(polymerase chain reaction reakcija lanane polimerizacije)

Osnovni principi:

Fenomeni topljenja (denaturacije) DNKRaskidanje vodoninih veza i prelazak sekundarne u primarnu strukturu na taki topljenjaSnienjem temperature dolazi do ponovnog uspostavljanja vodoninih veza izmedju parova baza

Komplementarnost azotnih baza

Koraci tokom analize:Ekstrakcija i preiavanje DNK iz elijeTestiriranje istoe izolovane DNKPCR reakcijaUtvrdjivanje broja i veliine dobijenih fragmenata

Ekstrakcija DNKZavisno od vrste organizma i lokalizacije u okviru istog4 principijelna koraka:1. liziranje elije (mehaniki,enzimski, ultrazvukom, ..) i oslobadjanje elijskog sadraja2. Uklanjanje membranskih lipida (primena pufera sa dodatkom detergenata)3.Otklanjanje proteina ( dejstvom proteinaza, uz dodatak helirajuih agenasa)4. precipitacija DNK (najee nekim alkoholom)

Medjutim,...

Danas se sve ee koriste kitovi koji sadre tzv. spin kolone i ve pripremljene pufere za ekstrakcijuSpin kolone napunjene su modifikovanim silika gelovima i funkcioniu po principu apsorpcione i jonoizmenjivake hromatografijeistoa izolovane DNK utvrdjuje se spektrofotometrijski- odnos A260/A280 treba da bude izmedju 1,7 i 1,9 Kvantifikacija izolovane DNK- na osnovu merenja apsorbance referentnog rastvora i uzorka na 260 nm

Princip PCR metode:Za PCR reakciju neophodno je: prajmeri specifini za krajeve eljene sekvence, matrica, komplementarni nukleotidi, Taq polimeraza, ligaza, pufer (pH 8,3-8,8), MgCl2Koraci:1.Denaturacija DNK (96 C)2.Anniling (hibridizacija prajmera i matrice) (55 C)3. Elongacija (72 C) Prajmeri: 15-30 nukleotida Broj ciklusa: 25-40Eksponencijalno umnoavanje target sekvence

Aparatura

Utvrdjivanje veliine dobijenih produkata:Agarozna elektoforezaPrimena molekulskih markeraBojenje etidijum bromidom- interkalacija u dvostruku spiralu DNK (- interakcije)Pod UV svetlou-mesta na kojima se EtBr vezao za molekul DNK, uoavaju se kao obojene trake na neobojenoj pozadini