Dr Marta Żebrowska

Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki,

Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej

Molekularne markery nowotworowe

Źródło ryc: http://www.utmb.edu/scccb/; http://www.bioflawonoidy.com.pl/wolne_rodniki.php; glejak-mozgu-rak-mozgu-300x181.com

Etapy kancerogenezy

- nadekspresja onkogenów

- zahamowanie ekspresji genów supresorowych

- zahamowane ekspresji genów mutatorowych

-aktywacja telomerazy

-zmiany epigenetyczne

-zahamowanie apoptozy

Tor mutacyjny raka jelita grubego

Źródło Ryc.: Żelazowski M i wsp. „Molekularne modele nowotworzenia w raku jelita i odbytnicy.” Współczesna onkologia 2010; 14(3); 181-188

Dążenie do rozpoznawania nowotworu na jak

najwcześniejszym (bezobjawowo stadium choroby)

etapie rozwoju jest bodźcem dla rozwoju diagnostyki

onkologicznej w tym także diagnostyki molekularnej

Marker genetyczny / molekularnym

• zmiana w strukturze, sekwencji lub

ekspresji materiału genetycznego

diagnostyka molekularna daje

narzędzia, które pozwalają na

wykrycie zmian w DNA, RNA,

białku już w pojedynczej komórce

techniki molekularne pozwalają

na wykrywanie mutacji

charakterystycznych dla danego

typu nowotworu

Źródło:http://pixers.pl/obrazy-i-plakaty/helisa-dna-pod-lupa-w-centrum-uwagi-44108803

Markery molekularne znalazły zastosowanie w:

-w badaniach predyspozycji

-diagnozowaniu

-prognozowaniu przebiegu choroby

-wyborze terapii

Źródło: http://pl.123rf.com/photo_4335910_izolowanego-dna-pochodzace-z-testtube-wypelnione-niebieskim-plynu-na-bialym-

tle.html;http://pl.wikipedia.org/wiki/Reakcja_%C5%82a%C5%84cuchowa_polimerazy;http://nt.interia.pl/raport-medycyna-przyszlosci/medycyna/news-zaprojektuj-sobie-dziecko-narodziny-syntetycznej-

genetyki,nId,935128;: httpblog.ebdna.plindex.phpjedno-z-najwiekszych-zagrozen-ludzkosci-wciaz-niepokonane

Typy markerów molekularnych w diagnostyce chorób nowotworowych:

1. Markery genowe

2. Markery klonalności

3. Markery prognostyczne

4. Markery tkankowo specyficznej ekspresji

Markery genowe

umożliwiają rozpoznawanie zmian w genach, które tworzą tory mutacyjne

pozwalają na identyfikacje zmian charakterystycznych w komórce nowotworowej

w genomie komórki nowotworowej występuje więcej niż pojedyncza zmiana

pojedyncza zmiana w genie może służyć jako molekularny marker nowotworowy

należy pamiętać, że obecność pojedynczej zmiany nie zawsze musi wskazywać na komórkę nowotworową

Markery genowe

dotychczas tylko w przypadku kilku jednostek chorobowych znaleziono związek pomiędzy

mutacjami w określonym genie lub określonej pozycji danego genu a ich rozwojem i agresywnością

przebiegu

skomplikowany i złożony mechanizm kancerogenezy nie pozwala na znalezienie wielu

jednoznacznych korelacji między określoną zmianą mutacyjną genotypu a typem nowotworu

obecna diagnostyka jest głównie nastawiona na jak najwcześniejsze odróżnienie komórki

nowotworowej od komórki prawidłowej

Przykłady korelacji pomiędzy defektem molekularnym a chorobową nowotworową

MUTACJA RODZAJ NOWOTWORU

Mutacja w kodonie 12 protonoogenu Ki-RAS

- zmiana charakterystyczna dla 85-95% pierwotnych gruczolakoraków trzustki - mutacja nie jest praktycznie obserwowana w zmianach nienowotworowych (przewlekłe zapalenie trzustki) czy w tkance prawidłowej

Mutacje w protoonkogenie RET

-mutacja w kodonach 630 i 634 -mutacja w kodonach 883 i 918 -mutacje w kodonach 609,611,618 oraz 768,790,791 i 804

- zmiana związana z dziedzicznym rdzeniastym rakiem tarczycy - zespół MEN-2A (mnoga gruczolakowatość wewnątrzwydzielnicza typu II A) - zespół MEN-2B (mnoga gruczolakowatość wewnątrzwydzielnicza typu II A) - zespół FMTC (rodzinny rdzeniasty rak tarczycy)

Mutacje w genach KIT (głównie eksony 11 i 9) lub PDGFR (głównie eksony: 11 i 18)

- GIST (mięsaki podścieliska przewodu pokarmowego)

Gen fuzyjny BCR-ABL (po translokacji 9;22 -chromosom Philadelfia)

- 95% przewlekłych białaczek szpikowych (PBS;CML)

Markery klonalności

Pozwalają rozpoznać czy dany rozrost nowotworowy ma charakter klonalny

Guz – rozrost oligoklonalny

Nowotwory wywodzące się z układu hematopoetycznego (chłoniaki, białaczki) –

rozrost mono- bi-klonalny

Markery klonalności wykorzystywane są w diagnostyce chłoniaków i białaczek

Markerami klonalności mogą być:

- geny immunoglobulinowe

- geny receptorów limfocytów T

- sekwencje mikrosatelitarne

- geny fuzyjne

Markery prognostyczne

Rozpoznawanie w genomie charakterystycznych zmian, które pozwolą na

przewidywanie przebiegu choroby nowotworowej

Markery te mogą być wykorzystane jako wskaźniki:

- prognozujące przebieg choroby

- czasu do wznowy choroby nowotworowej

- pięcio- i dzieśiecioletniego przeżycia bez wznowy choroby

Markery prognostyczne

Przykłady:

Zwielokrotnienie liczby kopii onkogenu prowadzące do stymulacji proliferacji

-amplifikacja N-MYC w neuroblastoma świadczy o agresywności procesu

nowotworowego oraz wskazówką do prowadzenia intensywnej terapii

-nadekspresja białka receptorowego HER2 będąca konsekwencją amplifikacji genu c-

ERB-B2 jest związana ze złym rokowaniem

Pomiar ekspresji genów tworzących aktywną cząsteczkę telomerazy

-telomeraza jest nieaktywna w większości komórek prawidłowych; zostaje natomiast

zaktywowana w komórkach nowotworowych, przeciwdziała skracaniu telomerów

Markery tkankowo specyficzne

Rozpoznanie transkryptu genów, które ulegają ekspresji jedynie w

określonym typie komórek

Umożliwiają rozpoznanie danego typu komórek w otoczeniu nawet kilku

milionów komórek innego typu np.: krew obwodowa

Ocena zdolności przerzutowania danego nowotworu

Przykład:

Wykrywania krążących we krwi obwodowej komórek czerniaka:

- ocena ekspresji genu tyrozynazy

- we krwi obwodowej jedynymi komórkami które wykazują ekspresję tego genu

są komórki czerniaka

- test jest wysoce specyficzny i czuły – pozwala na wykrycie pojedynczej komórki

czerniaka w 5 ml krwi obwodowej

Sygnatura nowotworowa

•Jest najczęściej obrazem zmian w kilkunastu do kilkudziesięciu genach, które

wydają się być najlepszymi markerami danej jednostki chorobowej

•Pozwala na tworzenie nowej molekularnej klasyfikacji nowotworów

Klasyfikacja nowotworów na podstawie profilowania ekspresji genów

ZALETY WADY

Analiza całego transkryptomu w jednym badaniu

Brak standaryzacji metodologii oraz analizy danych (znaczna liczba wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych

Alternatywa dla konwencjonalnej diagnostyki

Zbyt dużo danych utrudniających stosowanie w rutynowej diagnostyce

Krótki czas analizy Zbyt mała liczba przebadanych grup nowotworów przez niezależne laboratoria

Duża dokładność, swoistość, czułość Konieczność potwierdzania uzyskanych wyników tradycyjnymi technikami genetycznymi

Możliwość diagnostyki w obrębie heterogennych typów nowotworów

Możliwość diagnostyki nowotworów trudnych do odróżnienia w badaniu histopatologicznym (subklasyfikacja nowotworów o zbliżonej budowie)

Korelacja z rokowaniem, odpowiedzią na leczenie oraz długością przeżycia

Źródło: Tabelę stworzono na podstawie: Szczepanek i wsp. „Postępy w kierunku molekularnej klasyfikacji nowotworów u dzieci” Postepy

Hig Med Dosw, 2008; 62; 222-240

Wybrane geny jako molekularne markery nowotworowe

Gen K-ras (protoonkogen)-biorący udział w przekazywaniu sygnałów mitogennych

•mutacje:

- prowadzą do nadmiernej proliferacji komórek

- gorsze rokowanie, szybsza progresja choroby

- oporność na terapie anty-EGFR (co jest wiązane z uniezależnieniem komórek od

przekaźnictwa sygnałowego pochodzącego z receptorów błonowych)

np.. rak płuca, głowy i szyi, jelita grubego

Wybrane geny jako molekularne markery nowotworowe

Receptor HER2 kodowny przez onkogen ErbB2; poprzez tworzenie dimerów z innymi

członkami rodziny HER dochodzi do fosforylacji wewnątrzkomórkowej domeny

receptora. Fosforylacja prowadzi do aktywacji szlaków sygnałowych inicjujących

proliferację oraz hamujących apoptozę

- czynnik predykcyjny – nadmierna aktywacja szlaku sygnałowego wiąże się z

opornością na terapie hormonalną

Wybrane geny jako molekularne markery nowotworowe

Gen EGFR – zaburzenia ekspresji wiążą się z nadmierną proliferacją i upośledzeniem

apoptozy

•czynnik predykcyjny

- pacjenci z mutacjami (19 delecji w eksonie 19; substytucja L858R w eksonie 21

substytucja w G719X eksonie 18) odznaczali się znacznie wyższym odsetkiem

odpowiedzi na leczenie erlotynibem i gefitynibem niż pacjenci z dzikim typem genu

(70-80% vs 1-7%)

-mutacja T790M w eksonie 20 oraz liczne insercje w tym eksonie są wiązane z

występowaniem wtórnej oporności na leczenie

Geny podatności

Obecność mutacji danego genu we wszystkich komórkach organizmu dowodzi, iż mają

one charakter mutacji germinalnej (odziedziczonej)

Występują one w przypadku dziedzicznych predyspozycji do rozwoju nowotworu

Najczęściej zalicza się do nich:

- geny supresorowe (np. APC; RB1; BRCA1; BRCA2)

- geny stabilizujące-uczestniczące w naprawie uszkodzeń DNA (np. hMSH2;

hMLH1)

Nieliczne zespołu dziedzicznych predyspozycji do rozwoju nowotworu są wiązane z

aktywacją protoonkogenów (np. RET, KIT)

Dziedziczna predyspozycja do rozwoju nowotworu:

- u nosicieli danej mutacji ryzyko rozwoju nowotworu jest większe niż ryzyko populacyjne

-młody wiek zachorowania

-liczne zachorowania u krewnych

-współwystępowanie ognisk nowotworowych w narządach parzystych

-mnogie ogniska nowotworowe u jednego pacjenta lub też występowanie u tego samego

pacjenta dwóch lub więcej różnego rodzaju nowotworów

-osoby posiadające taką mutację powinny zostać objęte programem wczesnej profilaktyki,

badań kontrolnych oraz nie standardowym leczeniem

Zespół BRCA1

- konstytucyjna mutacja genu BRCA1

- u nosicielek ryzyko rozwoju: raka piersi wynosi 60% a raka jajnika 40%

-ryzyko zależy od rodzaju mutacji, jej lokalizacji w genie oraz czynników środowiska

- średni wiek zachorowania ok. 40 r. ż.; obustronność; szybkie tempo rozrastania

się guzów ; gorsze rokowanie

- w Polsce 90% mutacji BRCA1 to: 5382insC; 61C>G; 4153delA

- marker istotny w procesie rozpoznawania, prognozowania przebiegu choroby oraz

wyboru terapii

- wysoka ekspresja BRCA1 – niekorzystny czynnik predykcyjny w leczeniu

cisplatyną oraz karboplatyną

Zespół CHEK2:

-mutacje konstytucyjne genu CHEK2

-wysokie ryzyko rozwoju raka piersi (30-40%) i prostaty (ok. 40%)

- W polskiej populacji występują z częstością 1% mutacje skracające białko

IVS2+1G>A; del5395; 1100delC

- rozpoznanie tych mutacji jest niezwykle istotne dla wprowadzenia odpowiedniego

schematu badań kontrolnych

Zespół Lyncha

-zespół dziedzicznego niezwiązanego z polipowatością raka jelita grubego

-ok. 5% wszystkich raków jelita grubego

-powstaje w wyniku mutacji jednego z kilku genów (MSH2; MLH1; MSH6; PMS1; PMS2)

-nosicielstwo mutacji w genach MMR jest wiązane z 40-60% ryzykiem zachorowania

na raka jelita grubego

Zespół Lyncha II

-jedna z postaci dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego

-współwystępowanie raka jelita grubego oraz gruczolakoraków innych narządów

-w przypadku nosicielstwa mutacji w genie MSH2 ryzyko zachorowania wynosi 10%

-przypadku nosicielstwa mutacji w genie MLH1 ryzyko zachorowania wynosi 3,5%

Zespół Li-Fraumeni

-uwarunkowany genetycznie zespół predyspozycji do rozwoju nowotworu

-spowodowany mutacjami w genie TP53

-mutacje w genie TP53 są rozrzucone w obrębie sekwencji kodującej

-u pacjentów z zespołem Li-Fraumeni występuję zwiększone ryzyko rozwoju na:

- nowotwory tkanek miękkich

- nowotwory mózgu

- nowotwory kości

- raka kory nadnerczy

- białaczkę

-zachorowanie przed 45 r.ż.

Wybór terapii

Zmiany w genomie komórek mogą być wykorzystywane przy wyborze terapii

Przykładowo:

w nowotworach w których gen TP53 uległ mutacji lub delecji i nie spełnia swojej funkcji

należy rozważyć zastosowanie chemioterapii której celem nie jest apoptoza

indukowana przez p53

w mięskach podścieliska przewodu pokarmowego pacjenci z mutacjami w eksonie 11

genu KIT reagują na leczenie mniejszą dawką imatynibu niż pacjenci z mutacjami w

eksonie 9 KIT oraz obu eksonach genu PDGFR, a pacjenci bez mutacji w tych genach

rzadko reagują na leczenie imatynibem

Pacjenci z nadekspresją genu kodującego receptor HER2 reagują na leczenie

przeciwciałem monoklonalnym trastuzumab

Znaczenie kliniczne badań genetycznych

Molekularne markery nowotworowe mogą stać się przydatnym narzędziem, który

pozwoli na rozpoznawanie określonego typu nowotworu (precyzyjne powiązanie

zmiany genetycznej z jednostką chorobową), ułatwi prognozowanie jej przebiegu

oraz pomoże wskazać najskuteczniejszą terapię.

Ze względu na swoisty „podpis molekularny” danego nowotworu każdy z nich będzie

wymagał odrębnego opracowania

Zakres badań molekularnych w diagnostyce nowotworowej

1. Testy na obecność komórek nowotworowych:

-wykrywanie mutacji w genach torów mutacyjnych oraz w sekwencjach mikrosatelitarnych

-wykrywanie aktywności telomerazy

-wykrywanie zmian epigenetycznych w promotorach niektórych genów

2.Testy podatności – wykrywanie mutacji w genach

-BRCA1 i/lub BRCA2, NSB1; RER

-polimorfizmy w genach detoksykacji, naprawy DNA

3. Testy umożliwiające podjęcie decyzji terapeutycznej

-wykrywanie mutacji w genie TP53- niecelwość terapii opartej na TP53-zależnej apoptozie

-obecność amplifikacji genu HER2 – stosowanie p-ciała monoklonalnego anty-HER2

Źródło: Na postawie tabeli: „Zakres badań molekularnych w diagnostyce chorób nowotworowych.” Bal J. (red). „Biologia molekularna w medycynie.”PWN 2008 str.396

Dziękuję

Źródło: http://laboratoria.net/pl/artykul/Metody%20sekwencjonowania%20DNA;12972.html