Universidad de Los Andes- sora

Universidad de Los Andes

Facultad de Ciencias

Departamento de Química

Laboratorio de Fisicoquímica Orgánica

Br. González C. Soranyel

Tutor académico: Prof. Uzcátegui N. Jorge L

Mérida, Mayo de 2008.

Trabajo Especial de Grado

Validación de un método analítico para la determinación de

plaguicidas Organofosforados y Carbamatos en muestras de

saliva de la comunidad El Paramito de Timotes, Municipio

Miranda, Estado Mérida.

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3

RESUMEN

En los Andes Venezolanos es común el uso de plaguicidas organofosforados y

carbamatos para el control de plagas y demás vectores de enfermedades que

puedan afectar el desarrollo normal de los cultivos. El empleo de una gran

diversidad estructural, así como de ingentes cantidades de estos plaguicidas

podría estar causando problemas de intoxicación de grado variable. La

intoxicación por estos agentes químicos puede causar enfermedades severas

siendo uno de sus principales efectos en los organismos vivos la inhibición de las

enzimas colinesterasas.

Durante muchos años se ha usado la medida de la disminución de la actividad de

la enzima colinesterasa en sangre para el monitoreo de la exposición a plaguicidas

organofosforados y carbamatos, especialmente en trabajadores que tienen

contacto con estos plaguicidas, desde esta perspectiva se han desarrollado

numerosos métodos analíticos rápidos y sencillos, entre los que destacan el

método de Ellman, Rappaport, Michel, Lovibond etc, los cuales miden la actividad

a través reacciones químicas coloreadas o cambios de pH.

Sin embargo muchas veces no es posible hacer seguimientos continuos de estos

individuos, ya que la sangre es una matriz que requiere un método de obtención

invasivo, y los trabajadores se rehúsan a este tipo de análisis, lo cual constituye

una limitación. Por esta razón se han venido estudiando el potencial de diferentes

fluidos biológicos tales como sudor, saliva, leche materna, lágrimas, entre otros,

que permitan brindar información de diferentes enfermedades, logrando de esta

forma realizar un diagnóstico eficaz.

En el estado Mérida, existe gran número de comunidades agrícolas que usan

plaguicidas, muchos de los cuales son mal aplicados, o no presentan la

información necesaria para su manejo, lo cual ha aumentado el riesgo de

intoxicación no solo de los trabajadores, sino de sus familias. En particular la

comunidad de El Paramito, ubicada en Timotes, capital del Municipio Miranda del

Estado Mérida, es una de las comunidades agrícolas que presenta esta


4

problemática. La principal fuente económica de esta comunidad es el cultivo de

gran variedad de rubros agrícolas, por lo tanto es posible que sus habitantes estén

expuestos constantemente o durante gran periodo de tiempo a plaguicidas, como

los organofosforados y carbamatos, usados para la protección de sus cultivos.

La aplicación de alguno de los métodos mencionados anteriormente para evaluar

la salud de los habitantes de la comunidad de El Paramito, requiere el uso de

sangre como matriz biológica, lo cual trae como desventaja el hecho de ser un

medio biológico que requiere un método invasivo para su obtención, además de

personal médico para la toma y manejo de las muestras.

Atendiendo a la necesidad de controlar y evaluar la exposición a plaguicidas

organofosforados y carbamatos en los habitantes de la comunidad El Paramito, el

Laboratorio de Fisicoquímica Orgánica, de la Universidad de Los Andes, llevo a

cabo la optimización del método de Ellman para la determinación de la enzima

acetilcolinesterasa en muestras de saliva total.

Fueron estudiadas las condiciones necesarias para la medida de la actividad de la

enzima acetilcolinesterasa en saliva, encontrándose que la saliva puede ser usada

para evaluar la exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos.

Los valores de actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva determinados

en los individuos muestreados de la comunidad El Paramito, presentan valores

promedio de actividad menores a los encontrados para una población de

referencia. Específicamente la población masculina revela que los niveles de

actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva, pueden estar inhibidos por

exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos.


5

INDICE

Capitulo I. Introducción y Planteamiento del problema.

I.1Introducción 2

I.2 Planteamiento del problema. 7

I.3 Hipótesis. 8

I.4 Objetivo general. 8

I.5 Objetivos específicos 8

Capitulo II. Antecedentes. 9

Capitulo III. Marco teórico

III.1 la saliva

14 III.1.1 Composición química de la saliva. 14

III.1.2 Usos de la saliva. 15

III.1.3 Limitaciones de la saliva como medio diagnostico. 17

III.2 Indicador Biológico (IB) 18

III.3 Valores limites biológicos (VLB) 19

III.4 Plaguicidas. 22

III.4.1 Clasificación de los plaguicidas. 22

III.4.2 Plaguicidas organofosforados y carbamatos. 23

III.5 Fases que constituyen el fenómeno tóxico de los plaguicidas. 26

III.5.1 Exposición 26

III.5.2 Toxicocinética. 27

III.5.3 Toxicodinámica. 27


6

III.5.4 Toxicología. 29

III.6 Mecanismo de Acción enzimática de la acetilcolinesterasa. 30

III.6.1 Mecanismo de acción de los OPs y Cs. 32

III.7 Metodología analítica para la determinación de residuos

de plaguicidas en muestras biológicas de origen humano. 34

III.7.1 Toma de muestra. 34

III.7.2 Transporte y almacenamiento. 36

III.7.3 Preparación de la muestra. 36

III.7.4 Extracción con disolventes orgánicos. 37

III.7.5 Determinación instrumental 37

II.8 Espectroscopia ultravioleta-visible 38 III.8.1 Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción. 39

III.8.2 Componentes de los instrumentos. 40

III.8.2-1 Fuentes. 40

III.8.2-2 Selectores de longitud de onda. 41

III.8.2-3 Recipientes para la muestra. 41

III.8.2-4 Detectores de radiación. 42

III.8.2-5 Procesadores de señal y dispositivos de lectura. 42

III.8.3 Especies absorbentes. 42

III.8.3.1Modos de excitación electrónica. 43 Capitulo IV Metodología experimental

IV.1 Población. 44

IV.2 Tamaño de la muestra. 44

IV.3 Toma de muestras. 45


7

IV.4 Determinación de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva. 47

IV.4.1 Reactivos, material y equipos instrumentales. 48

IV.4.2 Resultados. 50

IV.4.3 Procedimiento para la optimización de las condiciones de

análisis de la enzima AChE en saliva. 51

IV.4.4 Validación del método. 53

IV.4.5 Procedimiento para la determinación del efecto de sustancias

Interferentes. 54

IV.4.6 Procedimiento para la determinación del efecto de plaguicidas

Organofosforados y Carbamatos. 54

IV.4.7 Procedimiento general para la determinación de la enzima

AChE en muestras de saliva por el método de Ellman. 55

Capitulo V. Resultados y Discusión.

V.1 Condiciones de análisis establecidas para la determinación de

la actividad de de la enzima Acetilcolinesterasa en saliva. 56

V.2 Validación del método analítico. 66

V.3 Efectos de sustancias interferentes. 69

V.4 Efecto de la concentración de inhibidor. 70

V.5 Determinación de los niveles de actividad de la enzima

Acetilcolinesterasa en muestras de saliva. 73

V.5.1 Parámetros estadísticos descriptivos de la actividad de la

enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva de la

población expuesta a plaguicidas y de control. 73

V.5.2 Distribución de los resultados de actividad de la enzima


8

Acetilcolinesterasa por intervalos en las muestras de

saliva de individuos expuestos. 74

V.5.3 Distribución de los valores de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva de individuos expuestos y

de control por sexo. 75

V.5.4 Distribución de los valores de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en muestras de saliva de los

individuos expuestos de acuerdo a la edad. 77

V.6 Discusión de Resultados. 79

VI. Conclusiones. 84

VII. recomendaciones. 86

VIII. Referencia bibliográficas. 87

IX. Anexos. 93

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Imagen de parte de los sembradíos de la comunidad de El Paramito. 3

Figura 2. Imágenes de niños pertenecientes a la comunidad de El Paramito. 4

Figura 3. Estructura básica de los Organofosforados. 24

Figura 4. Estructura Química de algunos Organofosforados comunes. 24

Figura 5. Estructura Química de algunos carbamatos. 26

Figura 6. Sinapsis colinérgica. Receptor nicotínico. 28

Figura 7. Formación del Complejo enzima-sustrato. 31

Figura 8. Regeneración de la enzima y liberación de acido acético mas colina. 31

Figura 9. Ataque nucleofílico de la serina al átomo de fósforo del OPs. 32


9

Figura 10. Niveles de energía para los diferentes tipos de transiciones. 43

Figura 11. Fotografía de la atención medico-odontológica brindada por

personal de la Facultad de Odontología de la Universidad de los

Andes a los habitantes de El Paramito. 45

Figura 12. Fotografías de la toma de muestra de los pobladores de

El Paramito, las cuales fueron tomadas por esputo en envases

colectores estériles, y trasvasados a tubos de ensayo plástico,

según se muestra. 46

Figura 13. Reacciones químicas involucradas en el método de Ellman. 47

Figura 14. Espectrofotómetro de Absorción UV-Visible Lambda 2, Perkin Elmer. 49

Figura 15. Efecto de la concentración de NaCl en la medida de la actividad

de la enzima Acetilcolinesterasa. 57

Figura 16. Espectro UV-Vis de la solución buffer pH 7.4 y de la enzima

Acetilcolinesterasa de anguila eléctrica (4250 U/L). 58

Figura 17. Espectros UV-Vis del sustrato Cloruro de Acetiltiocolina en

un rango de concentración de 0.4 mM y 2.0 mM 59

Figura 18. Espectros UV-Vis del indicador Acido 5,5´ditiobis-2-nitrobenzoico

(DTNB) a diferentes concentraciones. 59

Figura 19. Efecto de la concentración de DTNB sobre la determinación de la

Acetilcolinesterasa. 60

Figura 20. Efecto de la concentración de sustrato acetiltiocolina sobre la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa. 61

Figura 21. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad

de la enzima, usando un 500 µL de muestra de saliva sin tratamiento. 62

Figura 22. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad de

la enzima, al aumentar el volumen de muestra de saliva filtrada. 62


10

Figura 23. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad

de la enzima, al aumentar el volumen de muestra de saliva centrifugada. 63

Figura 24. Determinación de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en una

muestra de saliva de un mismo individuo bajo diferentes tratamientos.

a) ST. Sin tratamiento, b) Fil. Filtrada, c) centrifugada. 64

Figura 25. Espectro del complejo ácido 2-nitro-5-tiocolina, en dos etapas

diferentes de la reacción, donde se observa una máxima

absorción entre 405 y 412 nm. 65

Figura 26. Espectro del complejo, en dos etapas diferentes de la reacción,

formado a partir de una muestra de saliva como fuente de enzima. 65

Figura 27. Análisis de varias replicas de una muestra de saliva para evaluar la

precisión del método. 67

Figura 28. Linealidad del método obtenida a 405 nm. 67

Figura 29. Curva de calibrado. 68

Figura 30. Efecto de la concentración de alcohol (etanol) sobre la medida de

la actividad de la enzima acetilcolinesterasa por triplicado. 69

Figura 31. Efecto de la presencia de café y chimo en muestras de saliva, sobre la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa. 70

Figura 32. Efecto de una mezcla de organofosforados y carbamatos sobre la

actividad de la enzima AChE. (ATC 1.074 mM, DTNB 0.269 mM). 71

Figura 33. Efecto del plaguicida metil-paratión sobre la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa. 72

Figura 34. Efecto del plaguicida carbofuran sobre la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa. 72

Figura 35. Distribución de los resultados por intervalos de valores de actividad


11

de AChE de los individuos expuestos. 75

Figura 36. Valores promedio de la actividad de AChE encontrados según el

sexo de los individuos expuestos y de control. 76

Figura 37. Distribución de los valores promedio de actividad de AChE por edad. 77

Figura 38. Diagrama de distribución de los valores de ACHE en saliva con

respecto a la edad. Con un coeficiente de correlación de r= -0.179

para un nivel de confianza del 95 %. 78

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Algunos de los métodos existentes para el análisis de colinesterasa. 10

Tabla 2. Indicadores biológicos de exposición y efecto para Organofosforados y

Carbamatos. 19

Tabla 3. Valores de referencia del INSHT para algunos compuestos usados

como plaguicidas. 20

Tabla 4. Niveles de intoxicación según el grado de inhibición de la enzima

Acetilcolinesterasa. 20

Tabla 5. Clasificación de los plaguicidas. 22

Tabla 6. Denominación de los OPs según sus sustituyentes. 26

Tabla 7. Condiciones de análisis establecidas experimentalmente para

determinar la actividad de la enzima AChE en muestras de saliva. 66

Tabla 8. Parámetros estadísticos descriptivos de los valores de actividad de

acetilcolinesterasa obtenidos. 73

Tabla 9. Distribución de los valores de AChE obtenidos experimental. 74

Tabla 10.Distribución de los valores de AChE de acuerdo al sexo. 76

Tabla 11. Distribución de los valores de actividad en función de la edad. 77


12

INDICE DE ABREVIATURAS

AChE. Acetilcolinesterasa.

ACh. Acetilcolina.

ATC. Acetiltiocolina.

BChE. Butirilcolinesterasa.

Ch. Colinesterasa.

Cs. Carbamatos.

DTNB. Acido 5,5´ ditiobis-2-nitrobenzoico.

IB. Indicador biológico.

OPs. Organofosforados.

VLB. Valor limite biológico.


13

I.1 INTRODUCCIÓN

El sector agrícola es considerado como el grupo poblacional con más alto riesgo

de exposición a los plaguicidas, ya que los cultivos que se derivan de la actividad

agrícola, se ven afectados por una gran diversidad de plagas y malas hierbas, lo

cual hace que cada día se introduzcan nuevos compuestos químicos usados como

insecticidas, fungicidas, herbicidas, bactericidas, y fumigantes, que generan

desequilibrios ecológicos, y que traen como consecuencia, no sólo la proliferación

de plagas debidas a la desaparición de los predadores naturales, sino también, el

aumento de enfermedades en animales y seres humanos directa o indirectamente.

Uno de los riesgos de la población general es la exposición a largo plazo

provocada por la presencia de residuos de plaguicidas en los alimentos, agua y

suelos.

La falta de formación e información de los comerciantes y los campesinos,

además de una identificación deficiente de los envases (pictograma, rotulación en

lengua extranjera), causa la aplicación incorrecta de los plaguicidas. En muchas

ocasiones los plaguicidas son colocados frecuentemente por comerciantes locales

en recipientes propios de productos alimenticios y muchos recipientes de

plaguicidas son utilizados luego en el hogar con otros fines.

El uso indiscriminado de plaguicidas en la agricultura en general, y en particular

del Páramo merideño, ha provocado un aumento en la tasa de morbilidad y

mortalidad por enfermedades en la población más expuesta [1]. Lo que es más

grave aún, es que no existe un mecanismo de control, prevención y diagnóstico

precoz de intoxicaciones por parte del sistema regional de salud, aun cuando

Mérida es uno de los estados de Venezuela con mayor porcentaje de

intoxicados. [2]

En el Estado Mérida existe un gran número de comunidades agrícolas que usan

ingentes cantidades de plaguicidas para proteger los cultivos del ataque de

agentes nocivos. Específicamente, existe una comunidad, llamada El Paramito

ubicada a 35 minutos de Timotes, capital del Municipio Miranda del estado


14

Mérida, reconocida por su alta actividad agrícola en el cultivo de una gran variedad

de hortalizas.

Esta comunidad tiene un importante significado cultural y social, ya que sus

actuales pobladores pertenecen a la comunidad indígena Timote. Son

descendientes de los Mucuxaman, Quindora, hiquimpú, Mucuguá y Mucumbas, y

sus representantes o dirigentes más conocidos hoy son Ramón Araujo, Venancio

Paredes y Petra Paredes.

La comunidad está representada por un 52% de individuos menores de 18 años,

un 38% está entre los 19 y 50 y el 10% restante es mayor de 60 años. Los

habitantes se encuentran distribuidos de manera dispersa, en viviendas

construidas directamente dentro o en las cercanías de los terrenos que cultivan

(figura 1).

Figura 1.Imagen de parte de los sembradíos de la comunidad de El Paramito.

Estos Timotes, han sabido mantener a lo largo del tiempo características y

costumbres que lo definen como grupo indígena, constituyendo así un antiguo


15

resguardo indígena y la única comunidad indígena en la zona parameña

venezolana. [1] (Figura 2)

Figura 2. Imágenes de niños pertenecientes a la comunidad de El Paramito.

Como consecuencia de la alta actividad agrícola, los trabajadores de la comunidad

El Paramito, están expuestos al contacto con sustancias químicas nocivas, tales

como plaguicidas organofosforados y carbamatos, en cantidad y variedad que

dependen específicamente de la etapa del cultivo particular, constituyendo esta

práctica un problema de salud ocupacional.

En salud ocupacional, la monitorización de la exposición a agentes químicos

nocivos, es el procedimiento rutinario de medición, valoración e interpretación de

parámetros biológicos y ambientales con el fin de detectar de forma precoz el

posible riesgo para la salud. El monitoreo biológico, en particular, mide un tóxico

potencial, sus metabolitos o un efecto químico no deseado en una muestra

biológica, denominados indicadores biológicos o biomarcadores, para evaluar la

exposición a un determinado agente químico.

En clínica los biomarcadores permiten evaluar el riesgo en la salud, verificar

relación causa-efecto y particularmente en salud ocupacional a controlar riesgos.

Por estas características, un indicador biológico puede ser usado en salud general

y en salud pública u ocupacional al medir la exposición. El uso de biomarcadores


16

en exposición a plaguicidas se usa, entre otras cosas, para determinar la

concentración o un efecto primario de los plaguicidas en fluidos biológicos, lo cual

permite cuidar la salud en el trabajo manejando índices de exposición, de efecto y

de susceptibilidad, validos para la toma de acciones correctivas de salud laboral. [3]

El efecto sobre la salud de los plaguicidas organofosforados y carbamatos, es la

inhibición de las enzimas colinesterasas. Las colinesterasas (ChE) consisten en un

grupo de esterasas que hidrolizan esteres de colina a una alta velocidad

comparado con otros esteres. En los seres humanos se diferencian dos tipos de

colinesterasa: la acetilcolinesterasa (AChE) o colinesterasa eritrocítica y la

pseudocolinesterasa o colinesterasa plasmática (BuChE). La AChE es la

responsable de la eliminación del neurotransmisor acetilcolina, con su inhibición,

se ve alterado el funcionamiento normal del impulso nervioso.

La actividad de la enzima acetilcolinesterasa en sangre ha sido estudiada para la

determinación de la influencia de los organofosforados en el organismo, y requiere

al menos una reducción del 15% de un nivel individual normal de actividad

enzimática en eritrocitos o plasma, para ser considerado indicativo de una

exposición a plaguicidas organofosforados o carbamatos [4].

La aplicación de este indicador biológico para evaluar la salud de los habitantes de

la comunidad de El Paramito requiere el uso de sangre como matriz biológica, lo

cual trae como desventaja el hecho de ser un medio biológico que requiere un

método invasivo para su obtención, además de personal médico para la toma y

manejo de las muestras. Una de las matrices que se adapta a las necesidades de

este tipo de análisis, es la saliva, la cual constituye un fluido biológico de fácil

acceso, que no requiere personal médico o procedimientos de recolección

invasivos.

Si bien la saliva se ha utilizado en la detección de muchas entidades, su uso como

medio diagnóstico para la intoxicación por organofosforados no ha sido estudiado

extensamente, por lo que representa un método novedoso. Además, existe la


17

necesidad de hallar un método de cuantificación y evaluación del nivel de

intoxicación, que asegure la temprana detección, con bajos niveles de toxicidad, y

que no sea invasivo en contraste con la vía sanguínea.

Por las circunstancias detalladas, esta investigación se propone desarrollar un

método, que permita determinar los niveles de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva total, de manera rápida, con alta especificidad,

precisión y bajo costo, que pueda ser aplicado no solo para monitorear la salud de

lo habitantes de El Paramito, sino de todas aquellas comunidades agrícolas que

presentan esta problemática.


18

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La población indígena Timote, es una población que se encuentra ubicada dentro

el territorio del Municipio Miranda del Estado Mérida. Geográficamente se asienta

en el caserío El Paramito al norte de la población de Timotes. La principal fuente

económica de esta comunidad es el cultivo de gran variedad de rubros agrícolas,

lo cual contribuye que sus habitantes estén expuestos constantemente o durante

gran periodo de tiempo a plaguicidas, como los organofosforados y carbamatos

usados para la protección de sus cultivos.

El Paramito es una comunidad que no cuenta con ningún lugar para actividades

recreativas o culturales, tampoco cuenta con espacios religiosos, de salud

(ambulatorio) o seguridad (casilla policial).[1] La comunicación es difícil y los

medios de acceso limitados debido a la falta de medios de transporte adecuados y

de recursos económicos, por lo cual los habitantes de la mencionada comunidad

muchas veces no acuden a los centros médicos ante cualquier anomalía en su

salud, para ser evaluados y poder determinar así los posibles grados de

exposición a plaguicidas.

Esta problemática ha sido abordada por el personal del Departamento de

Odontología Preventiva y Social de la Universidad de los Andes, quienes

conjuntamente con organismos como CORPOSALUD, y Misión Sonrisa, han

organizado jornadas de atención medico-odontológicas para evaluar los efectos

observados en la salud general y bucal debida a la exposición a plaguicidas de

estos trabajadores.

Como propuesta para diagnosticar la presencia de plaguicidas organofosforados y

carbamatos en fluidos biológicos, se hace necesario diseñar un método que

permita detectar precozmente los diferentes estadios de intoxicación, en los

habitantes de la comunidad de El Paramito.


19

I.3 Hipótesis

La exposición a los plaguicidas organofosforados y carbamatos produce la

inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en el organismo. Considerando la

existencia de enzima acetilcolinesterasa en saliva, entonces este fluido biológico

podría ser usado para evaluar la inhibición de la enzima por exposición rutinaria de

los habitantes de la comunidad El Paramito a los plaguicidas organofosforados y

carbamatos.

I.4 Objetivo General

Validar experimentalmente el método de Ellman para medir los niveles de

actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva, de los

pobladores de la comunidad El Paramito de Timotes Edo. Mérida.

I.5 Objetivos específicos

� Optimizar las condiciones de análisis para la determinación de la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva.

� Evaluar el efecto de la presencia de café, chimo y alcohol como

interferentes en la medida de la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva.

� Evaluar el efecto de la concentración de organofosforados y carbamatos

como inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa.

Inicialmente se propuso la determinación de plaguicidas organofosforados y

carbamatos en muestras de saliva por cromatografía de gases con detector NPD, así

como el desarrollo de un Kit de reactivos para la determinación de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva. Estos objetivos no se cumplieron debido a

inconvenientes presentados con el detector NPD del equipo de cromatografía de

gases, que no se pudieron solucionar a tiempo. El Kit de reactivos será implementado

partiendo de los resultados de esta investigación, por parte de los organismos

involucrados en el desarrollo de este trabajo.


20

II ANTECEDENTES

En las últimas décadas el uso de organofosforados y carbamatos ha incrementado

drásticamente, para el control de plagas y otros vectores de enfermedad en los

sectores agrícolas en todo el mundo, principalmente en los países en desarrollo.

Globalmente hay aproximadamente más de 3 millones de casos de intoxicación al

año, debidas a la exposición a organofosforados y carbamatos. La población en

general se encuentra expuesta a través del consumo de agua y alimentos los

cuales contienen residuos de estos agentes contaminantes [5].

La cuantificación de plaguicidas organofosforados y carbamatos en fluidos

biológicos es importante para el control de las personas ocupacionalmente

expuestas a estos compuestos. Existe un número de métodos analíticos basadas

en técnicas cromatográficas para la determinación cualitativa y cuantitativa de

organofosforados y carbamatos tales como la cromatografía de gases (GC) [5,6],

cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) [7-10], y cromatografía

líquida de alta presión (HPLC) [11,12]. Sin embargo estas técnicas no siempre

pueden ser usadas en casos de emergencia debido a la complejidad de sus

instrumentos y al tiempo que se requiere para la preparación de las muestras, por

esta razón es necesario la utilización de un método simple y rápido para la

detección de compuestos organofosforados y carbamatos en fluidos biológicos.

El mecanismo de acción primario de los plaguicidas organofosforados y

carbamatos en el organismo es la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa, que

causa la subsiguiente acumulación de la acetilcolina en la sinapsis colinérgica,

resultando en un amplio rango de efectos neurotóxicos. Basándose en este efecto,

el biomonitoreo de la exposición a plaguicidas OPs y Cs ha sido enfocado en la

determinación de la actividad de las enzimas colínesterasas, principalmente en

sangre, desarrollándose así métodos analíticos rápidos y sencillos como lo son: el

método de Ellman, Rappaport, Michel, Lovibond, etc., los cuales miden la actividad

de las colinesterasas a través reacciones químicas coloreadas o cambios de pH,

estos métodos se muestran en forma resumida en la tabla 1.


21

Tabla 1. Algunos de los métodos existentes para el análisis de colinesterasa.

MÉTODO MATRIZ INDICADOR PRINCIPIO REFERENCIA

Ellman modificado

Sangre, plasma, saliva

DTNB (ácido 5,5 ditiobis 2-

nitobenzoico)

La hidrólisis enzimática de acetilcolina genera tíocolina que forma un complejo con DTNB

[7,13-18]

Rappaport Sangre Cambios de pH en

presencia de un indicador ácido-base

m-nitrofenol

Acido acético producido por la hidrólisis enzimática de acetilcolina

[16]

Michel Sangre Cambio de pH en el tiempo.

Cambio de pH producido por la acción de la

enzima en una solución tampón estándar durante un tiempo determinado

[19]

Lovibond Sangre

Cambio de pH en el tiempo

Indicador: Azul de bromotimol

Reacción de las enzimas colinesterasas (plasmática y

eritrocitaria) en sangre total homolizada con un sustrato en presencia de

un indicador de pH.

[18]

La exposición también puede ser evaluada monitoreando la presencia de

metabolitos en orina [4,10], como los alquilfosfosfatos, sin embargo el costo de la

determinación y la demora en la obtención de los resultados no presenta ventajas

comparativas sobre la determinación sobre la determinación de la colinesterasa.

Clínicamente se monitorea principalmente la colinesterasa plasmática ya que su

concentración es mucho mayor, y los cambios en su nivel es mucho más

detectables por los métodos de laboratorio. [19]

El método de Ellman y modificaciones, es el método de uso más común para la

determinación de la actividad de colinesterasas. Con este método se determina la

velocidad de hidrólisis de esteres de colina por las enzimas colinesterasa, lo cual

produce tiocolina que forma un complejo con el acido 5,5´ ditiobis-2-nitrobenzoico,

que absorbe radiación en el rango de 400 a 420 nm. La determinación de la

actividad de colinesterasas por este método en plasma y eritrocitos, ha sido usada


22

durante muchos años para el monitoreo de trabajadores expuestos a

organofosforados y carbamatos.

Ralph, Patrick y colaboradores [17] desarrollaron un método rápido y sencillo, para

la medida de AChE en eritrocitos en el campo con el objetivo de evitar los

inconvenientes de transporte y almacenamiento de las muestras, así como de los

equipo de difícil acceso; la valides de este método fue demostrado en pacientes

de hospitales con síntomas de exposición a plaguicidas.

En Perú, la determinación de la actividad de colinesterasa en muestras de sangre

de trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas inhibidores de las

colinesterasas, reveló que la mayoría de los individuos analizados tienen los

niveles de colinesterasa sérica por debajo de los valores normales, atribuyéndose

estos valores a las malas condiciones de trabajo y al poco conocimiento que

tienen los agricultores sobre el correcto uso de los plaguicidas que son nocivos

para la salud, lo cual resalta la necesidad del monitoreo constante de los

trabajadores agrícolas. [20]

De manera similar en Chile, atendiendo a la problemática existente en los sectores

agrícolas, se creó la Red de Vigilancia Epidemiológica en plaguicidas, teniendo los

laboratorios clínicos una alta demanda de análisis de pacientes expuestos a

plaguicidas, estableciéndose valores de referencia para la actividad de la

colinesterasa plasmática, por varias técnicas, siendo para mujeres de 4,50 a 10,98

U/L y para hombres de 3,37 a 10,23 U/L [19].

En varias poblaciones de Colombia, se han establecido igualmente valores de

referencia por diferentes métodos, en este caso de la actividad de la colinesterasa

eritrocítica, a través del programa de vigilancia epidemiológica de plaguicidas

organofosforados y carbamatos, con la finalidad de poder monitorear de manera

eficaz la población laboral activa de este país. [21]

Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos realizados, el uso de sangre sigue

teniendo inconvenientes, muchas veces no es posible hacer seguimientos


23

continuos de individuos expuestos, ya que la sangre requiere una técnica de

colección invasiva y los trabajadores se rehúsan a estos análisis, lo cual constituye

una limitación. Por esta razón se han venido estudiando el potencial de diferentes

fluidos biológicos (sudor, saliva, leche materna [22], lágrimas, entre otros) [23] que

permitan brindar información de diferentes enfermedades, y realizar un diagnóstico

eficaz.

En el caso del monitoreo de contaminantes ambientales, la actividad de las

enzimas colinesterasa ha sido demostrada en varios de los fluidos biológicos

nombrados anteriormente, específicamente en sudor, lagrimas, orina y saliva [24],

siendo esta última propuesta como un fluido ideal que puede sustituir la sangre en

los biomonitoreos.

Existen numerosos reportes sobre la estimación de colinesterasas en sangre, sin

embargo la actividad de colinesterasas en fluidos orales es limitada, tanto en

animales como en los seres humanos. En un estudio para determinar la actividad

y farmacocinética de la colinesterasa en saliva de ratas, como un biomarcador

biológico para la exposición a plaguicidas por el método de Ellman, se encontró

que, en comparación con plasma y cerebro, la actividad de colinesterasa en saliva

es inhibida en un porcentaje mayor al 95%, en presencia de inhibidores selectivos

de AChE y BuChE con diferentes sustratos, y que esta inhibición está asociada

principalmente a la actividad de la enzima BuChE [16].

Análogamente, resultados de un estudio para determinar el efecto de malatión

sobre la actividad de colinesterasa en saliva y plasma de ratas, por el método de

Ellman, indican que la exposición a este organofosforado disminuye la actividad

de la enzima acetilcolinesterasa de forma significativa en ambos fluidos, siendo la

actividad en saliva la más afectada, considerándose de esta manera la saliva

como una alternativa ante el análisis de plasma para el monitoreo de la toxicidad

de organofosforados. [5]

En saliva humana, diferentes estudios, indican que la saliva está compuesta por

una mezcla de acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa. Ryhanen y

colaboradores, encontraron que la actividad de butirilcolinesterasa, por el método


24

de Ellman, es de un 70-90% de la actividad total de colinesterasas en saliva, en

presencia de varios inhibidores [25]. Estudios más resientes encontraron resultados

similares, que favorecen el uso de saliva como medio diagnóstico. [11,24]

El estudio de inhibición de colinesterasas por exposición a organofosforados no

solo se limita a matrices biológicas. El uso de colinesterasa como indicador

biológico ha sido particularmente usado en regiones tropicales donde son usados

los insecticidas organofosforados en la agricultura y para el control vectores de

enfermedad, como el dengue. La inhibición de colinesterasa es usada como un

método bioquímico para evaluar, a través del método de Ellman, mezclas de

contaminantes en sedimentos de lagunas de México, localizadas en una área de

extracción de aceite, donde son usados pesticidas en la agricultura y como control

de vectores.[26]

Además de esto, la actividad de la colinesterasa ha sido estudiada como un

indicador de los efectos de combinaciones de organofosforados en agua de

diferentes fuentes ambientales, las cuales son afectadas por fuentes industriales,

agrícolas, y por el uso de organofosforados en la acuicultura, encontrándose que

es posible aplicar el método de Ellman, como una técnica para el monitoreo de la

calidad del agua en diferentes ecosistemas, lo cual contribuye a la preservación

del ambiente. [27]

Debido a la alta especificidad que posee los plaguicidas OPs y Cs, se ha

demostrado que son altamente tóxicos para aquellas especies que no son el

blanco directo de estos agentes químicos, tales como mamíferos, aves y

organismos acuáticos, por esta razón se ha aplicado el método de Ellman para

monitorear diferentes organismos de agua dulce y marina, tales como algas,

diferentes tipos de invertebrados y peces de consumo humano, en los cuales se

ha demostrado que varios organofosforados son altamente bioacumulables, como

el caso de el clorpirifos. [28-30]


25

III.1 LA SALIVA

Es el producto de la secreción de las glándulas salivares. Es un jugo digestivo que

durante la masticación se mezcla con los alimentos para formar el bolo alimenticio.

Igualmente sirve de medio de cultivo para los microorganismos bucales. Baña la

mucosa bucal, los dientes y las encías, y ejerce cierta influencia sobre la salud y el

metabolismo de estos tejidos. Comer, hablar y deglutir están perturbados sin la

acción lubricante de la saliva

III.1.1 Composición química de la saliva

La saliva es un líquido de la cavidad bucal, producido por las glándulas salivales,

es transparente, y de viscosidad variable. Es producida en un 70% por la glándula

submaxilar, 25 % por la glándula parótida y un 5% por la glándula sublingual. [31]

Está compuesta en un 95 % por agua y el 5 % restante por solutos tales como

iones sodio, potasio, cloruro, bicarbonato y fosfatos. Hay además una sustancia

cerosa llamada mucus (Líquido espeso viscoso segregado por las glándulas

mucosas), que humedece, lubrica y protege las zonas del organismo que están

revestidas por las mucosas del tracto digestivo y respiratorio, y dos enzimas: la

amilasa salival y la lisozima. Contiene además, mucina que es la proteína más

importante en la regulación de la viscosidad de la saliva

El agua permite que los alimentos se disuelvan y que sintamos su sabor. Los

iones cloruro, activan la amilasa salival; el bicarbonato y el fosfato neutralizan el

pH de los alimentos muy ácidos. El mucus lubrica el bolo alimenticio para que

pueda avanzar a lo largo del tubo digestivo. La enzima lisozima destruye las

bacterias, protegiendo los dientes de las caries, aunque su baja concentración no

destruye todas las bacterias.

Se estima que la boca está humedecida por la producción de entre uno y dos litros

de saliva al día, esta cantidad de saliva es variable, va disminuyendo conforme

avanzan los años y debido a diferentes tratamientos. La producción de saliva está

relacionada con el ciclo circadiano, de tal manera que por la noche se segrega una


26

mínima cantidad de saliva, su composición varía en función de los estímulos

(como el olor o la visión de la comida), aumentando así, por ejemplo, el pH ante

estos estímulos (cuando en condiciones normales es de 6 a 7).

La saliva es un ultrafiltrado natural del plasma. Los compuestos químicos

presentes en este fluido provienen del plasma, a través de transporte intercelular o

el intracelular, transporte activo o difusión pasiva, en dependencia de las

características del analito (peso molecular, solubilidad, grado de ionización y carga

proteica) [32]. A través de estos mecanismos es posible determinar en saliva

compuestos inorgánicos y orgánicos, tales como proteínas, hormonas, esteroides,

enzimas (entre ellas la enzima acetilcolinesterasa [25] ), anticuerpos, ácidos grasos,

entre otros compuestos, convirtiéndose en una matriz biológica importante en la

detección y diagnostico de enfermedades por sus implicaciones fisiológicas, y

patológicas, además tiene un método de colección simple, no invasivo, de fácil

almacenamiento y bajo costo, lo que ofrece una ventaja tanto para el analista

como para el paciente.

Estas características hacen posible monitorear varios biomarcadores en niños,

ancianos y personas no accesibles, en muchas circunstancias en las que las

muestras de sangre y orina no son posibles. Las investigaciones realizadas en

saliva proponen este fluido para el diagnóstico de infecciones virales y

bacteriológicas, cáncer, abuso de drogas y fármacos, hormonas, ADN, metales,

contaminantes ambientales y atmosféricos. [33]

III.1.2 Usos de la saliva [34]

En los últimos veinte años se ha demostrado cómo la saliva ha tomado un papel

relevante en la investigación. Actualmente, gracias a nuevas técnicas micro-

analíticas, es posible utilizar la saliva no sólo como un auxiliar de diagnóstico

clínico, sino también en el monitoreo de drogas, fármacos, contaminantes

ambientales y otros.


27

Algunas de sus ventajas son las siguientes:

� Constituye una vía de excreción de tóxicos. En la saliva se pueden excretar

compuestos liposolubles no disociados que se vuelven a deglutir y empieza

de nuevo el ciclo de absorción, distribución, metabolismo y excreción.

� Permite la detección de consumo de drogas en los controles preventivos de

tráfico en conductores que han consumido cualquier tipo de droga.

� Permite la detección de numerosos contaminantes ambientales en el

cuerpo, ya que existe una asociación entre los niveles de toxicidad que se

presentan en el plasma y los que se manifiestan en la saliva, considerando

que la misma constituye un ultra-filtrado de plasma.

� Permite determinar la presencia de factores de crecimiento y su posible

relación con las observaciones clínicas.

� Muchos investigadores han estudiado y evaluado las pruebas de saliva

como alternativa diagnóstica para la detección de VIH encontrándola tan

válida como los análisis de sangre, aunque sus niveles de anticuerpos son

más bajos.

� El estudio de fluidos como la saliva o la transpiración son la base de las

nuevas técnicas para detectar en forma temprana diversos tipos de cáncer,

evitando dolorosos e invasivos exámenes.

� Considerando la simplicidad de la recolección y el menor riesgo de

contaminación durante los procedimientos, se ha utilizado la saliva como

medio diagnóstico de exposición ocupacional a plaguicidas y de numerosos

metales entre ellos cadmio, arsénico, y plomo.

Reconociendo la importancia de la saliva como un fluido para el diagnóstico, la

Academia de Ciencias de Nueva York, el Instituto Nacional de Investigación Dental

de los Estados Unidos de América, los numerosos grupos de investigación sobre

saliva en el mundo y la industria privada de países desarrollados han apoyado y

recomiendan maximizar el potencial de este fluido para su uso en investigación, a

fin de extender la investigación en saliva de manera prioritaria para facilitar el


28

diagnóstico y monitorear el estado de salud general y buco dental de la

población.[9]

III.1.3 Limitaciones de la saliva como medio diagnóstico.

Considerando que la saliva es un fluido en estudio, no existe mucha información

sobre diferentes tipos de análisis y existencia de entidades químicas, por lo cual

presenta las siguientes limitaciones:

� Escasa información que se dispone acerca de la posibilidad de detectar

diferentes sustancias en relación con el tiempo teniendo en cuenta su

metabolismo y los métodos analíticos actuales.

� No se puedan utilizar las mismas técnicas analíticas establecidas en otros

fluidos biológicos.

� Ausencia de suficiente información analítica con la que se puede hacer

comparaciones.

� Existencia de dos tipos diferentes de saliva (la procedente de parótida,

serosa y la saliva mixta, serosa y mucosa), en las cuales los tóxicos

exhiben diferencias cinéticas.

� Las concentraciones en saliva son menores que las alcanzadas en orina, y

en algunos casos también más bajas que las correspondientes en plasma.

Independientemente de la concentración de agentes tóxicos que puedan estar

presentes (indicador biológico o biomarcador, presente en el medio diagnóstico), y

tomando en cuenta la alta sensibilidad de las técnicas analíticas modernas, la

saliva puede ser usada como medio diagnóstico para determinar el grado de

toxicidad producido por metales pesados, plaguicidas organofosforados y

carbamatos, entre otros, en trabajadores expuestos a estas sustancias químicas

nocivas.


29

III.2 INDICADOR BIOLÓGICO (IB)

Un indicador biológico o biomarcador es una sustancia química, generalmente un

tóxico, o los metabolitos que resulten de su biotransformación o cualquier

alteración bioquímica precoz, cuya determinación en los líquidos biológicos, tejidos

o aire exhalado (medios diagnóstico) permita evaluar la intensidad de exposición o

riesgo para la salud. En el estudio de trabajadores expuestos a determinados

agentes químicos, se consideran dos tipos de indicadores biológicos:

IB de dosis: es un parámetro que mide la concentración del agente químico o de

alguno de sus metabolitos en un medio biológico del trabajador expuesto.

IB de efecto: es un parámetro que puede identificar alteraciones bioquímicas

reversibles, inducidas de modo característico por el agente químico al que está

expuesto el trabajador.

En el caso de los plaguicidas, de la mayoría no se dispone de datos, en algunos

casos únicamente se dispone de datos parciales, que sólo permiten hacer

referencia a unos niveles indicativos que sugieren la posibilidad de una exposición

superior a la de la población o grupo estudiado que ha servido de referencia,

considerada como normal o aceptable. En otros casos, el valor del indicador no

radica en su aspecto cuantitativo sino en el cualitativo, y su presencia es indicativa

de exposición o contacto con un determinado agente, pero no evalúa la magnitud

o intensidad de este contacto. En la tabla 2 se muestra los indicadores biológicos

más comunes para el análisis de exposición a OPs y Cs.

En el caso de la saliva, el indicador biológico a estudiar en los experimentos

colorimétricos, será la disminución de la actividad de la acetilcolinesterasa

(indicador biológico de efecto), mientras que la detección de plaguicidas

organofosforados y carbamatos constituirá el indicador biológico de exposición por

cromatografía de gases. En cualquiera de los casos se debe establecer un valor

límite biológico, definido por un valor el cual servirá como referencia para el

diagnóstico clínico de toxicidad en los individuos.


30

Tabla 2. Indicadores biológicos de exposición y efecto para Organofosforados y

Carbamatos. [19]

EXPOSICIÓN A MUESTRA INDICADOR BIOLÓGICO

Organofosforados Sangre

• Actividad colinesterásica • Esteraza neurotóxica • Paraoxonasa • Plaguicidas OPs

Orina • Fenoles • Alquilfosfatos.

Carbamatos

Sangre • Actividad colinesterásica • Plaguicidas carbamatos

Orina • 1-naftol • 2-isopropoxifenol

III.3 VALORES LIMITES BIOLÓGICOS (VLB)

Son los valores de referencia para los Indicadores Biológicos asociados a la

exposición global a los agentes químicos. En general, los VLB representan los

niveles más probables de los Indicadores Biológicos en trabajadores sanos

sometidos a una exposición global a agentes químicos. Es decir, es el valor

máximo de tolerancia por encima del cual se puede definir una sobre exposición

de un trabajador a un determinado agente químico nocivo. [7]

El Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT) de España

tiene establecidos VLB solo para el pentaclorofenol, los organofosforados

inhibidores de la colinesterasa y el paratión. En la tabla 3 se presentan los

nombres de las sustancias activas, indicadores específicos, valores VLB, aspectos

referidos al momento apropiado para la toma de muestra, y algunas notas

correspondientes a los plaguicidas. [35]

En el análisis de plaguicidas organofosforados en sangre, se han establecido

valores límites biológicos, de acuerdo al grado de inhibición de la enzima

acetilcolinesterasa, a los cuales se asocian una variedad de síntomas clínicos, los

cuales se resumen en la tabla 4.


31

Tabla 3. Valores de referencia del INSHT para algunos compuestos usados como plaguicidas [35]

Sustancia activa Indicador

biológico Valor Límite

Biológico (VLB) Momento

de muestreo Notas

Organofosforado inhibidor de

colinesterasa

Colinesterasa eritrocitaria

(sangre)

Reducción de la actividad al 70% del valor

basal individual

El momento de la toma de muestra no resulta crítico

dado que la recuperación ChE es un proceso muy

lento

Determinante inespecífico. Es

un indicador cualitativo de exposición al

agente.

Paratión

p-Nitrofenol total en orina

0,5 mg/g creatinina

Final de la jornada laboral

Determinante inespecífico.

Colinesterasa eritrocitaria

Reducción de la actividad al 70% del valor

basal individual Discrecional

Indicador cualitativo de

exposición

Pentaclorofenol

Pentacloro fenol total en

orina 2 mg/g

creatinina Principio de la

última jornada de la semana laboral

presente en cantidades

detectables en personas no expuestas

Pentacloro fenol libre en

plasma 5 mg/L Final de la

jornada laboral Presente en personas no expuestas.

Tabla 4. Niveles de intoxicación según el grado de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa. [19]

INHIBICIÓN DE ACHE

NIVELES DE INTOXICACIÓN SÍNTOMAS CLÍNICOS

25-50 % Leve Cefalea, alteraciones visuales,

náuseas, mareo, lagrimeo, espasmo bronquial.

50-70 % Moderado Vómito, astenia, sudoración,

trastornos metabólicos, deterioro mental.

Más de 70 % Grave Convulsiones, coma, edema

pulmonar, insuficiencia respiratoria severa y muerte.


32

Los valores limites observados están referidos a las matrices sangre y orina. En el

caso de la saliva no existen valores límites biológicos a los cuales hacer referencia

para establecer el nivel de vigilancia de una sustancia química o sus metabolitos

en este medio.

Dado que la actividad de acetilcolinesterasa es una condición fisiológica normal y

los valores de actividad enzimática tienen una variabilidad interindividual, se ha

establecido que factores tales como edad, sexo, raza, estado nutricional, y

presencia de enfermedades, afectan el valor de la colinesterasa en sangre, por lo

cual se debe determinar el valor basal en saliva por ser el medio usado como

medio diagnostico, de manera que se pueda reconocer un efecto asociado a la

exposición a plaguicidas depresores de la actividad de acetilcolinesterasa en un

determinado individuo durante su vida laboral.

Este valor debe reflejar la variabilidad individual en del rango de valores de una

población no expuesta tomados como referencia para un determinado grupo de

plaguicidas y constituirá el valor de referencia contra el cual se comparan los

valores de acetilcolinesterasa obtenidos de un trabajador expuesto a plaguicidas

durante su periodo laboral.


33

III.4 PLAGUICIDAS

Los plaguicidas son sustancia o mezclas de sustancias, de carácter orgánico o

inorgánico, destinada a combatir especies indeseables de plantas y animales que

son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la

producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de

alimentos, productos agrícolas, madera o alimentos para animales.

Los plaguicidas de amplio espectro, son biocidas, y matan indiscriminadamente,

en el caso de los insecticidas, tanto a los insectos que actúan como plaga, como a

otros insectos benéficos, que pueden servir de controladores biológicos naturales

a otras poblaciones de insectos. El uso creciente de plaguicidas puede provocar la

resistencia de insectos, plantas y hongos como un mecanismo bioquímico de

defensa que permiten que la dosis aplicada ya no sea mortal, y es capaz de ser

heredada a las generaciones posteriores.

III.4.1 Clasificación de los plaguicidas

Los plaguicidas se pueden clasificar de muchas formas. En la siguiente tabla se

resume los principales tipos de clasificación de los plaguicidas.

Tabla 5. Clasificación de los plaguicidas.

Clasificación de los plaguicidas

De acuerdo al organismo que controlan

insecticidas, fungicidas, herbicidas, nematicidas, rodentinas, avicidas, acaricidas, entre otros

Por su composición química Botánico, Inorgánico, Orgánicos, Hidrocarburos clorados, Organofosforados, Carbamatos.

Por su forma de Acción Inmediata, residual

Por su forma de aplicación Fumigante, depósito, polvos, adhesivos, láminas

Por su forma de Penetración Digestivos, respiratorios, tegumentarios, Deshidratantes.

Por su Formulación Puros, aerosoles, rocíos, suspensiones, polvos, emulsiones.


34

III.4.2 PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS Y CARBAMATOS

Organofosforados (OPs)

Los plaguicidas organofosforados constituyen un amplísimo grupo de compuestos

de síntesis, en general altamente tóxicos, con un precedente en los gases de

guerra, entre los que se encuentran el sarín, tabún y soman, y que se

desarrollaron de manera especial a partir de la Segunda Guerra Mundial. Las

propiedades de estos compuestos como insecticidas fueron el motivo de que ya

en 1959 se hubieran sintetizado alrededor de 50.000, al revelarse como útiles

elementos de lucha contra las plagas de insectos, por lo que forman parte, como

ingredientes activos, de muchos formulados comerciales.

La fórmula estructural general de estos compuestos se puede representar de la

siguiente manera:

Son ésteres del ácido fosfórico, donde R1 y R2 son radicales alquilo, generalmente

–CH3 o –CH2-CH3. X es característico de cada compuesto, contribuye de forma

importante a sus propiedades. Dependiendo de los átomos que se encuentren en

la posición [1] y [2] el compuesto recibe diferente denominación, las cuales se

pueden resumir en la tabla 6.

Tabla 6. Denominación de los OPs según sus sustituyentes.

R1 y R2 Radicales alquilo –CH3 ó –CH2-CH3

X Característico de cada compuesto

[1] O Oxones [2] O Fosfatos

[2] S Tiolatos

[2] N Fosforoamidatos

[1] S Tiones [2] O Tionatos

[2] S Tiolotionatos


35

Los tiones son los más tóxicos, ya que atraviesan fácilmente las barreras

biológicas, y dentro del organismo se convierten en oxones por acción de las

enzimas microsomales del hígado, los cuales son fuertes inhibidoras de las

colinesterasas y otras esterasas. Las estructuras químicas se representan a

continuación en la figura 3.

Fosfatos Fosforotiolatos

Fosforotionatos Fosforoditionatos

Figura. 3 Estructura básica de los Organofosforados

Figura 4. Estructura Química de algunos Organofosforados comunes


36

Los compuestos OPs se caracterizan por ser altamente solubles lo cual facilita su

entrada en el organismo, poseen un tiempo de vida corto en el medio ambiente y

en el organismo, una de sus características mas importantes es que son

inhibidores activos e irreversibles de la enzima acetilcolinesterasa, lo cual lo

diferencia de otros plaguicidas. [36] en la figura 4, se muestra algunas estructuras

químicas de organofosforados usados como plaguicidas.

Carbamatos (Cs)

Son ésteres N-sustituidos del ácido carbámico, usados principalmente como

insecticidas y fungicidas. Fueron desarrollados en los años cuarenta en el

esfuerzo por encontrar nuevos insecticidas, el primer compuesto en salir al

mercado fue el carbaril. Los compuestos de este tipo presentan la siguiente

estructura general:

Donde R2 puede ser aromático o alifático, y dependiendo de la naturaleza de R1

estos compuestos tienen diferentes propiedades:

� Carbamatos insecticidas si R1 es un grupo metilo.

� Carbamatos herbicidas si R1 es un sustituyente aromático.

� Carbamato fungicidas si R1 es un sustituyente benzoimidazol.

El acido carbámico y sus esteres son compuestos inestables, se descomponen

fácilmente produciendo el alcohol correspondiente, la amina y dióxido de carbono.

Muchos carbamatos son inhibidores activos de la acetilcolinesterasa y su toxicidad

para insectos y mamíferos, incluido el hombre, se debe a esta acción [37]. En la

figura 5, se muestran algunas estructuras químicas de carbamatos usados

principalmente como insecticidas, funguicidas y nematicidas.


37

Figura 5. Estructura Química de algunos Carbamatos comunes

III.5 FASES QUE CONSTITUYEN EL FENÓMENO TÓXICO DE LOS

PLAGUICIDAS OPS Y CS.

III.5.1 Exposición.

La exposición y absorción de estos compuestos puede ser por vía dérmica,

respiratoria y digestiva. Las dos primeras se dan especialmente en el ámbito

laboral, tanto trabajadores que los fabrican como los que los usan en el sector

agrícola.

Diferentes grupos y sectores de la población en general también están expuestos

a ellos a través del consumo de alimentos de origen vegetal y animal (leche,

carnes, etc.) y el agua. El grado de exposición introducido por el consumo de

alimentos depende de los tratamientos efectuados por el agricultor, el tipo de

plaguicida, las condiciones climáticas en que se efectúen las aplicaciones, su

frecuencia y la dosis empleada. [36]

Las exposiciones accidentales o intencionales son importantes, según la

Organización Mundial de la Salud (OMS) se produce anualmente en el mundo

más de un millón de intoxicaciones graves accidentales entre los aplicadores de


38

plaguicidas, sin contar los millones de intoxicaciones accidentales,

fundamentalmente suicidios. [7]

III.5.2 Toxicocinética

Una vez absorbidos, los plaguicidas organofosforados, carbamatos y sus

metabolitos, se distribuyen rápidamente a su sitio de acción, se transportan a un

depósito de almacenamiento o se transportan a otros órganos para su

destoxificación o bioactivación antes de ser eliminados. Las concentraciones más

elevadas se alcanzan en el hígado y en los riñones.

El proceso de transformación se lleva a cabo principalmente en el hígado por

enzimas oxidasas, hidrolasas y glutation-S-transferasas, pudiendo dar como

resultado metabolitos más tóxicos característicos de cada organofosforado y

carbamato, estos compuestos resultantes son solubles en agua y se eliminan de

forma rápida por la orina y en menor medida por heces y aire expirado. La máxima

excreción se alcanza a los dos días, luego esta disminuye drásticamente.

III.5.3 Toxicodinámica

Aunque los organofosforados y los carbamatos poseen grupos químicos

diferentes, el mecanismo a través del cual producen toxicidad, es similar, ambos

actúan inhibiendo a la acetilcolinesterasa; enzima responsable de la eliminación

de acetilcolina. Con su inhibición, se ve alterado el funcionamiento normal del

impulso nervioso.

La acetilcolina (ACh) es un neurotrasmisor del sistema nervioso periférico y

sistema nervioso central, y esta presente en muchos organismos incluyendo los

seres humanos. Existen dos tipos de receptores de acetilcolina en las membranas

postsinápticas: los nicotínicos y los muscarínicos.

Los receptores nicotínicos (Figura 6) son responsables de la transmisión sináptica

excitadora rápida en la unión neuromuscular, en los ganglios y en el sistema

nervioso central, pertenecen a la familia de receptores acoplados a canales


39

iónicos y se dividen en receptores musculares y neuronales. Los receptores

muscarínicos están ampliamente distribuidos, en general se encuentran en el

tejido glandular, en el corazón, en el músculo liso y en el pulmón, pertenecen a la

familia de receptores acoplados a proteínas G.

Figura 6. Sinapsis colinérgica. Receptor nicotínico

La acetilcolina se encuentra en vesículas y libre en el citoplasma del Terminal

axónico de las neuronas presinápticas. Cuando llega un potencial de acción a la

terminal nerviosa la membrana se despolariza, y se abren los canales de Ca+2. El

Ca+2 se une a unas proteínas específicas que inducen la fusión de la membrana

de las vesículas con la membrana axónica, produciendo la expulsión del contenido

(acetilcolina) hacia la hendidura postsináptica.

La acetilcolina difunde hasta llegar al receptor que está en la membrana

postsináptica. En el receptor nicotínico al interaccionar con la acetilcolina modifica

su conformación, provocando un cambio en la permeabilidad de la membrana para

Ca+2 y Na+. El paso de ambos cationes produce una despolarización de la


40

membrana, y el potencial de acción se extiende, mediante canales regulados por

Na+ (Figura 6).

En el caso de los receptores muscarínicos la transmisión del potencial de acción

transcurre igual. Cuando el neurotransmisor se une al receptor, este cambia su

conformación, activando la proteína G que lleva acoplada.

La acetilcolina después de su liberación y de que haya realizado su función unida

a los receptores en el espacio sináptico, es degradada rápidamente por la

acetilcolinesterasa a colina y acetato. Gran parte de la colina originada se

reincorpora a la terminación nerviosa para volver a sintetizar acetilcolina.

III.5.4 Toxicología

Los organofosforados y carbamatos al inhibir la colinesterasa, hacen que se

produzca una acumulación de acetilcolina en los órganos efectores, provocando

su sobre-estimulación. En las terminaciones motoras hace que aumente la fuerza

de la contracción muscular, llegando a provocar fasciculaciones y en casos más

graves aparece un bloqueo neuromuscular despolarizante constante, con la

consecuente parálisis muscular. En el sistema nervioso central altas

concentraciones de acetilcolina causan alteraciones sensoriales y del

comportamiento, falta de coordinación, depresión de la función motora y

depresión respiratoria. El aumento en las secreciones pulmonares y la depresión

respiratoria son motivos usuales de muerte en intoxicación por estos compuestos.

El cuadro toxicológico provocado por los plaguicidas no depende solamente de la

naturaleza, dosis del toxico, y de la forma de exposición sino también de la

naturaleza de los coadyudantes (disolventes, estabilizantes y demás aditivos). Es

importante considerar la sensibilidad de los individuos expuestos, generalmente

las mujeres son más sensibles que los hombres, pero los de más riesgo son los

niños, mujeres gestantes, ancianos, y personas enfermas con rutas metabólicas

alteradas.


41

III.6 MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMÁTICA DE LA

ACETIlCOLINESTERASA (ACHE)

Existen dos tipos de enzimas colinesterasas: la acetilcolinesterasa (AChE) y la

pseudocolinesterasa (BuChE), las cuales consisten en una larga de cadena de

proteínas compuestas de una o mas subunidades catalíticas, que contiene cada

una secuencia de 583 amino ácidos, con un peso de entre 70-80 KDa. [6]

La BuChE se encuentra en el plasma y en células de diversos tejidos como

intestino, hígado, y músculo, ésta hidroliza tanto la acetilcolina como otros ésteres

de colina. La AChE se encuentra localizada, principalmente, en la hendidura

sináptica donde se libera acetilcolina, en las sinápsis ganglionares de la estructura

neuromuscular y en los eritrocitos. Ambas esterazas hidrolizan muchos

xenobióticos con grupos éster, amida, tioéster, ésteres fosfato y anhídridos de

ácido. Interaccionan con los organofosforados mediante un grupo –OH de un resto

de serina, formando un enlace P=O, que no es hidrolizable por H2O quedando

inhibidas.

En la enzima se distinguen dos dominios o sitios activos: uno aniónico y otro

esteárico. El dominio aniónico esta formado por un resto de glutamato, que se

combina con la carga positiva del sustrato ayudando a su orientación. El dominio

esteárico esta formado por un resto de serina (Ser) y otro de histidina, que se

combinan con el grupo carboxílico y es el principal responsable de la afinidad e

hidrólisis del sustrato. El mecanismo de acción de la acetilcolinesterasa se lleva a

cabo mediante una catálisis covalente.

La reacción entre la acetilcolina y la enzima es un proceso que ocurre en varias

etapas. En una 1ª etapa de la reacción, la acetilcolina es atraída al sitio activo de

la enzima por la carga negativa, estableciéndose un enlace electrostático entre el

nitrógeno cuaternario de la acetilcolina y el sitio aniónico de la enzima. Esta unión

se complementa en el sitio esteárico, ya que se realiza un ataque nucleofílico por

parte del grupo OH del resto de serina al grupo carboxílico de la acetilcolina. La

unión se concreta también con el establecimiento de enlaces o puentes de

hidrógeno entre los grupos ácido y básico presentes en el sitio esteárico y la


42

acetilcolina, como resultado de estas uniones se forma el complejo enzima

sustrato. Este mecanismo de acción se muestra en la figura 7.

Figura 7. Formación del Complejo enzima-sustrato

En la 2ª etapa de la reacción se produce la hidrólisis de la molécula de

acetilcolina, desprendiéndose colina y quedando la enzima acetilada. El ultimo

paso es la desacetilación de la enzima debida al rompimiento del enlace covalente

por acción del agua, dando lugar a la liberación acido acético y la restitución de la

enzima (Figura 8).

Figura 8. Regeneración de la enzima y liberación de ácido acético mas colina

2

Enzima Acetilada Enzima regenerada + Colina + Acido acético

Enzima Acetilcolinesterasa Complejo Enzima-Sustrato


43

III.6.1 Mecanismo de acción de los OPs y Cs

La inhibición enzimática, por parte de los OPs y Cs, se desarrolla a través de una

serie de etapas muy semejantes a las mencionadas anteriormente entre la enzima

y la acetilcolina. Estos plaguicidas actúan sobre el centro activo impidiendo la

unión de una molécula de sustrato (acetilcolina), ya sea bloqueando el sitio por su

alta afinidad o reaccionando irreversiblemente con la serina.

Para el caso de los OPs, en primer lugar, ocurre la formación de un complejo entre

la enzima y la molécula de plaguicida como consecuencia del ataque electrofílico

del resto de serina al átomo de fósforo. Posteriormente ocurre la reacción de

hidrólisis, liberándose el grupo saliente y quedando la enzima fosforilada, la cual

presenta gran estabilidad. Este proceso se representa en la figura 9.

Figura 9. Ataque nucleofílico de la serina al átomo de fósforo del OPs.

Los carbamatos siguen un mecanismo similar al de los OPs, quedando en este

caso la enzima carbamilada.

La ultima etapa, que seria el rompimiento del enlace por acción del agua presente,

con la consiguiente restitución de la enzima, es donde se establece la diferencia,

ya que la fuerza del enlace es normalmente de tal magnitud que el ataque

Complejo Enzima-Fosforado Enzima fosorilada


44

nucleofílico realizado por las moléculas de agua no es suficiente para romperlo,

por lo menos a corto plazo, quedando la enzima inactivada.

La reactividad de los OPs y Cs varía según su estructura química, el proceso de

organofosforación y carbamilación de la enzima depende de la electrofílicidad del

centro activo, y la estructura global, ya que ésta afecta la velocidad de la reacción.

El factor que determina el grado de inhibición de la enzima por los

organofosforados, es el carácter electrofílico del átomo de fósforo. Los grupos

químicos unidos al átomo de fósforo pueden afectar su naturaleza electrofílica,

siendo aquellos compuestos que tienen un doble enlace entre el P y el O los más

reactivos, ya que el átomo de P es altamente electrofílico. Dentro de los grupos

que cambian la reactividad del P se encuentre el nitro, ciano, halógenos, cetona y

éster carboxílico. Los grupos que lo desactivan son el hidróxido y acido carboxílico

En el caso de los carbamatos, el factor más importante que va a determinar el

grado de inhibición es la afinidad del compuesto con los sitios activos de la

enzima. De manera general se puede decir que aquellos compuestos carbámicos

que estructuralmente se parecen más al sustrato natural de la enzima, la

acetilcolina, tendrán un mejor acoplamiento con la enzima y serán mejores

inhibidores. Dentro de los inhibidores más potentes de la AChE se encuentran

aquellos carbamatos que tienen en su estructura grupos acil como los siguientes:

-C(O)NH2 > -C(O)NHCH3 > -C(O)N(CH3)2


45

III.7 Metodología analítica para la determinación de residuos de

plaguicidas en muestras biológicas de origen humano.

El amplio uso de plaguicidas en el medio ambiente, y su elevada toxicidad ha

obligado al desarrollo de métodos analíticos confiables, rápidos, económicos, y

suficientemente sensibles que permitan el control de los compuestos tóxicos en

diversos tipos de muestras, en especial de origen humano. El análisis ambiental

tiene establecido toda una metodología para la toma de muestras, de análisis, y

los parámetros y límites permitidos, a diferencia de este, en el análisis de

muestras biológicas, para determinar agentes tóxicos de exposición laboral, no

existe una metodología especifica, no suele haber métodos normalizados y

aunque las técnicas analíticas son similares a las empleadas en la evaluación

ambiental, la naturaleza de las matrices y la existencia de metabolitos hace que la

preparación y extracción sea más complicada.

En la evaluación de la exposición humana a plaguicidas es importante conocer el

modo de acción, metabolismo de los analitos, para determinar así el parámetro

biológico adecuado, siempre que esté disponible esta información. El primer

parámetro a tener en cuenta es la elección de la matriz a analizar, la cual es

dependiente de un número de variables tales como farmacocinética del

contaminante, la disponibilidad de la matriz, la facilidad de manipulación, y el límite

de detección del método.

En el caso de la matriz sangre (suero o plasma), la ventaja principal es que se

puede determinar directamente el compuesto original, en lugar de los metabolitos,

y no se requiere por tanto conocer el metabolismo, sin embargo el análisis de

sangre presenta inconvenientes en la toma de muestras, limitación en la cantidad

y los niveles de concentración de los contaminantes es baja. El análisis de

contaminantes de exposición laboral en orina tiene ciertas ventajas como la

obtención de la muestra, volumen, requiere instrumentos menos sensibles ya que

la concentración es más alta dado que es un medio de eliminación, sin embargo

esto no siempre es así ya que la concentración de los analitos puede variar aun si

la dosis interna se mantiene constante. Otras matrices tales como tejido, saliva,


46

leche materna, sudor u otro no han sido muy estudiadas. En el caso de la saliva,

esta ofrece ventajas en lo que se refiere a colección, disponibilidad y volumen, sin

embargo dependiendo del agente contaminante y su toxicocinética, los niveles de

concentración del compuesto son más bajas que en otras matrices. [7]

La determinación de plaguicidas en muestras biológicas no se realizan de forma

directa sobre la muestra, esta requiere una serie de etapas previas que

constituyen el proceso analítico:

• Toma de muestra: almacenamiento y conservación.

• Preparación de la muestra: extracción, separación, purificación y pre-

concentración.

• Determinación instrumental.

III.7.1 Toma de muestra

En la toma de muestra de fluidos biológicos hay que tomar en cuenta la

representatividad de la muestra capaz de reflejar la exposición del trabajador, y

ésta depende del momento de la toma. Para contaminantes que tienen un tiempo

de vida larga (varias semanas) y su cinética de eliminación transcurre en una sola

fase, la toma puede realizarse a cualquier hora del día. Para los indicadores de

tiempo de vida corta, o de metabolismo en diferentes fases, la toma debe

realizarse en el momento más adecuado en el turno de trabajo. De forma general

dependiendo del tiempo de vida del indicador, éste nos informará de una

exposición reciente (en las últimas horas), o de una exposición a lo largo del día,

la semana, el mes o de toda la vida del individuo estudiado. [7]

No existe un procedimiento estándar general para la toma de muestra, éste

depende del tipo de muestra y de su complejidad, lo que hay que tener en cuenta

es que se debe conocer la cantidad de fluido a extraer, el colector adecuado, la

adición de un estabilizante, si es necesario, y de algún tratamiento previo antes de

su transporte o almacenamiento.

Para la colección de saliva existen diferentes métodos, dependiendo del tipo de

análisis. En muchos estudios, la toma se realiza a través del esputo del sujeto

directamente sobre un tubo colector. Aunque muchos pacientes prefieren donar


47

saliva en vez de sangre, debido a factores de inhibición personal, las personas

experimentan menos secreción salival (boca seca). Para inducir el flujo se usan

diferentes estimulantes tales como: masticar cera parafina, piezas teflón o gomas

masticables, limón o pequeñas cantidades de acido cítrico, los cuales aumentan el

flujo de 1 a 3 mL/min. Sin embargo estos métodos pueden influir en el pH de la

saliva conduciendo a errores en la interpretación de la concentración. [38]

III.7.2 Transporte y almacenamiento

El trasporte debe ser tal que evite contaminaciones, derrames, roturas, etc., que

son las causas de maltrato durante el transporte al laboratorio. Para esto se debe

cerrar bien los envases colectores, colocarlos en cajas u otro medio provisto de

material de relleno, y mantenerlos refrigerados lejos de la luz en todo momento.

Las muestras biológicas destinadas al análisis de plaguicidas por lo general se

almacenan a -20ºC [12]. En el caso de la saliva, existen diferentes opiniones, pero

por lo general las muestras se congelan a -20ºC, algunos investigadores

recomiendan centrifugar antes de congelar, y otros después, esto dependerá del

tipo de análisis. Uno de los problemas con la saliva es que, en las personas

fumadoras, aumenta la densidad haciendo más viscosa la saliva, para lo cual se

recomienda congelar a -40ºC durante 24 horas antes del análisis, lo que permite

que los componentes celulares y partículas suspendidas se rompan dejando un

liquido que es fácil de procesar. En trabajos forenses las muestras de saliva se

calientan en agua hirviendo durante 15-30 minutos antes de congelar, siempre y

cuando los analitos no sean muy volátiles o inestables a altas temperaturas. [32]

III.7.3 Preparación de la muestra En esta etapa se incluye la extracción de los plaguicidas o metabolitos y otro

opcional, de purificación, que debe ser efectivo para separar los analitos de los

interferentes que están formando parte de la matriz. Se deben considerar varios

factores para la elección de la técnica de extracción los cuales van a depender de

la matriz en estudio. Generalmente la mayoría de los trabajos extraen los

plaguicidas mediante extracción con disolventes orgánicos o mediante extracción


48

en fase sólida (SPE), acompañado de algún método de purificación para eliminar

interferencias.

III.7.4 Extracción con disolventes orgánicos.

La extracción con disolventes orgánicos o extracción líquido-líquido (LLE) es una

de las técnicas de tratamiento más usadas para la determinación de plaguicidas

en fluidos biológicos debido a su simplicidad y fácil manejo. Una de las variables a

tener en cuenta es la elección del solvente orgánico usado como extractante. En la

elección de este se han de considerar aspectos como polaridad, volatilidad, y

compatibilidad con las técnicas analíticas. En el análisis de orina y sangre

generalmente se usa hexano para la extracción de metabolitos de piretroides;

mezclas de hexano con acetona, diclorometano, y éter dietílico para los

organoclorados, otros solventes como tolueno y metanol también son usados.

III.7.5 Determinación instrumental

La elección de la técnica analítica depende de una variedad de factores tales

como costo, disponibilidad, selectividad, sensibilidad, propiedades del analito y

capacidad de análisis. Por lo general la determinación de plaguicidas se lleva a

cabo mediante técnicas cromatográficas como cromatografía de gases (GC) o

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acopladas a detectores que

permiten obtener la sensibilidad y selectividad adecuada. Los detectores mas

usados son el de captura de electrones (ECD) y el de nitrógeno-fósforo (NPD), sin

embargo los detectores de masa han adquirido gran importancia.

En el caso de la determinación de la actividad de colinesterasas, como

biomarcador para la exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos, el

método más ampliamente usado en sangre y plasma es el método de Ellman. Este

método hace uso de una técnica colorimétrica, determinando la absorbancia de un

complejo coloreado en la región visible del espectro electromagnético. Esta

técnica de espectroscopía molecular en la región de ultravioleta-visible podría ser

usada para realizar la misma determinación, usando saliva como medio

diagnóstico.


49

III.8 ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE La espectroscopia de absorción UV-Vis utiliza la radiación del espectro

electromagnético cuya longitud de onda está comprendida entre los 100 y los

800 nm (energía comprendida entre las 286 y 36 Kcal/mol) y su efecto sobre la

materia orgánica es producir transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos

y/o moleculares de la sustancia.

En la siguiente figura, se destaca el rango de absorción de los principales colores

en el espectro visible.

Espectro Visiblemayor frecuencia menor frecuencia

longitud de onda (nm)

Violeta: 400-420 nm Indigo: 420-440 nm

Azul: 440 -490 nm Verde: 490-570 nm

Amarillo: 570-585 nm Naranja: 585-620 nm

Rojo: 620-780 nm:

Los espectrofotómetros UV-Vis permiten obtener el espectro de compuestos a

modo de curva que representa la transmitancia o la absorbancia en función de la

longitud de onda.

La transmitancía es una medida de la atenuación del haz luminoso basada en la

comparación entre la intensidad trasmitida (I) y la intensidad incidente (I0)

dependiendo de que la muestra esté o no situada en el trayecto óptico entre la

fuente y el detector.

T se expresa por un cociente:

A menudo se expresa como porcentaje: % T = I/Io x 100.


50

La absorbancia A de una solución se define mediante la ecuación:

La transmitancía y la absorbancia se miden en un instrumento llamado

espectrofotómetro, la solución del analito se debe contener en algún recipiente

transparente, tubo o celda.

III.8.1 Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción

Ley de Lambert-Beer

Las medidas de absorción se basan en la ley de Lambert-Beer que relaciona, en

determinadas condiciones, la absorción de la radiación con la concentración de un

compuesto en disolución. Esta ley se expresa de la siguiente manera:

Donde A representa la absorbancia, parámetro óptico adimensional registrado por

el espectrofotómetro, b es el espesor (cm) de la disolución atravesada, c es la

concentración molar y el coeficiente de absortividad molar a una longitud de

onda determinada, característico del compuesto analizado, la temperatura y el

disolvente, tiene unidades de L g-1cm-1.

Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de

onda correspondiente a un máximo, pues el error de medición es mínimo y la

sensibilidad máxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe

realizar la curva de calibración; absorbancia (A) en función de concentración (c),

para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de concentraciones conocidas

y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida. Si es válida la ley de Beer,

para esa sustancia a esas concentraciones, la relación debe ser una recta, que

pase por el origen de los ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones

debidas a diversos factores.

La ley de Beer es exitosa en describir el comportamiento de absorción de

soluciones diluidas solamente; a concentraciones altas (generalmente mayores

que 0,01 M), la distancia promedio entre las especies responsables de la


51

absorción está disminuida hasta el punto que cada una afecta la distribución de

cargas de sus vecinas. Esta interacción, a su vez, puede alterar la habilidad de las

especies para absorber en una longitud de onda de radiación.

III.8.2 COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS

Los instrumentos para medir la absorción ultravioleta, visible y en el infrarrojo

cercano están compuestos por uno o más de los siguientes componentes:

1. fuentes

2. selectores de longitud de onda.

3. recipientes para la muestra.

4. detectores de radiación.

5. procesadores de señal.

6. dispositivos de lectura.

III.8.2-1 Fuentes

En las medidas de absorción molecular es necesario disponer de una fuente

continua cuya potencia no varié bruscamente en un intervalo determinado de

longitudes de onda.

Lámpara de deuterio e hidrogeno. La excitación eléctrica del deuterio o hidrogeno

a baja presión produce un espectro continuo en la región ultravioleta. El

mecanismo por el cual produce el espectro requiere la formación inicial de una

especie molecular excitada seguida de la disociación de la molécula excitada para

dar dos especies atómicas más un fotón ultravioleta.

D2 + Ee → D2* → D´ + D´´ + hv

Ambas lámparas de deuterio e hidrogeno producen un espectro continuo útil para

la región comprendida entre 160 y 375 nm. Deben emplearse ventanas de cuarzo

en los tubos: ya que el vidrio absorbe fuertemente en esta región del espectro

electromagnético.


52

Lámpara de filamento de wolframio. Es la fuente más común de radiación visible,

la distribución de energía de esta fuente se aproxima a la de un cuerpo negro y

por ello depende de la temperatura. Esta lámpara es útil para la región entre 320 –

2,500 nm.

III.8.2-2 Sistema selector de la longitud de onda de trabajo

Para la mayoría de análisis espectroscópicos se necesita una radiación constituida

por un grupo limitado, estrecho, y continuo de longitudes de onda denominado

banda. Existen dos tipos de selectores de longitud de onda los filtros y los

monocromadores. Dentro de los filtros, se emplean dos tipos, los filtros de

interferencia y los filtros de absorción, este último se limita a la región visible del

espectro y se usan para la selección de bandas, absorbiendo ciertas zonas del

espectro. Mientras que los de interferencia operan en la región ultravioleta visible y

buena parte del infrarrojo, estos se fundamentan en la solución de la interferencia

ópticas para producir bandas estrechas de radiación.

Los monocromadores se diseñan para realizar barridos espectrales. Utilizan rejilla,

lentes, espejos, ranuras de entrada y salida y redes o prismas. Estos instrumentos

pueden seleccionar longitud de onda en forma continua y en algunos casos con

precisión de décimas de nm. Por lo tanto, es posible obtener en forma continua el

espectro de absorción de una molécula.

III.8.2-3 Recipientes para la muestra

La mayor parte de las aplicaciones espectrofotométricas utiliza las muestras en

solución líquida, por esta razón se requieren recipientes para colocar la muestra

(celdas). La celda debe transmitir el 100% de la energía radiante en la zona

espectral de trabajo. En la región UV se usan celdas de cuarzo (200-2000 nm), y

en la región visible se usan celdas de vidrio (350-2000 nm). La longitud más

común para el trabajo en las regiones UV-VIS es 1 cm (otras son: 2, 5 y 10 cm).


53

III.8.2-4 Detectores de radiación

Son los encargados de transformar la energía radiante en una señal. El detector

ideal debe tener una elevada sensibilidad, una elevada relación señal/ruido y una

respuesta constante en un intervalo considerable de longitudes de onda, además

de tener un tiempo de respuesta rápido y una señal de salida igual a cero en

ausencia de iluminación. Existe dos tipos generales de detectores de radiación,

uno responde a los fotones y otro al calor. Todos los detectores de fotones tienen

una superficie activa que es capaz de absorber radiación, la energía absorbida

causa la emisión de electrones y el desarrollo de una fotocorriente, en este caso la

detección se basa en el aumento de la conductividad resultante. Los detectores

térmicos la radiación incide sobre un pequeño cuerpo negro y es absorbida por el,

se mide el aumento de temperatura resultante.

III.8.2-5 Procesadores de señal y dispositivos de lectura

El procesador de señal es un dispositivo electrónico que amplifica la señal de

corriente eléctrica del detector. El procesador de señal puede utilizarse para llevar

a cabo operaciones matemáticas como diferenciar integrar o convertir a logaritmo.

Existen distintos tipos de lectura como lo son los medidores digitales, escalas de

potenciómetros, registradores y tubos de rayos catódicos.

III.8.3 Especies absorbentes

La absorción de radiación ultravioleta o visible por una especie atómica o

molecular M se puede considerar que es un proceso en dos etapas, la primera de

las cuales implica una excitación electrónica como muestra la ecuación:

M + hv M*

El producto de la reacción entre M y el fotón es una especie electrónicamente

excitada que se representa por M*. El tiempo de vida de la especie excitada es

breve (de 10-8 a 10-9 s) su existencia acaba por alguno de los diversos procesos

de relajación. Hay varias formas de volver al estado fundamental:


54

- Disipa energía en forma de calor.

- Emite algún tipo de radiación (puede ser de la misma frecuencia).

La absorción de radiación ultravioleta o visible resulta, generalmente, de la

excitación de los electrones de enlace pudiéndose relacionar los picos de

absorción obtenidos con los tipos de enlaces de las especies estudiadas.

III.8.3-1 Modos de excitación electrónica.

Cuando la radiación incide sobre una sustancia no toda ella se ve afectada por la

misma; al átomo o conjunto de átomos que absorben radiación se le denominaba

cromóforo. En las moléculas existen también átomos o grupos de átomos que no

absorben radiación, pero hacen que se modifique alguna de las características de

la absorción del cromóforo, se denominaban a tales grupos auxocromos.

Figura 10. Niveles de energía para los diferentes tipos de transiciones.

Dependiendo del tipo de enlace que consideremos existen tres tipos de

transiciones electrónicas: electrones π, σ, y n, electrones d y f, y electrones de

transferencia de carga.


55

IV METODOLOGIA EXPERIMENTAL

IV.1 Población

La población motivo de esta investigación es la población de “El Paramito”,

ubicada en Timotes, Municipio Miranda. Según lo indicado por los dirigentes la

población ésta conformada por 87 individuos, establecidos en un total de 18

familias, estando la mayoría de ellos dedicados a la agricultura, y presentan un

bajo nivel socio-cultural y económico, lo cual se pudo constatar por observación

directa.

IV.2 Tamaño de la muestra

El tamaño de la muestra se determinó por el teorema del Limite Central e

Intervalos Confiables de acuerdo a la siguiente formula:

n= (Z)2 P.(1-P) Ec.1 D2

Donde:

n= Tamaño de la muestra.

Z= Factor para un nivel de confianza del 95%, valor: 1.96.

P= proporción poblacional de individuos con niveles de actividad de la

colinesterasa disminuidos. Este valor se tomara como 0.5 (50%).

(1-P) = proporción poblacional de individuos con niveles de actividad colinesterasa

normales. Este valor se tomara como 0.5 (50%).

D= precisión elegida para el cálculo, igual a 0.09 (9%)

Aplicando esta fórmula con los valores anteriores, se obtiene un valor para n de

118.56, el cual es corregido aplicando el factor de corrección poblacional para la

muestra con la siguiente fórmula:


56

n´= n / [1+ (n/N)] Ec. 2

Donde n´ es el tamaño de la muestra a considerar, n tamaño de la muestra sin

corrección (118.56), y N el tamaño de la población (87 individuos). El tamaño de la

muestra calculado, según la ecuación 2, para este estudio es de 50 muestras.

IV.3 Toma de muestras

La toma de muestra de saliva se realizó por esputo, a los individuos considerados,

en un envase colector estéril (Véase figura 12). Las muestras se trasvasaron a un

tubo de ensayo plástico con tapa, y se transportaron en un baño agua-hielo-sal,

hasta el lugar donde fueron almacenadas a una temperatura de -20 ºC hasta el

momento del análisis.

Se tomaron un total de 60 muestras de saliva (mayor al número de muestras

calculado), de individuos de ambos sexos, utilizando como único criterio de

selección individuos mayores de 8 años de edad, que realizan trabajos en el

campo, o que están expuestos a plaguicidas OPs y Cs en los sitios de

almacenamiento de estos productos.

Para la obtención de las muestras de

saliva se realizaron jornadas de atención

odontológica y apertura de historias

clínicas en la población de El Paramito,

Timotes, con la finalidad de conocer las

condiciones generales y buco-dentales

de cada uno de los individuos de esta

población. Figura 11. Fotografía de la atención medico-

odontológica brindada por personal de la

Facultad de Odontología de la Universidad

de los Andes a los habitantes de El

Paramito.


57

No se excluyeron del análisis mujeres gestantes, en periodo menstrual, o

individuos con algún tratamiento farmacológico.

Figura 12. Fotografías de la toma de muestra de los pobladores de El Paramito, las

cuales fueron tomadas por esputo en envases colectores estériles, y trasvasados a tubos

de ensayo plástico, según se muestra.

Para el grupo de control se tomaron 10 muestras de saliva, de individuos sanos,

con previa información acerca del tipo de análisis y fines de los mismos,

pertenecientes a cualquier ámbito laboral dentro de la ciudad de Mérida no

expuestos a plaguicidas organofosforados y carbamatos.


58

IV.4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA

ACETICOLINESTERASA EN SALIVA

En este apartado se describe el procedimiento para la determinación de la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva mediante el

método de Ellman por espectroscopía de absorción UV-Vis, como método para la

evaluar la exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos

Fundamento. El Método de Ellman se basa en la medida de la actividad de las

enzimas colinesterasa usando como sustrato esteres de colina, tal como la

acetiltiocolina. La liberación selectiva de tiocolina, por hidrólisis enzimática, es

monitoreada con el reactivo ácido 5,5´ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), el cual

forma un anión de color amarillo cuya intensidad es proporcional a la actividad

enzimática, que puede ser medido espectrofotométricamente a 405 nm. Las

reacciones involucradas se representan en la Figura 13.

1. H2O + Cl (CH3)3N+CH2CH2-S-CO-CH3 Cloruro de Acetiltiocolina

(CH3)3N CH2CH2-SH + CH3COOH

Tiocolina Acido Acético

2. (CH3)3N CH2CH2-SH +

Tiocolina DTNB

+ Acido 2-nitro-5-tiocolina Complejo de color amarillo TNB Absorbe a 405 nm.

Figura 13. Reacciones químicas involucradas en el método de Ellman.

Enzima AChE


59

IV.4.1 Reactivos, material y equipos instrumentales

Reactivos:

� Cloruro de acetiltiocolina. (Sigma 99 %)

� 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB). (Sigma).

� Acetilcolinesterasa de anguila eléctrica. (Sigma 61 %)

� Cloruro de sódio (J.T Baker 99.5 %).

� Dihidrogenofosfato de sódio. (Riedel de Haën AG 99 %).

� Monohidrógenofosfato de disodio. (Riedel de Haën AG 99 %).

� Sulfato de sódio anhídrido. (Baker analyzed 500 g, 99.9 %).

� Agua desionizada.

Patrones de plaguicidas inhibidores de la colinesterasa

Se trabajó con mezclas patrón de plaguicidas organofosforados y carbamatos, y

patrones individuales de estos, la mayoría de ellos usados en las actividades

agrícolas rutinarias. Cada experimento fue llevado a cabo utilizando una solución

diluida de la mezcla patrón en diferentes solventes. Los plaguicidas utilizados se

describen a continuación:

Mezcla de Organofosforados 1. EPA 8270 Organophosphorus pesticidas Mix 2.

99 %. Lote LA-65527. Contiene: dimetoato; disulfon; metil paratión; o,o,o trietil

fosforotionato; paratión; forato; sulfotep; tionazin. En una concentración de

2000 ppm. Se uso como solvente diclorometano.

Mezcla de Carbamatos 2. Dr. Ehrenstorfer. 100 mg/L. Lote 05310100. Contiene:

aldicarb; aldicarb-sulfona; aldicarb, sulfoxido; carbaryl; carbofuran; 3-hodroxi

carbofuran; metiocarb; metomil; 1-naftol; oxamyl; y propoxur. En una

concentración de 100 ppm. Se uso como solvente metanol.

Plaguicidas individuales. Metil-paratión (Dr. Ehrenstorfer GMBH, 98.5 %) y

carbofuran (Dr. Ehrenstorfer GMBH, 98.5 %).


60

Materiales:

� Material de vidrio: vasos precipitados (25, 250 y 500 mL), tubos de ensayo

sin graduar (5 mL).

� Material volumétrico: matraz aforado (2, 5, 10, 250, y 500 mL), pipetas

volumétricas y graduadas (1, 2, y 5 mL).

� Celdas de vidrio, 1 cm de espesor.

Muestras

Las muestras de saliva usadas para la optimización pertenecían a personas

sanas, no expuestas a plaguicidas. Las muestras fueron tomadas por esputo en

un envase colector estéril, y luego trasvasadas un tubo de ensayo plástico con

tapa. Las muestran se almacenaron a – 20 °C, hasta el momento del análisis.

Equipos Instrumentales

� Espectrofotómetro de Absorción UV-Visible Lambda 2, Perkin Elmer,

equipado con una lámpara UVS 54, ubicado en el laboratorio de

Fisicoquímica Orgánica, facultad de Ciencias, de la Universidad de Los

Andes.

Figura 14. Espectrofotómetro de Absorción UV-Visible Lambda 2, Perkin Elmer


61

IV.4.2 Resultados

Los resultados están expresados en términos de media y desviación estándar, en

unidades de actividad enzimática (U).

La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y

del nivel de actividad de la misma, expresa además la cantidad de sustrato

convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción.

En el Sistema Internacional de Unidades, la unidad para la actividad catalítica es

el Katal (kat, 1 mol convertido por segundo), pero es una unidad demasiado

grande, por lo que suele usarse la unidad de actividad enzimática (U, 1 μmol de

sustrato convertido por minuto).

Para el cálculo de la actividad se usa la siguiente ecuación:

Act (U/L) =ΔAbs/ min Vt Ec. 3 ε. b. Vm

Vt = Volumen total.

Δ Abs/min = cambios de absorbancia por min.

ε = Coeficiente de extinción, igual a 13.3 L mM-1 cm-1

b = paso óptico (1 cm).

Vm = Volumen de la muestra

Para el análisis de los resultados se uso Exel 2007, y el programa estadístico spss

versión 15.0.


62

IV.4.3 Procedimiento para la optimización de las condiciones de

análisis de la enzima AChE en saliva

Durante la aplicación inicial del método de Ellman para la determinación de la

actividad de la enzima AChE, se hizo necesaria la optimización de los siguientes

parámetros:

� pH.

Se trabajó con un buffer fosfato (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7.4.

� Presión osmótica.

Se analizaron diferentes concentraciones de cloruro de sodio, entre 0,05 M

y 0,50 M, para ello se mantuvo fijo las concentraciones de todos los

reactivos y se varió la concentración de sal en el medio final de reacción.

� Temperatura.

Se trabajo experimentalmente a temperatura ambiente.

Considerando que la saliva esta constituida en 95 % de agua, se evaluó en agua,

a través de una solución patrón de la enzima acetilcolinesterasa de anguila

eléctrica, los siguientes parámetros:

� Toma de espectros.

Se tomó el espectro de absorción de los reactivos a diferentes concentraciones

en un intervalo de longitud de onda entre 300 y 600 nm. En el caso del sustrato

cloruro de acetiltiocolina se tomaron los espectros en el rango de

concentración entre 0.4 mM y 2.0 mM, y entre 0.10 mM y 0.50 mM para el

indicador ácido 5,5'-ditio-bis- (2-nitrobenzoico).


63

� Efecto de la concentración de Indicador.

Se evaluaron concentraciones de indicador comprendidas entre 0.1 y

0.5 mM, manteniendo constante la concentración de sustrato (0.6 mM) y de

enzima (2 U/L), en buffer fosfato pH 7.4 (0.9 % NaCl), a temperatura ambiente.

Los cambios de absorbancia se midieron a 405 nm durante 5 minutos.

� Efecto de la concentración de Sustrato.

Se analizaron diferentes concentraciones del compuesto cloruro de

acetiltiocolina en el intervalo de concentración de 0.25 mM a 2.00 mM,

manteniendo constante la concentración del indicador DTNB (0.25 mM), de

enzima (2 U/L) y de los demás parámetros. Los cambios de absorbancia se

midieron a 405 nm durante 5 minutos.

� Tratamiento y efecto del volumen de muestra de saliva.

Para evaluar el efecto de volumen de muestra de saliva se tomó una muestra

de saliva, de un mismo individuo y se sometió a diferentes tratamientos. Se

analizaron diferentes alícuotas de muestra de saliva sin tratamiento, filtrada y

centrifugadas.

En la muestra de saliva sin tratamiento, se tomó la muestra de saliva y se

homogenizó por agitación en Vortex durante varios minutos. Diferentes

volúmenes de muestra de saliva (100 a 800 μL) se diluyeron en solución buffer

pH 7.4 (0.9% NaCl), agitando durante 2 minutos. Posteriormente se adicionó el

indicador DTNB y el sustrato ATC, hasta aforar a un volumen total de 2 mL.

Los cambios en la absorbancia se midieron a 405 nm durante 5 minutos.

En la muestra de saliva filtrada, se tomó la muestra homogénizada por

agitación en vortex y se hizo pasar a través de un filtro minisart SRP 15

(0.20 μm). Se tomaron diferentes alícuotas del filtrado (100 a 500 μL) y se

diluyeron en solución buffer pH 7.4, 0.9 % NaCl. Seguidamente se adicionó el

indicador DTNB, el sustrato ATC, hasta aforar a un volumen total de 2 mL.

Los cambios de absorbancia se midieron a 405 nm durante 5 minutos.


64

En la muestra de saliva centrifugada, se tomó la muestra de saliva y se

centrifugó durante 5 minutos a 2000 rpm. Se analizaron varias alícuotas del

sobrenadante (0,3 a 1.0 mL) de la misma forma que en los casos anteriores.

� Posteriormente se evaluó el efecto de las concentraciones y condiciones

establecidas, en el análisis del complejo ácido 2-nitro-5-tiocolina, para ello

se tomó el espectro de absorción del complejo, entre 300 y 600 nm,

partiendo de la enzima acetilcolinesterasa de anguila eléctrica para

determinar el máximo de absorción, y de una muestra de saliva con el fin de

determinar si existe interferencia considerable por parte del indicador.

IV.4.4 Validación del método analítico. Una vez establecidas las condiciones, se validó el método en saliva, evaluando

siguientes parámetros:

� Precisión.

La precisión del método se evaluó analizando repetidamente (n=5) una

muestra de saliva, bajo las mismas condiciones en un mismo día, por el mismo

analista y en el mismo equipo

� Linealidad.

La linealidad del método se comprobó analizando diluciones de la enzima

acetilcolinesterasa de anguila eléctrica en un intervalo de actividad ente 0.4

y 6,0 U/L.

� Limites de Detección y Cuantificación.

La determinación de los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) se

realizó utilizando la desviación estándar del blanco (medida tres veces) y la

pendiente de la curva de calibración


65

IV.4.5 Procedimiento para la determinación del efecto de sustancias

interferentes.

Optimizadas todas las condiciones necesarias para aplicar el método de Ellman en

muestras de saliva, se evaluó el efecto de sustancias interferentes sobre la

determinación de la actividad de la enzima, tales como:

� Alcohol.

Para evaluar el efecto de la concentración de alcohol sobre la actividad de la

enzima acetilcolinesterasa en saliva, se tomó una muestra de saliva y se le

agregó diferentes alícuotas de etanol 95 % (v/v). Los cambios de absorbancia

se midieron por triplicado a 405 nm durante 5 min.

� Café y chimo.

El efecto del consumo de café y chimo se evaluó tomando una muestra de

saliva de dos individuos sanos que habían consumido café y chimo 30 minutos

antes de la toma de la muestra. Se había tomado previamente una muestra de

saliva a los mismos individuos sin ningún tipo de interferente. Las muestras de

saliva se descongelaron y centrifugaron. Los cambios en la absorbancia se

midieron a 405 nm durante 5 minutos por triplicado.

IV.4.6 Procedimiento para la determinación del efecto de plaguicidas

organofosforados y carbamatos sobre la actividad de la enzima

AChE.

El efecto de la concentración de inhibidor sobre la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa se evaluó a través de soluciones diluidas de mezclas de

plaguicidas organofosforados y carbamatos (0-100 ppm), y de plaguicidas

individuales metil-paratión (0-100 ppm) y carbofuran (0-100 ppb), usando para ello

una solución de acetilcolinesterasa de anguila eléctrica con una actividad de 3 U/L.


66

V. RESULTADOS

V.1 Condiciones de análisis establecidas para la determinación de la

actividad de la enzima Acetilcolinesterasa en saliva

El método de Ellman y sus modificaciones, son métodos analíticos usados para la

determinación de la actividad de las enzimas colinesterasas principalmente en

sangre. Estos métodos brindan información semi-cuantitativa acerca del grado de

exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos al que puede estar

sometido un individuo, permitiendo así monitorear la salud de los trabajadores

laboralmente expuestos a estos agentes químicos.

En esta investigación se optimizaron las condiciones necesarias para adaptar el

método de Ellman a la determinación de la enzima acetilcolinesterasa en muestras

de saliva humana. Dentro de los parámetros variables que se optimizaron se

encuentra la presión osmótica, la concentración de indicador, y la concentración

de sustrato. Dentro de las variables que se dejaron fijas se encuentra el pH, el

cual se estableció de acuerdo con la bibliografía consultada, y la temperatura. Los

resultados se describen a continuación.

1. pH

Variaciones del pH pueden ocasionar cambios importantes en la estructura de la

enzima, así como también pueden causar la desnaturalización de la estructura

proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno de las enzimas,

afectando su actividad. La mayoría de las enzimas funcionan en un intervalo de

pH entre 6,0 y 8,0. En este estudio se trabajo con un buffer fosfato a pH de 7.4, de

acuerdo con la bibliografía consultada. [13-27]

2. Temperatura.

Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del

organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente

provocan un incremento de la velocidad de reacción.


67

La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre

los 35 y 40 °C, a partir de los 40 °C comienzan a desnaturalizarse rápidamente.

Experimentalmente se trabajó a temperatura ambiente a fin de aplicar el método

propuesto en determinaciones rutinarias de campo, donde muchas veces no es

posible controlar la temperatura.

3. Fuerza osmótica.

La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal

extremamente altas, ya que los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de

las proteínas. Las enzimas típicas son activas en concentraciones salinas de 1 a

500 mM. En la figura 15, se observa el efecto de la concentración salina en la

medida de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa. Obsérvese que en

ausencia de cloruro de sodio, existen cambios de absorbancia irregulares,

mientras que al aumentar la concentración salina del medio se estabiliza la señal,

obteniéndose cambios de absorbancia por minuto más lineales, y la difusión del

complejo en la celda. Para este estudio se escogió una concentración salina de

0.15 M.

Figura 15. Efecto de la concentración de NaCl en la medida de la actividad de la

enzima Acetilcolinesterasa.

0,080,0850,09

0,0950,1

0,105

0,110,1150,12

0,1250,13

0 50 100 150 200 250 300

Tiempo (s)

Abs

Sin NaCL 0,10 M 0,15 M 0,40 M 0,50 M


68

4. Espectros de absorción.

Considerando que el método de Ellman se puede llevar a cabo en un rango de

longitud de onda entre 400 y 420 nm, se tomaron los espectros de absorción de

cada uno de los reactivos, a diferentes concentraciones, para determinar los

rangos de máxima absorción de los mismos.

En la figura 16, se muestra el espectro de absorción de la solución buffer fosfato

pH 7.4 (0.9% NaCl), y de la enzima acetilcolinesterasa de anguila eléctrica, en el

cual se puede observar que no hay absorción considerable en el rango estudiado.

Figura 16. Espectro UV-Vis de la solución buffer pH 7.4 y de la enzima Acetilcolinesterasa de anguila eléctrica (4250 U/L).

De forma similar a la solución buffer y a la enzima, el espectro UV-Vis del sustrato

acetiltiocolina, a diferentes concentraciones, figura 17, no muestra absorción

considerable a medida que aumenta la concentración.

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600,0-0,010

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,100

nm

A

- Buffer Fosfato pH 7.4 - Enzima AChE


69

Figura 17. Espectros UV-Vis del sustrato Cloruro de Acetiltiocolina en un rango de concentración de 0.4 mM y 2.0 mM

Los espectros de absorción UV-Vis a diferentes concentraciones de indicador

(ácido 5,5´ditiobis-2-nitrobenzoico, DTNB) se muestran en la figura 18. Obsérvese

que existe absorción por debajo de 400 nm, aumentando considerablemente a

medida que aumenta la concentración del reactivo en solución.

Figura 18. Espectros UV-Vis del indicador Acido 5,5´ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) a diferentes concentraciones.

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 650,00,000

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,100

nm

A

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600,00,00

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,43

nm

A

DTNB 0.096 mM

DTNB 0.144 mM

DTNB 0.192 mM

DTNB 0.250 mM

DTNB 0.302 mM

DTNB 0.398 mM

DTNB 0.504 mM


70

5. Efecto de la concentración del indicador DTNB

El efecto de la concentración de indicador sobre la actividad de la enzima se

muestra en la figura 19. En ella se observa que los cambios de absorbancia más

lineales se obtienen a concentraciones entre 0.1 a 0.3 mM, mientras que a

concentraciones mayores los cambios de absorbancia por minuto disminuyen,

afectando la velocidad de la reacción. Se escogió para los análisis una

concentración de indicador de 0.25 mM.

Figura 19. Efecto de la concentración de indicador DTNB sobre la determinación de la enzima acetilcolinesterasa

6. Efecto de la concentración de sustrato acetiltiocolina.

El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de la enzima, figura 20,

revela que al aumentar la concentración de sustrato aumenta la actividad de la

enzima acetilcolinesterasa, con máxima hidrólisis a una concentración 2 mM de

sustrato. Sin embargo se escogió una concentración de 1.0 mM ya que a partir de

esta concentración se obtienen valores de actividad similares, y además para

disminuir la hidrólisis espontánea del sustrato, la cual aumenta a concentraciones

mas altas.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 50 100 150 200 250 300 350

Tiempo (seg)

Abs

0,1009 mM0,1513 mM0,2018 mM0,2522 mM0,3027 mM0,3532 mM0,4036 mM0,5045 mM


71

Figura 20. Efecto de la concentración de sustrato acetiltiocolina sobre la actividad

de la enzima acetilcolinesterasa.

7. Tratamiento y efecto del volumen de muestra.

Para evaluar el efecto del volumen de muestra de saliva sobre la determinación de

la actividad de la enzima, se procedió a determinar el tratamiento de muestra más

adecuado. Se analizó una muestra de saliva, de un mismo individuo, sin

tratamiento, filtrada y centrifugada, manteniendo constante todas las condiciones,

los resultados se muestran a continuación.

Sin tratamiento

En la figura 21 se muestran los cambios de absorbancia obtenidos, usando un

volumen de 500 μL de muestra de saliva de sin tratamiento. Obsérvese que los

cambios de absorbancia por minuto son muy irregulares. Estos resultados se

mantienen a medida que aumenta el volumen de muestra, debido al aumento de

partículas en movimiento en solución, no siendo posible determinar la actividad de

la enzima.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 0,5 1 1,5 2 2,5Sustrato ATC (mM)

Activ

idad

(U/L

)


72

Figura 21. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad de la

enzima AChE, usando un volumen de 500 μL de muestra de saliva sin tratamiento

Figura 22. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad de la enzima AChE, al aumentar el volumen de muestra de saliva filtrada

00,00010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,00080,0009

0,001

0 100 200 300 400 500

Volumen muestra (mL)

DA

bs/m

in


73

Filtrado

Analizando diferentes alícuotas de la muestra de saliva filtrada, se observa que a

medida que aumenta el volumen del filtrado, aumenta los cambios de absorbancia

por minuto (figura 22), sin embargo estos cambios son pequeños, dando valores

de actividad muy bajos.

Centrifugado

Analizando diferentes alícuotas del sobrenadante, se observa que los cambios de

absorbancia por minuto aumentan con el volumen de centrifugado, según se

muestra en la figura 23. Obsérvese que los cambios de absorbancia obtenidos con

este tratamiento son mayores que los observados anteriormente usando la

muestra de saliva filtrada.

Figura 23. Cambios de absorbancia por minuto en la medida de la actividad de la enzima AChE, al aumentar el volumen de muestra de saliva centrifugada.

En la figura 24, se compara la medida de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en la muestra de saliva, del mismo individuo, sometida a los

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Volumen de muestra (mL)

DAbs

/min


74

diferentes tratamientos, obsérvese como dependiendo del tratamiento realizado,

se obtienen diferentes valores de actividad, siendo el valor más alto el obtenido al

centrifugar la muestra de saliva.

Figura 24. Determinación de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en una

muestra de saliva de un mismo individuo bajo diferentes tratamientos. a) ST. Sin

tratamiento, b) Fil. Filtrada, c) Cn. Centrifugada.

8. Análisis del complejo ácido 2-nitro-5-tiocolina

Una vez establecidas las condiciones para el análisis de la enzima, se tomó el

espectro de absorción del complejo a analizar, ácido 2-nitro-5-tiocolina, para

comprobar que las condiciones eran las más adecuadas.

Usando una concentración de enzima de anguila eléctrica de 4250 U/L se

determinó el máximo de absorción del complejo, el cual esta comprendido entre

una longitud de onda de 405 y 412 nm, según se observa en la figura 25.

En muestras de saliva donde la concentración de la enzima acetilcolinesterasa es

baja, se tomó un espectro del complejo, en dos etapas de la reacción, usando

0,001

0,534

2,01

0

0,5

1

1,5

2

2,5A

ctiv

idad

(U/L

)

ST FL Cn

Tratamiento


75

directamente una muestra de saliva, figura 26. En este espectro no se observa

interferencia notable por parte del indicador, siendo éste el reactivo que presenta

la mayor absorbancia, en el intervalo de longitud de onda estudiada.

Figura 25. Espectro del complejo ácido 2-nitro-5-tiocolina, en dos etapas diferentes de la reacción, donde se observa una máxima absorción entre 405 y 412 nm. (Concentraciones: Buffer fosfato pH 7.4 (0.9% NaCl), 1.125 mM de ATC, 4250 U/L de

enzima de anguila eléctrica, y 0.25 mM de DTNB)

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600,00,00

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,20

nm

A

410,50

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600,00,00

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,36

nm

A

DTNB 0.25 mMComplejo Fase IComplejo Fase II


76

Figura 26. Espectro del complejo, en dos etapas diferentes de la reacción, formado a partir de una muestra de saliva como fuente de enzima. (ATC 1.02 mM,

DTNB 0.25 mM)

Estos resultados muestran que no existe interferencia por parte de los reactivos ni

de los otros parámetros establecidos en el análisis de la enzima

acetilcolinesterasa en muestras de saliva, fijándose así estas condiciones (tabla 7)

para el

análisis de las muestras de saliva de los individuos expuestos.

Tabla 7. Condiciones de análisis establecidas experimentalmente para determinar

la actividad de la enzima AChE en muestras de saliva.

Parámetro Condición.

Temperatura Ambiente

pH Buffer fosfato 7.4

Fuerza Osmótica 0.155 M (0.9 %) NaCl

Concentración DTNB 0.25 mM

Concentración de ATC 1.0 mM

Volumen de Muestras 1,0 mL Saliva centrifugada.


77

V.2 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

Para validar el método de Ellman en saliva, se utilizó un patrón de la enzima

acetilcolinesterasa de anguila eléctrica, evaluándose además diferentes

parámetros analíticos en muestras de saliva de personas no expuestas. Los

resultados se describen a continuación.

La precisión del método se evaluó analizando repetidamente (n=5) una muestra de

saliva, bajo las mismas condiciones en un mismo día, por el mismo analista y en el

mismo equipo. Los resultados (figura 28) presentan una desviación estándar

relativa de 1.79 %.

La linealidad del método se comprobó analizando diluciones de la enzima

acetilcolinesterasa de anguila eléctrica en un intervalo de actividad ente 0.4 y

6,0 U/L. La ecuación lineal obtenida fue y = 0.9682 x - 00409, con un coeficiente

de correlación de 0.995 (Figura 28).

Figura 27. Análisis de varias replicas de una muestra de saliva para evaluar la

precisión del método. (ATC 1.055 mM, DTNB 0.270 mM)

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0,65

I II III IV VReplicas

Act.

(U/L

)


78

Figura 28. Linealidad del método obtenida a 405 nm, usando un patrón de enzima acetilcolinesterasa de anguila eléctrica.

La determinación de los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) se

realizó utilizando la desviación estándar del blanco (medida tres veces) y la

pendiente de la curva de calibración, descritas en la ecuación 4 y 5.

LD = 3DSB/b Ec. 4 LC = 10DSB/b Ec. 5

Donde DSB es la desviación estándar del blanco y b es la pendiente de la curva de

calibración.

La curva de calibración se realizó midiendo los cambios de absorbancia por

minuto, a 405 nm, en soluciones a diferentes concentraciones de enzima

acetilcolinesterasa de anguila eléctrica. La curva de calibrado se muestra en la

figura 29, obteniéndose un coeficiente de correlación de 0.999.

El límite de detección y cuantificación calculado, bajo las condiciones de análisis

establecidas, es de 0.1289 U/L y 0.4298 U/L respectivamente.

y = 0,9682x - 0,0409R2 = 0,995

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7

Actividad esperada (U/L)

Activ

idad

Obt

enid

a (U

/L)


79

Figura 29. Curva de calibrado

y = 0,013x + 0,000R2 = 0,999

00,01

0,020,030,04

0,050,060,07

0,080,09

0 2 4 6 8Act. (U/L)

DA

bs/m

in


80

V.3 EFECTO DE SUSTANCIAS INTERFERENTES EN LA MEDIDA DE LA

ACTIVIDAD DE LA ENZIMA ACETILCOLINESTERASA EN SALIVA POR

EL METODO DE ELLMAN.

� Alcohol

La figura 30 muestra que no existe una variación significativa en la actividad de la

enzima acetilcolinesterasa, al aumentar la concentración de alcohol en saliva

(coeficiente de variación de 0.81 %).

Figura 30. Efecto de la concentración de alcohol (etanol) sobre la medida de la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa por triplicado.

� Café y chimo.

En la figura 31, se compara los resultados obtenidos en el análisis de las muestras

de saliva de los donantes sin interferente, tomada días antes, y la muestra de

saliva tomada luego del consumo de café y chimo. En esta figura se puede

observar como la presencia de estas sustancias disminuye la sensibilidad del

método, obteniéndose valores de actividad de acetilcolinesterasa más bajos que

en ausencia de estas sustancias.

0 2,38 4,275 6,65

1

1,05

1,1

1,15

1,2

1,25

1,3

1,35

AChE

(U/L

)

EtOH (% V/V)


81

Figura 31. Efecto de la presencia de café y chimó en muestras de saliva, sobre la

actividad de la enzima acetilcolinesterasa.

V.4 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE INHIBIDOR.

Para evaluar el efecto de la concentración de plaguicidas organofosforados y

carbamatos sobre la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, se trabajó con

soluciones patrón de la enzima acetilcolinesterasa de anguila eléctrica, a una

concentración de 3 U/L, a las que se agregó diferentes alícuotas de una mezcla

patrón de OPs (mezcla 1) y de Cs (mezcla 2), por separado.

En la figura 32, se muestra el efecto de las mezclas de plaguicidas sobre la

actividad de la enzima, obsérvese que a medida que aumenta la concentración de

la mezclas, tanto de OPs como de Cs, aumenta el porcentaje de inhibición,

obteniéndose a una concentración de 60 ppm un porcentaje de inhibición del 80

% aproximadamente.

Caffe Ch.

2,03

1,45

1,78

1,18

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Act

. (U

/L)

Interferente

Sin Interferente Efecto del interferente


82

Figura 32. Efecto de una mezcla de organofosforados y carbamatos sobre la

actividad de la enzima AChE. (ATC 1.074 mM, DTNB 0.269 mM)

Para estudiar el efecto individual de los plaguicidas sobre la actividad de la

enzima, se trabajó con una solución de los plaguicidas metil-paratión

(organofosforado) y carbofuran (carbamato). El Metil-Paratión, es un compuesto

organofosforado usado como insecticida y nematicida en los cultivos agrícolas,

mientras que el Carbofuran, es uno de los plaguicidas más tóxicos del grupo de

los carbamatos, es empleado como insecticida, acaricida y nematicida, es de

origen sistémico y posee un largo efecto residual tanto en el medio ambiente como

en el organismo.

El efecto del plaguicida metil-paratión sobre la actividad de la AChE se muestra en

la figura 33, obsérvese que a una concentración de 67 ppm la actividad de la

enzima ha disminuido en un 64 % de su valor inicial de 3 U/L, y continua

disminuyendo a medida que aumenta la concentración de plaguicida.

En el caso del plaguicida Carbofuran, el efecto sobre la actividad de la enzima

AChE es mucho más marcado que el observado con el metil-paratión. La figura 34

muestra que a una concentración de 60 ppb la actividad de la enzima disminuye

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Concentración de la mezcla (mg/L)

Act.

AChE

(%)

OPs Cs


83

en un 84 % de su valor inicial de 3 U/L, y a una concentración de 100 ppb, la

inhibición es completa.

Figura 33. Efecto del plaguicida metil-paratión sobre la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa. (0-100 ppm)

Figura 34. Efecto de la concentración del plaguicida carbofuran sobre la actividad

de la enzima acetilcolinesterasa. (0-100 ppb).

Metil-Paratión

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100Concentración (mg/L)

% I

nhib

ició

n

Carbofuran

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Concentración (ug/L)

% In

hibi

ción

N

+

P

S

O-

O

OO

O

CH3

CH3


84

V.5 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA

ACETILCOLINESTERASA EN MUESTRAS DE SALIVA

Se analizaron un total de 60 muestras de saliva pertenecientes a individuos

expuestos a plaguicidas organofosforados y carbamatos de la comunidad agrícola

El Paramito, ubicada en las cercanías de la población de Timotes, Municipio

Miranda del Estado Mérida.

Como población de control, o referencia, se analizaron un total de 10 muestras de

saliva, de individuos no expuestos laboralmente a plaguicidas organofosforados y

carbamatos.

V.5.1 Parámetros estadísticos descriptivos de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva de la población expuesta a plaguicidas y de control.

En la Tabla 8, se presentan los parámetros estadísticos descriptivos más

importantes de los valores de actividad obtenidos en saliva para la población

expuesta y de referencia. En esta tabla se puede observar que existe una alta

variabilidad de los valores de actividad en ambos grupos, siendo esta mayor en los

individuos expuestos, según lo demuestra el coeficiente de variación.

Tabla 8. Parámetros estadísticos descriptivos de los valores de actividad de

acetilcolinesterasa obtenidos.

Parámetros estadísticos

Población Expuesta Control

Numero de muestras 60 10 Valor promedio (U/L) 1,4643 2,4820 Valor Mínimo (U/L) 0,4618 0,7950 Valor Máximo (U/L) 5,8346 6,4800 Desviación estándar 1,1819 1,6347

Varianza (U/L) 1,3970 2,6720 Coeficiente de variación

(C.V) 0.8071 0.6586


85

Además se observa que el valor de actividad promedio para la población expuesta

es menor al de la población de control, se determinó una diferencia de medias

estadísticamente significativa (p>0.10), lo cual indica que los valores de actividad

pueden estar afectados por la exposición a plaguicidas OPs y Cs

V.5.2 Distribución de los resultados de actividad de la enzima acetilcolinesterasa por intervalos, en las muestras de saliva de individuos expuestos.

En la tabla 9 y figura 35, se distribuyen los valores de actividad por intervalos. Los

resultados muestran que un 39 % de los individuos analizados poseen un valor de

actividad en el intervalo entre 0.430 y 0.999 U/L, un 17 % entre 1.00 y 1.99 U/L,

un 12 % entre 2.0 y 2.99 U/L, y un 6.8 % a valores de actividad mayor a 3 U/L. Se

encontró además que un 15,25 % de los individuos posee una valor de actividad

por debajo del límite de cuantificación, y un 10,17 % por debajo del límite de

detección, determinados experimentalmente.

Tabla 9. Distribución de los valores de AChE obtenidos experimental.

Intervalos de actividad de AChE (U/L)

Población Expuesta

Nº de Individuos % 0,43-0,99 23 39,00 1,00-1,99 10 17,00 2,00- 2,99 7 12,00 3,0-3,99 2 3,40

> 4,0 2 3,40 No cuantificable (NC) 9 15,25 No detectable (ND) 7 10,17

TOTAL 60 100,00


86

Figura 35. Distribución de los resultados por intervalos de valores de actividad de

AChE de los individuos expuestos.

V.5.3 Distribución de los valores de actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva de individuos expuestos y de control por sexo.

De los 60 individuos expuestos muestreados, 30 eras de sexo femenino, y 30 eran

de sexo masculino, por lo que cada género contribuye en 50 % a la población

muestreada. Dentro de la población de control se analizaron 5 personas de sexo

femenino y 5 de sexo masculino.

Los valores de actividad de AChE promedio encontrados en ambos grupos se

muestran en la tabla 10 y figura 36. En estas se puede observar que la actividad

promedio de la enzima AChE en saliva de la población de sexo femenino es

similar a la encontrada para la población tomada como control, no existe una

diferencia de medias estadísticamente significativa entre ambos valores (p<0.05).

En el caso de la población masculina, se observa que la actividad promedio para

la población expuesta es menor que la determinada para la población de control,

con una diferencia de medias estadísticamente significativa (p> 0.05), lo cual

0

5

10

15

20

25

Nº d

e ca

sos

0,43-0,99

1,00-1,99

2,00-2,99

3,0-3,99

> 4,0 NC ND

Intervalo de actividad (U/L)


87

indica que existe un nivel de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en los

individuos de sexo masculino de la población El Paramito.

Tabla 10.Distribución de los valores de AChE de acuerdo al sexo.

Parámetro Población Expuesta Control

Sexo F M F M

N 30 30 5 5

Valor promedio (U/L) 1,5081 1,4244 1.4650 3,4888 Desviación estándar

(U/L) 1,0657 0,8799 0.6929 2.0039

Figura 36. Valores promedio de la actividad de AChE encontrados según el sexo

de los individuos expuestos y de control.

1,4244 1,5081

3,4888

1,4650

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Activ

idad

Pro

med

io (U

/L)

1 2

M F


88

V.5.4 Distribución de los valores de actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva de los individuos expuestos de acuerdo a la edad.

Existen diversos factores que producen la variación de los niveles de las enzimas

colinesterasa en el organismo, algunos de ellos son la edad, el sexo, la grasa

corporal, los niveles de lípidos y lipoproteínas plasmáticas y el embarazo. En la

tabla11, y figura 37, se muestran los valores de actividad de AChE obtenidos por

intervalo de edad.

Tabla 11. Distribución de los valores de actividad en función de la edad.

Intervalo de Edad Nº de casos %

Promedio de los valores de ACHE

(U/L) 7-9 8 13,33 1,6333 ± 0,8237

10-19 14 13,33 1,5111 ± 1,2971 20-29 10 16,66 1,8960 ± 1,8045 30-40 13 21,66 1,3373 ± 0,9715 41-49 6 10,00 1.0020 ± 0,3880 50-59 5 8,33 1,3055 ± 0.4396 > 60 4 6,66 0.8831 ± 0.3591 Total 60 100

Figura 37. Distribución de los valores promedio de actividad de AChE por edad.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Valo

r Pro

med

io A

ChE

(U/L

)

7-9. 10.-19 20-29 30-40 41-49 50-59 > 60

Intervalo de Edad (años)


89

Obsérvese que los valores de actividad más altos se encontraron en muestras de

saliva de individuos con edad comprendida entre 7 y 29 años de edad. Se

determinó una cierta correlación inversa, con un coeficiente de correlación de

r = -0.179 (p=0.05), entre los valores de actividad de AChE y la edad, lo cual indica

que a mayor edad menor valor de actividad acetilcolinesterasa en saliva, con una

diferencia en el intervalo de edad entre 20 y 29 años, donde los valores promedio

de actividad aumentan. (Figura 38)

Figura 38. Diagrama de distribución de los valores de AChE en saliva con respecto a la edad. Con un coeficiente de correlación de r= -0.179 para un nivel de

confianza del 95 %.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0 20 40 60 80 100

Edad (años)

Act

ivid

ad D

e A

ChE

(U/L

)


90

V. 6 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la determinación de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras

de saliva, por el método de Ellman, se estudiaron las condiciones más óptimas

para la medida de la enzima en este fluido biológico. El pH del medio se fijó en

7.4, usando para ello un buffer fosfato, de acuerdo con la bibliografía consultada

para el desarrollo de esta investigación [13-27], las cuales establecen este pH como

el más óptimo para la medida de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en

sangre, y otras matrices.

El buffer contenía además una concentración de cloruro de sodio de 0.155 M (0.9 %), la cual se escogió analizando el efecto de diferentes concentraciones de

cloruro de sodio en la mezcla final de reacción (figura 15), al observar que en

ausencia de sal, lo cambios de absorbancia por minuto y la difusión del complejo

eran muy irregulares. Se descartaron concentraciones salinas mayores a 0.155 M,

debido a que aumenta la desnaturalización de la enzima con el tiempo,

disminuyendo su actividad progresivamente.

De los espectros de absorción tomados a todos los reactivos involucrados en el

análisis, solo el indicador (ácido 5,5´ditiobis-2-nitrobenzoico, DTNB) presenta una

absorción considerable en el intervalo entre 400 y 420 nm de longitud de onda.

Concentraciones de indicador mayores a 0.302 mM interfieren notablemente en la

longitud de onda de absorción del complejo a analizar (Figuras 16-18).

Considerando que el indicador posee color en solución acuosa se determinó el

grado de interferencia mostrado por éste respecto a la longitud de onda de

máxima absorción del producto de reacción. Los resultados de este estudio (figura

19), muestran que los cambios de absorbancia no varían significativamente al usar

concentraciones de indicador entre 0.1 y 0.3 mM, mientras que concentraciones

mayores a 0.3 mM influyen en la velocidad de reacción y en la longitud de onda de


91

análisis, por lo cual se escogió una concentración de 0.25 mM como la más

adecuada para el análisis de AChE en saliva.

En cuanto a la concentración del sustrato cloruro de acetiltiocolina, se observó que

un aumento en la concentración de sustrato aumenta la actividad de la enzima,

encontrándose una máxima actividad enzimática a una concentración de 2 mM de

sustrato (figura 20). Se escogió una concentración de 1.0 mM como adecuada

para el análisis de AChE en saliva, ya que a concentraciones mayores aumenta la

hidrólisis espontánea del sustrato.

En cuanto al tratamiento de la muestra de saliva, se observó que en muestras de

saliva centrifugadas se obtienen los valores de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa más altos (figuras 21-23). Comparando los tratamientos

realizados (figura 24), se observa que la muestra de saliva sin tratamiento no

permite medir la actividad de la enzima y en la muestra de saliva filtrada se pierde

sensibilidad, por lo cual se escogió 1 mL de muestra de saliva centrifugada como

volumen adecuado para los análisis.

Los espectros de absorción del complejo tomados a las concentraciones de los

reactivos establecidas, muestran un máximo de absorción a una longitud de onda

comprendida entre 405 y 412 nm, tanto en el espectro usando enzima

acetilcolinesterasa de anguila eléctrica de referencia (figura 25), como en el

tomado usando una muestras de saliva como fuente de enzima (figura 26). En

ambos casos los espectros del complejo no muestran interferencia por parte del

indicador a la concentración escogida para los análisis. A partir de estos

resultados los análisis se llevaron a cabo a una longitud de 405 nm.

Bajo las condiciones descritas anteriormente, el método es lineal en un rango de

actividad enzimática entre 0.4 y 6.0 U/L, con un coeficiente de correlación de

0.995 (figura 28). El método presenta además un limite de detección y

cuantificación de 0.1289 U/L y 0.4298 U/L respectivamente.


92

En el estudio del efecto de sustancias interferentes sobre la medida de la actividad

de la enzima acetilcolinesterasa en saliva, los resultados muestran que la actividad

de la enzima no varia significativamente al aumentar la concentración de alcohol

en saliva, los valores de actividad determinados presentan un coeficiente de

variación de 0.81 % (figura 30). Uno de los efectos más notorios sobre un

individuo que consumió alcohol es la deshidratación, lo cual provoca una menor

producción de saliva, afectando principalmente la toma de la muestra.

La presencia de café y chimo en las muestras de saliva, a diferencia del alcohol,

disminuye la sensibilidad del método (figura 31). Visualmente no se observa con

detalle la formación del complejo de color amarillo por la presencia del color

marrón proveniente del café y chimo en las muestras, las cuales a pesar de ser

tratadas previamente conservan parte de la coloración producto del consumo de

los mismos. Para evitar este tipo de interferentes, se recomienda evitar el

consumo de café y chimo, por lo menos 3 horas antes de la toma de la muestras

de saliva, en caso contrario se debe lavar bien la boca por lo menos 30 minutos

antes de la toma de la muestra.

En cuanto al efecto de la concentración de plaguicidas organofosforados y

carbamatos sobre la actividad de la enzima AChE, se obtuvo que a una

concentración de 60 ppm de la mezcla, tanto de plaguicidas organofosforados

como de carbamatos, el porcentaje de inhibición de la enzima AChE es

aproximadamente 80 %, en una solución con una actividad de 3 U/L de la misma

(figura 32, anexo 1). Estos resultados indican que bajas concentraciones de

plaguicidas afectan considerablemente la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en el organismo.

En el caso de plaguicidas individuales, se determinó que el plaguicida metil-

paratión, en una concentración de 67 ppm, produce una inhibición de la enzima

AChE del 64 % (figura 33), mientras que el plaguicida carbofuran, a una

concentración de tan solo 60 ppb, produce un porcentaje de inhibición del 84 %

(figura 34). La diferencia en el efecto sobre la actividad del enzima observado


93

entre ambos plaguicidas, se debe a las diferencias estructurales de los

compuestos químicos considerados, lo cual va a determinar la afinidad del

plaguicida por la enzima AChE, desplazando con mayor o menor facilidad el

sustrato acetiltiocolina.

La mayoría de los agricultores no están expuestos a un solo tipo de plaguicidas,

sino a mezclas de ellos en proporciones diferentes, con un poder de inhibición de

la enzima acetilcolinesterasa que va a depender, como se pudo observar, de las

características físicas y químicas del compuesto. El método estudiado no permite

diferenciar la identidad de los plaguicidas que producen la inhibición, pero permite

estimar, en un primer plano, un determinado nivel de exposición a estos

plaguicidas, que conduzcan a la toma de acciones correctivas.

En el estudio de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de

saliva de individuos laboralmente expuestos a plaguicidas organofosforados y

carbamatos, se analizaron un total de 60 muestras de saliva, pertenecientes a

individuos de la comunidad de El Paramito (Anexo 2 y 3). Los resultados muestran

que la actividad promedio de la enzima AChE en los individuos expuestos (1.4643

U/L) es menor a la determinada para el grupo de control (2.4820 U/L) (Tabla 7). Se

determinó que existe una diferencia de medias estadísticamente significativa

(p>0.10), lo cual indica que los valores de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en los individuos de El Paramito, pueden estar afectados por la

exposición a plaguicidas organofosforados y carbamato.

Comparando los valores de actividad de la enzima obtenidos para la población

expuesta y de control, de acuerdo con el sexo (tabla 9, figura 36), se observa que

en las mujeres los valores promedio de actividad no son significativamente

diferentes a los encontrados para la población de control (p<0.05). En el caso de

los hombres, el valor promedio de la actividad es menor en la población expuesta

que el valor promedio para la población de control. De acuerdo con estos

resultados, y en ausencia de información clínica y de otros factores que puedan

afectar los niveles enzimáticos, se puede decir que los niveles de


94

acetilcolinesterasa en saliva de los hombres expuestos pueden estar inhibidos por


Considerando el estilo de vida de las mujeres de la comunidad de El Paramito, son

pocas las mujeres que se dedican a las labores agrícolas o a cualquier otra

actividad que contribuya a una exposición constante a plaguicidas. La mayoría de

ellas se dedican a las labores del hogar y al cuidado de sus hijos, siendo su mayor

fuente de exposición los lugares de almacenamiento de los plaguicidas, los cuales

por lo general se hace en los alrededores, o dentro de sus hogares. Por estas

razones es posible que los niveles promedio de acetilcolinesterasa encontrados

sean similares a los encontrados en la población de control femenina.

Los valores promedio de la actividad de la enzima AChE obtenidos para los

individuos expuestos, agrupados por intervalo de edad (tabla 10 y figura 37),

muestran que existe una cierta correlación inversa entre los valores de actividad

de AChE en saliva y la edad, (r = -0,179, p=0,05), lo cual indica que a mayor edad

menor actividad promedio de AChE (figura 38).

Los valores más altos de actividad promedio de AChE en saliva se encontraron en

niños de 7-9 años de edad (1,6333 U/L), adolescentes (1,5111 U/L), y en adultos

hasta los 29 años de edad (1,8960 U/L). Se puede esperar que los valores de

acetilcolinesterasa en niños y adolescentes se encuentren entre los más altos

comparados con otros grupos de personas de mayor edad, ya que su actividad en

el campo es baja, debido a que la mayoría de ellos estudia, ya sea en la escuela

comunitaria ubicada en El Paramito, o en escuelas y liceos más lejanos ubicados

en Timotes. Estos individuos contribuyen en las actividades agrícolas pocas horas

al día o solo los fines de semana, lo cual disminuye el grado de exposición a

sustancias químicas. A partir de los 30 años de edad comienza a disminuir los

valores promedios de la actividad de AChE, siendo los valores más bajos

pertenecientes a individuos mayores de 60 años (0.8831 U/L). Esto se debe a que

las personas de edad entre 30 y 60 años de edad, son las que realizan la mayor

parte de las labores agrícolas, siendo por tanto las más expuestas a las sustancias


95

químicas usadas para el control de sus cultivos. Los individuos mayores de 60

años, aunque no poseen una exposición considerable, presentan valores de AChE

más bajos debidos posiblemente a los factores fisiológicos, que pudieran estar

presentes, producto de la edad.


96

VI. CONCLUSIONES

1. El método desarrollado permite la determinación de los valores de actividad

de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva total.

2. Se comprobó que la saliva puede ser usada como indicador biológico para

la determinación de la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa por


3. No se observó un efecto significativo de la presencia de alcohol (etanol) en

las muestras de saliva sobre la determinación de la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa.

4. La presencia de café y chimo afecta la sensibilidad del método para la

determinación de la actividad de la enzima en saliva.

5. Se observó que los plaguicidas organofosforados y carbamatos, tanto en

mezclas como de forma individual, afectan significativamente los valores de

actividad de la enzima acetilcolinesterasa en saliva, produciendo

porcentajes de inhibición de la enzima de 80 % a concentraciones menores

a 100 ppm de plaguicida.

6. El análisis de las muestras de saliva de los individuos de El Paramito reveló

que los valores promedio de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa de

estos individuos es menor que los obtenidos para la población tomada

como control, con una diferencia de medias estadísticamente significativa

(p>0.10).

7. En ausencia de información clínica relevante, se puede decir que los niveles

de acetilcolinesterasa en saliva de la población masculina expuestos, mayor


97

de 30 años de edad, están inhibidos por exposición a plaguicidas

organofosforados y carbamatos

8. No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre los

valores de acetilcolinesterasa en saliva entre la población femenina

expuesta y de control.

9. Se observó una correlación inversa entre los valores de actividad de la

enzima acetilcolinesterasa en saliva y la edad de los individuos analizados,

lo cual indica que a mayor edad disminuye los niveles de acetilcolinesterasa

en saliva.

10. De acuerdo con los resultados obtenidos, el análisis de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva, por el método desarrollado en esta

investigación, permite establecer efectos relacionados con la exposición de

plaguicidas organofosforados y carbamatos.


98

VII. Recomendaciones

Con el fin de completar y ampliar la metodología analítica desarrollada, o diseñar

nuevas experiencias de análisis, a continuación se plantean las siguientes

recomendaciones.

1. Establecer un valor limite biológico para la actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva, que permita identificar un patrón de

intoxicación debida a la exposición a plaguicidas organofosforados y

carbamatos, por el método validado en esta investigación.

2. Confirmar la identidad de los plaguicidas en muestras de saliva, a través de

técnicas analíticas como la cromatografía de gases, acoplada a detectores

específicos como Nitrógeno-Fósforo o de masas, que permita establecer

una relación entre la identidad de los plaguicidas y los niveles de inhibición.

3. Determinar la relación existente entre los valores de actividad de la enzima

acetilcolinesterasa en saliva y sangre.

4. Desarrollar y validar el método para la determinación de los niveles de

acetilcolinesterasa en saliva por comparación colorimétrica con una banda

de referencia.


99

VIII REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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105

Anexo 1.

Figura 1. Imagen del efecto visual de la presencia de una mezcla de organofosforados (0-100 ppm) sobre la actividad de la enzima acetilcolinesterasa por el método de Ellman.

Obsérvese que a medida que aumenta la concentración de plaguicida disminuye la coloración de la solución producto de la inhibición de la enzima.


106

Anexo 2.

Tabla 1. Datos descriptivos de los individuos analizados de la comunidad de El

Paramito, con los valores de actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva obtenidos.

Numero de

Historia Sexo Edad Actividad de la

Enzima AChE Desviación estándar

1 m 37 0,7662 0,0946 2 m 26 1,4992 0,0744 3 f 8 1,0316 0,0893 4 f 35 0,7218 0,0085 5 m 73 1,0677 0,0383 6 f 27 0,6 0,0149 7 m 35 0,6177 0,0026 8 m 9 2,2173 0,1372 9 f 50 1,6917 0,0957

10 m 34 2,9128 0,1212 11 f 20 NC NC 12 f 25 5,8346 0,0851 13 f 9 0,5932 0,0181 14 f 7 NC NC 15 f 23 0,794 0,0170 16 f 36 ND ND 17 f 8 ND NC 18 f 45 0,8421 0,0510 19 m 7 1,0827 0,0021 20 f 12 NC NC 21 m 50 ND ND 22 m 42 NC NC 23 f 56 0,8271 0,0213 24 m 11 0,5908 0,0081 25 m 56 1,3984 0,0594 26 f 26 NC NC 27 m 43 0,4618 0,0105 28 m 32 0,8425 0,0622 29 m 30 ND ND 30 f 19 0,7407 0,0108

f. Femenino. m. Masculino. NC. No cuantificable. ND. No detectable.


107

Anexo 3.

Tabla 2. Continuación de los datos descriptivos de los individuos analizados de la

comunidad de El Paramito, con los valores de actividad de la enzima acetilcolinesterasa en muestras de saliva.

Numero de Historia

Sexo Edad Actividad de la Enzima AChE

Desviación estándar

31 f 19 0,5018 0,0079

32 m 32 NC NC 33 f 76 0,6145 0,0011

34 f 47 0,8268 0,0379

35 m 15 0,9287 0,1505 36 m 15 0,5449 0,0220

37 f 27 0,6734 0,0014

38 m 23 0,7558 0,0884

39 m 19 1,5363 0,1676

40 m 14 1,7932 0,1056

41 m 31 ND ND 42 f 31 0,7591 0,0938

43 f 10 NC NC 44 m 9 2,3647 0,2595

45 m 8 2,5105 0,2371

46 m 59 ND ND 47 m 22 3,8496 0,0804

48 f 23 ND ND 49 m 46 ND 0,2371

50 f 15 2,0298 0,0282

51 f 66 NC NC 52 m 36 2,0872 0,2189

53 f 33 0,5484 0,1391

54 m 43 1,402 0,0035

55 f 14 3,1857 0,0372

56 f 80 1,3237 0,0191

57 f 13 4,7492 0,0340 58 f 38 2,7802 0,1238

59 m 12 0,652 0,0753

60 m 11 0,8797 0,0255

f. Femenino. m. Masculino. NC. No cuantificable. ND. No detectable.


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