Uji Biokimia

BAB I

PENDAHULUAN

A. Judul Percobaan

Uji Biokimia terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

B. Latar Belakang

Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan

lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup yang lain. Bakteri memiliki

ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-

tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula

yang merugikan. Salah satu ciri bakteri adalah melakukan metabolisme

pada dirinya sendiri, metabolisme pada suatu bakteri bertujuan

memperoleh suatu energi atau untuk kebutuhan hidupnya (Champbell,

2005).

Aktivitas kimiawi sel yang dilakukan oleh bakteri sangatlah rumit.

Pada dasarnya aktivitas kimiawi sel bakteri seperti metabolisme dilakukan

dengan bantuan katalisator. Dalam hal ini, katalisator yang digunakan

adalah biokatalisator yaitu enzim. Enzim ini akan membantu bakteri dalam

hal seperti kegiatan fisiologis meliputi penyusunan zat organik,

pencernaan makanan, pembongkaran dan zat makanan. Adanya tipe enzim

tertentu dalam baketri akan membuat bakteri tersebut spesifik terhadap

substrat tertentu, sehingga dapat pula dilakukan untuk menguji sifat

bakteri (Waluyo, 2007). Misal, pada Bacillus subtilis memiliki enzim

amylase yang digunakan untuk menghidrolisis pati (Clifton, 1958).

Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia

dari bakteri tersebut. Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka

akan diketahui sifat-sifat suatu koloni bakteri. Sifat-sifat suatu koloni

tersebut ialah sifat-sifat yang ada sangkut pautnya dengan bentuk,

susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya (Dwidjoseputro, D.

1981.)

Uji biokimia dapat digunakan untuk menentukan sifat metabolisme

bakteri dilihat melalui interaksi reagen - reagen kimia dengan metabolit -

metabolit yang dihasilkan. Selain itu juga dapat dilihat dari kemampuan

bakteri dalam pemakaian suatu senyawa tertentu sebagai sumber karbon

dan sumber energi. Metode Uji Biokimia dapat digunakan sebagai upaya

untuk proses identifikasi bakteri (Backmann, 2006).

C. Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat biokimia dari

bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme tidak mempunyai varietas dan ciri-ciri anatomi, tidak

seperti halnya pada tumbuhan atau hewan yang mudah dipelajari dalam

taksonomi. Masalah yang paling mendasar di dalam bakteriologi adalah

penyembuhan, pembersihan, dan identifikasi dari kultur bakteri. Identifikasi

bakteri didasarkan pada varietas dari karakteristik yang dimiliki oleh bakteri

tersebut, tidak hanya dari morfologi tetapi juga karakteristik kultur

mikroorganisme, fisiologi, dan patogenitas (Seeley & VanDemark, 1971).

Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk

hidup. Proses metabolisme dibedakan menjadi dua jenis yaitu anabolisme dan

katabolisme. Anabolisme (biosintesis) yaitu reaksi biokimia yang merakit

molekul-molekul sederhana menjadi molekul-molekul yang lebih kompleks.

Misalnya pembentukkan protein dari asam amino. Secara umum proses anabolik

membutuhkan energi. Sedangkan katabolisme yaitu reaksi biokimia yang

memecah atau menguraikan molekul-molekul kompleks menjadi molekul-

molekul yang lebih sederhana. Proses katabolik melepaskan energi yang

dibutuhkan oleh sel (Waluyo, 2004).

Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan

tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan

eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem endoenzim

selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan eksoenzim yaitu

enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian besar

eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan

molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana.

Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan

digunakan untuk kepentingan sel (Waluyo, 2004).

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari

interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain

itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon

dan sumber energi (Waluyo, 2004).

E. coli adalah suatu bakteri gram negative berbentuk batang, bersifat

anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E. coli dibedakan atas

sifat serologinya berdasarkan antigen o (somatic), K (kapsul) dan H (flagella)

(Fardiaz, 1992)

Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain uji

dalam melakukan fermentasi, reduksi terhadap nitart, uji oksidase, produksi

katalase, hidrolisis protein, uji sitart simmons, hidrolisis urea, hidrolisis H2S dan

uji motilitas (Funke, 2004).

Reduksi Nitrat digunakan untuk menentukan kemampuan beberapa

organisme dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit atau di luar bentuk nitrit. Uji

menunjukan hasil positif karena pada saat panambahan serbuk Zn tidak terjadi

perubahan warna (Backmann, 2006).

Bakteri yang tergolong dalam grup fekal dapat memecah asam amino

triptofan dan menghasilkan suatu senyawa berbau busuk yang disebut indol.

Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam medium yang mengandung triptofan,

kemudian diberi 3-5 tetes pereaksi Kovacs yang mengandung amil alkohol atau

diberi kristal asam oksalat. Adanya indol akan menyebabkan amil alkohol

berubah warnanya menjadi merah tua atau warna kristal asam oksalat menjadi

merah muda. Uji yang menggunakan penunjuk amil alkohol disebut metode

Kovacs, sedangkan yang menggunakan penunjuk asam oksalat disebut metode

Gnezda.

Uji fermentasi karbohidrat dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang

mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi

perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning,

artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa

juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam

tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas (Anonim, 2008)

Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghridolisis

bakteri dengan menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan polisakarida yang

memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya yang besar, polisakarida

tidak mampu diserap oleh membrane sel (Capuccino & Sherman, 1992).

Uji peptonisasi dan fermentasi susu ini bertujuan untuk melihat

kemampuan bakteri dalam menggunakan komponen-komponen yang terdapat

pada susu, misalnya laktosa, proteinsusu (kasein), lacto-albumin, dan

lactoglobulin.

BAB III

METODE

A. Alat dan Bahan

1. Alat :

a. Petridish

b. Vortex

c. Tabung reaksi

d. Rak tabung reaksi

e. Tabung durham

f. Kapas

g. Jarum ose

h. Bunsen

i. Pipet tetes

j. Propipet

k. Pipet ukur

l. Inkubator

m. Karet gelang

n. Kertas payung

2. Bahan :

a. Biakan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

b. Medium glukosa cair

c. Medium sukrosa cair

d. Medium laktosa cair

e. Medium BCPM

f. Medium nitrat cair

g. Larutan asam sulfanilat

h. Larutan alpha naphtylamin

i. Medium hidroksilat kasein

j. Larutan eter

k. Reagen ehrlich eter

l. Medium pati agar

m. Iodium

B. Cara Kerja

1. Fermentasi Karbohidrat

Biakan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

diambil dengan ose dan masing-masing diinokulasikan ke dalam

medium glukosa, fruktosa, dan laktosa cair secara aseptis. Kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Semua tabung diamati dan

dicatat hasilnya.

2. Peptonisasi dan Fermentasi Susu



medium BCPM secara aseptis. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC

selama 48 jam. Semua tabung diamati dan dicatat hasilnya. Jika terjadi

endapan, berarti terjadi peptonisasi. Jika terdapat lapisan kuning,

berarti terjadi fermentasi.

3. Reduksi Nitrat



medium nitrat cair secara aseptis. Kemudian diinkubasi pada suhu

37oC selama 48 jam. Reduksi nitrat diuji dengan ditambahkannya 1 ml

asam sulfanilat dan 1 ml alpha napthylamin. Jika digojok terbentuk

warna merah, berarti menunjukkan adanya nitrit (hasil reduksi nitrat)

4. Pembentukan Indol



medium hidroksilat kasein secara aseptis. Kemudian diinkubasi pada

suhu 37oC selama 48 jam. Pembentukan indol diuji dengan

ditambahkannya 1 ml eter pada tiap-tiap tabung, digojok dan

didiamkan hingga terbentuk lapisan. Reagen ehrlich ditambahkan

sebanyak 1 ml secara perlahan-lahan melalui dinding tabung. Masing-

masing tabung didiamkan dan diamati. Jika terbentuk cincin berwarna

merah muda, bakteri tersebut dapat membentuk indol.

5. Hidrolisis Pati



medium pati agar (dengan streak plate) secara aseptis. Kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah diinkubasi, larutan

iodium atau lugol’s iodine solution dituangkan ke medium tersebut dan

didiamkan beberapa menit. Sisa dari larutan iodium dibuang.

Hidrolisis pati yang terjadi diamati. Jika berwarna biru, berarti tidak

terjadi hidrolisis. Jika warna birunya menghilang, berarti terjadi

hidrolisis pati.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

No. Nama Uji

Kondisi Medium

Sebelum

Inokulasi

Sesudah Inokulasi & Inkubasi

SA EC

1

Fermentasi Karbohidrat

a. Glukosa cair Merah AG A

b. Sukrosa cair Merah AG O

c. Laktosa cair Merah AG A

2Peptonisasi dan

Fermentasi Susu

Biru

keunguan

Terjadi

peptonisasi tanpa

fermentasi

Terjadi fermentasi

dan peptonisasi

3 Reduksi NitratKuning

bening

(+) terbentuk

endapan coklat

(+) terbentuk

endapan coklat

4 Pembentukan IndolKuning

bening(-) (-)

5 Hidrolisis PatiPutih

bening (-) (-)

B. Pembahasan

Pada bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dilakukan uji

biokimia seperti uji fermentasi. Uji fermentasi dilakukan dengan medium glukosa

cair, sukrosa cair, laktosa cair. Fermentasi adalah penggunaan piruvat atau

derivatnya sebagai aseptor electron untuk mengoksidasi NADH menjadi NAD+

(Presscott et.al, 2008). Sedangkan fermentasi karbohidrat adalah perombakan

monosakarida menjadi alkohol, gas karbondioksida, asam organik dan energi

dengan bantuan mikrobia. Adanya asam organik akan mengubah pH medium

sehingga indikator akan memberikan respon dan terjadi perubahan warna pada

medium. Pada indicator fenol merah yang digunakan jika dalam kondisi asam

akan menjadi berwarna kuning.

Hasil yang ditunjukan dalam uji fermentasi menggunakan medium yang

berisi gula berupa glukosa dan laktosa cair pada E. coli adalah positif dan pada

sukrosa menunjukkan hasil yang negatif. E. coli memiliki enzim beta-

galaktosidase yang dapat memecahkan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa.

Selain itu E.coli juga memiliki enzim sukrase yang seharusnya dapat memecah

sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Setelah semua gula menjadi sederhana

yaitu berupa monosakarida, proses fermentasi dapat terjadi pada medium-medium

tersebut. Hasil fermentasi akan mengeluarkan asam organik yang dapat merubah

pH medium, karena itu medium tersebut akan mengalami perubahan warna akibat

respon indikator didalamnya.

Selain factor tersebut, E.coli merupakan bakteri anaerob fakultatif yang

dapat hidup dalam tidak hanya dalam kondisi aerob, sehingga kemampuan dalam

memfermentasikan zat sangat diperlukan untuk kelangsungan hidupnya karena

E.coli mendapatkan energi dari proses fermentasi tersebut.

Pada S. aureus reaksi positif yang menunjukan adanya proses fermentasi

hanya terjadi pada ketiga medium cair. Hal ini terjadi karena S. aureus memiliki

enzim beta-galaktosidase yang dapat memecah laktosa, mempunyai enzim sukrase

yang dapat memecah sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa yang merupakan

monosakarida yang dapat difermentasikan.

Uji selanjutnya adalah mengenai kemampuan S. aureus dan E.coli dalam

melakukan fermentasi atau peptonisasi terhadap susu dengan menggunakan

medium BCPM (Brom Cresol Purple Milk). Pada medium BCPM yang

diinokulasikan E.coli menunjukan hasil yaitu perubahan warna yang pada

awalnya berwarna biru keunguan menjadi ada endapan dan terdapat lapisan

kekuningan. Hal tersebut menandakan terjadinya peptonisasi dan fermentasi susu.

Warna kuning yang terjadi disebabkan oleh adanya respon indicator terhadap

perubahan pH yang menjadi asam. Asam yang terdapat didalam medium adalah

asam organik hasil fermentasi oleh E.coli. Fermentasi yang terjadi didalam

medium tersebut adalah fermentasi laktosa. E.coli merupakan bakteri yang

memiliki enzim beta-galaktosidase yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa

dan galaktosa, sehingga E.coli mampu memfermentasikan laktosa.

Pada medium BCPM yang diinokulasikan bakteri S. aureus menunjukan

perubahan warna yang semula biru keunguan menjadi berwarna kehijauan.

Berubahnya warna pada medium ini disebabkan oleh hasil peptonisasi yang

menyebabkan pH medium yang semula netral menjadi cenderung ke basa,

sehingga indikator didalamnya akan merespon dengan berubah warna. Kasein

akan dihidrolisis oleh enzim rennin dan enzim protease yang terdapat dalam S.

aureus menjadi para kasein dan pepton-pepton terlarut sehingga terjadi

peptonisasi.

Uji pembentukan indol dengan menggunakan medium hidroksilat kasein

yang didalamnya terkandung asam amino Triptofan. Triptofan yang memiliki

cincin indol akan didegradasi oleh bakteri dengan bantuan eter. Setelah itu, indol

yang dilepaskan akan berikatan dengan reagen Ehrlich membentuk cincin warna

merah. Tetapi hasil uji terhadap E. coli dan S. aureus menunjukan reaksi negatif.

Hal ini bisa saja disebabkan karena kedua bakteri tersebut tidak dapat

mendegradasi triptofan yang tersedia sehingga pembentukan indol tidak dapat

terjadi.

Uji selanjutnya adalah uji kemampuan E. coli dan S. aureus dalam

mereduksi nitrat menggunakan medium nitrat. E.coli dan S. aureus menunjukan

hasil positif, mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit ditandai dengan terbentuknya

perubahan warna menjadi warna merah. E. coli merupakan bakteri fakultatif

anaerob merupakan bakteri yang dapat hidup di lingkungan dengan atau tanpa

oksigen. Pada kondisi aerob E. coli dapat menggunakan oksigen untuk

mendapatkan energi, sedangkan dalam kondisi anaerob nitrat dapat digunakan

oleh E.coli sebagai aseptor organik dalam usaha memperoleh energi. Sehingga

E.coli memiliki kemampuan untuk mereduksi nitrat. Pada bakteri S. aureus juga

dapat menggunakan oksigen untuk mendapatkan energi, sedangkan dalam kondisi

anaerob nitrat dapat digunakan sebagai aseptor organik dalam usaha memperoleh

energi. Berikut reaksi yang terjadi dalam reduksi nitrat :

Gambar 1. Reaksi reduksi nitrat

Gambar 2. Reaksi Pembentukan Warna Merah

Uji kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati didapatkan

hasil setelah penetesan Iod adalah pada E. coli dan S. aureus tidak terdapat

zona jernih yang berarti reaksi negatif. Hal tersebut berarti kedua bakteri

ini tidak mampu memecah pati menjadi lebih sederhana untuk digunakan

sebagai energi.

BAB V

KESIMPULAN

Dari hasil uji diatas dapat disimpulkan bahwa S. aureus memiliki sifat

biokimia seperti memiliki enzim sukrase, enzim beta-galaktosidase, memiliki

enzim rennin dan protease, tidak dapat membentuk indol, dapat mereduksi nitrat,

mampu memfermentasikan dan menyebabkan terjadinya peptonisasi pada susu

serta tidak memiliki enzim amilase untuk menghidolisis pati. Sedangkan bakteri

E. coli memiliki sifat biokimia seperti, memiliki enzim beta-galaktidase, enzim

sukrase, tidak dapat membentuk indol, dapat mereduksi nitrat, mampu

memfermentasikan dan menyebabkan terjadinya peptonisasi pada susu, dan tidak

memiliki enzim amilase.

DAFTAR PUSTAKA

Backmann, A. 2006. Carbohydrate Metabolism in Bacteria-Use of Differences in

Carbohydrate Metabolism for Identifying Bacteria. Caister Academic

Press. USA.

Campbell, N.A., J.B. Reece. 2005. Biology Seventh Edition. Benjamin Cummings.

San Francisco.

Cliffton, C.E. 1950. Introduction to the bacteria. McGraw-Hill Book Company,

Inc. New York.

Dwidjoseputro, D. 1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta

Funke BR, Tortora GJ, Case CL . 2004. Microbiology: An Introduction 8th

Edition. Benjamin Cummings. San Francisco.

Pelczar, M.J.Jr., E. C. S Chan, and N. R. Krieg. 1997. Microbiology. McGraw-

Hill Book Company, Inc. New York.

Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology 7th Edition.

McGraw-Hill Book Company, Inc. USA.

Salle, A. J. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology 5th Edition. McGraw-

Hill Book Company. New York.

Seeley, H. W., dan P. J. VanDemark. 1971. Microbes in Action A Laboratory

Manual Of Microbiology. W. H. Freeman and Company: San

Fransisco

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Penerbit Universitas Muhammadiyah

Malang. Malang.

Documents

Uji Biokimia