PRUEBAS MOLECULARES EN APOYO A DIAGNÓSTICO DE

Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp, E. coli.

QFB. OSCAR URIEL ALVAREZ NERI

Lab. Microbiología Epidemiológica Febrero 2016

V. cholerae

V. parahaemolyticusPUNTO FINAL

E. coli

PCR Bacillus anthracis

Bordetella

RicketsiasTIEMPO REAL

Leptospiras

Salmonella

E. coli

V. choleraePFGE

V. parahaemolyticus

Enterobacter

Klebsiella

Neisserias

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa, (polymerasechain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular

Componentes de la reacción

* Cuatro desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP)

* Dos iniciadores (en inglés primers)

* ADN polimerasa, la más común es la polimerasa Taq

* ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

Etapas de la PCR:

* Desnaturalización

* Alineamiento

* Alargamiento (polimerización)

Detección del producto de la PCR

* Electroforésis

**agarosa**poliacrilamida

La posterior visualización se puede realizar conbromuro de etidio, gel star (lámpara de luz UV),tinción de plata.

Concentración recomendada de gel de agarosa paraseparar moléculas de ADN lineales.

Porcentaje Gramos de agarosa Gramos de agarosa Fragmentos de del gel (30mL de TBE 1X) (100mL de TBE 1X) ADN(%) (7 X 10 cm) (15 X 10 cm) (pb)

12

2.5

0.300 1,00 500 – 10 0000.600 2,00 100 – 2 5000.750 2,50 50 – 1 000

2 µL de Buffer deCarga (naranja G)

PARAFILM

8 µL de muestra

Muestra

Laboratorio deRecepción de

muestras

Laboratorio deCólera-

Enterobacterias

Identifica bioquímicamenteV. cholerae, Escherichia coli o V.

parahaemolyticus

Envía cepa a Laboratoriode Bacteriología Molecular

RealizaPCR punto

final

Resultado se entrega aLab. de Cólera-Enterobacterias

CEPAVibrio cholerae,

Escherichia coli oVibrio parahaemolyticus

Resuspender 1- 3 colonias en200 µL de agua

destilada

Hervir 15 min

GENES DE E. coli

gen Pares de bases (pb) Codifica para

LT 322 Toxina Termolábil

ST 185 Toxina Termoestable

ial 320 Locus asociado a la invasividad

bfp 324 Subunidad A del pili BFP

Hly A 1551 Hemolisina

eae 384 Fracción de A/E

stx1 150 Toxina similar a Shiga (stx1)

stx2 255 Toxina similar a Shiga (stx2)

aat 630 Factor de adherencia

484 T+ 484 T+ 484 T+Bco T- 482 483 Bco T- 482 483 Bco T- 482 483

aatbfpLT

ialST

484 T+Bco T- 482 483 T+Bco T- 482 483 484

Hly Aeaestx2 stx1

Escherichia coli

7

enterohermorrágica

81 2 3 4 5 6

hlyA

eaeAStx2

Stx1

Banda hlyA de 1551 bp,Banda eaeA de 384 bp,Banda Stx1 de 255 bp,Banda Stx2 de 150 bp.

CARRIL MUESTRA

1 ΦX 174/Hae III

2 BLANCO

3 Escherichia hermanii

4 Escherichia coli ATCC 25922

5 Cepa H. Gea González Agar Sangre

6 Cepa H. Gea González Base de AgarSangre

7 Testigo PositivoEscherichia coli O157 H7

8 ΦX 174/Hae III

EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR

Utiliza técnicas de biología molecular con el fin deevidenciar relaciones entre aislamientos de una misma especie, como herramienta para la vigilancia e investigación de brotes.

PFGE (pulsed field gel electrophoresis)

Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 unsistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron separar cromosomas de levadura de varios cientos de kpb

Es una técnica usada para la separación demoléculas de DNA muy largas en un gel de agarosa por la aplicación cambios periódicos dirección de un campo eléctrico.

de

PFGE

a 610 nm

Buffer

1mm +Buffer* 4 veces con TE 1X

con BrEtRevelarAnalizar

Bionumerics

Preparar gel 1% incluyendo el

plug

Realizar corrimiento

18-22h

Cortar PlugLavar* 2 veces con H2O

Restricción37°c o 50°C

2 a 4 h

EliminarVerter en Moldes (PLUG)

Plug+BLC+Prot K

Incubar a 54°C1.5-2h conAgitación

Ajustar DO 0.8-1Suspender enBSC

Cepa pura18-24h

Suspensión+agarosa 1%+ Prot. K

Somos miembros de la Red de PulseNet América Latinay el Caribe desde el año de 2004.

Existe interacción entre Latinoamérica cuando existenbrotes de interés internacional.

Certificado para realizar geles de Salmonella spp., yVibrio cholerae.

Certificado para realizar análisis de Salmonella spp.,y Vibrio cholerae.

Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos.México Departamento de Bacteriología

Laboratorio de Bacteriología Molecular.

Comparación de huellas enviadas, de corrimientos de cepas de Salmonella Agona asociadas a unbrote del 2011 en USA de alimento (papaya), enviadas por el CDC para detección de casos en nuestro país.No se encuentran huella similares en las cepas de nuestro país.

04 Cepas aisladas de Salmonella Braenderup obtenidas de coprocultivo delestado de Sinaloa, comparadas contra la cepa asociada a un brote pormangos en Canadá, aislada de humano.

31agosto2012

Corrimiento de 21 cepas de 24 de Salmonella Enteritidis del estado deMichoacán observándose un 100% de similitud en 15 de ellas. 04sept14

Herramienta “Show bands”

11 cepas de Salmonella Schwarzengrund digeridas con la primer enzima XbaI , brote Michoacán

25-mayo-2012

11 cepas de Salmonella Schwarzengrund digeridas con la segunda enzima BlnI , brote Michoacán

Evidencia de bandas por sistema Bionumerics, 3 cepas (1482,1483 y 1486) pierden la novena banda,sin embargo se observa un 95.2% de similitud con las demás, y recordando que con la primer enzimaobtenemos un 100%, podemos concluir que se trata de la misma clona.

05-junio-2012

Corrimiento de 9 cepas de Salmonella ser. Oranienburg y comparadas contra lacepa reportada en un brote en USA aislada de semillas de Chia. No tenemos aislamientos reportados en nuestro país de estas semillas. Concluimos que las cepas circulantes en nuestro país son diferentes a las reportadas.01julio2014

CASO E.coli EN HOSPITAL INFANTIL

Enterobacter cloacae en jardín de niños

Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae