 29 2.7. Parametri metode ................................................................................................................... 30 2.8. Obrada dobijenih rezultata ...................................................................................................... 30

III rezUlTaTI I dIskUsIja .................................................................................................................... 34 3.1. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom sistemom rastvarača heksan/aceton ......................................................................................................................... 35 3.2. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom, sistemom rastvarača cikoloheksan/aceton ............................................................................................................... 40 3.3. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim QuEChERs ekstrakcijom........................ 44

Iv zakljUcak ......................................................................................................................................... 49 v reference ....................................................................................................................................... 51

1

Uvod

2

Tokom 60-tih i 70-tih godina prošlog veka, kao kontaminanti koji nastaju obradom hrane

otkriveni su policiklični aromatični ugljovodonici (PAH-ovi). Poslednjih godina vlada veliko interesovanje naučnika za ispitivanje policikličnih aromatičnih ugljovodonika koji svakodnevno utiču na zemljište, vodu, vazduh, biljke i životinje, pa i ljude. Nepoželjni su nusproizvodi u raznim prirodnim i antropogenim procesima. Nalaze se u vazduhu, u vezanom obliku i slobodni. U vodene tokove dospevaju ispuštanjem otpadnih voda, nafte i plina. U zemljištu se nalaze najveće koncentracije PAH-ova. Izvori: fosilna goriva, izduvni gasovi automobila, otpadne vode, otpadni mulj, korišćenje kompozita i đubriva, sušenjem, dimljenjem i prženjem hrane.

GC/MS (kombinacija gasna hromatografija/masena spektrometrija) je postala jedan od najmoćnijih instrumenata dostupnih hemičarima kod analize kompleksnih organskih i biohemijskih smeša. Koristi se u analizi hrane, za potrebe sudske medicine (analiza droga i drugih toksičnih jedninjenja), u oblasti toksikologije (identifikacija metabolita lekova), našla je primenu u analizi kancerogenih supstanci iz životne sredine (pesticidi, PAH-ovi)…

Validacija analitičke metode mora biti izvršena kako bi se osigurala pouzdanost i tačnost analitičkih podataka. Validacija je postupak kojim se dokazuje da metoda služi svrsi za kojoj je namenjena, pa je prvo potrebno definisati svrhu metode, zatim utvrditi postupak i izvoditi eksperiment čiji se rezultati koristie kao dokaz o validnosti metode.

Cilj ovog rada je izbor odgovarajuće metode pripreme uzoraka zemljišta koji će biti se koristiti za analizu PAH-ova. Analizirano je 16 PAH-ova čija je kvantifikacija prioritetna po preporukama US EPA (Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen, Benzo[a]piren, Benzo[b]fluoranten, Benzo[ghi]perilen, Benzo[k]fluoranten, Krizen, Dibenzo[a,h]antracen, Fluoranten, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]piren, Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften).

3

I TeorIjskI deo

4

1.1. PAH – ovi

Policiklični aromatični ugljovodonici (PAH) su organska jedinjenja koja se sastoje od dva ili više kondenzovana aromatična prstena i veoma su rasprostranjena u životnoj sredini, Nalaze se u nafti, uglju, katranu a nastaju i kao nusproizvodi sagorevanja goriva (bilo fosilnih goriva, bilo biomase) u prisustvu kiseonika. Mogu se naći i u atmosferi, geosferi, hidrosferi itd. Neki od PAH-ova su kancerogeni, mutageni i teratogeni. Nalaze se takođe i u prženoj hrani, pogotovo onoj spremljenoj na visokoj temperaturi kao i u dimljenim proizvodima. Dimljenje je jedna od najstarijih tehnologija čuvanja hrane, koja se zasniva na izlaganju mesa i proizvoda od mesa dimu koji je nastao sagorevanjem drveta. Količine PAH-ova u dimljenim namirnicama zavise od različitih parametara, kao što su sadržaj vlage drveta, temperature sagorevanja drveta i koncentracija kiseonika u komori za sagorevanje drveta (Toth i Blaas, 1972). Istraživanja o prodiranju PAH-ova u unutrašnjost dimljenog proizvoda od mesa, pokazuju da se oko 99 posto svih PAH jedinjenja nalaze u spoljašnjem delu uzorka, koji čini 22 posto ukupne mase analiziranog proizvoda kobasice (Jira i sar, 2006).

Emisija PAH-ova u atmosferu prirodnim putem uključuje i vulkanske erupcije i požare. Na urbanim i industrijskim lokalitetima, PAH-ovi se gotovo u potpunosti emituju ljudskom delatnošću i osnovni su nusprodukti nepotpunog sagorevanja organske materije. Izduvni gasovi automobila predstavljaju najznačajniji izvor emisije PAH-ova u urbanim sredinama. Dizel motori imaju količinski veće čestične emisije u odnosu na vozila sa benzinskim motorima. Pored saobraćaja, važan izvor emisije PAH je industrijska aktivnost kao što je primarna proizvodnja aluminijuma, produkcija koksa, spaljivanje otpada, proizvodnja cementa, rafinerije nafte, petrohemijska industrija, industrija bitumena i asfalta, proizvodnja guma i komercijalna termo-elektro produkcija.

U zavisnosti od molekulske mase oni se u atmosferi mogu zadržavati ili ne, pa tako se teški PAH-ovi adsorbuju na česticama prašine, dok lakši ostaju u gasovitoj fazi i kasnije se uklanjaju padavinama. PAH-ovi se vazdušnom masom mogu daleko prenositi, a njihova depozicija u kiši ili snegu je značajan izvor zagađenja površinskih voda.

Većina PAH-ova dospeva u zemljište putem padavina iz atmosfere. Drugi potencijalni izvori obuhvataju odlaganje otpadnih voda, procednih voda iz koksnih peći kao i korišćenje zemljišnog kompozita i đubriva.

Koncentracija PAH-ova u zemljištu se smanjuje dejstvom bakterija i gljivica koje ih pretvaraju u druga organska i neorganska jedinjenja, pri čemu su krajnji proizvodi ugljen – dioksid i voda. Neke bakterije ih čak i koriste kao izvor ugljenika pa ih tako dodatno razgrađuju.

5

1.1.1. Hemijske osobine PAH-ova

PAH-ovi su relativno slabo rastvorna jedinjenja u vodi, ali su rastvorni u organskim rastvaračima. Jedinjenja sa većom molekulskom masom su manje rastvorljiva u vodi i manje nestabilna. Baš zbog tih karakteristika više se nalaze u zemljištu nego u vodi i atmosferi. Boja PAH-ova u čvrstom stanju je bela, žuta, bledo zelena, ali mogu biti i bezbojni, PAH-ovi imaju karakteristične UV spektre, otporni su na fotorazgradnju i u pobuđenom stanju mogu da fluoresciraju.

Imaju kondenzovane aromatične prstenove koji ne sadrže heteroatome niti sadrže supstituente. Po IUPAC-u najprostiji PAH-ovi su fenantren i antracen, koji imaju tri aromatična jezgra, dok se manji molekuli kao npr, benzen ne smatraju za PAH jedinjenja. Najčešće se javljaju PAH-ovi sa pet ili šest aromatičnih jezgra. PAH-ovi sastavljeni od šestočlanih prstenova nazivaju se alternativnim PAH-ovima, dok se neki iz te grupe nazivaju benzenoidnim PAH-ovima, čije ime naravno potiče od benzena – aromatičnog šestočlanog prstena. PAH-ovi se sastoje iz aromatičnih prstenova koji su međusobno povezani jednostukom ugljenik-ugljenik vezom.

PAH-ovi koji sadrže do šest aromatičnih prstenova nazivaju se “malim” PAH-ovima, dok oni koji sadrže više od šest su “veliki” PAH-ovi. Zbog dostupnosti uzoraka “malih” PAH-ova, istraživanja se uglavnom vrše na njima. Biološka aktivnost i postojanje “velikih” PAH-ova je manja zbog kinetičkog ograničenja usled dodavanja uzastopnih prstenova. Iako “veliki” PAH-ovi imaju veći broj izomera, postojanje specifičnih izomera je malo. Rastvorljivost se smanjuje za otprilike jedan stepen sa svakim dodatim prstenom.

Naftalen se sastoji iz dva koplanarna šestočlana prstena koja imaju zajedničku stranicu. On se po IUPAC-u ne smatra za pravim PAH-om iako je biciklični aromatični ugljovodonik.

Slika 1: Naftalen Primeri nekih PAH-ova koji se najčešće javljaju u zemljištu i koji su prioritetni po US

EPA (ukupno 16 – sa naftalenom) (European Commision, 2005,)prikazani su u tabeli 1:

6

Tabela 1: EU prioritetni policiklični aromatični ugljovodonici

Naziv Strukturna formula Molekulska formula

Molekulska masa

Naftalen

C10H8 128

Acenaftilen

C12H8 152

Acenaften

C12H10 154

Fluoren

C13H10 166

Fenantren

C14H10 178

Antracen

C14H10 178

Fluoranten

C16H10 202

7

Piren

C16H10 202

Benzo[a]antracen

C18H12 228

Krizen

C18H12 228

Benzo[b]fluoranten

C20H12 252

Benzo[k]fluoranten

C20H12 252

Benzo[a]piren

C20H12 252

8

Indeno[1,2,3-cd]piren

C22H12 276

Dibenzo[a,h]antracen

C22H14 278

Benzo[ghi]perilen

C22H12 276

Velike količine PAH-ova mogu biti sorbovane od strane organske materije u zemljištu.

Sa porastom molekulske mase PAH-ova, raste stepen sorpcije, usled povećanja lipofilnosti. Određeni PAH-ovi male molekulske mase se gube vremenom usled isparavanja, degradacije i izluživanja.

1.1.2. Uticaj PAH-ova na ljudsko zdravlje

PAH-ovi u zavisnosti od strukture mogu biti netoksični do izrazito toksični, Npr, benzo[a]piren je prvo otkriveno kancerogeno jedinjenje u duvanskom dimu. EPA (Larsen, 2002) je klasifikovala PAH-ove u šest grupa koje su kancerogene za ljude: benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenz(a,h)antracen, i indeno(1,2,3-cd)piren.

PAH-ovi koji su poznati po svojim kancerogenim, teratogenim i mutagenim svojstvima su: benzo[a]antracen i krizen, benzo[b]fluoranten, benzo[j]fluoranten, benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren, benzo[ghi]perilen, koronen, dibenzo(a,h)antracen, indeno(1,2,3-cd)piren, i ovalen. Oni izazivaju rak pluća, jednjaka, želuca, debelog creva, mokraćnog mehura, kože i prostate. U većoj meri su im izloženi pušači. Profesionalno su izloženi radnici koji rade sa asfaltom, koksom, u proizvodnji aluminijuma, gvožđa i čelika.

http://en.wikipedia.org/wiki/Benzo%28a%29anthracene

http://en.wikipedia.org/wiki/Chrysene

http://en.wikipedia.org/wiki/Benzo%28b%29fluoranthene

http://en.wikipedia.org/wiki/Benzo%28j%29fluoranthene

http://en.wikipedia.org/wiki/Benzo%28k%29fluoranthene

http://en.wikipedia.org/wiki/Dibenz%28a,h%29anthracene

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Indeno%281,2,3-cd%29pyrene&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Ovalene

9

PAH-ovi se vrlo lako mogu da inhaliraju a potom i adsorbuju u plućima i crevima. Ovako adsorbovani PAH-ovi se mogu putem krvi da prošire kroz ceo organizam, izazivajući imunotoksičnost, teratogenost, različite oblike karcinoma, arteriosklerozu, i još mnoga druga oboljenja. Takođe, vrlo štetan uticaj koji PAH-ovi mogu da prouzrokuju je oštećenje DNA što za posledicu ima različite vrste i oblike mutacija.

Regulativa Komisije Evropske unije br. 1881/2006 propisuje maksimalno dozvoljene količine benzo[a]pirena u različitim grupama namirnica, 16 US EPA prioritetna PAH jedinjenja su: Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen (BaA), Benzo[a]piren (BaP), Benzo[b]fluoranten (BbF), Benzo[ghi]perilen (BgP), Benzo[k]fluoranten (BkF), Krizen (CHR), Dibenzo[a,h]antracen (DhA), Fluoranten, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]piren (IcP), Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften.

Toksični ekvivalentni faktor (TEF vrednost) se, uglavnom, koristi za procenu kancerogenog potencijala određenih policikličnih aromatičnih ugljovodonika i izražava se u odnosu na karcinogenost benzo[a]pirena (Nisbet i LaGoy, 1992; Boström i sar,, 2002,).

Vršena su ispitivanja na miševima i njihovim fetusima: ingestija velike količine benzo[a]pirena u trudnoći rezultovala je teškoćama u reprodukciji. Ovo dejstvo je uočeno i na potomcima. Kao posledica su se javili i deformiteti pri rođenju kao i povećana telesna masa. Ne zna se da li se ove posledice javljaju i kod ljudi. (Department of Health, Government of South Australia, 2009,).

Vršena su i istraživanja na ljudima: uzeti su uzorci mleka, posteljice kao i krv pupčanika i analizirani izabrani PAH-ovi. Najviši nivo benzo[a]pirena, dibenz[a,c]antracena i krizena su zabeleženi u mleku i krvi pupčanika, ali su u polovini uzoraka PAH-ovi bili prisutni u koncentracijama vrlo malo iznad granice detekcije. Ipak, autori su zaključili da koncentracija PAH-ova i kod fetusa i kod odojčadi zavisi od ishrane majke (Larsen, 2002,). Kod majki koje puše duvan, uočeno je da PAH – ovi mogu proći kroz placentu i dospeti u telo nerođenčeta (Department of Health, Government of South Australia, 2009).

PAH-ovi se preko krvi distribuiraju u tkivima, zbog svog nepolarnog karaktera posebno u onim sa visokim sadržajem masti. Pošto im se metabolizmom povećava polarnost lakše se izlučuju iz organizma.

Smatra se da su metilovani derivati PAH-ova toksičniji od nesupstituisanih jedinjenja. Teorija koja opisuje toksičnost PAH-ova („the bay theory”) objašnjava veću reaktivnost PAH-ova u formi „zaliva” od PAH-ova u formi “fjorda” (slika 2) (Weis, 1998,).

Slika 2. Strukture „zaliva” i “fjorda”

“Zaliv” “Fjord”

10

Kancer se javlja usled vezivanja PAH-ova za DNA. Ćelije koje su najviše podložne uticaju ovih jedinjenja su koštana srž, koža i pluća, krvne ćelije i imuni sistem, mozak, reproduktivni organi. Akutno izlaganje PAH-ovima dovodi do glavobolje, oštećenja kože, mučnine i respiratornih smetnji, dok hronična izloženost izaziva bronhitis, rak pluća, bubrega i usne duplje, leukemiju.

1.1.3. Metabolizam PAH-ova

Nakon ulaska u ljudsko telo, PAH-ovi podležu nizu oksidacionih biotransformacija pri čemu se pretvaraju u niz metabolita (slika 3):

U Fazi I PAH-ovi se oksiduju enzimima citohroma P450 pri čemu nastaju visokoreaktivni epoksidni intermedijeri koji se onda redukuju ili hidrolizuju uz pomoć enzima epoksid hidroksilaze u OH-PAH-ove. PAH-ovi se mogu i direktno hidrolizovati bez formiranja epoksidnog intermedijera,

U Fazi II OH-PAH-metaboliti se konjuguju sa glutationom, glukuronskom kiselinom ili sulfatom kako bi se olakšala detoksikacija, i pri čemu dolazi do izlucivanja putem urina, ali se tokom godina deo akumulira u organizmu,

Slika 3. Oksidaciona biotransformacija PAH-ova

11

Kao krajnji metabolit benz[a]pirena nastaje 7,8 -dihidrodiol-9,10-epoksid benz[a]pirena koji je njegov najtoksičniji metabolit. On se vezuje za DNA i RNA. Izrazito je kancerogen. Izaziva veću mutagenost u odnosu na druge metabolite benz[a]pirena.

1.2. Validacija analitičkih metoda

Validacija je postupak kojim se dokazuje da metoda služi svrsi kojoj je namenjena, a zahteva je i zakonska regulativa i analitička profesija. Validaciju treba sprovesti: - pri razvoju i uvođenju nove metode - pri promeni bilo kojeg dela analitičke metode koja je već bila validirana

• promena postojeće metode • poboljšanje i prilagođavanje postojeće metode • prenošenje metode u drugu laboratoriju • prenošenje metode na drugi instrument • promene u sintezi glavne komponente, sastavu gotovog proizvoda ili analitičkom

postupku

Prvo je potrebno definisati svrhu metode. Zatim se utvrđuje postupak rada, izvode eksperimenti i prikupljaju rezultati koji dokazuju validnost metode.

Postoje osam osnovnih parametara validacije jedne analitičke metode: 1. Specifičnost / selektivnost 2. Linearnost 3. Analitički opseg metode (Radno područje) 4. Preciznost

- Ponovljivost (eng, repeatability) - Međupreciznost (eng, Intermediate precision) - Reproduktivnost(eng,reproducibility)

5. Tačnost (recavery vrednost) 6. Granica kvantifikacije 7. Granica detekcije 8. Robusnost

1.2.1. Specifičnost / selektivnost

Je svojstvo metode da tačno i specifično odredi željeni analit u pristvu ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrđenim uslovima ispitivanja. Iako se u praksi često poistovjećuju, specifičnost i selektivnost su dva različita svojstva metode. Specifična metoda je ona kojom se može odrediti samo jedan specifični analit. Metoda kojom se može određivati više

12

komponenata istovremeno, ali pod uslovima da te komponente pri određivanju ne smetaju jedna drugoj naziva se selektivnom. Kod hromatografskih metoda, osim upoređivanja hromatograma referentnog materijala i uzorka, potrebno je dokumentovati i parametre koji određuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod određenih metoda i prikupiti dokaze o čistoći pikova.

1.2.2. Linearnost

Je mogućnost metode da unutar određenog područja daje rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku. U praksi se linearnost određuje merenjem odziva metode na različite poznate koncentracije referentnog materijala (preporučuje se najmanje pet različitih koncentracija uz tri ponavljanja). Linearnost metode se procenjuje matematički i grafički. Matematički način procene se vrši na taj način što se primenom linearne regresije izrazi jednačina pravca (y = ax + b) i izračuna koeficijent korelacije (k). Nagib pravca (a) je parametar koji ukazuje na osetljivost metode. Što je veća vrednost nagiba pravca, metoda je osetljivija. Odsečak pravca (b) može da ukaže na sistematsku grešku. Načešće korišćena forma linearne regresije je bazirana na tri pretpostavke:

-svaka razlika između eksperimentalnih podataka i izračunate regresione linije dovodi do neodređenih grešaka koje utiču na vrednost y -ove neodređene greške imaju normalnu distribuciju -neodređene greške su iste za sve standarde, svaki standard doprinosi podjednako u dobijanju nagiba i odsečka

Kao rezultat regresione i korelacione analize moguće je izračunavanje koeficijenta korelacije (k). Kriterijum koji se postavlja prilikom validacije metode podrazumeva da je vrednost koeficijenta korelacije k≥0,99. U slučaju izuzetno niskih koncentracija analita, prihvata se i kriterijum k≥0,98. Grafičke metode koje prikazuju zavisnost analitičkog signala od koncentracije analita omogućavaju vizuelnu procenu (slika 4):

Slika 4: Dva načina grafičkog prikaza linearnosti

13

1.2.3. Analitički opseg metode (Radno područje)

Je interval između gornje i donje koncentracijske granice analita (granice su uključene) u uzorku, unutar kojeg analitički postupak ima zadovoljavajuću preciznost, tačnost i linearnost. Za određivanje tog parametra nije potrebno izvođenje posebnih eksperimenata, nego se zaključci izvode iz studije linearnosti. Raspon koncentracija treba da odgovara stvarnom uzorku, ali treba i da uključi koncentraciju na granici kvantifikacije kada je ona bitna.

1.2.4. Preciznost

Predstavlja meru slaganja između niza merenja istog homogenog uzorka izvedenih pod propisanim uslovima. Važno je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na homogenom autentičnom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu kojim će se kasnije raditi u praksi. Preciznost se izražava kao:

-Ponovljivost (Repeatability) - podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem istog uzorka istom metodom pod istim uslovima (isti analitičar, isti instrument, ista laboratorija u kratkom vremenskom razdoblju)

-Srednja preciznost (Intermediate precision) - odstupanje rezultata dobijenih merenjem istog uzorka istom metodom pod različitim uslovima u istoj laboratoriji (različit analitičar, različit instrument, reagensi različitih dobavljača, duži period)

-Reproduktivnost - podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem nekoliko istih uzorka istom metodom u različitim laboratorijima (različit analitičar, različiti radni uslovi unutar specificiranih parametara metode) Preciznost se eksperimentalno kvantifikuje vrednošću greške metode, a numerički pokazatelji toga su standardna devijacija, koeficijent varijacije i varijanca.

S-standardna devijacija xi- pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem

-srednja vrednost određivanja

S-standardna devijacija -srednja vrednost određivanja

S2 - varijanca xi- pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem n –broj određivanja

-srednja vrednost određivanja

Eksperimenti određivanja preciznosti se vrše na homogenom analitičkom uzorku, tj veštački pripremljenom uzorku, dok se postupak određivanja sprovodi po metodi koja će se

( )

11

2

2

−

−=∑=

n

xxs

n

ii

100(%) ⋅=xsKV( )

11

2

−

−=∑=

n

xxs

n

ii

14

ubuduće raditi u praksi. Broj ponavljanja treba da zadovolji zahteve statistike. Najčešće se rade po tri ponavljanja na nekoliko koncentracija koje se nalaze u opsegu linarnosti.

Kao alternativa, za potvrdu preciznosti mogu da se upotrebe rezultati određivanja najmanje devet proba na najmanje tri koncentraciona nivoa tretiranih radi provere tačnosti metode. Izračuna se sadržaj analita u svim probama, a zatim se dobijeni rezultati obrade statistički.

Izračuna se srednja vrednost sadržaja, standardna devijacija i relativna standardna devijacija.

1.2.5. Tačnost (Recovery vrednost)

Predstavlja meru usaglašenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloženom metodom sa pravim (stvarnim) vrednostima, odnosno ona ukazuje na ispravnost merenja. Procena tačnosti često se naziva i Recovery eksperiment. Izražava se kao procenat prinosa. Tačnost metode se proverava:

- Analizom standardnih referentnih materijala - Određivanjem procenta prinosa ili tzv. recovery vrednosti - Upoređivanjem sa metodom koja je potvrđena kao tačna standardna metoda

Tačnost metode se eksperimentalno proverava na sledeći način: -Najpre se odmeri dovoljno istovetnih slepih proba, a zatim se dodavanjem različitih količina standardne supstance analita, formiraju najmanje tri koncentraciona nivoa sa po najmanje tri probe:

– prvi nivo sa manjom količinom analita od specifikovane, – drugi nivo sa količinom analita kao specifikovane u ispitivanom uzorku – treći nivo sa većom količinom analita od specifikovane,

- Zatim se primenom metode koja se validira, uradi kvantitativna analiza svih proba, - Izračuna se sadržaj analita u svakoj probi, - Na kraju se za svaku probu izračuna tzv. recovery vrednost, prema sledećem izrazu

Gde je: xi – pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem

μi – tačna (dodata) vrednost analita u svakoj probi

15

Na slici 5 su prikazani pojmovi preciznosti i tačnosti:

Slika 5: prikaz preciznosti i tačnosti određivanja

1.2.6. Granica detekcije / kvantifikacije

Granica detekcije se još naziva i Limit detekcije (LOD). To je granica dokazivanja ili detekcije (eng. Limit of Detection - LOD), odnosno najmanja moguća koncentracija analita koja se može detektovati, ali ne i kvantitativno odrediti. Određivanje limita detekcije moguće je vršiti statistički ili vizuelno.

Izračunavanje očekivanog teorijskog limita detekcije statistički se vrši primenom regresione analize funkcije dobijene za linearnost. Iz izračunate vrednosti nagiba (b) regresione prave i standardne devijacije (S) funkcije linearnosti, izračunava se teorijski limit detekcije prema formuli:

Zbog interferencija koje je nemoguće potpuno otkloniti, eksperimentalno se određuje realni limit detekcije na sledeći način: - Najpre se odmere najmanje tri istovetne slepe probe pa se u njih dodaju različite količine standardne supstance analita:

- prva proba sa količinom analita jednakom izračunatom limitu detekcije, - druga proba sa dvostruko većom količinom analita od izračunatog limita detekcije,

16

- treća proba sa trostruko većom količinom analita od izračunatog limita detekcije, - Zatim se primenom metode koja se validira uradi kvantitativna analiza svih proba, - Na bazi signala svih proba, limit detekcije se izračunava kao realna koncentracija analita koja bi dala signal tri puta veći od standardne devijacije signala slepe probe tj, šuma bazne linije.

Granica kvantifikacije se naziva i Limit kvantifikacije (LOQ) i predstavlja granicu kvatitativnosti (eng. Limit of Quantification - LOQ), tj. najmanju moguću koncentraciju analita koja se može odrediti uz dozvoljenu grešku.

Određivanje limita kvantifikacije sprovodi se u dve faze: - U prvoj fazi se izračuna očekivani teorijski limit detekcije primenom regresione analize funkcije dobijene za linearnost. Iz izračunate vrednosti nagiba (b) regresione prave i standardne devijacije (S) funkcije linearnosti, izračunava se teorijski limit kvantifikacije (LOQ), prema formuli:

- Takođe, očekivani limit kvantifikacije može da se izračuna eksperimentalno kao koncentracija analita koja bi dala signal deset puta veći od standardne devijacije slepe probe, dobijene merenjem šuma bazne linije.

1.2.7. Robusnost

Robusnost analitičke metode je mera njene sposobnosti da se odupre malim i namernim promenama u parametrima metode, a ujedno je i mera pouzdanosti metode tokom rutinske primene. Robusnost se može smatrati delom validacije metode koji se izvodi na kraju razvoja metode ili na početku validacije. Robusnost metode se procenjuje variranjem jednog faktora dok ostali ostaju nepromenjeni. Na taj način se identifikuju faktori koji utiču na metodu, te je analitičar u stanju da definiše uslove koji moraju da se strogo kontrolišu tokom primene metode. Ciljevi procene robusnosti metode su sledeći:

-procena kvantitativnosti metode -određivanje limita za procenu pogodnosti sistema

Koraci u proceni robusnosti: - izbor faktora koji će se testirani, - definisanje nivoa faktora, - izbor eksperimentalnog dizajna, - definisanje eksperimentalnog protokola, - definisanje odgovora koji će se pratiti, - izvođenje eksperimenta i određivanje odgovora metode, - izračunavanje efekata, - statistička i/ili grafička analiza efekata i - izvođenje zaključaka iz statističke analize

17

Stabilnost analita i celog sistema se eksperimentalno proverava na sledeći način: - U prvoj fazi se primenom metode koja se validira uradi kvantitativna analiza najmanje tri probe iz istog homogenog uzorka, - Pripremljeni radni rastvori se izmere sa najmanje trostrukim očitavanjem na odgovarajućem aparatu, - Iz dobijenih analitičkih signala standardnih rastvora izračuna se sadržaj analita. U drugoj fazi se svi pripremljeni radni rastvori, posle isteka izabranog vremenskog intervala, na isti način ponovo izmere na istom aparatu. Stabilnost se procenjuje, ali ne i ograničava, na period od 48 sati, pri čemu uslovi čuvanja radnih rastvora moraju biti definisani. - Opet se zabeleže signali standardnih rastvora i ponovo izračuna sadržaj analita, - Zatim se uporede signali standardnih rastvora i izračunati sadržaji analita u ponovljenom merenju (P2) u odnosu na prvo merenje (P1) i izračuna procenat promene, prema sledećoj formuli:

Kao alternativa, za proveru stabilnosti analita i sistema mogu da se mere radni rastvori koji se pripremaju radi provere preciznosti ili tačnosti metode.

18

1.3. Metode pripreme uzorka

Radi prečišćavanja uzorka zemljišta mogu se koristiti različite metode: ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača, Soxhletova ekstrakcija, mikrotalasna ekstrakcija, ekstrakcija organskim rastvaračima na koloni, ekstrakcija superkritičnim fluidima, mikroekstrakcija čvrstom fazom.

Ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača: ultrazvuk visoke snage koji se ovde

koristi omogućava veće prodiranje rastvora u materijal (K. Joa i sar, 2009,). Preporučuje se da se uzorci koji sadrže manje koncentracije PAH-ova ekstrahuju najmanje dva puta, uvek svežom porcijom rastvarača. Od rastvarača je najbolje primeniti smešu aceton/metilen hlorid (1:1, v/v) ili aceton/heksan (1:1, v/v). Ultrazvučna ekstrakcija omogućava delotvorniju ekstrakciju od klasične ekstrakcije tečno/tečno i Soxhlet-ove ekstrakcije. Prednosti postupka ultrazvučne ekstrakcije su njena relativna brzina, jednostavnost, ubrzani prenos mase i to što ne zahteva skupe instrumente, a nedostaci velika zapremina rastvarača koja se koristi i potreba da se ekstrakcija ponovi više puta. Ekstrakti se nakon završene ekstrakcije moraju filtrirati.

Soxhletova ekstrakcija je najčešće primenjivana za ekstrakciju isparljivih i slabo

isparljivih organskih jedinjenja iz čvrstih uzoraka. Uzorak se smešta u celuloznu čauru ekstrakcija se vrši kontinualno, uvek dodatkom sveže porcije rastvarača. Ekstrakcija se vrši na temperaturi ispod tačke ključanja rastvarača brzinom od 4-6 ciklusa na sat u vremenskom intervalu od 16-24 časa.

Tečna ekstrakcija pod pritiskom (Accelerated solvent extraction, Pressurized fluid

extraction) je jedna od novijih tehnika ekstrakcije, koja se za ekstrakciju PAH-ova primenjuje od devedesetih godina prošlog veka (Popp i sar, 1997; Saim i sar, 1998,). Uzorak i rastvarač se ubacuju u ekstrakcionu ćeliju i ona se zatvara. Nakon toga, uzorak se tretira na povišenoj temperaturi i pod pritiskom, 5-10 minuta, pa se rastvarač odstranjuje iz sistema.

Mikrotalasna ekstrakcija koristi mikrotalase kao izvor zagrevanja smeše uzorak-

rastvarač (Eskilson i Bjorkland, 2000,). Obično se biraju oni rastvarači koji apsorbuju mikrotalase. Velika prednost ove tehnike je što primenom mikrotalasne ekstrakcije ne dolazi do degradacije uzorka.

19

1.4. Gasna hromatografija (GC)

Gasna hromatografija je metoda razdvajanja i detekcije lako isparljivih organskih jedinjenja i nekih neorganskih gasova iz smeše (aditivi, degradacioni produkti polimera…). Mobilna faza, gas nosač koji nosi komponente smeše kroz kolonu, je u gasovitom stanju, a stacionarna faza može biti tečna ili čvrsta. Uzorak se pre uvođenja u kolonu mora prevesti u gasovito stanje.

GC ima brojne prednosti: veoma je osetljiva metoda (10-15 g), određivanja se izvode veoma brzo, potrebne su male količine uzorka za ispitivanje (≤ 10 mL) i ima mogućnost povezivanja sa MS. Metoda pokazuje i izvesne nedostatke: ispitivana jedinjenja moraju biti u gasovitom agregatnom stanju tako da usled visoke temperatute (>300 °C) kojoj je kolona izložena može doći do isparavanja same kolone kao i do degradacije uzorka,

Princip gasno hromatografske analize se zasniva na prolasku smeše (koja je nošena gasom nosačem) kroz kolonu u kojoj se vrši razdvajanje uzorka na komponente u zavisnosti od njihovih fizičkih i hemijskih osobina. Identifikacija komponenti smeše se vrši na osnovu retencionog vremena (vreme zadržavanja svake komponente na stacionarnoj fazi). Na kraju kolone je detektor koji registruje odvojene komponente i prevodi ih u električni signal koje prikazuje u vidu hromatograma. Brzina prolaska uzorka kroz kolonu se određuje temperaturom kolone u peći podešavanjem brzine prolaska nosećeg gasa (flow rate). Gasni hromatografa prikazan na slici 6 se sastoji iz sledećih delova:

- boca sa nosećim gasom i regulatorom pritiska (izvor gasa nosača), - injektorski sistem (za unošenje uzorka u kolonu), - termostat (za održavanje konstantne temperature), - hromatografska kolona (za razdvajanje komponenata smeše), - detektor (detektuje komponente istim redosledom kojim one napuštaju kolonu), - sistem za registrovanje signala iz detektora – monitor ili štampač, Gas nosač (He, Ar, N2, H2): mora da bude hemijski inertan i čist. Izbor gasa zavisi od

analizirane supstance i detektora, Veoma je važna regulacija pritiska i protoka gasa jer utiču na efikasnost razdvajanja.

Kolone mogu biti u obliku kruga, spirale, slova U; metalne, staklene ili plastične. Razdvajanje zavisi od dužine i širine kolone (što je kolona duža i uža razdvajanje je bolje). Kolone se pune silika gelom, zeolitom, aluminijum oksidom, aktivnim ugljem, u zavisnosti od prirode analiziranog uzorka. Optimalna temperatura kolone bi trebala da bude nešto viša od temperature ključanja komponente čija je Tk najveća.

20

Slika 6: Delovi gasnog hromatograma Detektori: koriste se različite vrste detektora. Najviše se koriste termo provodljivi

detektori (TCD) i plameno jonizacioni (FID), Oni imaju primenu u širokom opsegu koncentracije za različita organska jedinjenja. Može se koristiti i maseni spektrometar.

1.5. Masena spektrometrija

Masena spekrometrija je fizičko-hemijska metoda koja se zasniiva na jonizaciji ispitivanog uzorka, kao i razlaganju nastalog jonskog snopa na jone različitog odnosa masa/naelektrisanje (m/z). Masena spektrometrija se može kombinovati sa drugim metodama kako bi se povećale njihove performanse, najčešće sa gasnom i tečnom hromatografijom. Kompleksne smeše se mogu veoma lako razdvojiti gasnom hromatografijom. Masena spekrometrija se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi.

Pojedinačne komponente smeše se pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vreme može poslužiti kao veličina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne sme koristiti za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja. Ono što je veoma bitno za GC – MS je da obe tehnike koriste približno istu količinu uzorka u gasovitom stanju (manje od 1 ng). Gasni hromatograf se može direktno vezati za maseni spekrometar. U sistemu GC – MS koriste se različiti sistemi za injektovanje, kolone, gasovi nosači, jonski izvori i maseni analizatori. Tokom analize dobija se

21

veliki broj podataka, koji se ne mogu obraditi ručno, pa je neophodno povezivanje instrumenata sa računarskim sistemom.

Opšta šema aparature prikazana je na slici 7, pri čemu su brojevima označeni sledeći

delovi: 1. boca sa gasom nosačem 2. injektor (sistem za unošenje uzoraka) 3. kapilarna kolona 4. veza između GC i MS 5. jonski izvor 6. maseni analizator 7. detektor 8. vakuum sistem 9. računar

Slika 7: Šema aparature za GC-MS Uloga jonskog izvora je da molekule uzorka fragmentiše u jone i da formira i ubrza

nastali jonski snop koji se kreće ka masenom analizatoru. S obzirom na to da je većina jonizatora dizajnirana za rad sa gasovima, molekuli se najpre prevode u gasovito stanje. U slučaju da uzorci u gasovitom stanju imaju visok napon pare, neophodno je da se unose direktno u jonski izvor. Tečnosti i čvrste materije se obično prethodno zagrevaju, da bi im se povećao napon pare za analizu. Uobičajene jonizacione tehnike koje se danas koriste su:

- Jonizacija elektronima (EI – electron ionization) – najčešće korišćena - Hemijska jonizacija (CI – chemical ionization) - Bombardovanje brzim atomima i (FAB – fast atom bombardment)

22

- Jonizacija potpomognuta laserskom desorpcijom iz matriksa (MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Maseni analizator ima dvostruki zadatak: da odvoji jone mase m od jona slične mase

m+Δm i da nakon toga fokusira izdvojeni snop jona. Ovo se ostvaruje pod dejstvom električnih i magnetnih polja. Neki od analizatora koji se koriste su jonski trap, analizator na bazi vremena preletanja, ali se najčešće koristi kvadrupolni analizator. On se sastoji iz 4 metalne šipke od kojih su 2 vezane za pozitivni izvor, a 2 za negativni. Između njih se formira dvodimenzionalno radiofrekventno polje. Samo rezonantni joni (joni sa konstantnom putanjom) čiji se pravac kretanja poklapa sa pravcem oscilovanja radiofrekventnog polja, dolaze do detektora. Ostali joni koji su nerezonantni, ne dolaze do detektora. Na slici 8 je data šema kvadrupolnog analizatora.

Slika 8: Šema kvadrupolnog analizatora

Kada se jonske vrste razdvoje u masenom analizatoru potrebno ih je kvalitativno i

kvantitativno odrediti. Detekcija se najčešće izvodi električnim putem, tako što se meri abundanca – ukupna jonska struja.

Maseni spektrometar radi u uslovima visokog vakuuma, pritiska reda veličine 10-5 do 10-7 mbar. Ovakve uslove obezbeđuju dve pumpe: mehanička (za grubo vakuumiranje sistema) i pumpa visokog pritiska. Vakuum uklanja čestice nosećeg gasa i sve nejonizovane ili nefragmentisane molekule uzorka.

Najsavremeniji aparat “Agilent 7000 series Triple Quadrupole GC/MS” je korišćen za snimanje uzoraka u ovom radu. To je jedina tripl kvadrupol GC/MS kombinacija, koji ima heksapolnu kolizionu ćeliju ispunjenu kombinacijom azota i helijuma, radi poboljšanja fragmentacije pre konačne filtracije i kvantifikacije.

23

1.5.1. Operacije unutar Triple quadrupole MS Joni se transportuju iz jonskog izvora do prvog kvadrupola (slika 9):

Slika 9: Šema TQ MS U analizatoru se između 4 paralelne šipke određeni joni filtriraju. Nakon prolaska kroz prvi kvadrupol, filtrirani joni ulaze u kolizionu ćeliju u kojoj se fragmentišu. Koliziona ćelija se obično naziva drugim kvadrupolom, ali u ovom slučaju ona zapravo predstavlja heksapol ispunjen azotom ili drugim kolizionim gasom. Joni fragmenti nastali joniyacijom odabranih jona u kolizionoj ćeliji, dalje se šalju do trećeg kvadrupola, za drugi stadijum filtracije, radi izdvajanja i ispitivanja mogućnosti višestrukih prekursora za identifikaciju i kvantifikaciju ciljnog molekula.

Na kraju, joni koji prolaze kroz treći kvadrupol se detektuju pomoću visokoenergetskog detektora (slika 10).

Slika 10: Delovi detektora

24

Detektor je visoko energetska dinoda kuplovana sa elektronskim multiplikatorom. Visoko energetska dinoda se nalazi van ose centra prednjeg kvadrupolnog analizatora. Orijentacija smanjuje mogućnost neutralnih molekula da dođu do detektora, dok u isto vreme privlači jone visokim potencijalom. Kada jonski snop udari dinodu, joni se konvertuju u elektrone pre udara u multiplikator. Ovi elektroni su privučeni ka pozitivnijem kraju elektronskog multiplikatora. Ovakva orijentacija detektora omogućava neutralnim atomima da prođu i da budu eliminisani od strane vakuum sistema.

1.5.2. Metode snimanja masenih spektara Postoje dve metode snimanja uzoraka: SIM (Selected ion monitoring) metoda – prate se samo odabrani joni i MRM (multiple reaction monitoring) metoda - posmatranje višestrukih reakcija. SIM metoda se koristi u kvantitativnim određivanjima, Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti anliza SCAN metodom (snimanje kompletnog masenog spektra). SIM tehnikom detektuju se vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praćenja jona je veće pa se samim tim povećava i osetljivost čak od 100 do 1000 puta. Karakteristični joni, vreme početka snimanja (start time) i vreme praćenja jona (dwell time) biraju se na osnovu podataka dobijenih pomoću SCAN tehnike. MRM metoda se može izvoditi jedino sa TQ MS. U ovom načinu rada, prednji analizator radi u SIM režimu, izdvajajući određeni jon ili grupu jona karakterističnih m/z vrednosti. Nakon filtracije u prvom kvadrupolu, očekuje se da će samo joni sa tačno određenom m/z vrednošću proći dalje. Nakon fragmentacije u kolizionoj ćeliji, treći kvadrupol takođe radi u SIM režimu za određeni opseg m/z vrednosti, radi hvatanja produkt jona nastalih iz prekursora.

25

1.6. Pregled literature

S obzirom da su PAH-ovi veoma prisutni u životnoj sredini, naučna javnost se često bavi njihovim ispitivanjem. Kao metoda analize najčešće se koristi upravo kombinacija gasne hromatografije i masene spektrometrije.

Tabela 2: Karakterizacija PAH-ova sa različitog područija (Nam i sar., 2003)

U radu “Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils in South Korea” (Nam i sar., 2003,) korišćena je Soxhletova ekstrakcija kao način pripreme uzorka, Kvantitativna analiza je rađena uz pomoć GC-MS tehnike: korišćena silika kapilarna kolona (DB – 5 ms, 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μl, J&W Sci, INC, USA) i helijum kao noseći gas sa konstantnom brzinom uduvavanja od 40 cm/s. Program je započeo zagrevanjem sistema na temperaturu 75 ºC, održavana temperatura 5 minuta a zatim povećana na 150 ºC, po 25 ºC po minuti a zatim na 265 ºC, po 4 ºC po minuti. Finalna temperatura je održavana 10 minuta a zatim povećana na 285 ºC, 1 μl uzorka je injektovan u splitless modu. Dobijeni rezultati koncentracije ukupnih PAH-ova u zavisnosti od geomorfološke lokacije je prikazana u tabeli 2, iz koje se vidi da se najveće koncentracije PAH-ova javljaju u oblastima gde se prerađuje gvožđe.

U radu “Global patterns of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil”, (Wilcke, 2007,) prikazani su rezultati analize uzoraka pripremanih različitim metodama ekstrakcije: metanolna saponifikacija sa KOH, ultrazvučna ekstrakcija, Soxhletova ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan:aceton (2:1,v/v), ekstrakcija pod pritiskom, ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan:aceton (2:1,v/v) u aparatu Accelerated Solvent Extractor (Dionex ASE 200, Dionex,Co, Sunnyvale, CA). Za određivanje PAH-ova korišćen je Hewlett Packard 5890 series II sa masenim detektorom Hewlett Packard 5971, u SIM modu uz pomoć jonskog izvora sa elektronskom jonizacijom (EI). Korišćena je kapilarna kolona od silika gela (30x0,25x0,25 μm) i helijum kao noseći gas (konstantan pritisak, 80 kPa). Temperatura injektovanja podešena je na 300 ºC i detektora 320 ºC. Primenjeno je splitless injektovanje.

26

Slika 11: koncentracije 20 ispitivanih PAH-ova(Wilcke, 2007) Na slici 11 su prikazane koncentracije svih 20 ispitivanih PAH-ova. Ispitano je 225

uzoraka iz 12 različitih geografskih regija. U zemljištu sa niskim koncentracijama svih 20 PAH-ova koji su ispitivani, dominantni su naftalen, fenantren i perilen. U zemljištima sa visokom koncentracijom ovih 20 PAH-ova, dominantno je 11 PAH-ova sa velikom molekulskom masom. Najveće koncentracije PAH-ova su prisutne u industrijskim oblastima u Nemačkoj, a najmanja koncentracija je u zemljištu koje je uzorkovano iz šuma Amazona u Brazilu.

U radu “Levels of PAHs in soil and vegetation samples from Tarragona County, Spain”,

(Nadal i sar., 2004,) prikazani su rezultati određivanja PAH-ova u uzorcima koji su ekstrahovani u Soxhletovoj aparaturi sa 300 ml smeše rastvarača heksan/dihlormetan (1:1,v/v). Uzorci su analizirani uz pomoć GC (Agilent 6890, Wilmington, DE, USA), opremljen kapilarnom kolonom od silica gela (HP-5; 30 m dužine, 0,25 mm i.d., 0,25 μm debljine). Temperatura injektovanja bila je 80 ºC a temperatura detektora 325 ºC. Izabran je splitless metod i helijum kao noseći gas (17,8 ml/min). Ispitane su koncentracije PAH-ova u zemljištu i vegetaciji. Uzorci su skupljani u urbanim sredinama i u nezagađenim delovima. Rezultati su prikazani u tabeli 3:

Tabela 3: koncentracije PAH-ova u različitim sredinama (Nadal i sar., 2004,)

27

eksperImenTalnI deo

28

2.1. Aparatura - Triple Quadrupole GC/MS system – Agilent 7000 Series - Vaga - Shimadzu AX20 - Ultrazvucno kupatilo – J.P.Selectra, s.a. Barselona, Spain - Aparatura za Soxletovu ekstrakciju - Vodeno kupatilo - Baths HH-S114 - Vakuum uparivac, IKA RV 05 basic Werke - Aparat za dejonizovanu vodu - TKA MICROMED

2.2. Reagensi - PAH standardi Kit 610-N – Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca,

koji sadrži: acenaftilen, antracen, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen (93%), dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren, acenaften

- Deuterisani Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca: krizen d10, acenaften d10

- Surogat deuterisani Standard Mix 4mg/ml Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca, koji sadrži: 2-hlorfenol-3,4,5,6-d4, 1,2-dihlorbenzen-d4, 2-fluorbifenil, 2-fluorfenol, nitrobenzen-d5, fenol-d6, p-terfenil-d14, 2,4,6-tribromofenol

- Silika gel – Macherey - Nagel Germany; veličina pora: 0,063-0,2 mm; 70 – 230 mesh ASTM

- Al2O3– Merck; veličina pora: 0,063-0,2 mm; 70 – 230 mesh ASTM - Dihlormetan - for HPLC , gradient grade, SIGMA-ALDRICH - n - Heksan - Fluka, Spain, for HPLC - Aceton - for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH

2.3. Pribor - erlenmajer sa čepom - kvantittativni levak - balon sa okruglim dnom - kiveta za centrifugu - vijale za GC - automatska pipeta - menzura - normalni sudovi - kleme, mufovi, stativi, prsten za levak

29

2.4. Priprema uzoraka U ovom radu korišćene su ultrazvučna i 4,2, QuEChERS ekstrakcija, kao metode pripreme uzorka.

2.4.1. Ultrazvučna ekstrakcija

Odmeno je 5 g uzorka zemljišta, preneto u erlenmajer sa zapušačem i preliveno sa 15 mL smeše rastvarača heksan / aceton u odnosu 1:1. Nakon toga vršena je ekstrakcija 3 puta po 15 minuta na ultrazvučnom kupatilu, pri čemu je pre svake nove ekstrakcije dodavano po 15 ml smeše rastvarača. Kako bi se povećala efikasnost ekstrakcije, posle druge ekstrakcije izvršeno je ceđenje ekstrahovanog sistema, a uzorku zemljišta koji je ostao u erlenmajeru dodavano je novih 15 mL smeše rastvarača. Nakon završene ekstrakcije, proceđen ekstrakt je uparen do suva na vakuum uparivaču, na 400C.

Nakon uparavanja vršeno je rastvaranje ostatka i na taj način pripremano 5 mL svakog od ispitivanih uzoraka. Kivete u kojima su pripremljeni uzorci neophodno je dobro zatvoriti kako uzorci ne bi isparili.

2.4.2. QuEChERS ekstrakcija

QuEChERS je skraćenica za veoma koristan analitički pristup koji znatno pojednastavljuje analizu u komleksim uzorcima. QuEChERS procedura podrazumeva nekoliko jednostavnih analitičkih koraka koji se lako obavljaju i malo su osetljivi na greške. Takođe obezbeđuje visok prinos ekstrakcije za veliki broj PAH – ova, a krajnji ekstrakt se može direktno analizirati GC ili LC hromatografijom. Procedura QuEChERS ekstrakcije sastoji se u sledećem - odmerena količina uzoraka (5g prosejane zemlje) prenese se u kivetu za centrifugiranje (50ml), doda se 5 ml dejonizovane vode, energično promućka, potom se dodaje rastvarač za ekstrakciju (acetonitril) i dobro promućka. Nakon ovoga, dodaje se sadržaj QUECHERS pack – a (4g MgSO4 i 1g NaCl), meša se energično. Nakon ovog postupka centrifugira se 10min na 3500 rpm.

2.5. Prečišćavanje uzorka U kivetu u kojoj se nalazi 5 ml ekstrakta dodato je 250 mg PSA (koji predstavlja primarni, sekundarni amin, za prečišćavanje) i 500 mg Al2O3 (5%). Kivete su energično mućkane 5 minuta, a zatim je izvršeno centrifugiranje u trajanju od 10 minuta pri brzini od 8000 obrtaja u

30

minuti. Nakon završenog centrifugiranja pažljivo je prenešeno 0,6 mL ekstrakta u vijalu za GC snimanja u SIM modu.

2.6. Kalibracione prave

U kivete koje sadrže PSA i Al2O3 (5%) dodavano je 50, 100, 250 i 500 μl standardnog rastvora čija je koncentracija 1691,5 μg/ml i 950, 900, 750 i 500 μl ekstrakta slepe probe pripremane na tri načina (ultrazvučna ekstrakcija heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija cikloheksan/aceton, QuEChERS ekstrakcija). Zatim je dodato po 200 μl unutrašnjeg standarda čija je koncentracija 80 μg/ml kao i po 100 μl surogat standarda koncentracije 100 μg/ml. Kivete su energično mućkane5 minuta, a zatim centrifugifugirane 10 minuta pri brzini od 8000 obrtaja u minuti. Nakon završenog centrifugiranja preneto je 0,6ml ekstrakta u vijalu za GC snimanja u SIM metodu. Na taj način dobijene su kalibracione prave za određivanje PAH-ova uzoraka pripremljenih na tri načina (ultrazvučna ekstrakcija heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija cikloheksan/aceton, QuEChERS ekstrakcija).

2.7. Parametri metode Snimanje serije standardnih rastvora i uzoraka rađeno je u SIM modu. U tabeli 4 su dati parametri metode:

Tebela 4: parametri metode za SIM mod

Zapremina koja se injektuje 5 μl

Temperaturni režim Inicijalno 3 min/75 ºC, temperaturni gradijent 6 ºC /min do 300 0C, održavano 10min

Vreme trajanja procesa 50,5 min Mod splitless

Pritisak 15,44 psi Ukupni protok 54 ml/min Kolona- vrsta HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxan

Dimenzije kolone 30 m x 250 μm x 0,25 μm Protok 1 ml/min

Prosečna brzina 23,607 cm/sec

2.8. Obrada dobijenih rezultata Za obradu dobijenih rezultata analize korišćen je program Mass Hunter.

Nakon otvaranja programa iz File sekcije odabrati radnju New Batch i iz foldera odabrati željenu datoteku i imenovati je. Nakon toga iz sekcije File/Add Sample odabrati željene uzorke za analizu i odrediti njihov Level (koncentraciju, gde je L5 najkoncentrovaniji rastvor iz standardne serije). Zatim se postavlja nova metoda tako što se odabere standardni rastvor sa najvećom koncentracijom (pikovi imaju najveći intenzitet te se sa sigurnošću smatra da će se sve

31

željene komponente videti na hromatogramu), čekiranjem kvadratića, a zatim se odabere Method/Edit. Zatim se bira Method Setup Task/Retention Time Setup gde se vrše podešavanja vezana za retenciona vremena svake komponente (slika 12):

slika 12: Retenciona vremena Iz sekcije Method Setup Task/ISTD Setup odabere se odgovarajući unutrašnji standard -

acenaften d10 i krizen d12 (bira se standard koji ima sličnu strukturu kao i analizirani PAH) i u odeljku ISTD Concentration unese njegova koncentracija (slika 13):

32

slika 13: Odabir unutrašnjeg standarda U sekciji Method task/Calibration curve setup, čekira se FORCE kako bi grafik prošao

kroz nulu. Da bi se izvršila kalibracija u odeljku Method/Create Levels from Calibration Samples za

seriju standardnih rastvora potrebno je podesiti željene koncentracije standarda. U slučaju da neki od standarda imaju istu koncentraciju može se izvršiti kopiranje vrednosti koncentracija odabirom jedinjenja sa istim koncentracijama u odeljku Method/Copy Calibration Levels to. Ukoliko su uneti svi potrebni podaci, nova metoda može da bude validirana i sačuvana odabirom opcije Validate iz sekcije Save/Exit.

Podešavanje integratora vrši se u odeljku Method/Edit/Method Tasks/Advanced Task. Za sve uzorke podesiti MS – MS metod integracije i zapamtiti podešavanje (slika 14):

33

slika 14: Podešavanje integratora

Analiza serije rezultata vrši se klikom na dugme Analyze Batch, dok se čuvanje podataka postiže odabirom komande Save Batch iz File sekcije (slika 15).

slika 15: Analiza i čuvanje rezultata Ovako dobijeni rezultati se dalje mogu koristiti i obrađivati.

34

III rezUlTaTI I dIskUsIja

35

Cilj ovog rada je izbor odgovarajuće metode pripreme uzoraka zemljišta za analizu PAH-

ova. Analizirano je 16 PAH-ova koji su prioritetni po EU standardima (Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen, Benzo[a]piren, Benzo[b]fluoranten, Benzo[ghi]perilen, Benzo[k]fluoranten, Krizen, Dibenzo[a,h]antracen, Fluoranten, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]piren, Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften). Kao metode za pripremu uzoraka, u cilju njihove ekstrakcije korišćena je ultrazvučna ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija sa smešom rastvarača cikloheksan/aceton i disperzivna ekstrakcija čvrstom fazom (QuEChERS), a kvantifikacija izvršena primenom GC-MS analizesnimanjem u SIM modu.

3.1. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom sistemom rastvarača heksan/aceton

Hromatogrami uzorka i standardnih rastvora pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom u sistemu heksan/aceton dobijeni snimanjem u SIM modu dati su na slikama 16 – 21:

Slika 16: Hromatogram slepe probe pripremljene ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)

Slika 17: Hromatogram standarda 1 pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)

6x10

0

0.

0.

0.

0.

0.

0.

0.

0.

0.

1

1.

1.

1.

1.

+EI TIC SIM P2.d

18.049

12.106

16.209

30.617

34.481

7.107

9.680

20.67024.282

28.85539 302 43 17621 681 32 802 46 59014 134 35 9645 811 49 562

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324

Counts vs. Acquisition Time (min)

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

-0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1.

1.

1.

+EI TIC SIM P0.d

16.210

18.670

30.628

34.492

7.085

9.670

12.084 24.27820.666 28.854 40.38938.258 46.59732.802 35.965 49.57914.1296.337 43.996

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324 2


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

36

Slika 18:Hromatogram standarda 2 pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)



Slika 21: Hromatogram uzorka pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)

6x10

0

0.

0.

0.

0.

1

1.

1.

1.

1.

2

2.

2.

+EI TIC SIM P3.d

18.077

12.132

16.211

30.617

34.4807.11220.6759.687

24.28628.861

39 299 43 17421 682 33 2015 818 25 72014 135 37 161 46 587 49 559

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0.

1

1.

2

2.

3

3.

4

4.

+EI TIC SIM P4.d

12.218

18.171

16.22520.710

30.6367.127 24.307 34.4949.710 28.885

39 308 43 18133 25714 142

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0.

1

1.

2

2.

3

3.

4

4.

5

+EI TIC SIM P5.d

12.257

18.215

20.730

16.220 24.31830.625 34.5777.132

9.70939 307 43 18333 244

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

4x10

0

0

0

0

0

1

1

1

1

+EI TIC SIM P4A.d

18.045

12.186

16.228

20.6838.632 41.28837.97630.58524.292 34 40514 187 43 184 48 037

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

37

Iz dobijenih hromatograma uočljivo je da su odabrani optimalni uslovi GC/MS analize koji omogućavaju dobro razdvajanje i dobijanje pikova. Bazna linija je takođe ravna što ukazuje na odsustvo šuma i visok odnos signal/noise.

U tabeli 5 prikazana su retenciona vremena analiziranih PAH-ova dobijena snimanjem hromatograma u SIM modu. Uočava se da krizen i benzo[a]antracen imaju iste vrednosti retencionih vremena, obzirom na veoma sličnu strukturu tako da nisu mogli biti hromnatografski razdvojeni, a i fragmentacija je ista, te će prilikom kvantifikacije biti određivana suma ova dva PAH-a.

Tabela 5: Retenciona vremena analiziranih PAH-ova

PAH Retenciono vreme (min) Acenaftilen 18,216 Antracen 24,493

Benzo[a]piren 39,307 Benzo[b]fluoranten 38,263 Benzo[ghi]perilen 43,999

Benzo[k]fluoranten 38,347 Krizen, Benzo[a]antracen 34,577

Dibenzo[a,h]antracen 43,182 Fluoranten 28,900

Fluoren 20,731 Indeno[1,2,3-cd]piren 43,046

Naftalen 12,259 Fenantren 24,318

Piren 29,717 Acenaften 18,962

Kvantitativna analiza PAH – ova u uzorcima izvršena je korišćenjem kalibracionih prava dobijenih analizom serije standardnih rastvora. U tabeli 6 su prikazane jednačine kalibracionih prava, R2 vrednosti i opseg koncetracija u kojima je moguće analizirati svaki od ispitivanih PAH-ova u uzorcima pripremljenim ultrazvučnom ekstrakcijom korišćenjem rastvarača heksan/aceton.

38

Tabela 6: jednačine kalibracionih prava, R2 vrednosti opseg koncetracija analiziranih PAH-ova pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)

Primenom odgovarajućih jednačina kalibracionih prava izračunate su pojedinačne koncentracije svakog od PAH-ova prisutnih u ispitivanom uzorku, sa izuzetkom krizena i benzo[a]antracena koji su određivani u sumi. Dobijeni rezultati prikazani su u tabeli 7.

PAH Jednačina kalibracione prave R2 opseg koncetracija

(μg/ml)

Acenaftilen y = 1,765972*x 0,9593 9,0826 - 206,5009

Antracen y = 1,068766*x 0,9524 0,4148 - 10,3956

Benzo[a]antracen + Krizen y = 0,1,429554*x 0,9724 0,0612 - 0,9371

Benzo[a]piren y = 0,611062*x 0,9721 0,0522 - 0,1767

Benzo[b]fluoranten y = 1,024099*x 0,8379 0,0687 - 0,9307

Benzo[ghi]perilen y = 0,270746*x 0,9701 0,0512 - 0,1826

Benzo[k]fluoranten y = 1,044386*x 0,8865 0,7004 - 9,2916

Dibenzo[a,h]antracen y = 0,353734*x 0,9727 0,1359 - 1,8631

Fluoranten y = 1,014069*x 0,9528 0,4385 - 10,3956

Fluoren y = 1,872373*x 0,9525 0,8321 - 20,7914

Indeno[1,2,3-cd]piren y = 0,181204*x 0,9685 0,0995 - 1,8789

Naftalen y = 1,635415*x 0,9624 9,2182 - 205,7796

Fenantren y = 1,751516*x 0,9551 0,4620 - 10,3716

Piren y = 1,014491*x 0,9765 0,5768 - 9,3972

Acenaften y = 1,170720*x 0,9592 8,9853 - 206,5123

39

Tabela 7: Koncentracije pojedinačih PAH-ova u uzorku zemljišta pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton)

Iz tabele 7 se uočava se da je u uzorku zemljišta u najmanjoj koncentraciji bio prisutan benzo[k]fluoranten (0,0233μg/ml), a najviše je bilo naftalena (47,2767 μg/ml). Smeša krizena i benzo[a]antracena u ovom uzorku nije detektovana.

PAH Koncentracije pojedinačih PAH-ova u

uzorku zemljišta (μg/ml)

Acenaftilen 34,9856 Antracen 0,3016


Benzo[k]fluoranten 0,0233 Krizen+Benzo[a]antracen n.d.





40

3.2. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom, sistemom rastvarača cikoloheksan/aceton

Hromatogrami standardnih rastvora i uzorka zemljišta pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom u sistemu cikloheksan/aceton dobijeni snimanjem u SIM modu dati su na slikama 22 – 26:

Slika 22:Hromatogram slepe probe pripremljene ultrazvučnom ekstrakcijom

(cikloheksan/aceton)

Slika 23: Hromatogram standarda 1 pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom


Slika 24:Hromatogram standarda 2 pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom


6x10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

1

+EI TIC SIM Q0A.d

16.274

30.68318.719

7.128

9.787 34.500

21.746

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

5x10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

+EI TIC SIM Q2A.d

16.256

18.719

30.663

7.12912.143

34.5009.769

20.68324.290 28.865

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

1

1

1

+EI TIC SIM Q3A.d

12.200 18.129

16.276

30.6867.163

8.495

20.701 34.500

24.30028.87521.748

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

41

Slika 25:Hromatogram standarda 3 pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom


Slika 26: Hromatogram uzorka pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom (cikloheksan/aceton)

Kvantitativna analiza PAH – ova u uzorcima izvršena je korišćenjem kalibracionih prava

dobijenih analizom serije standardnih rastvora. U tabeli 8 su prikazane jednačine kalibracionih pravi, R2 vrednosti i opseg koncetracija u kojima je moguće analizirati svaki od ispitivanih PAH-ova u uzorcima pripremljenim ultrazvučnom ekstrakcijom korišćenjem rastvarača cikloheksan/aceton.

6x10

0

0

0

0

0

1

1

1

1

+EI TIC SIM Q4A.d

12.22518.168

16.264

30.6787.116

20.715

9.772 34.70124.31228.887

21.740

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

+EI TIC SIM Q2.d

16.272

18.077

12.160 30.676

7.161

8.500

34.500

20.68824.293 28.866

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

42

Tabela 8: jednačine kalibracionih prava i R2 vrednosti analiziranih PAH-ova pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom (cikloheksan/aceton)



(μg/ml)

Acenaftilen y=0,3517*x 0,9687 20,0239 - 191,1459

Antracen y=0,38636*x 0,9703 0,91055 - 9,6309

Benzo[a]antracen + Krizen y=0,256852*x 0,9696 0,1091 - 0,7375

Benzo[a]piren y=0,430515*x 0,9701 0,0526 - 0,1388

Benzo[b]fluoranten y=0,410923*x 0,9706 0,1065 - 0,7409

Benzo[ghi]perilen y=0,243916*x 0,9694 0,0499 - 0,1436

Benzo[k]fluoranten y=0,235154*x 0,9711 2,7115 - 6,6457

Dibenzo[a,h]antracen y=120,033604*x 0,2456 0,2518 - 1,4687

Fluoranten y=181,055081*x 0,3780 0,9392 - 9,6365

Fluoren y=97,691617*x 0,2529 1,8747 - 19,2333

Indeno[1,2,3-cd]piren y=102,982227*x 0,1067 0,1875 - 1,4964

Naftalen y=56,534811*x 0,2618 20,2962 - 190,4602

Fenantren y=12,962664*x 0,3163 1,0004 - 9,5888

Piren y=29,399820*x 0,2308 1,0296 - 7,3174

Acenaften y=18,6687*x 0,2775 20,2244 - 190,7908

43

Tabela 9: Koncentracije pojedinačih PAH-ova u uzorku zemljišta pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom (cikloheksan/aceton)

Iz tabele 9 se uočava da je uzorku zemljišta pripremljenom ultrazvučnom ekstrakcijom korišćenjem sistema raszvarača cikloheksan-aceton u najmanjoj koncentraciji bio prisutan benzo[k]fluorantena (0,0159μg/ml), a u najvećoj koncentraciji je bilo naftalena (5,9894 μg/ml).

PAH Koncentracije pojedinačih

PAH-ova u uzorku zemljišta (μg/ml)



Benzo[k]fluoranten 0,0159 Krizen, Benzo[a]antracen 1,6397





44

3.3. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim QuEChERs ekstrakcijom

Hromatogrami standardnih rastvora kao i uzorka zemljišta pripremljenih QuEChERs ekstrakcijom dobijeni snimanjem u SIM modu prikazani su na slikama 27 – 33:

Slika 27: Hromatogram slepe probe pripremljeneQuEChERs ekstrakcijom

Slika 28: Hromatogram standarda 1 pripremljenog QuEChERs ekstrakcijom

Slika 29: hromatogram standarda 2 pripremljenog QuEChERs ekstrakcijom

5x10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

+EI TIC SIM S0.d

34.469

30.600

18.660

16.235

6.0547.803 9.949

14.335

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

5x10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

+EI TIC SIM S1.d

34.469

30.60018.660

16.234

12.2445.9757.766 9.927

14.31211.288 20.676 24.283 28.851 40 383

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

5x10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

+EI TIC SIM S2.d

34.469

18.053 30.600

12.254

16.237

7.7836.236 9.939 20.67824.28314.345 28.853

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

45




Slika 33: Hromatogram uzorka pripremljenog QuEChERs ekstrakcijom

6x10

0

0.

0.

0.

0.

1

1.

1.

1.

1.

2

+EI TIC SIM S3.d

18.072

12.247

34.48030.609

16.235

11.012 20.6796.205 24.285 28.8607.738 9.91314.875

23 257

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0.

1

1.

2

2.

3

3.

4

+EI TIC SIM S4.d

18.122

12.239

17.20234.50030.61520.693

24.29816.23028.880

6.2049.843

23.373

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

+EI TIC SIM S5.d

12.35318.278

11.326

20.760

24.359 34.62416.254 30.636

7.603 9.860

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

6x10

0

0.

0.

0.

1

1.

1.

1.

2

2.

2.

2.

3

3.

+EI TIC SIM S3A.d

18.068

12.245

34.48330.607

16.232

6.299 11.000 20.67624.2837.739 28.8589.912

14.685 23 386

1 12 23 34 45 56 67 78 89 910 1011 1112 1213 1314 1415 1516 1617 1718 1819 1920 2021 2122 2223 2324


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

46

Kvantitativna analiza PAH – ova u uzorcima izvršena je korišćenjem kalibracionih prava dobijenih analizom serije standardnih rastvora. U tabeli 10 su prikazane jednačine kalibracionih pravi, R2 vrednosti i opseg koncetracija u kojima je moguće analizirati svaki od ispitivanih PAH-ova u uzorcima pripremljenim QuEChERs ekstrakcijom.

Tabela 10: jednačine kalibracionih pravi i R2 vrednosti analiziranih PAH-ovapripremljenih QuEChERs ekstrakcijom



(μg/ml)

Acenaftilen y=3,493258*x 0,7695 0,1347 - 218,8681

Antracen y=3,899889*x 0,9068 0,0849 - 11,0733

Benzo[a]antracen + Krizen y=1,372622*x 0,8555 0,0054 - 1,1465

Benzo[a]piren y=3,285457*x 0,0885 0,0023 - 0,2256

Benzo[b]fluoranten y=0,223809*x 0,8496 0,0049 - 1,1638

Benzo[ghi]perilen y=1,617243*x 0,9068 0,0012 - 0,2295

Benzo[k]fluoranten y=1,843854*x 0,9163 0,2040 - 11,0429

Dibenzo[a,h]antracen y=295,246766*x 0,8082 0,0140 - 2,32031006

Fluoranten y=441,8933443*x 0,7664 0,1129 - 10,8631

Fluoren y=283,007142*x 0,8154 0,1967 - 22,2556

Indeno[1,2,3-cd]piren y=297,762254*x 0,8124 0,00845 - 2,3328

Naftalen y=181,833736*x 0,8142 0,7174 - 240,5718

Fenantren y=54,083338*x 0,8011 0,4740 - 11,2282

Piren y=105,115950*x 0,7991 0,088 - 11,2048

Acenaften y=78,197136*x 0,8000 1,5225 -227,4708

47

Tabela 11: Koncentracije pojedinačih PAH-ova u uzorku zemljišta pripremljenih

pripremljenih QuEChERs ekstrakcijom

PAH Koncentracije pojedinačih

PAH-ova u uzorku zemljišta (μg/ml)



Benzo[k]fluoranten 0,0071 Krizen+Benzo[a]antracen 0,5516





U cilju preglednijeg prikazivanja i upoređivanja rezultata dobijenih različitim metodama

pripreme uzoraka zemljišta, sačinjena je tabela 12 u kojoj su uporedno prikazani parametri tačnosti i preciznosti različitih analitičkih metoda pripreme uzoraka zemljišta.

48

Tabela 12: Uporedni pregled recovery vrednosti za svaki od analiziranih PAH-ova dobijenih različitim metodama pripreme uzoraka zemljišta za eksperimente uradjene u tri ponavljanja

PAH

Recovery (%) Ultrazvučna

cikloheksan/aceton

RSD (%)

Recovery (%) Ultrazvučna,

heksan/aceton

RSD (%)

Recovery (%)

QuECHERS

RSD

(%)

Acenaftilen 99,39 17,3 107,4 11,01 113,81 1,13

Antracen 100,16 18,70 108,11 8,51 115,16 4,09

Benzo[a]piren 76,71 15,79 97,46 11,38 119,23 2,53

Benzo[b]fluoranten 72,21 17,28 105,52 9,28 117,32 2,99

Benzo[ghi]perilen 77,06 14,87 96,79 10,72 121,05 2,42

Benzo[k]fluoranten 74,56 15,80 94,95 13,20 119,37 2,11

Krizen+Benzo[a]antracen 69,11 4,63 96,63 n.d. 114,84 3,00

Dibenzo[a,h]antracen 76,38 18,71 96,88 14.19 120,65 2,32

Fluoranten 100,22 16,56 108,11 14,38 112,98 9,10

Fluoren 100,01 7,48 108,11 8,02 115,73 6,08

Indeno[1,2,3-cd]piren 77,81 12,65 97,71 14,17 121,30 8,98

Naftalen 99,04 17,88 107,00 13,82 125,10 3,78

Fenantren 99,73 16.53 107,86 3,95 116,77 8,91

Piren 76,10 9,87 101,15 5,51 116,53 3,36

Acenaften 99,21 17.32 130,04 13,33 118,28 5.53

Iz tabele 12 je uočljivo da se QuECHERS ekstrakcija odlikuje najvećom recovery vrednošću, najmanjim vrednostima za relativnu standardnu devijaciju kao i najširim opsegom koncentracija (Tabele 6.,8.,10.) u kojima je moguće određivanje svakog od navedenih PAH-ova, te se ona preporučuje kao optimalna metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu PAH-ova. Osim toga, metoda je i najekonomičnija u smislu vremena potrebnog za pripremu uzoraka, kao i količine utrošenih hemikalija.

49

Iv zakljUcak

50

PAH-ovi predstavljaju veliku grupu veoma opasnih organskih zagađivača, prisutnih u svim delovima životne sredine. Naročito dugo se zadržavaju u zemljištu, otkuda se različitim mehanizmima mogu preneti u druge delove životne sredine i dospeti u biljke, životinje pa i ljude. Stoga je praćenje njihovog sadržaja u zemljištu veoma važno, a razvoj novih I optimizacija postojećih analitičkih postupaka sve vise dobija na značaju. U savremenoj praksi je broj instrumentalnih tehnika za određivanje PAH-ova relativno ograničen i svodi se na različite hromatografske tehnike. Mnogo veći problem i izazov predstavljaju metode za pripremu uzoraka za analizu, s obzirom da se radi o složenim uzorcima u kojima je analizirana supstanca obično praćena jedinjenjima slične strukture, fizičkih i hemijskih osobina.

U ovom radu je ispitivano nekoliko metoda za pripremu uzoraka zemljišta u cilju određivanja 16 PAH-ova koji su prioritetni po preporukama US EPA (Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen, Benzo[a]piren, Benzo[b]fluoranten, Benzo[ghi]perilen, Benzo[k]fluoranten, Krizen, Dibenzo[a,h]antracen, Fluoranten, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]piren, Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften) primenom GC-MS tehnike za kvantifikaciju. PAH-ovi su iz zemljišta ekstrahovani ultrazvučno primenom dva sistema rastvarača (heksan/aceton i cikloheksan/aceton) i QuEChERS ekstrakcijom.

Metoda pripreme zemljišta primenom QuECHERS ekstrakcije se odlikuje najvećom recovery vrednošću, najmanjim vrednostima za relativnu standardnu devijaciju kao i najvećim opsegom koncentracija u kojima je moguće određivanje svakog od navedenih PAH-ova, te se ona preporučuje kao optimalna metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu PAH-ova. Metoda se izvodi za najkraće vreme primenom vrlo jednostavne i lako dostupne laboratorijske opreme i tehnika, uz korišćenje minimalne količine organskih rastvarača i drugih potrebnih reagenasa, pa je i sa aspekta ekonomičnosti najprihvatljivija za primenu u svakodnevnoj praksi.

51

v reference

52

1. Boström C. E., Gerde P., Hanberg A., Jernstrom B., Johansson C., Kyrklund T., Rannug A., Tornqvist M., Victorin K., Westerholm R., 2002., Cancer risk assessment, indicators, and guidelines for polycyclic aromatic hydrocarbons in the ambient air, Environmental Health Perspectives 110, 451−488,

2. Boyd R.K., Basic C., Bethem R.A., 2008., Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, John Wiley & Sons Ltd., Chichester,

3. Eskilsson C.S., Bjorklund E.J., 2000., Analytical-scale microwave-assisted extraction, J Chromatogr A, 902, 227 – 250,

4. European Commission, 2005., Commission recommendation of 4 February 2005 on the further investigation into the levels of polycyclic aromatic hydrocarbons in certain foods, Official Journal of the European Union, L 34, pp. 43–45,

5. http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out154_en.pdf 6. http://en.wikipedia.org/wiki/Polycyclic_aromatic_hydrocarbon#cite_note-1 7. http://www.health.sa.gov.au/pehs/PDF-files/ph-factsheet-PAHs-health.pdf 8. http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CB8QFj

AA&url=http%3A%2F%2Fwww.akreditacija.hr%2Fagencija%2Fcasopis%2F11.pdf&ei=zQ0SVNbjDqnNygO_zYCoBQ&usg=AFQjCNE9llH8WSmO9vuES0hXPaab87H4hQ&sig2=hvp7IQGu5ttm7zaqIpBO0A

9. http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/gasna-hromatografija-masena-spektrometrija-gc-ms

10. http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/maseni-spektrometar 11. Jira W., Ziegenhals K., Speer K., 2006., PAH in smoked meat products according to EU

standards, Fleischwirtschaft International, 4, 11-17, 12. K. Joa, E. Panova, N. Irha, E. Teinemaa, J. Lintelmann, U. Kirso, 2009., Determination

of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in oil shale processing wastes: current practice and new trends, Oil Shale, Vol, 26, No, 1, pp. 59–72

13. Larsen J.C., Alexander J., 2002., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons – Occurrence in foods, dietary exposure and health effects, Brussels Belgium

14. Nadal M., Schuhmacher M., Domingo J.L., 2004., Levels of PAHs in soil and vegetation samples from Tarragona County, Spain, Environmental Pollution 132, 1-11

15. Nam J.J., Song B.H., Eom K.C., Lee S.H., Smith A., 2003., Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils in South Korea, Chemosphere 50, 1281–1289

16. Nisbet I.C.T., LaGoy P.K., 1992., Toxic equivalency factors (TEFs) for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), Regulatory Toxicology and Pharmacology 16, 290-300,

17. Popp P., Keil P., Moder M., Paschke A., Thuss U., 1997., Application of accelerated solvent extraction followed by gas chromatography, high-performance liquid chromatography and gas chromatography; mass spectrometry for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons, chlorinated pesticides and polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans in solid wastes, J Chromatogr, 774, 203–211,

http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out154_en.pdf

http://en.wikipedia.org/wiki/Polycyclic_aromatic_hydrocarbon#cite_note-1

http://www.health.sa.gov.au/pehs/PDF-files/ph-factsheet-PAHs-health.pdf

http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CB8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.akreditacija.hr%2Fagencija%2Fcasopis%2F11.pdf&ei=zQ0SVNbjDqnNygO_zYCoBQ&usg=AFQjCNE9llH8WSmO9vuES0hXPaab87H4hQ&sig2=hvp7IQGu5ttm7zaqIpBO0A




http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/gasna-hromatografija-masena-spektrometrija-gc-ms

http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/gasna-hromatografija-masena-spektrometrija-gc-ms

http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/maseni-spektrometar

53

18. Saim N., Dean J.R., Abdullah M.P., Zakaria Z., 1998., An experimental design approach for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from highly contaminated soil using accelerated solvent extraction, Anal, Chem,70, 420 - 424,

19. Toth L., Blaas W., 1972., The effect of smoking technology on the content of carcinogenic hydrocarbons in smoked meat products, II, Effect of smoldering temperature of wood and of cooling, washing and filtering of smoke, Fleischwirtschaft, 52, 1419–1422,

20. Weis L.M., 1998., Bay or baylike regions of polycyclicaromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gapjunctional intercellular communication, Environ, Health Perspect, 106, 17–22,

21. Wilcke Wolfgang, 2007., Global patterns of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil, Rewiew, Geoderma 141, 157–166

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Јелена Ђорђевић Ментор, МН: Виолета Митић Наслов рада, НР:

Испитивање метода припреме узорака земљишта за анализу органских загађивача

Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2014.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

5 поглавља/ 55 стране/ 12 табела/ 33 слика

Научна област, НО: хемија Научна дисциплина, НД: аналитичка хемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Органски загађивачи, припрема узорака, полициклични

ароматични угљоводоници (PAH), валидација аналитичких метода, гасна хроматографија, масена спектрометрија

УДК 504.054 + 54 : 628.4

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У оквиру овог мастер рада вршено је испитивање различитих метода

припреме узорака земљишта у којима ће се квантитативно одређивати ПАХ-ови. Анализирано је 16 ПAХ-ова применом ГЦ-МС технике. ПАХ-ови су из земљишта екстраховани ултразвучно применом два система растварача (хексан/ацетон и циклохексан/ацетон) и QuEChERS екстракцијом. Најприхватљивија је метода QuEChERS екстракција која се одликује највећом recovery вредношћу, нajмaњим врeднoстимa зa рeлaтивну стaндaрдну дeвиjaциjу кao и нajвeћим oпсeгoм кoнцeнтрaциja у кojимa je мoгућe oдрeђивaњe свakoг oд нaвeдeних ПAХ-oвa. Веома је кратко време одређивања, једноставна опрема и мале количине растварача чине је веома економичном методом.

Датум прихватања теме, ДП: 15. 01. 2014. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан:

Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: University master degree thesis Author, AU: Jelena Đorđević Mentor, MN: Violeta Mitić Title, TI: Testing methods of sample preparation for analysis of

organic pollutants

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014. Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

5 chapters/ 55 pages/ 12 tables/ 33 pictures

Scientific field, SF: chemistry Scientific discipline, SD: analitical chemistry Subject/Key words, S/KW: Organic contaminants, sample

preparation, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), validation of analytical methods, gas chromatography, mass spectrometry

UC 504.054 + 54 : 628.4 Holding data, HD: library

Note, N: Abstract, AB: The objective of this master thesis was investigation of different

methods of preparing samples for analysis of PAH. We analyzed 16 PAHs using GC-MS techniques. PAHs were ultrasonically extracted from the soil using two solvent systems (hexane / acetone and cyclohexane / acetone) and QuEChERS extraction. The most suitable method for samples preparation for PAHs analysis is QuEChERS extraction. It is characterized by the highest value of the recovery, the smallest values of the relative standard deviation and the biggest range for PAHs determination. Also, QuEChERS extraction is a very economical method because it needs very short time for preparation simple equipment and small

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15. 01. 2014. Defended on, DE: 30.9.2014 Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Documents

Ispitivanje metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu ... · U zavisnosti od molekulske mase oni se u atmosferi mogu zadržavati ili ne, pa tako se teški PAH-ovi adsorbuju na