Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Pangan

PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PANGAN

Disusun oleh :

Seveline, S.TP., M.Si.

Teknologi Pangan Fakultas Bioindustri Universitas Trilogi

Jakarta 2018

i

Kata Pengantar

Mata kuliah Mikrobiologi Pangan adalah mata kuliah kekhususan yang didapat pada

program studi Teknologi Pangan Fakultas Bioindustri Universitas Trilogi. Mata kuliah ini

diwajibkan pada mahasiswa yang telah lulus mata kuliah Mikrobiologi Dasar dengan tujuan

agar mampu untuk praktik keahlian yang menyangkut keilmuan dan sebagai syarat lulusnya

mata kuliah Mikrobiologi Pangan.

Buku ini merupakan buku penuntun untuk mempermudah mahasiswa dalam

mempersiapkan praktikum Mikrobiologi Pangan. Praktikum Mikrobiologi Pangan ini

merupakan lanjutan dari Mikrobiologi Dasar yang hanya belajar dasar-dasar Mikrobiologi

saja sedangkan untuk Mikrobiologi Pangan lebih ditekankan pada produk pangan baik

berupa makanan dan minuman atau bahan ingredient lainnya dalam hal keamanan pangan,

kandungan mikroba bahan, jenis mikroba pangan dan uji-uji yang berhubungan dengan

mikrobiologi pangan.

Topik praktikum Mikrobiologi Pangan dibagi dalam 11 topik yang satu topic dengan

satu topik lainnya saling berkaitan. Hal tersebut ditujukan agar mahasiswa belajar

menganalisis dan menjelaskan permasalahan-permasalahan dalam mikrobiologi pangan,

seperti deteksi mikroba pada bahan pangan, pengujian bakteri indikator serta sampai

mekanisme subletal pada mikroba.

Akhir kata penyusun memohon maaf jika ada kekurangan di buku petunjuk

praktikum ini. Segala sesuatu tidak ada yang sempurna, penulis memohon maaf jika ada

masih terdapat kekurangan dan kesalahan. Penulis berterima kasih jika ada masukan yang

membangun untuk buku petunjuk praktikum Mikrobiologi Pangan. Semoga buku petunjuk

praktikum ini dapat bermanfaat.

Jakarta, April 2018

Penyusun

Seveline

ii

Daftar Isi

Kata Pengantar i

Daftar Isi ii

Isolasi Bakteri yang Berperan dalam Fermentasi Pangan 1

Isolasi dan Pertumbuhan Kapang pada Bahan Pangan 5

Sifat‐sifat Khamir Dalam Pengolahan Pangan 10

Pengujian Bakteri Enterik pada Air dan Minuman 15

Mikroorganisme Perusak Pangan 21

Uji Deteksi Salmonella‐Shigella pada Bahan Pangan 26

Uji Vibrio pada Produk Hasil Perikanan 30

Aktivitas Antimikroba 33

Germinasi dan Ketahanan Panas Endospora Bakteri 36

Pengaruh Pemanasan Subletal dan Penyembuhan Terhadap Pertumbuhan Bakteri 41

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Pangan

Teknologi Pangan Universitas Trilogi

1

Isolasi Bakteri yang Berperan dalam Fermentasi Pangan

A. Pendahuluan

Mikroorganisme yang berlimpah di alam ini ternyata memiliki peranan yang

beragam, bisa sebagai perusak tetapi banyak juga yang bermanfaat terutama di dalam

produk-produk fermentasi. Bakteri asam laktat (BAL) adalah kelompok bakteri gram

positif berbentuk kokus atau batang, tidak membentuk spora, suhu optimum ± 40oC,

pada umumnya tidak motil, bersifat anaerob, katalase negatif dan oksidase positif,

dengan asam laktat sebagai produk utama fermentasi karbohidrat.

BAL terdiri atas 4 genus yaitu :Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus dan

Pediococcus. Tetapi berkembang sejalan teknik identifikasi maka karakteristik terbaru

mempunyai 16 genus. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang sering digunakan

sebagai starter kultur untuk susu fermentasi, berpotensi sebagai antikolesterol yang

diduga karena adanya eksopolisakarida (EPS).

Bakteri homofermentatif adalah fermentasi bakteri asam laktat yang hanya

menghasilkan asam laktat sebagai akhir produknya. Bakteri homofermentatif sering

digunakan dalam pengawetan makanan, karena produksi asam laktat dalam jumlah

tinggi di dalam makanan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lainnya yang

menyebabkan kebusukan makanan. Pada kelompok bakteri ini asam piruvat yang

terbentuk dari jalur glikolisis (EMP) bertindak sebagai penerima hidrogen, dimana

reduksi asam piruvat oleh NADH2 menghasilkan asam laktat.

Bakteri asam laktat dapat dibedakan atas 2 kelompok yaitu:

1. Bakteri homofermentatif; glukosa difermentasi menghasilkan asam laktat

sebagai satu-satunya produk. Contoh : Streptococus, Pediococcus, dan beberapa

Lactobacillus.

2. Bakteri heterofermentatif : glukosa difermentasikan selain menghasilkan asam

laktat juga memproduksi senyawa-senyawa lainnya yaitu etanol, asam asetat. Contoh

:Leuconostoc, dan beberapa spesies Lactobacillus

Tujuan Instruksional

1. Mahasiswa mampu mengetahui bakteri yang berperan dalam fermentasi

pangan dan mampu mengisolaso bakteri yang berperan dalam fermentasi pangan



2

B. Bahan dan alat

Bahan : Alat:

Sayur asin Cawan Petri

Starter yoghurt Ose

Yoghurt Bunsen

Kefir Gelas piala

Erlenmeyer

Media : Mikropipet

MRS Agar

Lactose Broth (dengan tabung durham)

MR –VP

Alfa naftol

KOH

Larutan H2O2

Larutan Pengencer

Spiritus

Alkohol

Larutan pengencer

C. Prosedur kerja :

Pengaruh Suhu Berbeda pada Bakteri Asam Laktat

1. Siapkan larutan pengencer (NaCl fisiologis), siapkan pula media MRS Agar

2. Ambil bahan yang akan diuji sebanyak 1 cc encerkan pada larutan pengencer 9 ml

sedangkan untuk bahan pangan yang bukan cairan, timbang sebanyak 1 gram larutkan

dalam larutan pengencer 9 ml

3. Lakukan pengenceran sampai 101

4. Hidupkan pada media MRS Agar

5. Inkubasi sebanyak 2 hari, pada suhu 25oC dan 37oC amati

6. Lakukan secara aseptis

7. Lakukan teknik goresan kuadran dari sampel tersebut



3

Pemecahan karbohidrat (pengujian dengan lactose broth)

1. Dari sampel tadi inokulasikan sebanyak 1cc ke dalam Lactose broth)

2. Inkubasikan pada suhu 37oC

3. Diamati terjadinya pertumbuhan (ditandai dengan kekeruhan) dan pembentukan gas

di dalam tabung Durham. Timbulnya gas menunjukkan reaksi heterofermentatif

Pengujian Katalase

1. Ambil satu lop bakteri dari agar (boleh dari agar miring atau cawan petri)

2. Kemudian tetesi dengan hidrogen peroksida

3. Jika mengeluarkan gelembung gas maka katalase positif, jika gelembung gas tidak ada

maka katalase negatif

4. Lakukan pada beberapa bakteri dan catat hasilnya pada tabel

Pengujian Metil Red

Hari Pertama

1. Tandai tabung kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan

2. Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri

3. Inkubasikan dalam suhu 37oC selama 5x24 jam

Hari Kedua

1. Tambahkan 5 tetes reagens metil red ke dalam tabung MR VP

2. Laporkan hasil. Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan

reagens metil red. Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah menjadi kuning atau

jingga setelah penambahan reagens

Pengujian Voges Proskauer

Hari Pertama

1. Tandai kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan

2. Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri

3. Inkubasikan dalam 37oC selama 24-48 jam

Hari Kedua

1. Tambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alfanaftol dalam kaldu

MR-VP



4

2. Kocok tabung sehingga kaldu terlihat berbuih. Pengocokan dengan baik

meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi 2-3 butanadiol menjadi

asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat

setelah 30 menit

3. Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah

penambahan reagens. Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP tidak memperlihatkan

perubahan warna setelah penambahan reagens

Pengamatan dengan Mikroskop

1. Lakukan pengamatan dengan mikroskop dengan pewarnaan

2. Gambarkan yang anda lihat (foto bila perlu)

D. Hasil Pengamatan

Jenis Sampel

Pengaruh Suhu

Pemecahan Karbohidrat

Pengujian MR

Pengujian VP

Pengujian katalase

Pengamatan di Mikroskop

Pertanyaan :

1. Apakah isolasi bakteri yang telah kita dilakukan dapat digunakan untuk jenis bakteri

lainnya? Misalnya untuk bakteri patogen.

2. Mengapa perlu dilakukan beberapa pengujian terhadap bakteri tersebut?

E. Daftar Pustaka

Rahayu WP dan Nurwitri CC. 2012. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : IPB Press. Salminen, S. dan von Wright, A. 1998. Lactic Acid Bacteria Microbiology and Functional

Aspects. 2nd ed. Marcel Dekker, Inc, New York. Sopandi T dan Wardah. 2014. Mikrobiologi Pangan, Teori dan Praktik. Yogyakarta : Andi

Yogyakarta. Jay JM. 2007. Modern Food Microbiology. Maryland : Aspen Publication.



5

Isolasi dan Pertumbuhan Kapang pada Bahan Pangan

A. Pendahuluan

Fungi atau cendawan adalah salah satu contoh dari sel multiselular yang sering

kita temui di kehidupan kita sehari-hari. Baik berupa makro fungi seperti jamur tiram,

jamur kancing atau jamur kuping dan masih banyak lagi atau sebagai mikro fungi. Fungi

terbagi menjadi kelompok Ascomycota, Basidiomycota, Zygomicota, Chytridiomicota

dan beberapa memasukkan ke kelompok Deuteromycota. Ascomycota sebagian besar

adalah mikrofungi, basidiomycota sebagian besar berupa makrofungi, zygomicota tidak

mempunyai septa dan hifa, chytrid umumnya berupa fungi akuatik dan deuteromycota

yang biasa disebut dengan fungi anamorf. Morfologi fungi memiliki hifa dan septum

yang berfungsi nanti untuk pertumbuhan fungi.

Pada ilmu pangan fungi yang paling sering digunakan dalam proses fermentasi

pangan adalah fungi yang termasuk kelas Ascomycota seperti Aspergillus oryzae,

Aspergillus sojae, Aspergillus niger dan masih banyak lagi. Kapang yang menyebabkan

kerugian dapat menyebabkan kerusakan pangan, penyebab penyakit sampai penyebab

kematian, beberapa contohnya adalah Aspergillus flavus, Claviceps purpurea, Amanita

phalloides dan masih banyak lagi (Roosheroe, 2006).

Pertumbuhan fungi biasanya pada suhu 25oC atau suhu ruang, dan biasanya

diinkubasi selama 5 hari. Fungi bisa dihidupkan dalam media padat, media cair, bisa

digoyang maupun tidak digoyang ketika diinkubasi.


1. Mahasiswa mampu untuk mengetahui pertumbuhan kapang-kapang pangan

2. Mahasiswa mampu untuk mengetahui cara-cara menumbuhkan kapang dari bahan

pangan tersebut



6

B. Bahan dan Alat

Bahan pangan: Alat :

Kacang tanah 10 gram Autoklaf

Tempe Inkubator

Laru/usar tempe Vortex

Ragi tempe Lampu spiritus

PDA (Potato Dextrose Agar) Mikropipet

SDA (Saboraud Dextrose Agar) Tip

0.05 klorampenikol

MEA (malt extract agar)

Larutan pengencer

C. Prosedur kerja

C.1. Untuk kacang-kacangan

1. Siapkan SDA dan SDB (Sobaroud Dextrose Agar dan Broth) yang telah diberi dengan

kloramfenikol 0.05% dari volume media

2. Siapkan larutan pengencer NaCl fisiologis sebanyak 1 tabung berisi 90 ml dan larutan

pengencer berisi 9 ml. Sterilisasi dan dinginkan

3. Sementara itu siapkan bahan yang akan diuji dengan cara menghancurkan bahan

tersebut dengan mortar atau pestle, alat mortar pestle disemprot dahulu dengan

alkohol 95%

4. Ambil 10 gram bahan masukkan ke dalam pengencer 90 ml, kemudian goyangkan

hingga tercampur rata. Kemudian dari larutan pengencer 90 ml tadi ambil 1 ml



7

kemudian masukkan ke dalam larutan pengencer 9 ml sampai 102, votex dan lakukan

dengan cara steril dan aseptik

5. Lakukan metode pour plating atau dengan metode tuang dengan menggunakan SDA

6. Inkubasikan 29-30oC selama 4-5 hari (suhu ruang)

7. Lakukan dengan cara penggoyangan dan cara didiamkan

C.2. Untuk Bahan Pangan :

1. Siapkan media MEA, TEA dan PDA, sterilkan dan dinginkan

2. Siapkan larutan pengencer 1 tabung 90 mL dan 3 tabung larutan pengencer steril 9 mL

3. Ambil dan timbang sampel 10 gram dan hancurkan dalam mortar dengan pestle yang

telah disemprot dengan alkohol terlebih dahulu. Kemudian masukkan dalam pengencer

sebanyak 1 mL dan lakukan pengenceran sampai 10-3,vortex, dan lakukan secara steril

dan aseptik

4. Ambil 1 mL bahan pangan dengan mikropipet dan masukkan ke dalam cawan petri

dan tuang media-media yang tersedia

5. Inkubasi dengan suhu ruang selama 5 hari (29-30oC) dan catat hasilnya

C.3. Untuk laru/usar tempe dan ragi tempe

1. Siapkan media SDB dan larutan pengencer 9 mL dan sterilkan

2. Ambil 1 gram laru/usar tempe atau ragi tempe dan masukkan ke dalam larutan

pengencer, vortex

3. Kemudian ambil 1 mL masukkan ke dalam SDB yang telah disiapkan dan inkubasi

dengan cara penggoyangan selama 5 hari

4. Amati hasilnya



8

Membuat Slide Culture untuk Kapang

1. Siapkan agar steril (PDA) yang sudah keras di cawan petri

2. Potong segiempat dan masukkan ke dalam cawan petri steril yang telah dialasi

dengan kertas saring dan batang gelas berbentuk U

3. Ambil dengan ose jarum ke agar potong segiempat tadi dan tusuk pada 4 sisi agar

4. Tutup dengan cover glass, dan tetesi dengan aquadest steril pada kertas saring

tersebut

5. Inkubasikan selama 4-5 hari pada suhu ruang

6. Bisa dilihat dibawah mikroskop dengan mengambil cover glass dan menetesinya

dengan lactophenol blue stain sebelumnya.

D. Hasil Pengamatan

Prosedur

Percobaan

Media

Inkubasi

Dilakukan

dengan tidak

digoyang

Dilakukan dengan

digoyang

Karakteristik

Kapang

(warna, bentuk,

pola

penyebaran dan

lain-lain)

Foto

Kapang

C1

C2

C3



9

E. Pertanyaan

1. Apa fungsinya penambahan klorampenikol pada SDA?

2. Dalam pertumbuhan kapang tersebut lebih baik pada media yang mana? Apakah

SDA, SDB, PDA, PDB atau media lainnya?

3. Bagaimana gambar slide culture yang telah anda buat? Apakah ada perbedaan untuk

sampel-sampel yang telah anda inokulasi dan inkubasi?

F. Daftar Pustaka

Roosheroe I.G.; Sjamsuridzal W.;dan Oetari A. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta : Buku Obor

Rahayu WP dan Nurwitri CC. 2012. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : IPB Press. Sopandi T dan Wardah. 2014. Mikrobiologi Pangan, Teori dan Praktik. Yogyakarta : Andi

Yogyakarta. Jay JM. 2007. Modern Food Microbiology. Maryland : Aspen Publication



10

Sifat-sifat Khamir Dalam Pengolahan Pangan

A. Pendahuluan

Khamir merupakan salah satu kelompok mikroorganisme yang penting dalam

mikrobiologi pangan, karena disamping sifat-sifatnya yang dapat menyebabkan

kerusakan makanan khamir juga banyak digunakan dalam menghasilkan makanan-

makanan fermentasi. Sebagai organisme perusak makanan, khamir sering tumbuh pada

makanan-makanan yang mengandung gula dan menimbulkan perubahan bau seperti

bau asam atau bau alkohol, menimbulkan kekeruhan, pembentukan lender, film dan

pertumbuhan pada permukaan, endapan dan sebagainya.

Dalam fermentasi makanan, khamir berperan dalam produksi minuman-

minuman beralkohol, pembuatan roti, tape, dan sebagainya. Setiap jenis khamir

berbeda dalam kemampuannya untuk memecah karbohidrat menjadi senyawa-senyawa

yang lebih sederhana yang diinginkan dalam masing-masing proses fermentasi. Sifat-

sifat yang digunakan untuk karakterisasi dan klasifikasi khamir termasuk sifat-sifat

morfologinya, sifat-sifat pertumbuhannya di dalam medium cair maupun padat, bentuk

spora seksualnya, dan sifat-sifat fisiologinya termasuk pertumbuhannya pada berbagai

sumber karbon dan nitrogen.


1. Mahasiswa mampu mengetahui karakteristik khamir (sifat morfologi, pertumbuhan,

bentuk spora dan sifat-sifat fisiologinya

2. Mahasiswa mampu mengetahui peranan khamir dalam ilmu pangan



11

B. Bahan dan Alat

Kultur :

Ragi roti (4 macam merek)

Ragi tape (4 macam merek)

Candida utilis

Endomycopsis fibuliger

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae var. elipsoideus

Kultur khamir lainnya

Bahan Pangan

Tepung terigu

Nasi

Medium :

Per kelompok :

4 tabung sari buah jeruk steril + tabung durham

4 tabung Litmus milk

4 tabung molase + tabung durham

4 cawan agar PDA

Alat :

Gelas piala 200-250 mL

Tabung Erlenmeyer 100 mL dan 200-250 mL

Gelas ukur 250 mL yang diolesi minyak goreng

Pipet, tabung reaksi, cawan petri

Gelas obyek, gelas penutup

Mikroskop

C. Cara kerja

Persiapan kultur

Setiap kelompok memilih satu merk ragi roti, satu merek ragi tape, dan dua

macam kultur khamir. Untuk mengaktifkan ragi roti dan ragi tape, sebanyak 2 gram ragi

roti atau ragi tape dilarutkan ke dalam 30 mL air hangat di dalam tabung Erlenmeyer 100



12

mL, diaduk sampai larut dan didiamkan selama 10 menit. Untuk kultur ragi tape yang

digunakan adalah cairan bagian atas.

Uji Aktivitas Ragi Roti

Sebanyak 25 gram tepung terigu ditimbang dan dicampur dengan 25 mL

suspensi ragi roti di dalam gelas piala 200-250 mL dengan cara menambahkan tepung

sedikit demi sedikit. Adonan roti dibuat dengan cara menekan-nekan dengan sendok

atau batang gelas selama 5 menit. Adonan kemudian dimasukkan ke dalam gelas ukur

200-250 mL yang bagian tepinya telah dilapisi minyak goreng, dan ditekan ke bagian

bawah tabung. Volume awal adonan dicatat, kemudian adonan diinkubasi pada suhu

kamar selama 2 jam, dan diamati pertambahan volumenya setiap setengah jam.

Pertambahan volume dinyatakan dalam mL per 30 menit, dan dibandingkan aktivitas

keempat ragi roti yang diuji.

Uji Aktivitas Ragi Tape

Sebanyak 50 gram nasi ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer

200-250 mL, kemudian disterilisasi. Tambahkan sebanyak 50 mL suspensi ragi tape

dengan cara meneteskannya secara merata. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar

selama 2 hari, dan amati terbentuknya cairan dengan cara menuangkan cairan yang

terbentuk ke dalam gelas dan dilihat volumenya. Pengamatan lainnya adalah

pengukuran pH, total asam dan timbulnya bau asam/alkohol.

Untuk pengukuran total asam, sebanyak 10 mL cairan dipipet dan dipindahkan

ke dalam tabung Erlenmeyer 50 mL, dicampur dengan 10 mL air destilata dan ditambah

5 tetes larutan indikator fenolftalein 1%. Titrasi dilakukan menggunakan larutan NaOH

0.1 N sampai timbul warna merah muda. Total asam dihitung sebagai mL NaOH 0.1 N

yang diperlukan untuk sentrifugasi.

Pertumbuhan khamir

Sebanyak 0.1 mL kultur khamir dan suspensi ragi roti serta ragi tape dipipet dan

masing-masing dimasukkan ke dalam tabung yang berisi sari buah jeruk, Litmus milk dan

molase. Inkubasi dilakukan selama 2 hari pada suhu kamar. Amati pertumbuhan khamir

di dalam sari buah jeruk dan molase dengan melihat terbentuknya kekeruhan, endapan,



13

film pada permukaan, terbentuknya gas dan bau asam/alkohol. Pertumbuhan di dalam

Litmus milk diamati seperti tertera.

Morfologi khamir

Kultur khamir dan suspensi ragi roti serta ragi tape masing-masing digoreskan

pada agar cawan PDA dan di atas goresan tersebut ditutup dengan gelas penutup.

Inkubasi dilakukan pada suhu kamar selama 2 hari, dan diamati pembentukan

pseudomiselium pada pertumbuhan di sekeliling gelas penutup menggunakan

mikroskop dengan pemesaran 100x dan 400 kali.

Dari masing-masing kultur khamir dan suspensi ragi roti dan ragi tape dibuat

preparat basah dan pewarnaan biru metilen pada gelas obyek. Amati di bawah

mikroskop dengan pembesaran terendah sampai tertinggi terhadap ukuran dan bentuk

sel, serta cara repoduksi vegetatif misalnya pertunasan, pembelahan atau pembelahan

tunas.

Cara pewarnaan. Buatlah film tipis kultur khamir pada gelas objek. Biarkan

mengering, kemudian fiksasi di atas api perlahan-lahan. Teteskan larutan biru metilen

selama 2 menit, kemudian dicuci dengan air kran yang mengalir sampai tidak ada warna

yang luntur. Sisa air diserap dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop

dengan pembesaran terendah sampai tertinggi.

D. Hasil Pengamatan

Uji Aktivitas Ragi Roti

Nama Ragi Sebelum fermentasi Sesudah fermentasi

Uji Aktivitas Ragi Tape

Nama Ragi pH Total Asam Bau Asam/Alkohol



14

Pertumbuhan Khamir

Nama Khamir Sari buah jeruk Litmus milk Molase

Morfologi Khamir

Nama Khamir Gambar

E. Daftar Pustaka

Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc. Publishing

Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi.. UI Press Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB. Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley &

Klein



15

Pengujian Bakteri Enterik pada Air dan Minuman

A. Pendahuluan

Pencemaran bahan pangan sangat mudah terjadi. Air dan minuman sering

mengandung bakteri-bakteri enterik yang dicemari oleh kotoran-kotoran manusia

maupun hewan, baik kontaminasi langsung atau kontaminasi ulang. Beberapa di antara

bakteri enteric tersebut dapat menyebabkan penyakit menular, misalnya penyakit

disentri yang disebabkan oleh Shigella dysentriae, tifus atau paratifus yang disebabkan

oleh Salmonella typhi dan S.paratyphi atau penyakit kolera yang disebabkan oleh Vibrio

cholera. Disamping itu mungkin juga terdapat bakteri penyebab sakit perut seperti E.coli

enteropatogenik.

Intoksikasi dan infeksi dapat terjadi pada kejadian keracunan makanan.

Makanan yang tercemar oleh bahan pangan dapat menyebabkan keracunan dan infeksi

yang merugikan.

Pengujian bakteri enteric pada air dan minuman perlu dilakukan untuk

mengetahui kondisi sanitasi air/minuman tersebut. Tetapi uji lengkap dan cepat yang

dapat dilakukan untuk menguji bakteri-bakteri tersebut pada umumnya masih kompleks

dan memerlukan berbagai medium yang sulit dan harganya pun relatif mahal. Oleh

karena itu dalam praktikum kali ini, kita akan mecoba untuk menguji sederhana

terhadap bakteri enteric yang dapat dilakukan oleh laboratorium mikrobiologi. Uji yang

dilakukan mungkin kurang sensitif sehingga jika jumlah bakteri tersebut di dalam

minuman terlalu kecil mungkin sulit untuk mendeteksinya.


1. Mahasiswa mampu mengetahui karakteristik bakteri-bakteri patogen

2. Mahasiswa mampu mengetahui jenis-jenis bakteri patogen



16

B. Bahan dan Alat

Bahan :

Es cendol

Air aqua

Susu

Air kran

Air sumur

Kultur :

1. Escherichia coli

2. Salmonella sp

3. Staphylococcus aureus

4. Shigella dysentrieae

5. Vibrio parahaemolyticus

6. Clostridium perfringens

Media/bahan kimia

Per kelompok

12 tabung larutan pengencer

12 tabung Lactose broth + tabung durham

12 tabung Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

5 cawan Eosine methylene blue agar (EMBA)

5 cawan VRBA (Violet Red Bile Agar)

5 cawan XLD (Xylose lysine deoxycholate agar)

5 cawan SSA (Salmonella Shigella Agar)

5 cawan HEA (Hectoen Enteric Agar)

5 cawan BHI (Brain Heart Infusion Agar)

5 TSIA (Triple Sugar Iron Agar) atau LIA (lysine iron agar)

5 cawan thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS)

5 cawan simmons citrate agar

2 tabung alkaline peptone water (APW)

Larutan-larutan untuk pewarnaan Gram



17

Alat :

Pipet, tabung reaksi, cawan petri

Gelas obyek, gelas penutup

Mikroskop

Inkubator 37oC

C. Cara kerja

Persiapan Contoh

Setiap kelompok memilih satu contoh yang akan diuji, terdiri dari contoh air

kran, air kali, susu atau minuman jajanan. Terhadap air kran dibuat pengenceran sampai

10-2, sedangkan terhadap air kali, susu dan minuman jajanan dibuat sampai 10-4

Uji koliform

Uji penduga. Terhadap contoh air dan minuman dilakukan uji koliform

menggunakan 3 seri tabung/pengenceran dengan medium dan pengenceran sebagai

berikut :

Contoh Medium Jumlah Contoh

Air kran LB 10, 10-1, 10-2 mL

Air kali LB 10-1,10-2,10-3,10-4 mL

Susu BGLBB 10-1,10-2,10-3,10-4 mL

Minuman jajanan BGLBB 10-1,10-2,10-3,10-4 mL

Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 2 hari. Hitung jumlah positif dari

setiap pengenceran dan cocokkan koliform penduga/mL contoh.

Uji penguat. Pilihlan dua tabung positif dari uji penduga dan digoreskan masing-

masing pada agar cawan EMB, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam.

Pada agar EMB dapat dibedakan antara koloni fekal dan non fekal. Koliform fekal

berwarna gelap dengan sinar hijau metalik dan diameter kira-kira 0.5 -1.5 mm,

sedangkan koloni non-fekal berwarna merah muda dengan diameter 1.0 – 3.0 mm dan

bagian tengahnya berwarna gelap seperti mata ikan.

Identifikasi koliform. Pilihlah salah satu koloni fekal dan satu koloni nonfekal

dari masing-masing dibuat suspense di dalam 1-2 mL larutan pengencer. Sebanyak 0.1

mL dari masing-masing suspense diinokulasikan ke tiga macam medium yaitu Tryptone



18

Broth untuk uji indol, medium MRVP untk uji merah metil dan Voges Proskauer, serta

koser citrate agar untuk uji sitrat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 48 jam,

kecuali uji merah metil dimana inkubasi diperpanjang sampai 7 hari.

Uji Media Produk Akhir Reaksi Positif

Indol Tryptone Broth Indol Warna merah pada penambahan pereaksi Kovacs

Merah metil MR-VP Asam organik Warna merah pada penambahan merah metil

Voges Proskauer MR-VP Asetil-metil karbinol

Warna merah tua pada penambahan 5% alfa naftol dan 40% KOH

Citrat Koser citrate Alkali Timbulnya kekeruhan

E.coli biasanya menghasilkan uji IMViC ++-- sedangkan bakteri koliform lainnya

seperti Enterobacter aerogenes menghasilkan uji --++ atau --+-. Sebagai kontrol

goreskan kultur E.coli yang disediakan pada agar EMB dan lakukan uji IMViC terhadap

kultur tersebut.

Uji Salmonella-Shigella

Tahap enrichment dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 mL contoh

masing-masing ke dalam 9 mL Tetrahionate Broth atau Rappaport Vasidialis dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.

Uji penduga dilakukan dengan cara mengambil satu loop dari kultur enrichment

dan digoreskan pada agar SS. Setelah inkubasi selama 24-48 jam, dilihat adanya koloni

Salmonella/Shigella yaitu berupa koloni keruh atau bening dan tidak berwarna. Pada

media XLD agar berwarna merah jambu dengan atau tidak dengan bagian tengah

berwarna hitam. Pada BSA berupa koloni coklat,koloni abu-abu atau koloni hitam. Pada

HEA biasanya berupa koloni biru, biru kehijauan dengan atau tidak dengan bagian

tengah berwarna hitam atau koloni tipikal.

Uji penguat dilakukan dengan cara mengambil dua koloni terpisah yang

menunjukkan koloni tipikal Salmonella atau Shigella dan dinokulasikan pada agar miring

TSIA dengan cara membuat goresan pada permukaan agar miring, kemudian



19

menusukkannya pada bagian bawah agar dan ditusukkan pada agar tegak LIA. Inkubasi

agar TSI dan agar LI dilakuka pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Cocokkan dengan tabel

untuk melihat adanya bakteri Salmonella atau Shigella. Sebagai kontrol goreskan kultur

Salmonella pada agar SS/XLD/BSA/HEA dan diinokulasikan juga pada agar miring TSI dan

LIA untuk melihat reaksi yang terjadi.

Uji Vibrio cholera

Tahap enrichment dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 mL contoh

masing-masing ke dalam 9 mL APW dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.

Uji penduga dilakukan dengan menggoreskan satu loop dari kultur enrichment

pada agar TCBS dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni V.cholerae akan

berwarna kuning dengan permukaan datar, bagian tengahnya keruh dan bagian

pinggirnya bening.

Uji penguat dilakukan dengan cara mengambil dua koloni terpisah yang

menunjukkan koloni tipikal V.cholerae dan diinokulasikan pada agar miring TSI dan SIM

agar seperti pada uji Salmonella-Shigella. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 24-

48 jam, kemudian reaksi yang terbentuk dicocokkan dengan tabel TSI dan SIM. Sebagai

kontrol, goreskan kultur V.cholerae pada agar TCBS dan goreskan juga pada agar TSI dan

SIM untuk melihat reaksi yang terjadi.

Uji Streptococcus faecalis

Uji penduga dilakukan dengan cara menginolukasikan 1 mL contoh masing-

masing ke dalam tabung yang berisi Azide dextrose broth atau KF agar. Setelah inkubasi

pada suhu 37oC selama 24-48 jam, adanya pertumbuhan ditandai dengan timbulnya

kekeruhan.

Uji penguat dilakukan dengan cara menginokulasikan satu loop dari uji penduga

positif dan menginokulasikan ke dalam tabung berisi Ethyl-Violet Azide Dextrose Broth.

Setelah inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam, terjadinya pertumbuhan yang diikuti

dengan perubahan warna menunjukkan hasil uji penguat positif untuk streptokoki fekal.

Pengujian selanjutnya adalah dengan membuat pewarnaan Gram dari tabung

dengan hasil uji penguat positif dan dilihat adanya bakteri Gram positif streptokoki yang

membentuk rantai. Sebagai kontrol inokulasikan kultur S.faecalis pada Ethyl-Violet

Azide Dextrose Broth dan buatlah perwarnaan Gram tehadap kultur tersebut.



20

E. Daftar Pustaka



Klein



21

Mikroorganisme Perusak Pangan

A. Pendahuluan

Mikroorganisme yang dapat menyebabkan kerusakan atau kebusukan makanan

adalah mikroorganisme yang dapat memecah komponen-komponen yang ada di dalam

makanan menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana sehingga menimbulkan

perubahan cita rasa makanan. Uji yang sering dilakukan untuk menentukan sifat-sifat

mikroorganisme perusak makanan misalnya uji proteolitik, uji amilotlitik, uji lipolitik, uji

pektinolitik, uji pembentukan asam, uji pembentukan H2S dan sabagainya.

Mikroba-mikroba yang dapat menyebabkan kerusakan pada bahan pangan

tersebut mempunyai daya rusak yang tinggi karena dapat menyebabkan degradasi

komponen bahan pangan sehingga bersifat toksin dan berbahaya untuk kesehatan.

Bahan pangan yang telah terkontaminasi mikroba akan menjadi sumber kontaminasi

bagi bahan pangan yang masih bagus. Karena itu cara satu-satunya adalah bahan

pangan terkontaminasi harus segera dimusnahkan agar mikroba-mikroba tersebut tidak

berkembang biak dan menulari bahan pangan ainnya.

Salah satu kerja mikroorganisme perusak pangan adalah hidrolisis protein di

dalam makanan oleh mikroorganisme sering mengakibatkan timbulnya bau busuk dan

perubahan cita rasa makanan karena terbentuknya komponen-komponen penyebab bau

busuk seperti indol, skatol, ammonia, H2S dan sebagainya.


1. Mahasiswa mampu mengetahui bakteri perusak makanan

2. Mahasiswa mampu memilah bakteri yang menyebabkan kerusakan pangan



22

B. Bahan dan Alat

Bahan :

Contoh Makanan/Kultur

Perkelompok : 5 macam makanan olahan

2 macam kultur bakteri pembusuk

Medium/Bahan kimia :

Perkelompok (masing-masing 4 tabung/cawan per medium)

Medium untuk uji proteolitik :

-Skim milk agar (SMA), HCl 1%

-Nutrient Gelatin (NG)

-Litmus milk (LM)

Medium untuk uji amilolitik :

-Starch Agar (STA) dan larutan iodium (lugol)

Medium untuk uji pembentukan asam :

-Dextrose Tryptone Bromcresol Purple Agar (DTBPA)

-Media methyl-red – Voges proskauer (MR-VP), indicator merah metil, 5%

alfanaftol, 40% KOH

Medium untuk uji lipolitik :

-Plate count agar (PCA) + 1% minyak + indicator merah netral

Medium untuk uji pektinolitik :

-Polypectate Gel Medium (PGM), HCl 6-8 N

Medium untuk uji pembentukan H2S :

-Sulfite Agar (SA)

2 tabung larutan pengencer 45 mL

Alat :

-Timbangan

-Pipet, cawan petri, jarum ose, tabung reaksi

-inkubator

-penangas air suhu 50oC



23

C. Cara kerja

Persiapan Bahan :

Terhadap makanan yang akan diuji dilakukan pengenceran 1:10 dengan cara

menimbang 5 g atau memipet 5 mL bahan dan dimasukkan ke dalam larutan pengencer

45 mL, kemudian diaduk sampai merata. Kemudian didiamkan selama 5-10 menit

sambil sekali-kali diaduk untuk meratakan suspense

Cara Pengujian :

-Sebanyak satu mata ose kultur dan ekstrak makanan diambil dan digoreskan masing-

masing pada agar cawan SMA, STA, DTBPA, PCA 1% minyak dan PGM. Setiap akan

mengambil kultur dan menggoreskan pada medium yang berbeda, jarum ose harus

dibakar terlebih dahulu sampai membara.

-Sebanyak 0.1 mL kultur dan ekstrak makanan dipipet dan masing-masng dimasukkan ke

dalam tabung yang berisi medium NG, LM dan MR-VP dan sebanyak 1 mL masing-

masing dimasukkan ke dalam tabung yang berisi medium SA cair yang diambil dari

penangas 50oC , dikocok merata, kemudian didiamkan sampai membeku pada suhu

kamar.

-Semua cawan dan tabung diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 28-30oC, kecuali

medium NG dan medium MRVP yang dapat diperpanjang inkubasinya sampai satu

minggu jika masih menghasilkan uji negatif.

-Sifat-sifat mikroorganisme perusak makanan diamati sebagai berikut :

Medium SMA – koloni yang bersifat proteolitik membentuk warna bening di sekeliling

koloni, dan jika ditetesi dengan HCl 1 % akan tetap berwarna bening karena tidak terjadi

pengendapan protein.

-Medium NG – organisme yang dapat menghidrolisis gelatin mengakibatkan gelatin

menjadi cair, dan medium akan tetap cair meskipun dicelupkan di dalam air es.

-Medium LM – beberapa reaksi yang mungkin terjadi yaitu :

1. Pemisahan whei atau penggumpalan susu karena aktivitas enzim proteolitik

tanpa pembentukan asam sehingga warna litmus tetap biru

2. Pembentukan asam dari hasil pemecahan laktosa dengan atau penggumpalan

susu dimana terjadi reduksi litmus sehingga warnanya menjadi merah muda



24

3. Pembentukan gas ditandai dengan adanya gelembung-gelembung

-Medium STA – koloni yang tumbuh ditetesi dengan larutan iodium, dimana koloni

pemecah pati akan dikelilingi oleh areal berwarna kuning/coklat karena hidrolisis pati,

sedangkan areal di sekeliling koloni yang tidak memecah pati tetap berwarna biru

dengan adanya iodium

-Medium DTBPA – koloni mikroorganisme pembentuk asam akan dikelilingi oleh areal

berwarna kuning karena perubahan warna indicator ungu bromkresol pada pH rendah

-Medium MR-VP – sebanyak 1-2 mL pertumbuhan dari medium MR-VP dipindahkan ke

dalam tabung reaksi dan diberi 3 tetes larutan 5% alfa naftol dan 40% KOH.

Terbentuknya warna merah tua menunjukkan pembentukan asetil metil karbinol

(asetoin) oleh mikroorganisme. Sisa kultur MR-VP diinkubasi kembali sampai seminggu,

kemudian ditetesi indicator merah metil. Perubahan warna menjadi merah

menunjukkan terjadinya pembentukan asam.

-Medium PGM – koloni yang tidak bersifat pektinolitik (menghidrolisis pectin) akan

membentuk areal bening di sekeliling koloni jika ditetesi dengan larutan pengendap

polisakarida, misalnya larutan HCl 6-8 N

-Medium PCA + 1% minyak – koloni mikroorganisme pemecah lemak akan memecah

trigliserida menjadi gliserol dan asam-asam lemak sehingga menurunkan pH medium,

mengakibatkan timbulnya warna merah pada bagian bawah koloni karena perubahan

indikator merah netral pada pH rendah.

-Medium SA – pembentukan H2S ditandai dengan timbulnya koloni-koloni berwarna

hitam di dalam medium SA

D. Hasil Pengamatan

Media Kerusakan Foto



25

E. Daftar Pustaka

Lay. W. B., 1990. Analisis Mikroba di Laboratorium. IPB. Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc.

Publishing Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi.. UI Press Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB. Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley &

Klein



26

Uji Deteksi Salmonella-Shigella pada Bahan Pangan

A. Pendahuluan

Pangan (makanan) adalah bahan-bahan yang dimakan setiap hari untuk

memenuhi kebutuhan bagi pemeliharaan, pertumbuhan, kerja dan penggantian sel

tubuh yang rusak. Oleh karena itu pangan atau makanan sangat dibutuhkan oleh

manusia sebagai sumber zat gizi dan juga sumber energi. Namun pangan juga dapat

sebagai sarana penggangu kesehatan bagi manusia karena pangan dapat terkontaminasi

oleh cemaran fisik, kimia maupun mikrobia.

Bakteri pencemar makanan beragam dan memiliki karakteristik yang berbeda

satu sama lain, ada yang tahan asam atau basa, anaerob atau aerob, termofilik atau

psikrofilik dan masih banyak lagi. Beberapa contoh bakteri pencemar makanan adalah

Salmonella, Shigella, Vibrio dan yang lainnya yang bisa bersifat sebagai patogen melalui

bahan makanan.

Bakteri Salmonella ditemukan pertama kali oleh Theobald Smith pada 1885 saat

meneliti penyakit pencernaan pada babi. Dengan menggunakan mikroskop, Smith

menemukan sekelompok bakteri berbentuk batang yang menyebabkan kematian hewan

ternak tersebut. Nama Salmonella sendiri baru diberikan oleh Daniel Edward Salmon,

rekan Smith yang melakukan penelitian lebih lanjut terhadap jenis bakteri tersebut.

Salmon menyimpulkan bahwa bakteri salmonella termasuk dalam genus bakteri

enterobakteria gram-negatif, berbentuk batang, bisa bergerak bebas dan menghasilkan

hidrogen sulfida, serta menjadi penyebab timbulnya penyakit salmonellosis.

Untuk mengetahui keadaan hygienitas makanan dan minuman apakah

memenuhi syarat kesehatan atau tidak atau apakah makanan dan minuman tersebut

tercemar oleh salmonella atau tidak maka perlu dilakukan pengujian terhadap bahan

pangan yang akan kita analisa


1. Mahasiswa mampu mengetahui bahan pangan apa saja yang dapat tercemar oleh

Salmonella

2. Mahasiswa mampu mengetahui ciri-ciri Salmonella sebagai foodborne pathogens



27

B. Bahan dan Alat

Bahan : Alat :

Tetrahionate broth atau Blender

Rappaport vasidialis broth Neraca Analitis

XLD ( Xylose lysine deoxycholate agar) Bunsen

BSA (Bismuth Sulfite Agar) Mikropipet

HEA (Hektoen Enteric Agar) Tips

TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Erlenmeyer

LIA (lysine iron agar) Vortex

Sampel :

Gado-gado

Ketoprak

Rendang

Telur

Es krim

Daging dendeng

C. Prosedur

1. Timbang 10 gram sampel dan masukkan ke dalam larutan pengencer steril 90

mL. Kemudian lakukan tahap enrichment.

2. Tahap enrichment dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 mL contoh

masing-masing ke dalam 9 mL Tetrahionate Broth atau Rappaport Vasidialis dan


3. Uji penduga dilakukan dengan cara mengambil satu loop dari kultur

enrichment dan digoreskan pada agar SS. Setelah inkubasi selama 24-48 jam, dilihat

adanya koloni Salmonella/Shigella yaitu berupa koloni keruh atau bening dan tidak

berwarna. Pada media XLD agar berwarna merah jambu dengan atau tidak dengan

bagian tengah berwarna hitam. Pada BSA berupa koloni coklat,koloni abu-abu atau

koloni hitam. Pada HEA biasanya berupa koloni biru, biru kehijauan dengan atau tidak

dengan bagian tengah berwarna hitam atau koloni tipikal.

4. Uji penguat dilakukan dengan cara mengambil dua koloni terpisah yang

menunjukkan koloni tipikal Salmonella atau Shigella dan dinokulasikan pada agar miring



28

TSIA dengan cara membuat goresan pada permukaan agar miring, kemudian

menusukkannya pada bagian bawah agar dan ditusukkan pada agar tegak LIA. Inkubasi

agar TSI dan agar LI dilakukan pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Cocokkan dengan

tabel untuk melihat adanya bakteri Salmonella atau Shigella. Sebagai kontrol goreskan

kultur Salmonella pada agar SS/XLD/BSA/HEA dan diinokulasikan juga pada agar miring

TSI dan LIA untuk melihat reaksi yang terjadi.

5. Interpretasi Hasil untuk TSIA:

Media TSIA digunakan mengetahui kemampuan kuman untuk memfermentasikan

karbohidrat, juga dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat

apakah kuman memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai

gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman

memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S akan

bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+

membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap.

a. Hanya memfermentasi glukosa : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning

(bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa)

b. Memfermentasi semua karbohidrat : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning

(bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam)

c. Tidak memfermentasi semua karbohidrat : Bila pada dasar (butt) media berwarna

merah (bersifat basa) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa)

Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat dilihat dari

pecahnya dan terangkatnya agar.

D. Hasil Pengamatan

Jenis media Foto dan deskripsi Jumlah koloni (cfu/g)

Salmonella Shigella Agar

XLD

BSA

Hektoen Enteric Agar

TSIA

LIA



29

Pertanyaan :

1. Bahan (sampel) apakah yang positif salmonella?

2. Mengapa kita perlu melakukan tahap enrichment?

E. Daftar Pustaka

Cappucino dan Sherman. 2005. Microbiology, A Laboratory Manual. Pearson : New York.





30

Uji Vibrio pada Produk Hasil Perikanan

A. Pendahuluan

Perairan laut merupakan tempat hidup berbagai mikroorganisme dan

makroorganisme. Antara mikroorganisme dan makroorganisme akan terjadi interaksi

seperti bakteri akan bersimbiosis dengan organisme yang hidup diperairan seperti

plankton, zooplankton, ikan, udang, kerang. Pertumbuhan mikroorganisme dalam

makanan memegang peran penting dalam pembentukan senyawa yang memproduksi

bau tidak enak dan menyebabkan makanan menjadi tak layak makan. Beberapa

mikroorganisme yang mengkontaminasi makanan dapat menimbulkan bahaya bagi yang

mengkonsumsinya, kondisi tersebut dinamakan keracunan makanan.

Salah satu mikroba bakteri yang mengkontaminasi makanan (kerang, udang dan

hasil laut lainnya), menyebabkan keracunan makanan dan gastroenteritis (diare akut)

adalah bakteri Vibrio parahaemolyticus. Vibrio parahaemolyticus adalah bakteri halofilik

Gram negatif, bakteri ini muncul secara musiman. Biasanya, pada musim panas Vibrio

parahaemolyticus relatif mudah dideteksi pada air laut, sedimen, plankton, ikan,

krustasea dan moluska yang merupakan tempat hidupnya di ekosistem. Mereka

terkonsentrasi dalam saluran pencernaan moluska, seperti kerang, tiram dan mussel

yang mendapatkan makanannya dengan cara mengambil dan menyaring air laut.

Prinsip pengujian ini adalah contoh yang diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada

media pengkayaan dan dideteksi dengan menumbuhkan pada media agar selektif.

Koloni yang diduga V. parahaemolyticus pada media agar selektif diisolasi dan

dikonfirmasi melalui uji biokimia untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri V.

parahaemolyticus. Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis dan lakukan

pengujian di ruangan atau laminar air flow yang terkontrol. Media TCBS agar yang

digunakan dalam keadaan kering. Prosedur pengujian terdiri dari beberapa tahap yaitu

persiapan contoh, pengkayaan, isolasi Vibrio parahaemolyticus, pemurnian, uji biokimia

pendahuluan, dan uji biokimia lanjutan

II. Tujuan Praktikum

1. Mahasiswa mampu mengisolasi Vibrio spp pada bahan pangan hasil perikanan

2. Mahasiswa mampu mengidentifikasi Vibrio spp yang telah diisolasi



31

B. Bahan dan Alat

Bahan : Alat :

Ikan Cawan petri

Udang Tabung reaksi

Cumi Bunsen

5 tabung APW (alkaline peptone water) Inkubator

TCBS (thiosulfate citrate bile salt-sucrose)

TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

SIM (Sulfite Indole Motility)

C. Prosedur Kerja

Uji Vibrio cholera

1. Timbang media TCBS sesuai dengan ukuran yang akan digunakan, buat media TCBS

dengan tidak perlu diautoklaf tetapi tetap aseptis dan hygiene. Kemudian larutkan

dengan hotplate atau waterbath sampai terlarut sempurna, media siap digunakan

2. Tahap enrichment dilakukan dengan cara menginokulasikan 10 gram sampel pada 90

mL APW dan kemudian pipet 1 mL contoh masing-masing ke dalam 9 mL APW dan


3. Uji penduga dilakukan dengan menggoreskan satu loop dari kultur enrichment pada

agar TCBS dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni V.cholerae akan

berwarna kuning dengan permukaan datar, bagian tengahnya keruh dan bagian

pinggirnya bening.

4. Uji penguat dilakukan dengan cara mengambil dua koloni terpisah yang menunjukkan

koloni tipikal V.cholerae dan diinokulasikan pada agar miring TSI dan SIM agar seperti

pada uji Salmonella-Shigella. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 24-48 jam,

kemudian reaksi yang terbentuk dicocokkan dengan tabel TSI dan SIM. Sebagai kontrol,

goreskan kultur V.cholerae pada agar TCBS dan goreskan juga pada agar TSI dan SIM

untuk melihat reaksi yang terjadi.



32

D. Hasil Pengamatan

Jenis Media

Keterangan

TCBS TSIA/SIM

Warna koloni yang hidup di

media

Foto dan deskripsi keterangan

E. Daftar Pustaka

Cappucino dan Sherman. 2005. Microbiology, A Laboratory Manual. Pearson : New York.

Moss MO dan Adams MR. 1995. Food Microbiology. Royal Society of Chemistry : Cambridge British





33

Aktivitas Antimikroba

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Antimikroba adalah zat penghambat pertumbuhan mikroorganisme bahkan bisa

mematikan mikroorganisme. Antimikroba berdasarkan sifat toksisitasnya ada yang

bersifat fungistatik atau fungisidal, bakteristatik atau bakterisidal.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima kelompok,

yaitu:

1. Yang mengganggu metabolisme sel mikroba.

2. Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba.

3. Yang mengganggu permeabilitas membran sel mikroba.

4. Yang menghambat sintesis protein sel mikroba.

5. Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel

Untuk membandingkan kekuatan desinfektan dalam menghambat pertumbuhan

bakteri dapat digunakan cakram kertas. Pada cara cakram kertas ini didapat hasil

dengan diameter tertentu dibasahi dengan desinfektan, kemudian diletakkan pada

lempengan agar yang tetap diinokulasi. Jika desinfektan menghambat pertumbuhan

bakteri maka akan terlihat daerah jernih sekeliling cakram kertas. Luas daerah terang ini

menjadi ukuran kekuatan daya kerja desinfektan.

Antimikroba bisa juga berasal dari bahan kimia maupun dari bahan-bahan alami,

keduanya dapat dibedakan dari bahan asal antimikroba tersebut. Antimikrob dari bahan

kimia misalnya fenol, alkohol, halogen, logam-logam berat, senyawa amonium kuartener

dan aldehid. Antimikroba fenol dan turunannya seperti cresols, xylenols sering

digunakan untuk penggunaan di laboratorium maupun sterilisasi alat bedah . Berbeda

sedikit untuk antimikroba alami berasal dari bahan-bahan alami yang diekstrak di

destilasi seperti minyak cengkeh, minyak pala, minyak kecombrang dan lain-lain.

Penggunaan fenol sudah lama dilakukan untuk mendesinfeksi peralatan bedah,

sampai sekarang pun fenol digunakan sebagai larutan baku penentu keampuhan

desinfektan. Daya kerja antimikrobial bahan kimia seringkali disetarakan dengan fenol.

Bahan kimia yang digunakan dalam pengobatan (kemoterapeutik) menjadi pilihan bila

dapat mematikan dan bukan hanya menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Bahan

antimikrobial dapat bersifat bakteriostatik pada konsentrasi rendah, namun bersifat

bakterisidal pada konsentrasi tinggi.



34


1. Mahasiswa mampu mengetahui antimikroba sebagai pernghambat pertumbuhan mikroorganisme 2. Mahasiswa mampu mengetahui antimikroba alami atau sintetis dalam menghambat mikroorganisme

B. Bahan dan Alat

Bahan : Alat:

Media Nutrient Agar Cawan petri

Fenol Lampu spiritus

Alkohol Cakram bulat

Minyak cengkeh Jangka sorong

Natrium hipoklorit Pinset

Larutan pengencer Tip

Biakan kultur bakteri patogen

Biakan kultur khamir perusak pangan

Biakan kultur kapang perusak pangan

C. Prosedur kerja

Metode Paper Disc

1. Ambil biakan murni bakteri 1 mL encerkan dalam tabung pengencer 101

2. Kemudian goyang-goyang tabung pengencer sebanyak 8-10 kali

3. Ambil 1 mL, inokulasi ke dalam cawan petri tambahkan Nutrien agar, tunggu sampai

padat

4. Sementara itu siapkan larutan-larutan antimikroba pada beaker glass kecil yang telah

diketahui konsentrasinya

5. Ambil cakram kertas, celupkan dalam larutan antimikroba sampai basah semua

6. Tempelkan dalam media agar yang mengeras tadi

7. Inkubasikan selama 24-48 jam pada suhu 37oC

8. Amati hasilnya



35

Metode Agar Well Diffusion

1. Ambil 1 mL biakan bakteri, masukkan ke dalam cawan petri

2. Masukkan NA kemudian diamkan sampai mengeras

3. Lubangi secara steril NA tadi menjadi beberapa bagian dengan pelubang ukuran 6

mm

4. Kemudian dengan menggunakan mikropipet ambil 100 mikroliter antimikroba dan

masukkan ke dalam lubang tadi

5. Inkubasi dalam inkubator selama 24-48 jam pada suhu 37oC dengan tidak membalik

cawan petri

D. Hasil Pengamatan

Jenis Bakteri Jenis Antimikroba Zona Penghambatan

Pertanyaan :

1. Diantara antimikroba yang anda gunakan manakah yang paling memiliki daya

penghambatan paling sedikit? Dan manakah yang paling besar?

2. Antara metode paper disc dan well diffusion manakah yang paling baik representasi

hasilnya?

E. Daftar Pustaka

Lay. W. B., 1990. Analisis Mikroba di Laboratorium. IPB. Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc.

Publishing Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi.. UI Press Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB. Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley &

Klein



36

Germinasi dan Ketahanan Panas Endospora Bakteri

A. Pendahuluan

Latar Belakang

Endospora terbentuk ketika bakteri dalam keadaan tidak menguntungkan atau

dalam keadaan tidak terpenuhinya kebutuhan dalam pertumbuhan. Endospora bakteri

yang telah mengalami proses aktivasi, misalnya jika mengalami kejutan panas, akan

melakukan proses germinasi jika ditempatkan pada lingkungan dan substrat yang sesuai.

Kebutuhan akan germinasi bervariasi tergantung dari jenis dan spesies bakteri, dan

komponen kimia yang dibutuhkan untuk proses germinasi disebut germinan,

diantaranya beberapa asam amino, gula, enzim dan sebagainya. Sebaliknya beberapa

komponen yang mungkin terdapat di dalam makanan juga bersifat menghambat

germinasi, diantaranya garam dan nitrit.

Garam NaCl dan Na-nitrit sering digunakan dalam kuring daging untuk

membentuk cita rasa dan mempertahankan warna merah daging. Tetapi kedua bahan

tambahan tersebut juga diduga mempunyai pengaruh terhadap proses germinasi spora

bakteri.

Endospora bakteri lebih tahan panas dibandingkan dengan sel vegetatifnya, dan

juga lebih tahan panas daripada spora kapang dan khamir. Ketahanan panas spora

bakteri sangat bervariasi, dan beberapa spora mungkin tidak mati atau hanya

mengalami kerusakan subletal selama pemanasan. Bagi spora-spora yang mengalami

kerusakan subletal ini dibutuhkan media yang optimum untuk dapat melakukan proses

germinasi. Jika di dalam medium pertumbuhan terdapat komponen-komponen

penghambat, kemungkinan spora tidak dapat melakukan proses germinasi walaupun

spora yang normal mungkin dapat melakukan di dalam media tersebut.


1. Mahasiswa mampu mengetahui bakteri yang memiliki endospora

2. Mahasiswa mampu mengetahui bakteri yang dapat bertahan pada panas



37

B. Bahan dan Alat

Bahan :

Spora bakteri

Setiap kelompok memilih satu suspensi spora bakteri, yaitu Bacillus subtilis, B.cereus,

B.licheniformis, B.polymyxa, B.macerans atau B.megaterium.

Media / Bahan kimia

Agar cawan (masing-masing 4 cawan per kelompok)

a. Nutrient Agar (NA)

b. NA + 5 % NaCl

c. NA + 300 ppm NaNO2

d. NA + 5% NaCl + 300 ppm NaNO2

Agar cair (masing-masing 5 tabung per kelompok) :

a. Nutrient broth (NB)

b. NB + asam tartarat (pH 5.0)

c. NB + 3% NaCl

Larutan pengencer 9 ml ( 3 tabung per kelompok)

Larutan pewarna spora :

Larutan malachite green

Larutan safranin

Alat :

-Timbangan

-Pipet, cawan petri, jarum ose, tabung reaksi

-inkubator

-penangas air suhu 60oC dan 80oC



38

C. Cara kerja

Ketahanan Panas Spora Bakteri

Sebanyak 0.1 mL suspensi spora awal dipipet dan dimasukkan masing-masing ke

dalam tabung yang berisi 3 macam medium yang berbeda. Untuk setiap medium

digunakan 5 buah tabung, dan medium yang digunakan adalah:

a. NB

b. NB + asam tartarat (pH 5.0)

c. NB + 3% NaCl

Sebanyak 4 tabung dari setiap medium dipanaskan di dalam penangas air

dengan suhu 80oC, dan diangkat setelah waktu pemanasan 5, 10, 15 dan 20 menit (satu

tabung yang tidak dipanaskan dari masing-masing medium digunakan sebagai kontrol).

Semua tabung diinkubasikan pada suhu 28-30oC selama 2-3 hari, dan diamati

pertumbuhan bakteri yang ditanda dengan timbulnya kekeruhan. Tingkat pertumbuhan

dinyatakan secara relatif dengan tanda (- = tidak tumbuh, +, ++ atau +++ ). Data dari

setiap kelompok dikumpulkan dan ditabulasikan sehingga dapat dilihat pengaruh spesies

bakteri dan kondisi medium pemanasan terhadap panas spora.

Aktivasi spora bakteri

Suspensi awal spora bakteri diberi kejutan panas (heat shock) pada suhu 60oC selama 10

menit, kemudian dipipet 1 mL dibuat pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 menggunakan

larutan pengencer 9 mL

Germinasi Endospora Bakteri

Dari suspensi yang dipanaskan tadi dan hasil pengenceran masing-masing dipipet

sebanyak 0.1 mL dan dibuat pemupukan pada empat macam medium. Setiap seri

pengenceran masing-masing dipupuk ke dalam medium yang terdiri dari :

a. NA

b. NA + 5% NaCl

c. NA + 300 ppm NaNO2

d. NA + 5% NaCl + 300 ppm NaNO2



39

Dengan menggunakan batang gelas melengkung (hockey stick) yang telah

dicelupkan ke dalam alkohol, dipijarkan dan kemudian didinginkan, suspensi yang telah

diteteskan pada bagian atas agar cawan diratakan ke seluruh permukaan.

Semua cawan diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 28-30oC selama 2-3 hari.

Jumlah koloni yang terbentuk dihitung dan dinyatakan dalam jumlah koloni/mL

suspensi. Data dari setiap kelompok dikumpulkan dan disusun dalam suatu tabel

sehingga terlihat data yang diperoleh untuk setiap spesies spora yang diuji. Diamati

pengaruh spesies bakteri, penambahan NaCl dan Na-nitrit terhadap germinasi spora dan

pertumbuhan sel bakteri.

Pewarnaan Endospora

Contoh yang akan dilakukan pewarnaan spora adalah :

a. Suspensi spora awal

b. Contoh dari Nutrient Broth yang menunjukkan uji positif (setelah inkubasi)

Dari suspensi bakteri dibuat film tipis pada gelas obyek, kemudian dibiarkan

mengering di udara dan difiksasi di atas api secara perlahan-lahan. Ditetesi dengan

pewarna spora yaitu hijau malachit dan dibiarkan selama 20 menit di udara terbuka

(tanpa pemanasan), atau selama 5 menit di atas penangas air. Setiap kali pewarna

menjadi kering, ditetesi lagi pewarna yang baru. Kemudian pewarna dicuci secara hati-

hati menggunakan air selama 20-30 detik, dan ditetesi dengan safranin selama 30 detik.

Setelah dibilas dengan air, kemudian dikeringkan dengan kertas serap.

Preparat kemudian diperiksa di bawah mikroskop menggunakan lensa minyak

imersi dengan pembesaran sekitar 1000 kali. Diamati perbedaan antara sel vegetatif

dengan spora, bentuk dan besar spora, serta letak spora di dalam sel.

Catatan : kerjakan bagian Ketahanan Panas Spora Bakteri dahulu, pipet suspensi yang

belum dipanaskan ke dalam media broth, baru kemudian suspense awal tersebut

digunakan untuk Aktivasi Spora Bakteri dan Germinasi Endospora Bakteri.



40

D. Hasil Pengamatan

D.1. Germinasi Endospora Bakteri

NA NA + 5% NaCl NA + 300 ppm NaNO2

NA + 5% NaCl + 300 ppm NaNO2

Bakteri

Bakteri

D.2. Ketahanan Panas Spora Bakteri

NB NB + asam tartarat

NB + 3% NaCl

Bakteri

Bakteri

D.3. Pewarnaan Endospora

Gambarkan dan beri keterangan dari pewarnaan endospora, diamati perbedaan antara

sel vegetatif dengan spora, bentuk dan besar spora, serta letak spora di dalam sel.

Pertanyaan :

1. Garam NaCl atau Na-nitrit berpengaruh dalam germinasi spora, bagaimana kah

mekanisme kerja garam dalam germinasi spora tersebut?

E. Daftar Pustaka



Klein



41

Pengaruh Pemanasan Subletal dan Penyembuhan Terhadap Pertumbuhan Bakteri

A. Pendahuluan

Jumlah sel-sel bakteri yang mengalami kerusakan subletal karena perlakuan

pemanasan dan jumlah yang telah mengalami proses penyembuhan dapat dihitung

menggunakan dua macam media pemupukan, yaitu :

1. Medium non-selektif, yaitu medium optimal dimana sel-sel yang normal (tidak rusak)

maupun sel-sel yang mengalami kerusakan subletal dapat tumbuh dan membentuk

koloni.

2. Medium selektif, yaitu medium dimana hanya sel-sel yang normal dapat tumbuh,

sedangkan sel-sel yang mengalami kerusakan subletal tidak tumbuh.

Dalam pengolahan pangan, sel-sel yang mengalami kerusakan subletal perlu

dideteksi karena sel-sel yang terluka tersebut dapat sembuh kembali jika kondisinya

memungkinkan sehingga dapat berkembang biak seperti halnya sel-sel normal. Sebagai

medium penyembuhan digunakan medium yang optimal yang tidak mengandung

senyawa-senyawa selektif.

Di dalam pelaksanaan praktikum kali ini menggunakan medium penyembuhan

TSB (Trypticase Soy Broth) dan medium pemupukan TSA (Trypticase Soy Agar) untuk

mendeteksi sel-sel Staphylococcus aureus yang mengalami kerusakan subletal oleh

pemanasan. Medium TSAS yaitu medium TSA yang mengandung 7% NaCl digunakan

untuk menghitung jumlah sel-sel S.aureus yang normal karena sel-sel yang rusak tidak

dapat tumbuh oleh pengaruh stress dari NaCl.


1. Mahasiswa mampu mengetahui pengaruh pemanasan subletal

2. Mahasiswa mampu mengetahui bagaimana penyembuhan pertumbuhan pada bakteri

yang mengalami subletal



42

B. Bahan dan Alat

Kultur :

Staphylococcus aureus yang berumur 24 jam (37oC) di dalam medium TSB.

Medium/Larutan :

90 mL larutan buffer fosfat 0.1 M, pH 7.2

90 mL TSB

90 mL TSBS (TSB + 7% NaCl)

60 buah agar cawan TSA

60 buah agar cawan TSAS (TSA + 7% NaCl)

45 tabung larutan pengencer 9 mL

Alat :

Pipet 10 mL dan 1 mL, cawan petri, tabung reaksi

Batang gelas melengkung (hockey stick)

Penangas air 37oC dan 55oC

C. Cara kerja

Sebanyak 10 mL kultur dimasukkan ke dalam 90 mL larutan buffer fosfat yang

telah dipanaskan sebelumnya sampai suhu 55oC, kemudian dipanaskan di dalam

penangas air pada suhu 55oC selama 10 menit. Dengan pemanasan ini diharapkan

sebagian sel-sel S.aureus akan mengalami kerusakan subletal, sedangkan sebagian tetap

normal.

Kemudian sebanyak 10 mL kultur yang telah dipanaskan dimasukkan masing-

masing ke dalam dua macam medium, yaitu :

1. 90 mL TSB sebagai medium normal untuk penyembuhan sel

2. 90 mL TSBS sebagai medium stress karena mengandung zat penghambat

penyembuhan yaitu garam

Setelah dikocok dengan baik sehingga diperoleh suspensi yang homogen, kedua

tabung berisi medium dan kultur tersebut dimasukkan ke dalam penangas air dengan

suhu 37oC. Dengan interval waktu penyembuhan 0 (tanpa inkubasi), 30, 60, 90 dan 120

menit, sebanyak 1 mL kultur dari TSB dan TSBS masing-masing diambil dan diencerkan

sebanyak 10-1 sampai 10-5. Kemudian sebanyak 0.1 mL dari pengenceran 10-3, 10-4 dan

10-5 masing-masing dihidupkan pada agar cawan TSAS (untuk menghitung sel-sel yang



43

normal). Kultur di atas agar cawan diratakan menggunakan batang gelas melengkung

yang telah dicelupkan alkohol, dipijarkan dan didinginkan. Semua cawan diinkubasikan

dengan posisi terbalik pada suhu 37oC selama 48 jam. Karena data yang dikumpulkan

merupakan data kelas, maka dibuat pembagian pekerjaan per kelompok sebagai berikut:

Kelompok Medium Penyembuhan Medium Pemupukan

I TSB TSA

II TSB TSAS

III TSBS TSA

IV TSBS TSAS

D. Hasil Pengamatan

Semua data yang diperoleh dihitung, ditabulasi dan dibuat kurva yang

menunjukkan hubungan antara waktu penyembuhan dengan log jumlah sel pada empat

macam kombinasi medium penyembuhan dan medium pemupukan, yaitu :

1. Kultur TSB pada TSA

2. Kultur TSB pada TSAS

3. Kultur TSBS pada TSA

4. Kultur TSBS pada TSAS

E. Pertanyaan :

1. Jelaskan pengaruh media penyembuhan dan media pemupukan terhadap proses

penyembuhan dan jumlah sel bakteri! Media yang mana yang paling sedikit

pertumbuhannya? Dan mana yang paling tinggi pertumbuhannya?

F. Daftar Pustaka Madigan, Martinko, Stahl dan Clark. 2012. Biology of Microorganisms. Pearson Inc.

Publishing Pelczar, M.E dan Chan, E.C.S. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB. Willey, J.M., Sherwood L.M., Woolverton, C.J., 2008. Microbiology. Prescott, Harley &

Klein

Documents

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Pangan