Medicinski fakultet Sveučilišta u ZagrebuMedicinski fakultet Sveučilišta u ZagrebuZavod za patologijuZavod za patologiju

Laboratorij za molekularnu patologijuLaboratorij za molekularnu patologiju

MOLEKULARNA MOLEKULARNA PATOLOGIJAPATOLOGIJA

Marija Mišić, dipl. ing. biol.

molekularne metode

imunohistokemijska analiza

Dijagnostička obrada u patologiji: histološka analiza

• Molekularna patologija služi utvrđivanju

promjena na biološki važnim molekulama

i staničnim strukturama radi utvrđivanja

uzroka bolesti, odnosno prognoziranja

njenog tijeka i ishoda.

• Mol. patologija omogućuje: razumijevanje temelja i uzroka bolesti postavljenje dijagnoza povezivanje specifičnih molekula s

prognozom bolesti upoznavanje mol. mehanizama bolesti i

ciljano liječenje

Materijali za dijagnostičku obradu Dijagnostika se prakticira na nukleinskim kiselinama (DNA i RNA) i proteinima. Uzorci na kojima se vrši izolacija NK i proteina mogu biti: svježi (krv, k. srž, brisevi...) konzervirani (blokovi tkiva u parafinu, tekućem dušiku...)

Molekularne metode u laboratorijskoj

dijagnostici:• izolacija NK i proteina

• PCR (Polymerase Chain Reaction), lančana reakcija polimerazom

• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), analiza fragmenata dobivenih restrikcijskim cijepanjem

• elektroforeza• hibridizacija (FISH, CISH, SB, NB...)• sekvenciranje• protočna citometrija

. . .

Izolacija materijala

Svježe uzorke potrebno je podvrgnuti što hitnijoj izolaciji dok za konzervirane uzorke nije nužna takva hitnost.

Izolacija NK je postupak koji se sastoji od tri

važna koraka:• liza stanica (mehanički, fizikalno i kemijski)• inaktivacija st. nukleaza• odvajanje NK od staničnog otpada

Lančana Reakcija Polimerazom

(PCR - Polymerase Chain Reaction)

• PCR je tehnika in vitro replikacije (umnožavanja) ciljanog dijela molekule DNA (1983., Kary B. Mullis).

• Djelomično oponašajući stanične mehanizme umnožavanja DNA, ova metoda omogućuje relativno brzo i ekonomski isplativo umnožavanje DNA iz vrlo malih količina početnog materijala.

Za replikaciju u uvjetima in vitro

potrebno je imati:

• Uzorak DNA / RNA - kalup• Početnice • Magnezijevi ioni• dNTP-ovi• Pufer• DNA polimeraza

Uzorak DNA / RNA - kalup

• Čistoća uzorka je presudna za efikasnost umnožavanja (nečistoće mogu sadržavati inhibitore polimeraze).

• DNA i RNA kompetiraju za Mg2+ ione (kontaminacija DNA uzoraka RNA materijalom i obratno smanjuje efikasnost umnožavanja).

• Bitna je optimalna koncentracija (previsoka koncentracija uzorka povećava postotak nespecifičnog vezanja; preniska koncentracija smanjuje prinos produkta)

• Koncentracije i čistoća uzorka se određuje spektrofotometrijski.

Početnice

Početnice su lanci koji služe kao početna točka DNA sinteze (vezuju se na komplementarne lance).

Mg2+ ioni

• formiraju topljive komplekse između

dNTP-ova i DNA uzorka - kalupa • stimuliraju aktivnost polimeraze • stabiliziraju vezanje početnica• u previsokim koncentracijama povećavaju

postotak nespecifičnog vezanja početnica; preniske koncentracije smanjuju prinos produkta

dNTP – deoksiribonukleotid-trifosfat

dATP - deoksiadenozin-5’-trifosfatdGTP - deoksigvanozin-5’-trifosfatdTTP - deoksitimidin-5’-trifosfatdCTP- deoksicitidin-5’-trifosfat

Pufer

• deionizirana sterilna voda (Pro injectione) i dodaci (Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4)

• Odgovarajući pH

DNA polimeraza

• enzim odgovoran za sintezu DNA

• previsoka koncentracija dovodi do nespecifičnog vezanja

• preniska koncentracija smanjuje efikasnost umnožavanja

• polimeraza mora biti termostabilna na visokim temperaturama (Taq polimeraza dobiva se izolacijom iz termofilne bakterije Thermus aquaticus).

• U stanici se replikacija odvija uz pomoć

različitih enzima dok se kod PCR reakcije sve izvodi jednim enzimom - DNA polimerazom.

• Reakcija se izvodi u PCR uređaju koji može brzo mijenjati temperaturu u željenom ritmu.

• Tijekom PCR-a visoka temperatura se koristi za denaturaciju DNA, a umjesto malih RNA koje definiraju regiju koja se želi umnožiti koriste se sintetske početnice.

PCR ciklus se sastoji od tri faze:

1. Denaturacija DNA

2. Vezanje (hibridizacija) početnica na lance DNA

3. Produživanje (ekstenzija) lanaca DNA

Ciklusi se ponavljaju 30-40 puta.

Vrste Lančanih Reakcija Polimerazom

Klasična DNA lančana reakcija polimerazom

Reverse Transcription PCR

(RT-PCR)RNA se prevodi u cDNA i amplificira.

Koristi se pri: kontroli ekspresije gena utvrđivanje transkripcijskih START i STOP

regija na genomskoj DNA utvrđivanje položaja introna u genima

eukariotskih stanica

Quantitative real-time PCR (QRT-PCR)Mjeri se količina nastalih amplikona nakon

svakog ciklusa PCR reakcije (mjeri se

intenzitet fluorescencije specifično vezanih

fluorokroma u nekom vremenu).

Koristi se pri: utvrđivanju razlika u količini ekspresije različitih gena utvrđivanju razlika u

količini ekspresije jednog

te istog gena kroz dulji

vremenski period

(praćenje terapije)

Hot start PCR Proces započinje tek kada se dostigne

određena temperatura tako da je postotak

nespecifičnog vezanja početnica znatno

smanjen.

Blokada polimeraze pri nižim temeraturama

postiže se ručno, fizikalno ili kemijski.

Multiplex PCRU istoj reakcijskoj smjesi nalazi se više

različitih parova početnica te se istovremeno

amplificira nekoliko različito dugačkih

produkata.

. . .

Primjena lančane reakcije polimerazom u patološkoj dijagnostici:

• detekcija virusa i bakterija • detekcija specifičnih mutacija• kvalitativno i kvantitativno praćenje

ekspresije gena

. . .

Analiza restrikcijskih fragmenata (RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

• Restrikcijski fragmenti su enzimi izolirani iz bakterija koji prepoznaju točno određeni slijed nukleotida od 4 do 8 baza u dvolančanoj DNA i kidaju oba lanca dvostruke uzvojnice.

• Većina mjesta prepoznavanja ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindromi).   

Nomenklatura restrikcijskih endonukleaza:EcoRI: Escherichia coli RYI3I – prva izolirana RE

Restrikcija

Po završenoj restrikciji, dobiveni DNA fragmenti analiziraju se gel elektroforezom.

Detekcija točkaste mutacije

Elektroforeza

• Elektroforeza je metoda razdvajanja nabijenih molekula koja se temelji na njihovom propuštanju prostorom u kojemu vlada razlika potencijala (prostor između dvije elektrode).

• Molekule će se u električnom polju kretati u ovisnosti o jakosti električnog polja, naboju, masi i obliku molekule koja migrira te o viskoznosti medija.

• Najčešće korišteni mediji za elektroforezu su agaroza i poliakrilamid.

Gel elektroforeza

Uređaj za horizontalnu gel elektroforezu

Agarozni gel obojan

etidij-bromidom

Elektroforeza nukleinskih kiselina:

• Nukleinske kiseline su negativno nabijene: putuju prema pozitivnoj elektrodi.

• Manji fragmenti putuju brže kroz gel od većih fragmenata.

G6 EWS/FLI-1

Metode hibridizacije

• U metodama hibridizacije iskorišten je osnovni princip sparivanja komplementarnih lanaca DNA ili RNA.

• Određuje se položaj (lokalizacija) DNA ili RNA slijeda direktno u kromosomima, interfaznoj jezgri, organelima i dr.

• Svrha: identifikacija numeričkih i strukturnih aberacija kromosoma.

• Područje: klinička citogenetika, citogenetika tumora (mikrodelecije i mikroduplikacije) i dr.

• Do danas je razvijen veći broj različitih

metoda koje koriste princip hibridizacije: Flourescencijska in situ hibridizacija - FISH Kromogena in situ hibridizacija - CISH Southern blotting Northern blotting

. . .

Flourescencijska in situ hibridizacija(FISH – Fluorescence In Situ Hybridization)

• Hibridizacijska metoda u kojoj se upotrebljava specifična DNA ili RNA proba za traženi gen koja je obilježena obilježena fluoroforom - molekulom koja flourescira.

• Najviše se koristi u dijagnostici leukemija i limfoma (otkrivanje amplifikacije gena, kromosomskih translokacija i dr.).

• Reakcija se očitava flourescencijskim mikroskopom s filterima za određenu "boju“.

• FISH analiza EWS gena ( “break-apart“ sonde): jezgre gdje se signali sondi razdvajaju → rearanžman regije EWS gena

Primjena FISH metode u dijagnostici HER-2 statusa kod karcinoma dojke

Kromogena in situ hibridizacija(CISH – Chromogenic In Situ Hybridization)

• Hibridizacijska metoda koja se koristi pri detekciji amplifikacije gena, kromosomskih translokacija i promjena u broju kromosoma.

• Prednosti CISH metode: vidljiva je morfologija stanica preparati su trajni (signali ne blijede)• CISH se dijagnostički često koristi za

određivanje HER2 statusa kod pacijentica s karcinomom dojke.

• Kopije HER2 gena obilježe se sondama in situ

hibridizacijom, a dobiveni signal vizualiziramo imunodetekcijom.

• Rezultati se očitavaju svjetlosnim mikroskopom (može se istovremeno pratiti amplifikacija gena i morfologija tumorskih stanica).

Southern/northern blotting

• Southern blotting analiza ispituje prisutnost određenog slijeda nukleotida u DNA.

• Postupak: razgradnja DNA restrikcijskim endonukleazama razdvajanje molekula DNA elektroforezom u

agaroznom gelu razdvajanje niti DNA (denaturacija) prijenos DNA na nitroceluloznu membranu fiksiranje DNA za membranu hibridizacija s obilježenom sondom detekcija

• Northern blotting analizira RNA (ekspresija gena) i slična je metodi Southern blotting: RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s obilježenom sondom.

Sekvenciranje

• Sekvenciranje je tehnika kojom se određuje redoslijed nukleotida molekule DNA.

• Metoda koja danas prevladava je Sangerova „dideoksi-metoda“.

• Postupak: razdvajanje lanaca molekule DNA, sparivanju početnice s 5'-krajem jednoga lanca sinteza komplementarnog lanca dok se ne ugradi ddNTP (reakcijska

smjesa: dNTP + ddNTP) analiza elektroforezom

Protočna citometrija

• Protočna citometrija omogućuje određivanje kemijskih i fizikalnih svojstava pojedinačnih stanica, te njihovo odvajanje.

Materijali za analizu: Svaka suspendirana čestica

(monodisperzija) u rasponu veličina od 0,2 do 150 µm je pogodna za analizu.

Stanični materijal može biti svjež (stanice iz kulture, krv, koštana srž, …) ili fiksiran (parafinizirani materijali).

Dijelovi protočnog citometra:

Protočni citometar sastoji se od tri sustava :• protočni sustav (čine ga tekući medij -

nosač za uzorak i splet cjevčica i rezervoara pod tlakom)

• optički sustav (izvor laserske svjetlosti- argonski ili ksenonski laser, filteri i sakupljačke leće)

• elektronski sustav (detektori i analizatori, te računalo)

Princip mjerenja

• Postupak mjerenja odvija se dok pojedinačne stanice struje u izotoničnom mediju u nosaču kroz protočni citometar. One tada bivaju obasjane laserskom svjetlošću, laserski snop se raspršuje na česticama događa se fluorescencija specifično vezanih fluorokroma nakon laserske ekscitacije.

• Na osnovu toga se dobivaju podaci o njihovoj relativnoj veličini, stupnju zrnatosti staničnog sadržaja i intezitetu fluorescencije specifično vezanih fluorokroma.

• Ovakva analiza u kojoj se istovremeno mjeri nekoliko parametara, naziva se multiparametrijska analiza.

• Protočna citometrija je analitička metoda kojom se simultano mjere:

intenzitet fluorescencije svjetlosno raspršenje laserskog snopa na

pojedinačnim česticama (najčešće stanicama) dok bivaju nošene strujom tekućine kroz svjetlosni snop.

Protočnu citometriju praktično je podijeliti na:

• strukturnu (analiza veličine i granuliranosti stanica, analiza intenziteta fluorescencije specifično vezanih fluorokroma, analiza sadržaja stanične DNA)

• funkcionalnu (analiza membranskog potencijala, aktivnosti enzima, transporta

kalcija kroz staničnu membranu...)

Primjena protočne citometrije

• detekcija specifičnih staničnih membranskih markera - imunofenotipizacija

• mjerenje fiziološke aktivnosti stanica (pH, membranski potencijal, intenzitet aktivnosti enzima, intenzitet fagocitoze...)

• analiza sadržaja stanične DNA (stupanj ploidije, kromosomske analize, analiza specifičnih nukleotidnih sekvenci...)

Analiza sadržaja stanične DNA

• Analiza stupnja ploidije: brojčani pokazatelj stupnja ploidije je DNA-indeks. To je omjer relativnog sadržaja DNA G0-G1 faze staničnog ciklusa ispitivanog uzorka i relativnog sadržaja DNA stanica standarda.

Hvala na pažnji!