Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM BIOKEMIJA 3. Letnik
FUNKCIJSKA GENOMIKA (izbirni predmet, 5 KT)
Prof. dr. Damjana Rozman [email protected]
Izr. prof. Dr. Uroš Petrovič
U R N I K 2104
LOKACIJE: MF (Medicinska fakulteta): MF-JZ – Katedra za javno zdravje, Zaloška4 (Seminar 1) MF-CFGBC – Center za funkcijsko genomiko in bio-čipe, Zaloška 4; MF-IBK – Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2 (Vajalnica) MF-IBMI – Inštitut za biomedicinsko informatiko, Vrazov trg 2 (Računalniška učilnica) OM – Oddelek za montanistiko, Aškerčeva 12 IJS – Jamova 39, stavba B, soba B220.
Teden Datum 2013
Tema predavanja ali vaj ura
lokacija Oblika pouka
število ur
1 17. 2. Genom in genomika 14-17:30 MF-JZ P 4 DR
2 24. 2. Transkriptomika Uvod v vaje 14-18:15
MF-JZ P+V 4+1 DR
3 3. 3. Vaja I – Izolacija RNA iz tkiv in analiza 14-17:30
MF-IBK V 4 ND TR
4 10.3. Vaja II - Priprava cDNA, označevanje, hibridizacija 14-17:30
MF-IBK V 4 ND TR
5 17. 3. Vaja III – Skeniranje in obdelava slike 14-17:30
MF-JZ, CFGBC
V 4 TR
6 24. 3. Metabolomika 14- 19 MF-JZ P+V 4+2 DR
7 31. 3. Vaja IV – Bio-informatika, statistika 14-18:15
MF-IBMI P+V 4+1 PJ
8 7. 4. Proteomika 14-17:30 OM, IJS V 4 UP
9 14. 4. Vaja V - Rudarjenje in povezovanje podatkov 14-17:30
MF-IBMI V 4 PJ
10 5. 5. Interaktomika, Modelni organizmi 14-19
OM, IJS P+V 4+2 UP
11 12. 5. Fenomika 14-19 OM, IJS P+V 4+2 UP
12 19. 5. Sistemska biologija 14-18:15 OM, IJS P+V 3+2 UP
13 26. 5. Pravni in etični vidiki Seminarji I 14-19
MF-JZ P+S 3+2 DR vsi
14 2. 6. Seminarji II 14-18:15 MF-JZ S 5 vsi
UNIVERZITETNI ŠTUDIJ BIOKEMIJE FKKT FUNKCIJSKA GENOMIKA Študijski režim 2013/2014
VAJE Vaje iz Funkcijske genomike potekajo po veljavnem urniku in trajajo od 1 do 4 šolske ure. Študent sme opravljati vajo le, če pokaže, da razume in pozna teoretične osnove kot tudi praktični potek vaje. Vaje genomike/transkriptomike in bioinformatike potekajo v vajalnicah Inštituta za biokemijo, Inštituta za bioinformatiko Medicinske fakultete UL, Vrazov trg 2 in na Centru za funkcijsko genomiko in bio-čipe, Zaloška 4. Vaje ter demonstracijske vaje iz proteomike, fenomike in modelnih organizmov bodo potekale v stavbi B Instituta »Jožef Stefan« (IJS) na Jamovi 39. RED V VAJALNICAH MEDICINSKE FAKULTETE UL IN IJS Zaradi varovanja zdravja in zaščite pred poškodbami se je potrebno pri vajah držati reda v vajalnicah. Oblačila in torb se ne sme odlagati na delovne površine in tla. Zaradi tega morajo študenti ob prihodu v vajalnico shraniti torbe in oblačila v garderobo. Prav tako se v vajalnici ne sme uživati in shranjevati pijače in hrane. Pri določenih eksperimentalnih vajah morajo študenti nositi rokavice, ki jih bodo dobili v vajalnici. Na uporabo rokavic jih bo posebej opozoril asistent, ki z njimi opravlja vajo. Na CFGBC in IJS bodo vaje potekale tudi v raziskovalnih laboratorijih, zato bodo prilagojene tako, da ne bodo motile delovnega procesa. PRISOTNOST NA VAJAH Za frekvenčni podpis mora študent opraviti vse vaje po programu. Prisotnost na vajah je obvezna. Študent lahko manjka iz opravičljivih razlogov pri največ eni vaji v semestru. Manjkajočo vajo mora nadomestiti z ustnim zagovorom po dogovoru z asistentom ali učiteljem. Študent, ki je zaradi opravičljivih razlogov manjkal pri več kot pri eni vaji, mora učiteljem predmeta nasloviti pisno prošnjo za opravljanje manjkajočih vaj.
UNIVERZITETNI ŠTUDIJ BIOKEMIJE FKKT FUNKCIJSKA GENOMIKA Študijski režim 2013/2014
SEMINARJI Seminarje pripravijo študenti samostojno ali v paru. Študentje so vnaprej sezanjeni z vsebino seminarskega dela. Seminar sestavlja pisni izdelek, kjer so predstavljene biokemijske osnove in analiza podatkov, ter ustna predstavitev. Pred oddajo prve pisne oblike seminarja je obvezna konzultacija z učiteljem. Pisni povzetek seminarja študent odda v pregled učiteljem najmanj dva tedna pred zagovorom, najmanj en teden pred predstavitvijo pa ostalim študentom letnika. Pisni povzetek seminarja mora biti strukturiran (povzetek, uvod, namen dela, obdelava podatkov, razultati, razprava, zaključek, literatura) in lahko obsega največ 2 tipkani strani. Ustna predstavitev seminarja traja 20 -30 minut. Za pomoč pri predstavitvi študent pripravi računalniško prezentacijo. Predstavitvi seminarja sledi razprava, kjer učitelji, kot tudi kolegi v skupini, postavljajo vprašanja. Seminar predstavlja 30% ocene predmeta. Pozitivno ocenjen seminar je pogoj za pristop k pisnemu izpitu. EKSPERIMENTALNI DEL Praktični del vaj poteka v dveh oblikah: i) aktivno – tu študenti delajo vaje samostojno ali v skupinah in ii) pasivno – tu demonstrator izvede praktični del vaje ali asistent simulira poskus z ustreznimi aparaturami ali računalniškim programom. Pri tem študenti delo opazujejo in dobijo meritve. V obeh primerih študenti meritve ali podatke analizirajo in razpravljajo o končnih rezultatih. Na koncu vaje študenti v delovnem zvezku napišejo poročilo. Vaja je opravljena, ko jo asistent potrdi s podpisom. Študent pridobi do 10% ocene glede na aktivno sodelovanje pri eksperimentalnih vajah, predavanjih in seminarjih in do10% ocene za kvaliteto bioinformatične obdelave podatkov. Opravljene vaje in pozitivno ocenjena bioinformatična naloga so pogoj za pristop k pisnemu izpitu. PREVERJANJE ZNANJA Znanje študentov se preverja sprotno in s pisnim izpitom. Pri sprotnem preverjanju študent pridobi do 30 točk za seminarsko delo z bioinformatično obdelavo (pozitivna ocena je 17 točk) in do 10 točk za aktivno sodelovanje pri predmetu. V primeru, da seminarska naloga ni ocenjena pozitivno, jo mora študent po dogovoru z učitelji popraviti. Dokler ne doseže pozitivne ocene, ne more pristopiti k pisnemu izpitu. Preostalih 60% ocene (60 točk) študent pridobi s pisnim izpitom. Pri pisnem izpitu pozitivno oceno predstavlja 40 ali več točk. Končno oceno predmeta sestavlja seštevek točk seminarske naloge z bioinformatično obdelavo, sodelovanja pri predmetu in pisnega izpita. V primeru, da študent ne zbere 40 točk pri pisnem izpitu, mora le-tega ponavljati. Prijavljanje na izpit in opravljanje pisnega izpita poteka v skladu z Izpitnim pravilnikom FKKT.
19. Stoletje G. Mendel odkrije vzorce dedovanja 20. Stoletje J. Watson in F. Crick leta 1953 razkrijeta strukturo DNA
21. Stoletje Era funkcijske genomike in celostnih raziskav genoma
GENETIKA – znanost o genih, dednosti in variacijah dednine v živih organizmih. Obravnava strukturo in funkcijo posameznega gena v celici ali organizmu, načine dedovanja, ter različice v populaciji. GENOMIKA – znanost o genomih organizmov. Želi določiti zaporedje vseh genomov z resolucijo posameznega bp. Ne ukvarja se z raziskovanjem posameznih genov, temveč z mrežami genov, ki med seboj smiselno sodelujejo. Močna komponenta razvoja genomike je tehnologija. FUNKCIJSKA GENOMIKA – znanost, ki se ukvarja z razumevanjem visokogostotnih podatkov genoma, da bi opisala biološke vloge genov (in proteinov) ter njihovih interakcij. FG se ukvarja z dinamičnimi aspekti, kot so prepisovanje (transkripcija), prevajanje (translacija), interakcije med proteini, itd. Skuša odgovoriti na vprašanja o vlogi genov, prepisov in proteinskih produktov, na ravni celega genoma, z uporabo visokozmogljivostnih metod.
SISTEMSKA BIOLOGIJA Od leta 2000 dalje nov pristop v bimedicinskih in bioloških znanostih. Gre za biološke oz. biomedicinske študije, ki se osredotočajo na kompleksne interakcije znotraj bioloških sistemov. Pri tem se uporabljajo celostni (holistični) pristopi Eden od glavnih ciljev sistemske biologije je matematično in računsko modeliranje za odkrivanje lastnosti sistemov (celica, organ, etc., organizem). Tehnike, ki spadajo v sistemsko biologijo, vključujejo vzpostavljanje metaboličnih mrež, celičnih signalnih mrež, itd.
NEKATERI PRISTOPI FUNKCIJSKE GENOMIKE
transkriptom proteom metabolom
-Mikromreže -RNA-seq -qRT-PCR -siRNA
- 2D proteinske mape/MS -LC/MS(n)
- profiliranje metabolitov -Metabolični pretoki (fluksi)
Eksperimentalne tehnike za določanje različnih funkcijskih ravni genoma
OSNOVE GENOMIKE - GENOM Grško: “Postanem, sem rojen, da se razvijem v bitje” (1920, Hans Winkler)
GENOM - dedna informacija celotnega organizma (jedrni, mitohondrijski, kloroplastni genom; pri bakterijah tudi plazmidi in transpozoni; haploidni, poliploidni). Je vsota vseh genov organizma. Dedna informacija je zapisana v DNA ali pri nekaterih virusih v RNA. Genom vključuje tako gene kot tudi nekodirajoče predele DNA in RNA. Število baznih parov in število genov se med organizmi zelo razlikuje- velikost genoma se ne ujema s kompleksnostjo organizma (paradoks vrednosti C) (1948, Roger and Colette Vendrely)
Človeški genom ima priblizno 25 000 genov, protozoa Trichomonas pa 60 000.
VELIKOSTI GENOMOV ORGANIZMOV SO ZELO RAZLIČNE
Wikiipedia, Abizar, April 2010
1 Mb 1Gb
Paradox C vrednosti: bolj razviti organizmi nimajo večjih genomov
C vrednost: gre za konstanto (Constant) ali lastnost (Characteristic) haploidne DNA vsebnosti v jedru. Meri se v pg (cca 1 Gb).
ALI OBSTAJA POVEZAVA MED VELIKOSTJO GENOMA IN ŠTEVILOM PROTEIN KODIRAJOČIH GENOV?
- Pri evkariotih in drugih organizmih opazujemo korelacijo med log10 številom protein kodirajočih genov (Y9) in log10 velikostjo genomov (X9 v kbp).
- Bakterije arheje, virusi in genomi organel: Log vrednosti števila genov so v
premem sorazmerju z log vrednostimi velikosti genoma. Najboljše ujemanje z linearnim modelom: Y9 = 0.045+0.977X9 (p 0.001)
- Evkarioti: Nelinearna korelacija nastane zaradi nesorazmerno hitrega vključevanja nekodirajočih zaporedij v evkariontske genome.
Najboljše ujemanje z logaritmičnim modelom: Y9 = ln(-46.200+22.678X9) (p 0.001)
Yubo Hou and Senjie Lin*. Distinct Gene Number-Genome Size Relationships for Eukaryotes and Non-Eukaryotes: Gene Content Estimation for Dinoflagellate Genomes. PLoS One. 2009; 4(9): e6978. Published online 2009 September 14. doi: 10.1371/journal.pone.0006978
Število protein-kodirajočih genov proti velikosti genomov različnih organizmov na logaritmični skali. Pri evkariontih je manj protein kodirajočih genov kot bi pričakovali glede na velikost genoma! Razlog – vključevanje nekodirajočih zaporedij med evolucijo. Odostotek predelov, ki kodirajo gene proti velikosti genoma na logaritmični skali. Opazimo negativni trend pri genomih evkariotov. Pri ne-evkariotih opazimo horizontalno linijo z nekaj izjemami pri organelah.
KORELACIJA MED VELIKOSTJO GENOMA IN ŠTEVILOM GENOV: Odstopanja predvsem pri evkariontih
Hou Y., Lin S. PLoS One. 2009; 4(9): e6978.
ORGANIZMI SE ZELO RAZLIKUJEJO TUDI PO ŠTEVILU KROMOSOMOV
Organizem 2n n Mravlja 2 1 Plesen (Pink bread mold) 14 7 Paradižnik 24 12 Mačka 38 19 Človek 46 23 Konj 64 32 Pes 78 39 Metulj (Geometrid moth) 224 112 Praprotnica ( Ophioglossum reticulatum) 1260 630
ČLOVEŠKI GENOM: 22 PAROV AVTOSOMNIH KROMOSOMOV, EN PAR SPOLNIH KROMOSOMOV IN MITOHONDRIJSKI GENOM
Nehomologni Trije pari homolognih kromosomi kromosomov
Jedrni genom Mitohondrijski genom
- Vsebuje 23 poglavij (kromosomov); - Vsako poglavje vsebuje 48 – 250 milijonov črk (A,C,G,T) brez presledkov; - Skupaj knjiga vsebuje 3,2 bilijonov črk;
- Knjigo lahko spravimo v jedro velikosti točke; (1.7 µm, 1.7x10-6 m, povprečni premer jedra človeške celice);
- Najmanj eno kopijo knjige (vseh 23 poglavij) vsebuje večina celic našega
telesa (izjema so eritrociti, ki med zorenjem izgubijo jedro);
- Rakaste celice lahko vsebujejo več kopij ali delnih kopij knjige;
- Pristopi FUNKCIJSKE GENOMIKE omogočajo, da črke povezujemo v besede in besede v stavke, ki smiselno tvorijo posamezna poglavja. Omogočajo razumevanje vlog (funkcij), zapisanih v knjigi genoma.
KNJIGA ČLOVEŠKEGA GENOMA
- Haploidni genom je velik cca 3.2 x 10(E9) – tri bilijone baznih parov ali 3200 Mbp. Vsebuje cca 23.000 genov, ki zapisujejo proteine (le 1.5% genoma);
RAZDALJA, KI BI JO ZAPISALE ČRKE DNA ČLOVEŠKEGA GENOMA (velikost črk takšna, kot v knjigi)
http://www.ohio.edu/people/braselto/readings/sex_reproduction.html
GENOM KROMPIRJA IMA n x 12 kromosomov
PROJEKTI SEKVENCIRANJA GENOMOV
- Projekt človeški genom (1990 – 2001) - 1000 človeških genomov
- 1000 rastlinskih genomov (Alberta, Canada)
- 1000 referenčnih rastlinskih in živalskih genomov
- 10 000 mikrobnih genomov (2009 - )
- ………………..
Prvih 1000 genomov
PROJEK ČLOVEŠKI GENOM http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Začetek leta 1990, z željo, da se v 15 letih določi haploidni človeški genom. Cilj je bil dosežen na prelomu tisočletja, leta 2001.
Predhodno že sekvenirani genomi modelnih organizmov: S. cerevisiae (1996), E. coli (1997), C. elegans (1998).
ZGODOVINA PROJEKTA ČLOVEŠKI GENOM
HGP sta oktobra 1990 pričela Ari Patrinos (U.S. Department of Energy’s Office of Science) in Francis Collins (National Institutes of Health, National Human Genome Research Institute). Večina akademsko financiranega sekvenciranja je potekalo na univerzah ZDA, UK, Japonske, Francije in Nemčije, pa tudi Kitajske in Indije Vzporedni projekt je od leta 1998 dalje vodila privatna firma Celera Corporation. Namen HGP je bil sprva mapirati nukleotide haploidnega referenčnega genoma. Sledile so iniciative številnih skupin, ki so mapirale nukleotide diploidnega genoma: (International HapMap Project, Applied Biosystems, Perlegen, Illumina, J. Craig Venter Institute, Personal Genome Project, Roche-454.).
TEKMA ZA PRVO ZAPOREDJE ČLOVEŠKEGA GENOMA
Javni sektor proti privatnemu sektorju – Celera genomics želi patentirati gene! CG tudi ne objavi podatkov v javnih bazah. 7. julija , 2000, the UCSC Genome Bioinformatics Group na splet sprosti prvi osnutek človeškega genoma. V prvih 24h do podatkov dostopa množica strokovnjakov, ki so s strežnika naložili pol trilijona bitov informacij..
PRISTOPI SEKVENCIRANJA ČLOVEŠKEGA GENOMA – ZAKAJ JE CELERA GENOMICS HITREJE NAPREDOVALA?
Zaporedje človeškega genoma, ki je bilo najavljeno junija 2000, je “reprezentativni” genom na osnovi zaporedja izbranega posameznika. Na medicino je imelo manjši vpliv, kot se je predvidevalo. Ker je genom vsakega posameznika “reprezentativen”, ni važno, čigav genom je bil določen prvi (moški, belec), saj je zaporedje vseh ljudi identično cca 99%. “Reprezentativni” genom kaže le glavne značilnosti človeškega genoma, ne more pa pomagati pri vzpostavljanjem korelacij z npr. različnimi bolezenskimi fenotipi. Zato je zdaj želja je določiti nukleotidno zaporedje v genomu mnogih posameznikov.
KAJ PRAVZAPRAV POMENI SEKVENCIRANJE ČLOVEŠKEGA GENOMA?
GENOMI IN GENETSKA RAZNOLIKOST
- Zaporedje kateregakoli genoma NE odraža genetskih raznolikosti (polimorfizmov) posamezne vrste.
- Genetsko raznolikost lahko spoznamo le, če primerjamo zaporedja genomov posameznikov znotraj iste vrste organizmov.
- GENOM torej ne ponazarja informacije o posameznem zaporedju DNA. Podaja informacijo o skupini zaporedij, ki imajo skupen biološki pomen.
- Človeški genom med posamezniki je 99% identičen, kar pomeni, da se genom dveh posameznikov med sebom razlikuje v cca 3 milijone bp.
http://www.personalgenomes.org/
Steven Pinker- eden prvih ki je dal posekvencirati svoj genom in dovolil javno objavo podatkov
GENOM ČLOVEKA IN ŠIMPANZA STA 96% IDENTIČNA
Tipični protein človeka in šimpanza se razlikujeta v le 2 aminokislinah. 30% proteinov je pri obeh vrstah popolnoma enakih. A vendar je razlika med človekom in šimpanzom večja od razlike med dvema človekoma – podvojevenje regij in diferenčno spajanje eksonov – razlika v naboru proteinov.
Septemebr 2005
(6 Mio let)
- DNA polimorfizem predstavlja DNA lokus, ki ima dve ali več opaženih različic, od katerih se vsaka pojavlja s frekvenco vsaj 1% v populaciji (naključna razmejitev). Pri polimorfiznih sta v populaciji normalna (standardna) vsaj dva alela, vsak s svojo frekvenco.
- DNA mutacija je katerakoli sprememba v DNA, ki se razlikuje od “normalne” (standardne). Gre torej za vsako, tudi zelo redko spremembo.
- Najpogostejši polimorfizmi pri človeku so enojni nukleotidni polimorfizmi (SNP; v žargonu “snip”), kjer se med posameznikoma na določenem lokusu DNA razlikuje en sam bazni par (npr. T v G).
- Večina SNP ima le dva alela.
- Človeški genom ima približno 3 milijone SNP, kar pomeni, da se ena sprememba bp v povprečju pojavi na vsakih 1000 bp.
POSAMEZNIKI ISTE VRSTE SE RAZLIKUJEJO ZARADI DNA POLIMORFIZMOV
POGOVORNO govorimo o mutaciji, kadar gre za spremembo v genomu, ki povzroči neko okvaro ali bolezen, medtem ko polimorfizem opisuje spremembo, ki ni niti škodljiva, niti pozitivna.
Pravilna definicija mutacije in polimorfizma je glede na pojavnost v populaciji (polimorfizem prisoten v najmanj 1% populacije, najmanj 2 alela).
Polimorfizmi, posebej njihove kombinacije, lahko zelo vplivajo na posameznikove lastnosti in dovzetnosti za bolezni.
KAKŠNA JE RAZLIKA MED POLIMORFIZMOM IN MUTACIJO?
• Enojni nukleotidni polimorfizmi (SNP) • Mikrosateliti (ponovitve kratkih zaporedij), • Minisateliti (ponovitve dolgih zaporedij), • Delecije, • Duplikacije, • Druge prerazporeditve DNA.
VRSTE POLIMORFIZMOV
Število ponovitev Bolezenski status <28 Zdrav
28–35 Zdrav 36–40 Prizadeti heterozigoti >40 Bolezensko stanje
PRIMER: CAG ponovitve pri Hungtingtonovi bolezni
POLIMORFIZNI (NPR. POMNOŽEVANJE MIKROSATELITOV) LAHKO VODIJO DO BOLEZNI
Bolezen se deduje avtosomno dominantno.
POVZETEK
- GENOM - dedna informacija celotnega organizma (jedrni, mitohondrijski, kloroplastni genom; pri bakterijah tudi plazmidi in transpozoni; haploidni, poliploidni). Je vsota vseh genov organizma. -VELIKOST GENOMA ni vedno sorazmerna številu protein kodirajočih genov – odstopanja predvsem pri evkariontih. Velikost človeškega genoma je 3200 Mbp.
•Nelinearna korelacija med velikostjo genoma in št. protein kodrajočih genov nastane zaradi nesorazmerno hitrega vključevanja nekodirajočih zaporedij v evkariontske genome. • Manj kot 3% človeškega genoma vsebuje kodirajoča zaporedja. Ostalo so nekodirajoča (i.e. psevdogeni, introni) in medgenska zaporedja. Velik del so ponovljiva zaporedja (SINE. LINE. Alu, sateliti, etc. ). - Posamezniki iste vrste imajo POLIMORFNA DNA zaporedja. - DNA je med posamezniki človeške vrste najmanj 99% identična
• Mendlova genetika,
• Direktno sekvenciranje DNA (kapilarna EF)
• RFLP analiza (Restriction Fragment Length Polymorphism)
• Za alele specifični oligonukleotidi,
• DNA mikromreže (bolj znana kot metoda za določanje izražanja genov – transkriptom)
• Sekvenciranje s Sangerjevo metodo
• Nove generacije visokozmogljivostnega paralelnega sekvenciranja (uporabne tudi za določanje transkriptoma - RNA-seq) .
METODE ZA DOLOČEVANJE ZAPOREDIJ GENOMA
http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm
EKSPLOZIJA SEKVENCIRANJA – OD SANGERJEVE METODE DO NOVIH GENERACIJ VISOKOZMOGLJIVEGA PARALELNEGA SEKVENCIRANJA
VEČ TEHNOLOGIJ NOVE (NASLEDNJE) GENERACIJA SEKVENIRANJA (2. IN 3. GENERACIJA)
www.gatc.co.uk/cgi-bin/wPrintpreview.cgi?sour...
Sekvenciranje človeškega genoma je trajalo več let, z uporabo cca 20 kb BAC klonov, ki so vsebovali cca 100 kb dolge tarčne fragmente, in 8-kratnega pokrivanja vsakega dela tarče. Analiza s kapilarno elektroforezo.
Nadaljnji razvoj sekvenciranja je temeljil na sočasnem sekvenciranju celotnega genoma (WHS, angl. whole genome sequencing), ki je bil vstavljen v vektorje. Metoda je hitrejša, pušča pa velike praznine v zelo polimorfnih ali repetitivnih genomih. Analiza s kapilarno elektroforezo.
Naslednja generacija sekvenciranja (2004): visokozmogljivostno paralelno čitanje odsekov DNA na ravni celega genoma preko PCR pomnoževanja enoverižnih fragmentov genomske knjižnice.
Nova (naslednja) generacija sekvenciranja – pot do individualnih genomov
Tretja generacija sekvenciranja – direktno sekvenciranje brez pomnoževanja.
Genome sequenced (publication year) HGP (2003) Venter (2007) Watson (2008)
Time taken (start to finish) 13 years 4 years 4.5 months
Number of scientists listed as authors > 2,800 31 27
Cost of sequencing (start to fi nish) $2.7 billion $100 million < $1.5 million
Coverage 8–10 × 7.5 × 7.4 ×
Published online 16 April 2008 | 452, 788 (2008) | doi:10.1038/452788b James Watson's genome sequenced at high speed The first full genome to be sequenced using next-generation rapid-sequencing technology is published today (see page 872)1, marking another milestone in the extraordinarily fastmoving field of human genome sequencing. It took just four months, a handful of scientists and less than US$1.5 million to sequence the 6 billion base pairs of DNA pioneer James Watson. The achievement is first proof of principle that these rapid-sequencing machines can decipher large, complex genomes (see page 819)2. Made in this case by Connecticut-based 454 Life Sciences — a division of Roche Diagnostics — they allow many more sequencing reactions to proceed at the same time, on the same surface, than the previous generation of machines that produced the inaugural human genomes3, 4. That change has had big pay-offs in speed, efficiency and, ultimately, cost (see Table 1).
http://www.nature.com/nature
10 LET ČLOVEŠKEGA GENOMA
Ob tej obletnici je velo rahlo razočaranje, saj sekvenciranje genomov ni še ni prineslo revolucije v medicini, razumevanju bolezni in zdravljenju. Desetletje je postreglo s skokovitim napredkom tehnologij. Študijami GWAS in 1000 genomov, ter razcvetom osebne genomike.
Craig Venter
PROJEKT 1000 GENOMOV
Pričel se je januarja 2008, s ciljem narediti najbolj natančen katalog genetskih različic pri človeku. Znanstveniki bodo določili zaporedja genomov ljudi različnih etničnih skupin in obeh spolov. Sodelujejo ZDA, UK in Kitajska. Podatkovna zbirka je prosto dostopna. Podatki bodo imeli velik vpliv na medicino.
April 2010
PROJEKTI MNOGIH GENOMIV SO V TEKU – V 2010 DOKONČANIH PREKO 3800 GENOMOV RAZLIČNIH ORGANIZNOV
KEGG Organisms: Complete Genomes
Eukaryotes: 180 Bacteria: 2127 Archaea: 147
NOVE GENERACIJE SEKVENCIRANJA SO PRIVEDLE DO ŠTEVILNIH PROJEKTOV IN ORODIJ ZA RAZISKOVENJE GENOMOV ALI NJIHOVIH
LASTNOSTI
- GWAS – asociacijske študije širom genoma za številne večfaktorske bolezni
- Mednarodni konzorciji: HapMap, 1000 genomes, ENCODE….
- Mednarodne infrastrukture: npr. ELIXIR (tudi Slovenija): http://www.elixir-europe.org/
- Orodje Ensembl
http://www.ebi.ac.uk/training/online/
GWAS –ASOCIACIJSKE ŠTUDIJE ŠIROM GENOMA (GENOME WIDE ASSOCIATION STUDIES)
- Obravnavajo številne pogoste genetske različice pri različnih osebkih, da bi ugotovili potencialne povezave z boleznimi. Običajno gre za visokozmogljivostno preiskovanje SNP in povezavo s pogostimi obolenji.
- Če je ena oblika alela pogostejša pri ljudeh z obolenjem, je SNP povezan s tem obolenjem in označuje regijo genoma, ki vpliva na tveganje za obolenje.
- Pristop GWAS ne opazuje posameznega SNP, temveč SNP celotnega genoma, zato lahko odkrije kombinacije SNP, ki so povezani z boleznijo.
Ime po nebotičnikih Manhattana, ki se dvigajo nad drugimi stavbami različnih višin. Je diagram razpršenosti (scatter plot), ki se uporablja za prikaz velikega števila podatkovnih točk, kjer jih ima veliko amplitudo različno od nič, z velikim razponom vrednosti, kot se pojavlja pri GWAS. Genomska koordinata je na X osi in predstavlja –log (10) asociacijske p (probability) vrednosti za vsak SNP, ki ga prikažemo na Y osi. Ker imajo najmočnejše asociacije najmanjše p vrednosti (i. e. , 10-15), so njihovi negativni logaritmi največji (i. e. 15).
GWAS PREDSTAVIMO Z MANHATTAN GRAFOM
Primer: Manhattan graf GWAS kohorte 2.346 pacientov s sistemsko sklerozo (SSc) in 5.193 zdravih kontrol
Radstake TRDJ et al. Nature Genetics 42,: 426–429 (2010).
−log10 P vrednosti (Mantel-Haenszel test) 279,621 SNP proti fizični lokaciji na kromosomu. Kromosomi os prikazani v različnih barvah. SNP nad rdečo črto imajo P vrednost <5 × 10−7. Genomska koordinata je na X osi in predstavlja –log (10) asociacijske p (probability) vrednosti za vsak SNP, ki ga prikažemo na Y osi. Ker imajo najmočnejše asociacije najmanjše p vrednosti (i. e. , 10-15), so njihovi negativni logaritmi največji (i. e. 15).
Velja predpostavka, da je višina dedna v 80 – 90%. Če bi 29 cm ločilo najvišjih 5% ljudi od najnižjih, bi bila za 27 cm odgovorna dednost. V letu 2008 so 3 skupine raziskovalcev naredile študijo na 30.000 ljudeh. Našli so 40 (pogostih) lokusov, ki so povezani z razlikami v višini. Vendar so ti lokusi predstavljali le 5% (!!) dedne komponente višine (cca 6 cm). Nauk: za dednost so pomembne so tudi redke različice, ki se med posamezniki razlikujejo!
ŠTUDIE GWAS SO DALE MANJ OD PRIČAKOVANEGA: KAJ JE MANJKAJOČA DEDNOST? Primer: določanja višine človeka
PROJEKT HAPMAP
Cilj tega mednarodnega projekta je razkriti pogoste vzorce variacij človeškega genoma – zemljevid haplotipov (haplotip je zaporedje alelov na posameznem kromosomu). Gre za različice, ki so povezane z boleznimi in z odgovorom posameznika na zdravila in druge okoljske dejavnike. Sodelujejo raziskovalci različnih držav (Kanada, Kitajska, Japonska, ZDA, UK, Nigerija…). Projekt se je pričel leta 2002. Rezultati 1. faze so bili objavljeni oktobra 2005, 2. faze oktobra 2007, in 3. faze spomladi 2009. Podatki so javno dostopni.
http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/
ENCODE – Enciklopedija človeških DNA elementov
Od septembra 2003 (The National Human Genome Research Institute (NHGRI) launched a public research consortium named ENCODE, the Encyclopedia Of DNA Elements) Formalno gre za razvoj na temlejih projekta človeški gen, s cilem opredelitve funkcionalnih elementov človeškega genoma. Predvsem v nekodirajočih delih, tudi epigenom. Gre za svetovni konzorcij in javno dostopne zbirke. Nekaj kontroverznih ugotovitev. ENCODE projekt trdi, da ima 80% človeškega genoma biokemijsko funkcijo (ali je to “smrt junk DNA”?). Mnenja o tem, kaj je “funkcionalno”, se razlikujejo.
http://www.nature.com/encode/#/threads
EPIGENOM sestoji iz vrste kemijskih sprememb DNA in histonov posameznega organizma (metilacije, acetilacije, ubikvitinacje, itd. ). Te spremembe so v različnih tkivih lahko različne. Nekatere se prenašajo na potomce. Spremembe epigenoma povzročijo spremembo kromatina, kar lahko vodi do spremenjene biološke aktivnosti.
ENCODE: EN GENOM, VEČ EPIGENOMOV
MAPIRANJE EPIGENOMOV V OKVIRU MEDNARODNEGA KONZORCIJA ENCODE
V posameznih tkivih določujejo kemisjke spremembe DNA in histonov.
POVZETEK
- Nove generacija sekvenciranja so povzročile pravi razcvet genomike.
- Določeno je nukleotidno zaporedje več 1000 različnih organizmov, določevanje novih zaporedij je v razmahu.
- Določeno je tudi delno ali popolno zaporedje več 1000 človeških genomov.
- Opravljene so bile številne GWAS študije, ki so polimorfizme posameznikov prek celega genoma skušale povezati z boleznimi.
- Vzpostavljeni so mnogi mednarodni konzorciji (HapMap, ENCODE, itd.), ki se ukvarjajo s celostnim razumevanjem podatkov genomov. Njihove zbirke in brskalniki so javno dostopni.
- Vzpostavlja se tudi mednarodna infrastruktura (i. e. ELIXIR), ki se ukvarja s skladiščenjem, urejanjem in razširjanjem visokogostotnih podatkov pogenomske dobe.
