HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST …...UNIVRZIT T U NIŠU PRIRODNO-MAT MATIČKI AKULT T DEPARTMAN ZA HEMIJU HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE Helichrysum

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA HEMIJU

HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKIH

ULJA BILJNE VRSTE Helichrysum italicum (Roth) G. Don

(Asteraceae)

master rad

Niš, 2018.

Mentor

Docent dr Marija Genčić

Kandidat

Jelena Aksić

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Јелена М. Аксић Ментор, МН: Марија С. Генчић Наслов рада, НР: Хемијски састав и биолошка активност етарских уља биљне врсте

Helichrysum italicum (Roth) G. Don (Asteraceae) Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2018. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

8 поглавља; 78 страна; 91 цитат; 11 табелa; 16 слика; 4 шеме; 26 прилога

Научна област, НО: хемија Научна дисциплина, НД: органска хемија и биохемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Helichrysum italicum (Roth) G. Don, етарско уље, хемотипови,

антимикробна активност, антиинфламаторна активност, мултиваријантна статистичка анализа

УДК 665.52/.54 : 543.635.7 + 543.544.3 Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Део истраживања на пројекту ев. бр. 172061 надлежног Министарства Извод, ИЗ: Етарско уље биљне врсте Helichrysum italicum (смиље) употребљава се у

традиционалној медицини за зарастање рана, у третману oжиљака и других стања коже, као и хематома. До промене у терапеутској ефикасности овог уља би могло доћи услед природне варијабилности његовог састава (постојање хемотипова) или због промена у саставу овог уља до којих долази под утицајем различитих еколошких фактора. У овом мастер раду је испитан утицај састава на антимикробну и антиинфламаторну активност четири комерцијална уља смиља, за која је на основу GC-MS анализе утврђено да садрже различите количине нерил-естара, α-пинена, γ- и ar-куркумена, и β-дикетона (италидиона). Такође, извршенo је и хроматографско фракционисање једног од уља и испитана је антиинфламаторна активност одабраних фракција. Статистички третман (PCA анализа) добијених података о саставу и билошкој активности уља/фракција указује на то да уочене разлике у активности између уља/фракција нису последица само различите заступљености поменутих главних састојака, већ и присуства неких малозаступљених састојака. Резултати добијени у оквиру овог мастер рада потврдили су да антимикробна и антиинфламаторна активност етарског уља H. italicum у значајној мери зависе од садржаја α-пинена, ar-куркумена, 2-метилбутил-ангелата, кариофилен-оксида, лимонена, линалоола и других састојака, као и да су уочене активности највероватније последица синергистичког дејства између појединих састојака.

Датум прихватања теме, ДП: 17.01.2018. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Данијела Костић Члан: Нико Радуловић Члан, ментор: Марија Генчић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: master’s degree thesis Author, AU: Jelena M. Aksić Mentor, MN: Marija S. Genčić Title, TI: Chemical composition and biological activity of Helichrysum italicum (Roth) G.

Don (Asteraceae) essential oils

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2018 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

8 chapters/ 78 pages/ 91 ref./ 11 tables/ 16 figures/ 4 schemes/ 26 appendices Scientific field, SF: chemistry Scientific discipline, SD: organic chemistry and biochemistry Subject/Key words, S/KW: Helichrysum italicum (Roth) G. Don, essential oil, chemotypes, antimicrobial

activity, antiinflammatory activity, multivariate statistical analysis UC 665.52/.54 : 543.635.7 + 543.544.3

539.171

Holding data, HD: library Note, N: This work is a part of the research performed within the Project No. 172061 Abstract, AB: Helichrysum italicum or immortelle essential oil has been widely used in

traditional medicine for wound healing, scars treatment and other skin conditions as well as in treating hematoma. It is possible that the therapeutic efficacy of this oil changes with the natural variability of the composition, i.e. existence of chemotypes, and due to various environmental factors. In this master’s thesis we aimed to assess the relationship of the composition, and antimicrobial and antiinflammatory potentials for 4 commercial immortelle oils which, based on GC-MS analysis, contained differing amounts of neryl esters, α-pinene, γ- and ar-curcumenes and β-diketones (italidiones). Moreover, one of the oils was fractionated by dry flash chromatography and the antiinflammatory activity of the selected fractions was tested. The statistical (PCA) treatment of the obtained composition-activity data implied that the observed differences in activities among the tested oils/fractions were not only due to the different amounts of the mentioned major constituents but also due to the presence of some minor constituents. Our results confirmed that immortelle oil efficiency as antimicrobial and antiinflammatory agents strongly depends on amounts of α-pinene, ar-curcumene, 2-methylbutyl angelate, caryophyllene oxide, limonene, linalool, etc., and is an outcome of synergistic action between its constituents.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

17.01.2018. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Danijela Kostić Member: Niko Radulović Member,

Mentor: Marija Genčić

Образац Q4.09.13 - Издање 1

HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM (ROTH) G. DON

Ovaj master rad je urađen u okviru istraživanja na projektu ON 172061 „Kombinatorne

biblioteke heterogenih katalizatora, prirodnih proizvoda, modifikovanih prirodnih

proizvoda i njihovih analoga: put ka novim biološkim agensima” Ministarstva prosvete,

nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije čiji je rukovodilac prof. dr Niko Radulović.

Hromatografsko frakcionisanje etarskog ulja biljne vrste Helichrysum italicum i analize

sastava etarskih ulja i frakcija vršeni su u Laboratoriji za organsku analizu i sintezu

(Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu). Antimikrobna

aktivnost testirana je u Mikrobiološkoj laboratoriji (Departman za biologiju, Prirodno-

matematički fakultet, Univerzitet u Nišu), dok je antiinflamatorni potencijal ispitan u

Naučno-istraživačkom centru za biomedicinu (Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu)

Ovom prilikom najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru dr Mariji Genčić na ukazanom

poverenju, ogromnoj posvećenosti i pomoći tokom izrade ovog rada.

Veliku zahvalnost dugujem i dr Polini Blagojević, vanrednom profesoru, koja nam je

ustupila uzorak ulja sa tržišta Francuske za analizu; dr Zorici Stojanović-Radić,

vanrednom profesoru, na pomoći pri ispitivanju antimikrobne aktivnosti; Nikoli

Stojanoviću, istraživaču saradniku, na saradnji prilikom određivanja antiinflamatorne

aktivnosti; kao i Mileni Živković, istraživaču saradniku, i Marku Mladenoviću, naučnom

saradniku, na pomoći pri hemijskoj sintezi i analizi.

Takođe se zahvaljujem svim ostalim istraživačima iz Laboratorije za organsku analizu i

sintezu na njihovom strpljenju, pomoći i savetima.

Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici na bezgraničnoj podršci i ljubavi

tokom studiranja.


OZNAKE I SKRAĆENICE

-NOMENKLATURA-

ATP Adenosine TriPhosphate (adenozin-trifosfat)

CH3CO- Acetil

COX CycloOXygenase (ciklooksigenaza)

DNK DeoxyriboNucleic Acid (dezoksiribonukleinska kiselina)

IL-6 InterLeukin 6

LDL Low-Density Lipoprotein (lipoproteini niske gustine)

5-LO 5-LipOxygenase (5-lipooksigenaza)

Me ili CH3– Metil

NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide (nikotinamid adenin

dinukleotid)

NADP Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (nikotinamid adenin

dinukleotid-fosfat)

NOS Nitric Oxide Synthase (azot-monoksid sintetaza)

PGE2 ProstaGlandin E2

TBH terc-Butil-Hidrogenperoksid

TNF-α Tumor Necrosis Factor-α

o orto

p para

E Entgegen (stereodeskriptor)

Z Zuzammen (stereodeskriptor)

L Laevus

(+) desnorotatorni

-REAGENSI I RASTVARAČI-

DMSO DiMetilSulfOksid

Et2O Dietil-etar

MTT (3-(4,5-DiMetil(Tiazol-2-il)-3,5-difenil-Tetrazolijum-bromid

LPS LipoPoliSaharid

RPMI Roswell Park Memorial Institute

PBS Phosphate Buffered Saline iPrOH Izopropanol

TTC 2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride (2,3,5-trifeniltetrazolijum-

hlorid)

-HROMATOGRAFIJA I MASENA SPEKTROMETRIJA-

AMDIS Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System

(automatizovani sistem za identifikaciju i dekonvoluciju masenih

spektara)


EI Electron Impact

C Koncentracija

GC Gas Chromatography (gasna hromatografija)

GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry (gasna hromatografija-

masena spektrometrija)

HP Hewlett-Packard

[M]+. Molekulski jon

m/z Mass-to-charge-ratio (odnos mase i naelektrisanja)

rel. int. Relativni intenzitet

RI Retention Index (retencioni indeks)

∆RI Razlika u retencionim indeksima

Rt Retention Time (retenciono vreme)

TLC Thin-Layer Chromatography (tankoslojna hromatografija)

TIC Total Ion Chromatogram (ukupni jonski hromatogram)

-ANTIMIKROBNA I ANTIINFLAMATORNA AKTIVNOST-

ATCC American Type Culture Collection

CFU Colony-Forming Unit

MBC Minimum Bactericidal Concentration (minimalna baktericidna

koncentracija)

MBEC Minimum Biofilm Eliminating Concentration

MBIC Minimum Biofilm Inhibitory Concentration

MFC Minimum Fungicidal Concentration (minimalna fungicidna

koncentracija)

MIC Minimum Inhibitory Concentration (minimalna inhibitorna

koncentracija)

MHA Mueller Hinton Agar

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards (američki

nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde)

SDA Sabouraud Dextrose Agar

DPPH 1,1-DiPhenyl-2-PicrylHydrazyl radical (1,1-difenil-2-pikril-hidrazil

radikal)

-STATISTIČKA ANALIZA-

PCA Principal Component Analysis (analiza glavne komponente)

D Diketoni

K Ketoni

κ Pearson-ov koeficijent korelacije

HE Hemiterpenski estri

ME Monoterpenski estri

M Monoterpenski ugljovodonici


M* Oksigenovani monoterpeni

S Seskviterpenski ugljovodnici

S* Oksigenovani seskviterpeni

O Ostalo

-MERNE JEDINICE-

°C Celzijusov stepen

cm centimetar

eV electron Volt

g gram

h sat

kg kilogram

L litar

M mol/dm3

m metar

mg miligram

min minut

mL mililitar

mm milimetar

nm nanometar

rpm revolutions per minute (broj okretaja u minuti)

s sekunda

μL mikrolitar

μm mikrometar

-OSTALO-

aq. Aqueous solution (vodeni rastvor)

et al. Et alia (i drugi) 1H NMR Hydrogen-1 Nuclear Magnetic Resonance (protonska nuklearno-

magnetna rezonantna spektroskopija)

IC50 Inhibitory Concentration 50

IR InfraRed (infracrvena)

LC50 Lethal Concentration 50

NMR Nuclear Magnetic Resonance (nuklearno-magnetna rezonantna

spektroskopija)

ppm parts per milion

syn. sinonim

tr trag

s.d. standardna devijacija

UV UltraViolet


SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

2. CILJEVI RADA ........................................................................................................................ 4

3. OPŠTI DEO ............................................................................................................................ 6

3.1. SISTEMATIKA RODA HELICHRYSUM .................................................................................. 7

3.2. HEMIJSKI SASTAV ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM ........................................... 8

3.2.1. RAZLIKE U HEMIJSKOM SASTAVU ETARSKIH ULJA I POSTOJANJE HEMOTIPOVA .... 9

3.2.2. UTICAJ FAKTORA ŽIVOTNE SREDINE NA SASTAV ETARSKOG ULJA ..................... 10

3.2.3. ITALIDIONI – β-DIKETONI SPECIFIČNI ZA VRSTU H. ITALICUM ......................... 13

3.3. BIOLOŠKA I FARMAKOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA, EKSTRAKATA I SEKUNDARNIH

METABOLITA BILJNE VRSTE H. ITALICUM ........................................................................ 16

3.3.1. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST ......................................................................... 17

3.3.1.1. MEHANIZAM ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ....................................... 20

3.3.2. ANTIINFLAMATORNA AKTIVNOST ................................................................. 22

3.3.3. ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ..................................................................... 23

3.3.4. INSEKTICIDNA AKTIVNOST ........................................................................... 24

4. EKSPERIMENTALNI DEO ...................................................................................................... 26

4.1. HEMIKALIJE .................................................................................................................. 27

4.2. METODE ANALIZE ......................................................................................................... 27

4.2.1. GASNA HROMATOGRAFIJA-MASENA SPEKTROMETRIJA (GC-MS)..................... 27

4.2.1.1. IDENTIFIKACIJA SASTOJAKA ............................................................. 27

4.3. METODE RAZDVAJANJA.................................................................................................. 28

4.3.1. TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA ................................................................. 28

4.3.2. DRY FLASH HROMATOGRAFIJA....................................................................... 28

4.4. ODREĐIVANJE HEMIJSKOG SASTAVA ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM ................ 28

4.4.1. HROMATOGRAFSKO RAZDVAJANJE ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM 28

4.5. ISPITIVANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ....................................................................... 29

4.5.1. KORIŠĆENI MIKROORGANIZMI ...................................................................... 29

4.5.2. TESTIRANJE IN VITRO ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ........................................ 29

4.6. ISPITIVANJE ANTIINFLAMATORNE AKTIVNOSTI ............................................................... 30

4.6.1. LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE......................................................................... 30


4.6.2. IZOLOVANJE I KULTIVISANJE MAKROFAGA ..................................................... 30

4.6.3. ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI MAKROFAGA MTT TESTOM ................................ 31

4.6.4. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO OD STRANE MAKROFAGA ............................... 31

4.7. STATISTIČKA ANALIZA................................................................................................... 32

4.7.1. MULTIVARIJANTNA ANALIZA-METODA ANALIZE GLAVNE KOMPONENTE .......... 32

5. REZULTATI I DISKUSIJA ....................................................................................................... 34

5.1. HEMIJSKI SASTAV ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM .......................................... 35

5.2. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM ........................... 43

5.3. ANTIINFLAMATORNI POTENCIJAL ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM ................... 49

5.3.1. CITOTOKSIČNO DELOVANJE ETARSKIH ULJA I ODABRANIH FRAKCIJA NA

MAKROFAGE ................................................................................................ 50

5.3.2. INHIBITORNO DEJSTVO ETARSKIH ULJA NA PRODUKCIJU NO OD STRANE

MAKROFAGA ................................................................................................ 53

6. ZAKLJUČAK ......................................................................................................................... 56

7. LITERATURA ....................................................................................................................... 59

8. PRILOG ............................................................................................................................... 65


1. UVOD

2


Helichrysum italicum (Roth) G. Don je patuljasti, aromatični grm sa zlatno žutim

cvetovima koji pripada familiji glavočika (Asteraceae), a rasprostranjen je duž

Mediterana i u jugo-istočnoj Evropi (Mastelic et al., 2005). Ovaj takson ima i nekoliko

uobičajenih narodnih naziva poput: everlasting plant (ili immortelle na francuskom), koji

se odnosi na osobinu njegovih cvetova da zadrže svoj izgled, boju i miris dugo vremena

nakon ubiranja, ili curry plant, zbog njegovog karakteritičnog, prodornog mirisa koji

veoma podseća na aromu začina kari (Hellivan, 2009), dok je u našoj zemlji i regionu

ova biljna vrsta poznata pod nazivom smilje (Josifović, 1974). Ekstrakti i etarsko ulje

smilja se od davnina koriste u tradicionalnoj medicini mediteranskih naroda kod

tretmana alergija, infekcija, upala, stanja kože, nesanice, poremećaja u radu jetre i žuči,

itd. (Antunes Viegas et al., 2014).

Danas se ova biljna vrsta sve više uzgaja (prevashodno u Francuskoj, Italiji i

Španiji, a u skorije vreme i u Srbiji i Hrvatskoj) za proizvodnju etarskog ulja (Hellivan,

2009; Petersen, 2015) koje je veoma cenjeno u:

industriji parfema ‒ zbog karakteristično pikantnog mirisa na šafran koji lepo

dopunjuju note karija, orašastih plodova i celera (Hellivan, 2009);

aromaterapiji ‒ za zarastanja rana i u tretmanu drugih stanja kože, poput

hematoma i ožiljaka (Antunes Viegas et al., 2014);

i kozmetičkoj industriji ‒ za pripremu različitih preparata za kožu jer se smatra

da regeneriše kožu, podstiče cirkulaciju u njoj i dovodi do ublažavanja vidljivosti

bora (Sarkić i Stapen, 2018; slika 1.1).

SLIKA 1.1. a) PLANTAŽA SMILJA U BLIZINI PARAĆINA (SRBIJA), b) I c) KOZMETIČKI PREPARATI ZA NEGU

KOŽE NA BAZI ETARSKOG ULJA H. ITALICUM, d) NEKI OD PARFEMA U ČIJI SASTAV ULAZI ETARSKO ULJE

H. ITALICUM

Proizvodnja etarskog ulja biljne vrste H. italicum može biti veoma ekonomski

isplativa jer cena može dostići i 2000 € po kg. Ovako visoka cena je uslovljena ne samo

velikom potražnjom za ovim etarskim uljem, već i relativno niskim prinosom etarskog

ulja ‒ oko 0,2% (France Agrimer, 2017). Međutim, proizvodnja i primena ovog etarskog

ulja može biti ograničena prirodnom varijabilnošću biljne vrste H. italicum koja se

ogleda ne samo kroz postojanje više podvrsta, već i kroz postojanje većeg broja

hemotipova koji se međusobno razlikuju po hemijskom sastavu etarskog ulja. Pored

toga, dokazano je da do promena u sastavu etarskog ulja smilja može doći i pod uticajem

3


različitih ekoloških faktora, poput sastava zemljišta, nadmorske visine, izloženosti

suncu, faze vegetativnog ciklusa, itd. (Bianchini et al., 2009; Bianchini et al., 2001;

Leonardi et al., 2013; Melito et al., 2016). Na primer, na tržištu etarskih ulja su

najzastupljenija dva hemotipa smilja, tzv. „Korzikansko ulje“, koje karakteriše visok

sadržaj neril-acetata (ca. 40%) i nešto veća zastupljenost nerola i β-diketona u odnosu

na ostale hemotipove, i „Balkansko ulje“, koje sadrži znatno manje neril-acetata, ali je

zato α-pinen zastupljeniji i do 10 puta u odnosu na „Korzikansko ulje“ (Hellivan, 2009).

Terapeutska primena etarskog ulja biljne vrste H. italicum u narodnoj medicini

podstakla je, u poslednjih 20-30 godina, i ispitivanja njegove biološke aktivnosti, pri

čemu je pokazano da ovo ulje poseduje antimikrobna, antioksidantna, antiinflamatorna,

insekticidna, fitotoksična, citotoksična i antigenotoksična svojstva (Antunes Viegas et

al., 2014; Guinoiseau et al., 2013; Maksimović et al., 2017). Najintenzivnije je

proučavana antimikrobna aktivnost ulja smilja, pri čemu je, između ostalog, nađeno da

je ovo ulje posebno aktivno prema Gram-pozitivnoj bakteriji Staphylococcus aureus i

Gram-negativnoj bakteriji Escherichia coli i da svoje baktericidno dejstvo ispoljava

putem oštećenja ćelijske membrane (Cui et al., 2016; Cui et al., 2015). Takođe, ispitana

je i antimikrobna aktivnost glavnih sastojaka ovog ulja pri čemu je utvrđeno da je

najaktivniji sastojak ulja ‒ neril-acetat bio jednako aktivan kao samo ulje, dok su svi

ostali testirani sastojci bili manje aktivni (Cui et al., 2016). Za razliku od antimikrobne

aktivnosti, u literaturi su dostupna svega dva rada vezana za antiinflamatorna svojstva

ulja smilja (Djihane i Mihoub, 2016; Voinchet i Giraud Robert, 2007) što je donekle

iznenađujuće imajući u vidu da je jedna od najdokumentovanijih primena ulja u

narodnoj medicini za pospešivanje zarastanja rana i regeneracije kože (Guinoiseau et

al., 2013). Ovu etnofarmakološku primenu ulja smilja su donekle potvrdili Voinchet i

Giraud Robert (2007) u svom kliničkom ispitivanju tokom kog su razvili efikasan

protokol koji smanjuje lokalnu inflamaciju i ubrzava nestanak edema, modrica i

hematoma kod pacijenata nakon plastičnih i rekonstrukcionih operacija grudnog koša, a

zasniva se na primeni etarskog ulja smilja. Zanimljivo je da je u pomenutim

ispitivanjima antiinflamatornih svojstava ulja, kao i u većem broju radova gde je

testirana antimikrobna aktivnost, korišćen hemotip ulja koji je sadržao neril-acetat, γ-

kurkumen i β-diketon ‒ italidion I kao glavne sastojke, odnosno da ostali hemotipovi

nisu do sada dovoljno proučeni sa ovog aspekta, niti je izvršeno uporedno ispitivanje

antimikrobnog i antiinflamatornog potencijala različitih hemotipova.


2. CILJEVI RADA

5


Imajući sve prethodno u vidu, za ciljeve ovog master rada postavljeno je

ispitivanje etarskih ulja biljne vrste Helichrysum italicum (Roth) G. Don koje obuhvata:

detaljnu analizu hemijskog sastava četiri komercijalna etarska ulja vrste

H. italicum sa tržišta Francuske, Belgije i Srbije pomoću gasne hromatografije sa

masenom detekcijom (GC-MS);

frakcionisanje jednog od etarskih ulja pomoću dry flash hromatografije;

ispitivanje in vitro antimikrobne aktivnosti etarskih ulja pomoću mikrodilucione

metode po preporukama NCCLS-a;

ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti etarskih ulja i odabranih hromatografskih

frakcija u in vitro uslovima u modelima citotoksičnosti na makrofage i inhibicije

produkcije azot-monoksida od strane makrofaga;

uporednu statističku analizu sastava etarskih ulja (i hromatografskih frakcija) sa

rezultatima bioloških testiranja pomoću programskog paketa plug-in XLSTAT za

program EXCEL.


3. OPŠTI DEO

7


3.1. SISTEMATIKA RODA HELICHRYSUM

Helichrysum Mill. je rod familije Asteraceae i obuhvata preko 500 vrsta od kojih

se u Evropi i na Mediteranu mogu naći oko 25 vrsta. Ostale vrste ovog roda

rasprostranjene su u Africi, Aziji i Australiji (Galbany-Casals et al., 2006). Etimološki

naziv roda, Helichrysum, potiče od grčkih reči Helios, što znači Sunce, i chryos, što znači

zlato, a asocira na karakterističnu boju cvetova biljnih vrsta ovog roda (Perrini et al.,

2009). Pripadnici ovog roda su višegodišnje zeljaste biljke ili polužbunovi. To su

kserofite biljke, prilagođene da prežive u sušnim uslovima, pa naseljavaju peskovita i

suva travnata mesta (Josifović, 1974). Vrste roda Helichrysum rastu u širokom opsegu

nadmorsih visina, od nivoa mora pa do 1700 m (Perrini et al., 2009). Osnovne

morfološke karakteristike ovog roda su:

listovi celi i često pustenasto dlakavi;

glavice sa mnogo cvetova u gronjastim cvastima, retko pojedinačne;

listići involukruma potpuno suvokožičasti i goli, poređani kao crepovi na krovu,

u više redova, često člankovito savijeni i sa zračno proširenim vrhom;

cvetovi svi hermatofroditni, cevasti ili obodni ženski, sa končastim cvastom i

krunicom;

papus od mnogobrojnih, jednostavnih, čekinjastih dlačica, u jednom redu;

ahenije valjkaste, sa 5 ivica, jedva nešto spljoštene (Josifović, 1974).

U tabeli 3.1 je prikazano filogenetsko stablo roda Helichrysum.

TABELA 3.1. FILOGENETSKO STABLO1 RODA HELICHRYSUM

TAKSONOMSKE KATEGORIJE TAKSONI

Regnum − Carstvo Plantae

Subregnum − Podcarstvo Viridiplantae

Phylum – Odeljak Tracheophyta

Subphylum – Pododeljak Euphyllophytina

Classis – Klasa Spermatopsida

Subclassis – Podklasa Magnoliidae

Ordo – Red Asterales

Familia – Familija Asteraceae (syn. Compositae)

Subfamilia −Podfamilija Asteroideae

Tribus − Pleme Gnaphalieae

Genus − Rod Helichrysum

U Republici Srbiji se javlja samo jedna vrsta, H. italicum (Roth) G. Don (slika 3.1),

i to u Vojvodini, Deliblatskoj peščari, istočnoj Srbiji, Ramskom pesku i Kladovu

(Josifović, 1974).

1 Systema Naturae 2000 (http://sn2000.taxonomy.nl/).

8


SLIKA 3.1. IZGLED (CVETA I LISTA) BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Helichrysum italicum može se dalje podeliti na šest podvrsta koje su

rasprostranjene u različitim regionima Mediterana (tabela 3.2).

TABELA 3.2. PODVRSTE BILJNE VRSTE H. ITALICUM I NJIHOVA RASPROSTRANJENOST (BIONDI, 2007;

GALBANY-CASALS ET AL., 2011; PAOLINI ET AL. 2006; PROENÇA DE CUNHA ET AL., 2012)

PODVRSTA RASPROSTRANJENOST

H. italicum (Roth) G. Don subsp. italicum Mediteranski basen

H. italicum subsp. microphyllum (Willd.) Nyman Majorka, Dragonera, Sardinija,

Korzika, Krit i Kipar

H. italicum subsp. picardii Franco Francuska, Italija, Portugal i Španija

H. italicum subsp. pseudolitoreum (Fiori) Bacch. & al. Arđentario, Gargano, Mount Konero

H. italicum subsp. serotinum (Boiss.) P.Fourn. Pirinejsko poluostrvo

H. italicum subsp. siculum (Jord. & Fourr.) Galbany & al. Sicilija

3.2. HEMIJSKI SASTAV ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Viševekovna upotreba cvetova i listova biljne vrste H. italicum u tradicionalnoj

medicini mediteranskih naroda pri lečenju alergija, prehlada, kašlja, nesanice, kožnih

oboljenja, poremećaja u radu žučne kese i jetre, različitih infekcija i inflamatornih

procesa, podstakla je u poslednjih nekoliko decenija farmakološka ispitivanja ove biljne

vrste, kao i ispitivanja njenog hemijskog sastava, u cilju potvrde pomenute široke

etnofarmakološke upotrebe (Antunes Viegas et al., 2014). Do sada su proučavani sa

farmakološkog aspekta raznovrsni ekstrakti ove biljne vrste, a u zavisnosti od načina

pripreme oni se razlikuju po hemijskom sastavu. Najčešće analizirani ekstrakt je etarsko

ulje, koje se može dobiti iz svih zelenih delova biljke (Leonardi et al., 2013), i u literaturi

su dostupni brojni radovi o njegovom hemijskom sastavu.

Etarsko ulje smilja se najčešće dobija iz cvetnih vrhova biljke pomoću destilacije

vodenom parom. Destilaciju je potrebno izvršiti još dok su cvetovi sveži jer počinju da

fermentišu 24 sata posle branja što može uticati na sastav i smanjiti terapeutsku

aktivnost. Hemijski sastav ulja je složen i uopšteno, sadrži sledeće potencijalno aktivne

sastojke: terpene (uključujući limonen, α-pinen, γ-kurkumen), alkohole (nerol, geraniol,

linalool, furfurol, itd.), karboksilne kiseline, estre (neril-acetat i -propanoat), fenole,

9


ketone, β-diketone (tzv. italidioni). Bitno je naglasiti da sadržaj pojedinih aktivnih

sastojaka zavisi od hemotipa ove biljne vrste, podneblja gde je rasla, dela vegetacionog

ciklusa u kom je ubrana, itd. (Mastelic et al., 2008).

3.2.1. RAZLIKE U HEMIJSKOM SASTAVU ETARSKIH ULJA PODVRSTA I POSTOJANJE HEMOTIPOVA

Dosadašnja ispitivanja sastava etarskog ulja vrste Helichrysum italicum ukazuju

na postojanje različitih hemotipova dve njene najrasprostanjenije podvrste, subsp.

italicum i subsp. microphyllum. Kada je u pitanju sastav etarskih ulja H. italicum subsp.

italicum do sada je najmanje sedam hemotipova opisano u literaturi (Blumenthal et al.,

1998; Morone-Fortunato et al., 2010). Dominantni sastojci identifikovani u ulju

izolovanom iz biljaka ubranih u Grčkoj bili su geraniol (1), geranil-acetat (2) i

(E)-nerolidol (3) (Chinou et al., 1996; slika 3.2). Ispitivanjem hemijskog sastava etarskih

ulja dobijenih iz biljaka koje su uzgajane u Severnoj Americi dva hemotipa sa neril-

acetatom (4) kao glavnim sastojkom su razlikovana, jedan sa α-pinenom (5), a drugi sa

γ-kurkumenom (6) kao drugim najzastupljenijim sastojkom (Charles et al., 1991;

Tucker et al., 1997; slika 3.2). Tri hemotipa su opisana za etarska ulja dobijena iz biljnog

materijala skupljenog u bivšoj Jugoslaviji i duž obale Jadranskog mora (uglavnom

Hrvatska). Kod prvog hemotipa α-pinen (5), γ-kurkumen (6), β-selinen (7), neril-acetat

(4) i (E)-β-kariofilen (8) su identifikovani kao glavni sastojci (Leimner et al., 1984;

Weyerstahl et al., 1985; slika 3.2). Kod drugog, ar-kurkumen (9) i γ-kurkumen (6) su

nađeni kao glavni sastojci, dok je treći okarakterisan visokim sadržajem α-pinena (5) i

neril-acetata (4; Blažević et al., 1995; slika 3.2). Sedmi hemotip je opisan na osnovu

sastava etarskog ulja dobijenog iz biljke sa Korzike gde su nerol (11) i njegovi estri,

neril-acetat (4) i neril-propanoat (10), karakteristični sastojci (Peyron et al., 1978; slika

3.2). Važno je istaći da je uočeno da hemijski sastav etarskog ulja podvrste italicum

pokazuje veću različitost unutar podvrste kao rezultat delovanja brojnih faktora životne

sredine, a najuticajnijim faktorom smatra se tip zemljišta (Bianchini et al., 2009).

Za podvrstu microphyllum, opisana su dva glavna hemotipa. Prvi je bogat

nerolom (11; 10,7%), neril-acetatom (4; 28,9%), neril-propanoatom (10; 11,4%) i

γ-kurkumenom (6; 11,4%), dok je drugi bogat linaloolom (12; 14,9%) i γ-kurkumenom

(6; 18,2%; Satta et al., 1999; slika 3.2).

10


SLIKA 3.2. STRUKTURE NEKIH OD GLAVNIH SASTOJAKA RAZLIČITIH HEMOTIPOVA ETARSKIH ULJA VRSTE

H. ITALICUM

3.2.2. UTICAJ FAKTORA ŽIVOTNE SREDINE NA SASTAV ETARSKOG ULJA

Kao posledica širokog opsega staništa koje mogu nastaniti H. italicum subsp.

italicum i microphiyllum, javlja se visoka varijabilnost u pogledu morfoloških osobina i

hemijskog sastava, koje mogu nastati u toku adaptacionog procesa. Sastav sekundarnih

metabolita varira u zavisnosti od različitih faktora kao što su genetika (Shafie et al.,

2009), klima, tip zemljišta, nadmorska visina, izloženost suncu i ostali uslovi životne

sredine (Ložiene i Venskutonis, 2005; Purohit i Vyas, 2004). U suštini, iako je ovaj

obiman rod dosta izučavan, varijabilnost hemijskog sastava i genetska povezanost

unutar pojedinih vrsta ovog roda (poput H. italicum) su i dalje nedovoljno razjašnjene

(Morone-Fortunato et al., 2010).

Sastav etarskog ulja hemotipa podvrste italicum sa Korzike, posebno kada je u

pitanju odnos količina ketona/β-diketona i neril-acetata (4), zavisi od faze vegetativnog

ciklusa i tipa zemljišta (Bianchini et al., 2009; Bianchini et al., 2003; Bianchini et al.,

2001). Iako je nađeno da je u svim fazama razvića neril-acetat (4) glavni sastojak

pomenutog etarskog ulja (sa 20,3 – 35,3%), njegova količina je bila najveća u ulju

dobijenom iz biljaka u stadijumu neposredno pred cvetanje (tokom maja meseca), a

zatim u fazi punog cveta (tokom juna meseca), dok je najmanji procenat ovog estra

zabeležen u ulju izolovanom iz biljaka u ranoj fazi vegetativnog ciklusa (januar-mart).

Suprotan trend je zabeležen u slučaju ketona i β-diketona (posebno 4-metil-3-

heksanona (13) i 4,6-dimetil-3,5-oktadiona) čija je najveća količina (oko 24%) nađena u

ranoj vegetativnoj fazi, a najmanja neposredno pred cvetanje (oko 11%; Bianchini et al.,

2001). Takođe, pokazano je da se značajno veće količine neril-acetata (4) nalaze u

11


etarskom ulju ovog hemotipa ukoliko je ova biljna vrsta rasla na slabo kiselom zemljištu

koje u svom sastavu sadrži manje procente gline, sitnog peska ili grubog mulja, a visoke

procente grubog peska i sitnog mulja (Bianchini et al., 2009). Nekoliko godina kasnije,

Leonardi i saradnici (2013) su statistički poredili sastav etarskog ulja vrste H. italicum

subsp. italicum sa različitih prirodnih staništa na ostrva Elba (Italija), i utvrdili da je:

rast biljnih jedinki na intrusivnim magmatskim stenama povezan sa povećanom

količinom seskviterpena (α-humulena (14), eudezma-5-en-11-ola (15), α- i

β-eudezmola (16 i 17), itd.) u ulju;

zatim, da rast na peskovitim staništima podstiče produkciju ulja bogatijih

ugljovodoničnim monoterpenima (α- i β-pinena (5 i 18), kamfena (19) i

γ-terpinena (20));

i da su u uljima izolovanim iz populacija sa serpentinskih lokaliteta dominantni

sastojci monoterpenski estri (neril-acetat (4) i -propanoat (10)) i seskviterpenski

ugljovodonici (ar-kurkumen (9) i italicen (21); slike 3.2 i 3.3).

Satta i saradnici (1999) su proučavali hemijski sastav ulja podvrste

microphiyllum sa različitih lokaliteta na ostrvu Sardinija koja su se nalazila na

nadmorskim visinama u opsegu od 100 do 900 m i našli su da su etarska ulja populacija

sa nižih nadmorskih visina (100 – 200 m) bogata linaloolom (12) i γ-kurkumenom (6),

dok su rast na višim nadmorskim visinama (500 – 900 m) povezali sa produkcijom ulja

u kojima su glavni sastojci pored pomenutog γ-kurkumena (6), nerol (11) i njegovi estri

(acetat (4) i propanoat (10)). Sveobuhvatnije ispitivanje ovog uticaja (na 101-u

populaciju ove biljne vrste) urađeno je od strane Melito i saradnika (2016) koji su

statistički poredili profile etarskih ulja i nadmorske visine na kojima su rasle biljke iz

kojih je ulje izolovano. Utvrđeno je da količina 17 sastojaka u analiziranim uzorcima

etarskih ulja pokazuje značajnu korelaciju sa nadmorskom visinom. Među njima, pet

sastojaka (italicen (21), γ-kurkumen (6), ar-kurkumen (9), nerol (11) i geraniol (1)) je

pokazalo jaku pozitivnu korelaciju (P < 0,0001), dok su četiri pokazala jaku negativnu

korelaciju sa nadmorskom visinom (limonen (22), (E)-β-kariofilen (8), (E)-nerolidol

(3), cis-β-gvajen (23); slike 3.2 i 3.3). Sve u svemu, rezultati ovog istraživanja ukazuju na

postojanje dva osnovna hemotipa podvrste microphyllum. Prvi hemotip čine populacije

sa planina koje proizvode etarsko ulje koje sadrži značajno veći procenat geraniola (1),

cis- i trans-α-bergamotena (24 i 25), α-gvajena (26) i u zbiru najmanje 70% sledećih

sastojaka: linaloola (12), nerola (11), italicena (21), γ- i ar-kurkumena (6 i 9), gvajola

(27), β-eudezmola (17) i eudezma-7(11)-en-4-ola (28), dok drugi hemotip obuhvata

biljke koje su rasle pored mora, a čiji uzorci ulja sadrže između 40 i 60% neril-acetata

(4), zatim, značajne količine (E)-nerolidola (3), cis-β-gvajena (23) i (E)-β-kariofilena

(8), niži procenat linaloola (12) i α-gvajen (26), cis- i trans-α-bergamoten (24 i 25)

samo u tragovima (Melito et al., 2016; slike 3.2 i 3.3). Razlike u profilima etarskih ulja

H. italicum subsp. microphyllum koje potiču sa različitih staništa (obala mora ili planina)

mogu se još lakše uočiti ukoliko se posmatra sadržaj pojedinih klasa sekundarnih

metabolita. Osnovna razlika je u proizvodnji terpena, jer iako monoterpene proizvode i

biljke iz planinskih i obalskih predela, njihov sadržaj je znatno veći u uljima dobijenim iz

obalskih biljaka, dok seskviterpene proizvodi uglavnom planinski hemotip. Statistička

12


analiza je pokazala da se ova dva hemotipa (obalski i planinski) vrste H. italicum subsp.

microphyllum, osim po sadržaju mono- i seskviterpena, razlikuju i po sadržaju

kiseonične, nekiseonične, alkoholne i estarske frakcije (tabela 3.3).

SLIKA 3.3. STRUKTURE NEKIH OD SASTOJAKA ČIJI SADRŽAJ U ETARSKOM ULJU VRSTE H. ITALICUM ZAVISI

OD EKOLOŠKIH FAKTORA

TABELA 3.3. PROCENTUALNI SADRŽAJ GLAVNIH KLASA SEKUNDARNIH METABOLITA IDENTIFIKOVANIH U

ETARSKIM ULJIMA VRSTE H. ITALICUM SUBSP. MICROPHYLLUM (MELITO ET AL., 2016)

KLASA UKUPNI SADRŽAJ

[%]

OBALSKI HEMOTIP

[%]

PLANINSKI HEMOTIP

[%]

Monoterpeni 0 – 96,6 0 – 96,6 4,4 – 71,2

Seskviterpeni 0 – 78 0 – 66,5 7,5 – 7,8

Kiseonična frakcija 0 – 95,6 0 – 95,6 19,4 – 78,4

Nekiseonična frakcija 0,7 – 68,9 0,7 – 68,9 5,1 – 26,4

Alkoholi 0 – 60 0 – 60 10,5 – 54,9

Estri 0 – 91,9 0 – 91,9 1,1 – 60,9

Etri 0 – 11,5 4,1 – 6,8 0 – 11,5

Pored nadmorske visine, Melito i saradnici (2016) su ispitivali i uticaj različitih

klimatskih faktora na sastav etarskih ulja vrste H. italicum subsp. microphyllum. Utvrdili

su da postoji jaka pozitivna korelacija (PCA analiza) između sadržaja (E)-nerolidola (3) i

prosečne temperature tokom zime, kao i između količina italicena (21), bergamotena

(24 i 25), nerola (11) i kurkumena (6 i 9) i prosečne količine padavina tokom proleća i

leta (slike 3.2. i 3.3).

13


3.2.3. ITALIDIONI - β-DIKETONI SPECIFIČNI ZA VRSTU H. ITALICUM

Pre nekih pola veka u etarskom ulju biljne vrste H. italicum su po prvi put

identifikovani β-diketoni (tzv. italidioni), za koje se može reći da predstavljaju

sekundarne metabolite koji su specifični za ovu vrstu imajući u vidu da većina njih do

sada nije nađena ni u jednoj drugoj biljnoj vrsti. Strukturno gledano, H. italicum

produkuje dve serije β-diketona koje „biosintetski“ mogu nastati acilovanjem dva

različita ketona: (i) 4,7-dimetilokt-6-en-3-ona (29) i (ii) 3-pentanona. Prvu seriju

β-diketona u etarskom ulju H. italicum su identifikovali Sergio i saradnici 1967. godine,

a drugu Manitto i saradnici 1972 godine. Imajući u vidu stepen razvoja metoda

stukturne analize (prevashodno NMR i GC-MS tehnika), kao i sintetskih metoda koje su

bile dostupne pre pola veka, može reći da je potvrda strukture ovih β-diketona tada

predstavljala pravi izazov.

Tokom ispitivanja hemijskog sastava etarskog ulja vrste H. italicum pomoću

gasne hromatografije, Sergio i saradnici (1967) su uočili signal u gasnom hromatogramu

na velikom retencionom vremenu, koji je bio veoma dobro razdvojen od prethodnih

signala, a činio je 4-5% ukupne mase ulja. Kao što je bilo i očekivano, ovaj signal je

relativno lako odvojen od ostatka ulja na preparativnoj koloni, a nakon prečišćavanja

dobijen je proizvod u vidu bezbojnog, veoma mirisnog i maloisparljivog ulja.

Elementnom analizom ovog uzorka Sergio i saradnici su došli do njegove grube

molekulske formule ‒ C14H24O2. Iz IR spektra uzorka došli su do zaključka da u molekulu

postoji nekonjugovana karbonilna grupa (ν = 1720 cm-1), dok je u UV/Vis spektru

postojao maksimum aprsorbcije na 290 nm, koji se batohromno pomerao, na 315 nm, u

baznoj sredini. Svi ovi podaci su ukazivali na prisustvo β-diketo i nezasićenog alifatičnog

fragmenta u kome dvoguba veza nije bila konjugovana ni sa jednim od karbonila. Više

infomacija dala je 1H NMR spektroskopija kojom je definitivno dokazano prisustvo

(CH3)2C=CH-CH2– fragmenta (na osnovu dva troprotonska singleta na 1,67 i 1,60 ppm, i

jednoprotonskog tripleta na 5,00 ppm, pri čemu su sva tri signala bila široka usled

daljinskog kuplovanja). Dublet na 1,20 ppm (tri protona) je pripisan sekundarnoj metil

grupi, ali je dalje deljenje ovog signala, kao i veoma složeni izgled spektra u opsegu od

0,80 do 1,35 ppm, ukazivalo da se ne radi o čistom jedinjenju, odnosno da je reč o smeši

homologih β-diketona.

Baznom hidrolizom uzorka sa 8%-tnim Ba(OH)2 u metanolu, uz dvočasovno

zagrevanje, u neutralnoj frakciji detektovan je samo jedan nezasićeni keton molekulske

formule C10H18O, dok su kiselu frakciju činile propanska (30), izobutanska (31) i

2-metilbutanska kiselina (32; šema 3.1). Analizom NMR spektra pretpostavljeno je da je

pomenuti keton 4,7-dimetilokt-6-en-3-on (29), a njegova struktura je kasnije potvrđena

koinjekcijom sintetskog uzorka ovog ketona. U tom trenutku je bilo jasno da vrlo

verovatno ovaj uzorak predstavlja smešu tri sastojka: 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-diona

(33), 2,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5-diona (34) i 3,5,7,10-tetrametilundec-9-en-4,6-

diona (35) (šema 3.1) u relativnom odnosu 4 : 5 : 1. Ovo je definitivno potvrđeno

poređenjem osobina pirazola dobijenjih tretiranjem ove smeše hidrazinom, koje je bilo

moguće razdvojiti na hromatografskoj koloni, sa osobinama pojedinačnih pirazola

14


dobijenih iz sintetskih standarda ovih β-ketona. Standardi ova tri β-diketona su

prethodno dobijeni mešovitom Claisen-ovom kondenzacijom 4,7-dimetil-6-okten-3-ona

(29) i odgovarajućeg metil-estra (metil-propanoata, -izobutanoata i -2-metilbutanoata)

u prisustvu NaNH2.

ŠEMA 3.1. STRUKTURE PRVIH β-DIKETONA KOJI SU NAĐENI U ETARSKOM ULJU VRSTE H. ITALICUM I

IDENTIFIKOVANI PROIZVODI NJIHOVE BAZNE HIDROLIZE (TJ. RETRO-CLAISEN-OVE KONDENZACIJE)

Pet godina kasnije, Manitto i saradnici (1972) su ispitivali sastav ulja biljne vrste

H. italicum sa planine Ligurian (Francuska). GC-MS analiza ovog ulja je ukazala na

postojanje 4 signala u hromatogramu, od kojih je jedan predstavljao nepoznato

jedinjenje sa molekulskim jonom na m/z 170 u masenom spektru. Na osnovu

fragmentacije u masenom spektru ovog jednjenja autori su pretpostavili da dato

jedinjenje ima acikličnu strukturu i da bi ono moglo biti jedan od četiri moguća izomera:

4,5-dimetilokta-3,6-dion (36), 4-metilnona-3,5-dion (37), 4,7-dimetilokta-3,5-dion (38)

ili 4,6-dimetilokta-3,5-dion (39; slika 3.4). Naime, odnos signala na m/z 58 i m/z 57 je

ukazivao da oba jona, i C4H9+ i C3H5O+ mogu doprineti osnovnom jonu u masenom

spektru na m/z 57 (Budzikievicz et al., 1967). Pored toga, postojanje jona parne mase na

m/z 86 je, bar delimično, moglo biti objašnjeno McLafferty-jevim premeštanjem

(Budzikievicz et al. 1967; šema 3.2 i slika 3.5).

SLIKA 3.4. PRETPOSTAVLJENE STRUKTURE DIKETONA MOLEKULSKE FORMULE C10H18O2

Prisustvo i pozicija druge karbonilne grupe u molekulu je pretpostvaljena na

osnovu nekoliko činjenica: a) fragmentacioni obrazac se nije slagao sa alkil delom od

osam C-atoma (Sharkey et al., 1956), b) prisustvo CH3CO– grupe je isključeno jer bi tada

u masenom spektru postojao mnogo intenzivniji jon na m/z 43 i c) struktura

4-metilnona-3,7-diona je isključena usled nedostatka signala na m/z 72 koji se očekuje

15


da nastane McLafferty-jevim premeštanjem koje uključuje karbonilnu grupu u položaju

7 (slika 3.5).

ŠEMA 3.2. MEHANIZAM MCLAFFERTY-JEVOG PREMEŠTANJA 4,6-DIMETILOKTA-3,5-DIONA (39)

SLIKA 3.5. MASENI SPEKTAR JEDINJENJA 4,6-DIMETILOKTA-3,5-DIONA (39) SA KARAKTERISTIČNOM

FRAGMENTACIJOM

Kako bi odredili koja od pretpostavljenih struktura odgovara nepoznatom

diketonu (36, 37, 38 ili 39) autori su sintetisali sva četiri izomera. Poređenjem

retencionih vremena i masenog spektra sintetskih diketona sa onima iz uzorka došli su

do zaključka da je struktura 39 ona prava (slika 3.4). Sličnim razmatranjem

fragmentacije u masenom spektru još jednog jedinjenja u gasnom hromatogramu, autori

su pretpostavili da je reč o β-diketonu, 2,4-dimetilhepta-3,5-dionu (40), što su kasnije i

potvrdili njegovom sintezom (slika 3.6). Nakon dobijanja sintetskih 4,6-dimetilokta-3,5-

diona (39) i 2,4-dimetilhepta-3,5-diona (40) u čistom stanju (takođe, acilovanjem

odgovarajućeg ketona), bilo je očigledno da karakterističan, neprijatan miris stabljika

vrste H. italicum potiče uglavnom od dva malo zastupljena sastojka.

SLIKA 3.6. STRUKTURE 2,4-DIMETILHEPTA-3,5-DIONA (40) I 5,7,10-TRIMETILUNDEC-9-EN-4,6-

DIONA (41)

16


Pored već pomenutih β-diketona 33, 34, 35, 39 i 40, u radovima novijeg datuma

se, kao sastojak etarskog ulja vrste H. italicum, navodi još jedan β-diketon ‒

5,7,10-trimetilundec-9-en-4,6-dion (41; slika 3.6) i to mahom u uljima koja su izolovana

iz populacija koje su rasle na ostrvima u Mediteranskom moru (Morone-Fortunato et al.,

2010; Paolini et al., 2006;), a koje pripadaju hemotipu koji karakteriše povećani sadržaj

italidiona u etarskom ulju. Međutim, ovaj β-diketon nije izolovan u čistom stanju, već je

identifikovan samo tentativno (poređenjem RI vrednosti i MS spektra). Iako je većina

β-diketona iz etarskog ulja H. italicum identifikovana još pre pedeset godina još uvek ne

postoje potpuni podaci o spektralnim karakteristikama ovih jedinjenja (u literaturi su

dostupne RI vrednosti, ali nisu dostupni ni MS, ni NMR, ni RI spektri), izuzev onih datih

u radovima Manitto i saradnika (1972) i Sergio i saradnika (1967). Razlog može biti

nemogućnost izolovanja ovih β-diketona u čistom stanju zbog veoma slične polarnosti,

zatim, složeni izgled NMR spektara (npr. sintetskih standarda) kao posledica postojanja

keto-enolne tautomerije u 1,3-diketo fragmentu pri uslovima snimanja, kao i dobijanje

smeše dijastereomernih β-diketona kao proizvoda pri standardnim uslovima mešovite

Claisen-ove kondenzacije.

3.3. BIOLOŠKA I FARMAKOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKOG ULJA, EKSTRAKATA I

SEKUNDARNIH METABOLITA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Jedan od najranije spomenutih načina medicinske upotrebe biljaka iz roda

Helichrysum u Evropi se pojavljuje u radu Grka Theophrastus od Eresosa „Historia

Plantarum“ (3 ‒ 2. vek pre nove ere), gde se navodi da „Heleiochrysos“ može biti

korišćen u tretmanu opekotina (pomešan sa medom) i uboda/ujeda otrovnih životinja

(Scarborough, 1978). Prvi zapis medicinske upotrebe Helichrysum vrsta u Južnoj Africi,

iz renesansnog perioda, pripisuje se holandskom botaničaru Hermanu Boerhaaveju, koji

je zabeležio njihovu upotrebu u tretmanu nervoze i histerije 1727. godine (Lourens et

al., 2008). Međutim, u ovim ranim zapisima lekovitih svojstava biljaka ovog roda, rod je

posmatran kao celina bez jasne naznake o kojoj je vrsti reč. Stoga, činjenica da se rod

Helichrysum danas smatra veoma kompleksim usled velike morfološke sličnosti između

pojedinih vrsta, može opravdati teškoće u tačnoj identifikaciji vrsta kako kroz istoriju,

tako i u današnje vreme (Sala, 2001).

Kao što je već napomenuto, u poslednjih nekoliko decenija, sve su brojnija

hemijska i famakološka ispitivanja biljnih vrsta ovog roda (poput H. arenarium,

H. graveolens, H. italicum i H. stoechas) koja su prevashodno bila motivisana njihovom

terapeutskom primenom u tradicionalnoj medicini (Antunes Viegas et al., 2014). Sama

vrsta H. italicum ima široku upotrebu u narodnoj medicini mediteranskih naroda

posebno kod tretmana inflamatornih i alergijskih stanja koja su povezana sa

respiratornim traktom i kožom (Antunes Viegas et al., 2014; Peris et al., 2001; Peris et

al., 1995). Zanimljivo je da je u aromaterapiji posebno istaknuta upotreba etarskog ulja

ove biljne vrste za potrebe zarastanja rana i tretmana drugih stanja kože, poput

hematoma i ožiljaka, a “njegovo dejstvo se smatra toliko ubedljivim da nikada nije bilo

17


susreta ni sa kakvom vrstom kritike uprkos nedostatku podataka o efikasnosti“

(Schnaubelt, 1999).

3.3.1. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST

Od svih blagotvornih dejstva po zdravlje ljudi za koje se tvrdi da vrsta H. italicum

poseduje, antimikrobna aktivnost ekstrakata, etarskog ulja i njihovih sastojaka je

privukla najveću pažnju naučne zajednice. U nekoliko radova je istaknuta efektivnost

ekstrakata i etarskog ulja vrste H. italicum prema Gram-pozitivnim bakterijama, dok su

se Gram-negativne bakterije pokazale otpornijim na njihovo dejstvo (Antunes Viegas et

al., 2014; tabela 3.4). Ovo je u skladu sa opšim stavom da su Gram-negativne bakterije

manje podložne dejstvu etarskih ulja, i drugih biljnih ekstrakata, od Gram-pozitivnih

bakterija, a što se dovodi u vezu sa strukturom njihovih ćelijskih zidova. Naime, kod

Gram-negativnih bakterija ćelijski zid je sastavljan od citoplazmine membrane,

periplazma i spoljne membrane i kompleksnije je strukture u odnosu na ćelijski zid

Gram-pozitivnih baktreija (slika 3.7). Spoljna membrana Gram-negativnih bakterija je ta

koja ograničava difuziju hidrofobnih molekula (koji su u najvećoj meri sastojci etarskih

ulja) kroz svoj lipopolisaharidni sloj. Ovo je jedan od razloga zašto je ove bakterije teško

iskoreniti, a njihovoj otpornosti na dejstvo antimikrobnih agenasa doprinose i drugi

mehanizmi koje su razvile, poput efluks pumpi (Guinoiseau et al., 2013).

SLIKA 3.7. STRUKTURA ĆELIJSKOG ZIDA GRAM-NEGATIVNIH I GRAM-POZITIVNIH BAKTERIJA

Prethodna ispitivanja su pokazala da i etarsko ulje i dietil-etarski ekstrakt biljne

vrste H. italicum pokazuju (koncentracijski-zavisnu) izraženu sposobnost inhibicije

rasta Gram-pozitivne bakterije Staphylococcus aureus (tabela 3.4). Među najaktivnijim

su se pokazala dva H. italicum ulja (Cui et al., 2016; Cui et al., 2015) veoma sličnog

sastava, čiji su glavni sastojci neril-acetat (4; 32,6 ‒ 33,8%), γ-kurkumen (6; 11,6 ‒

14,2%) i italidion I (4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-dion (33); 7,4 ‒ 7,5%). Za jedno od njih

je utvrđeno da pokazuje i antibiofilm aktivnost prema bakteriji S. aureus, pri čemu je

opažena i inhibicija i eradikacija stvaranja biofilma pri minimalnoj koncentaciji od MBIC

= MBEC = 2 mg/mL (Cui et al., 2016; slika 3.8). Ispitana je i antimikrobna i antibiofilm

18


aktivnost glavnih sastojaka ovog ulja i nađeno je da je najaktivniji neril-acetat (4), ali se

ovaj monoterpenski estar pokazao jednako ili manje aktivnim od samog etarskog ulja

(MIC = 0,5 mg/mL, MBC = 2 mg/mL, MBIC = MBEC = 4 mg/mL), što ukazuje na

postojanje određenog sinergističkog dejstva između sastojaka ovog etarskog ulja.

TABELA 3.4. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST RAZLIČITIH EKSTRAKATA BILJNE VRSTE H. ITALICUM PREMA

GRAM-POZITIVNIM BAKTERIJAMA

MIKROORGANIZAM EKSTRAKT MIC MBC REFERENCA

Staphylococcus aureus etarsko ulje 1,6 mg/mL 3,2 mg/mL Malenica Staver et al., 2018

50,6 μg/mL 50,6 μg/mL Djihane et al., 2017

0,5 mg/mL 1 mg/mL Cui et al., 2016

0,05% 0,05% Cui et al., 2015

5 μL/mL - Mastelic et al., 2005

0,125% - Ferrarese et al., 2005

dietil-etarski

ekstrakt

125 ‒ 500

μg/mL -

Nostro et al., 2002; Nostro et

al., 2001

Bacillus subtilis etarsko ulje 12,65 μg/mL 50,6 μg/mL Djihane et al., 2017

0,05% 0,05% Cui et al., 2015

0,06% - Ferrarese et al., 2005

dietil-etarski

ekstrakt 0,0125% - Nostro et al., 2000

Enterococcus cereus etarsko ulje 0,79 μg/mL 0,79 μg/mL Djihane et al., 2017

Micrococcus luteus etarsko ulje 6,325 μg/mL 12,65 μg/mL Djihane et al., 2017

metanolni

ekstrakt 50 μg/mL - Tundis et al., 2005

Streptococcus mutans etanolni

ekstrakt 62,5 μg/mL - Nostro et al., 2004

SLIKA 3.8. IZGLED BIOFILMA BAKTERIJE S. AUREUS POD SKENIRAJUĆIM ELEKTRONSKIM MIKROSKOPOM

(SEM): a) NETRETIRANE ĆELIJE (NEGATIVNA KONTROLA) I b) ĆELIJE NAKON TRETMANA ETARSKIM

ULJEM H. ITALICUM KONCENTRACIJE 2 mg/mL U TOKU 40 MIN (PREUZETO IZ CUI ET AL., 2016)

Nostro i saradnici (2001) su pokazali da su i meticilin-otporni i meticilin-

senzitivni sojevi S. aureus podjednako osetljivi na dejstvo dietil-etarskog ekstrakta vrste

19


H. italicum. Pored toga utvrdili su i da ovaj ekstrakt pri manjim koncentacijama od MIC

vrednosti (sub-MIC) smanjuje aktivnost enzima koje produkuje S. aureus, poput

deoksiribonukleaze, koagulaze, termonukleaze i lipaze, a koji se smatraju faktorima

virulencije. Dietil-etarski ekstrakt pri sub-MIC koncentacijama, takođe, smanjuje

sposobnost produkcije enterotoksina B i C od strane soja S. aureus (Nostro et al., 2002).

Postoje određene nedoumice po pitanju toga koji sastojci ekstrakata su odgovorni

za antimikrobnu aktivnost protiv bakterije S. aureus. Neka istraživanja ističu terpensku

frakciju (Mastelic et al., 2005), dok drugi sugerišu da ta aktivnost može biti posledica

dejstva i terpena i flavonoida (Nostro et al., 2002; Nostro et al., 2001). U svakom slučaju,

sposobnost terpena i flavonoida da interaguju sa citoplazminom membranom bakterije

S. aureus i da izazovu njenu strukturnu i funkcionalnu destabilizaciju je jedan od

mogućih načina kojim oni doprinose antibakterijskoj aktivnosti vrste H. italicum

(Nostro et al., 2001; Nostro et al., 2000).

Za razliku od antibakterijske aktivnosti, u literaturi su dostupni oskudni podaci o

dejstvu vrste H. italicum na kvasce i gljivice. Na primer, nađeno je da etarsko ulje

inhibira rast gljivice Candide albicans (Mastelic et al., 2005), veoma važnog patogenog

mikroorganizma koji može biti uzročnik kako trivijalnih oralnih i genitalnih infekcija

tako i fatalnih sistemskih infekcija kod imunokompromitovanih pacijenata (McCullough

et al., 1996). U pomenutom radu, Mastelic i saradnicu (2005) su imali za cilj da

međusobno uporede antimikrobnu aktivnost etarskog ulja i njegove ugljovodonične

(terpeni) i kiseonične (terpenoidi) frakcije na nekoliko sojeva mikroorganizama. Gram-

negativna bakterija Pseudomonas aeruginosa nije bila osetljiva na dejstvo ni jednog od

pomenutih uzoraka pri testiranim koncentracijama (MIC ≥ 8 μL/mL), dok je zabeležena

slaba aktivnost ovih uzoraka prema Escherichia coli, još jednoj Gram-negativnoj

bakteriji (MIC = 7 ‒ 8 μL/mL). Najjaču aktivnost su pokazale terpenoidna frakcija i

etarsko ulje protiv sojeva S. aureus i C. albicans (MIC = 5 μL/mL), dok je ugljovodonična

frakcija etarskog ulja, pokazala slabije antimikrobno dejstvo i prema ova dva

mikroorganizma. Na osnovu ovih rezultata pretpostavljeno je da su sastojci ulja vrste

H. italicum sa kiseoničnim funkcionalnim grupama verovatno odgovorni za njegovu

antimikrobnu aktivnost. Autori su, takođe, ukazali da uočena aktivnost može poticati od

monoterpenskih kiseoničnih jedinjenja, kao što su neril-acetat (4) i geranil-acetat

(2; Hinou et al., 1989) koji predstavljaju glavne sastojke ovog ulja, ali da ne treba

zanemariti ni mogući sinergizam između nekih minornih sastojaka. U cilju potvrde ovih

pretpostavki potrebna su dalje istraživanja koja zahtevaju ispitivanje antimikrobne

aktivnosti na većem broju sojeva i dodatno frakcionisanje terpenoidne frakcije.

Međutim, u nedavnom istraživanju, Djihane i saradnici (2017) su utvrdili da je etarsko

ulje vrste H. italicum iz Alžira izuzetno aktivno prema gljivici C. albicans (MIC = 6,325

μg/mL i MBC = 12,65 μg/mL), kao i prema drugim fungalnim mikroorganizmima, poput

Saccharomyces cerevisiae i Aspergillus niger (MIC vrednosti u opsegu od 6,325 do 50,6

μg/mL).

Vredno je istaći da je utvrđeno i da etarsko ulje H. italicum i jedan od njegovih

sastojaka, geraniol (1), pokazuju izrazitu sposobnost da povrate aktivnost nekoliko

antibiotika na koje su otporne pojedine Gram-negativne bakterije. Lorenzi i saradnici

20


(2009) su utvrdili da etarsko ulje značajno povećava efikasnost hloramfenikola protiv

otpornih sojeva bakterija Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Acinetobacter

baumannii i Pseudomonas aeruginosa, i to najverovatnije tako što blokira efluks pumpe

pomenutih mikroorganizama. Ovi rezultati su posebno značajni zbog povećanog broja

multi-rezistentnih sojeva bakterija, među kojima su Gram-negativne najproblematičnije

jer za njih trenutno postoji nedostatak efikasnih terapijskih alternativa

konvencionalnim antibioticima (Giamerllou, 2010).

3.3.1.1. MEHANIZAM ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

Cui i saradnici (2015) su na osnovu osetljivosti bakterija E. coli i S. aureus na

dejstvo etarskog ulja vrste H. italicum, izabrali ove dve bakterije kao model organizme

za dalja proučavanja mehanizma antimikrobnog dejstva pomenutog etarskog ulja. Inače,

testirano ulje je pripadalo hemotipu koji kao glavne sastojke ima neril-acetat

(4; 32,6%), γ-kurkumen (6; 11,6%) i italidion I (33; 7,4%). Ispitivanje kinetike

antimikrobnog dejstva je pokazalo da ulje nakon 2 h od aplikacije (MIC = 0,05%) dovodi

do smanjenja broja živih ćelija kod obe vrste bakterija za 50%, dok je u oba slučaja broj

živih ćelija nakon 4 h od tretmana uljem bio veoma blizak nuli (slika 3.9). Dobijeni

rezultati ukazuju da je testirano ulje jako efikasno jer je kompletna eliminacija bakterija

postignuta nakon kratkog vremena inkubiranja.

SLIKA 3.9. KINETIKA ANTIMIKROBNOG DEJSTVA ETARSKOG ULJA H. ITALICUM NA SOJEVE BAKTERIJA

E. COLI I S. AUREUS (PREUZETO IZ CUI ET AL., 2015)

U ovom radu je ispitano i dejstvo ulja H. italicum na ćelijski zid bakterija E. coli i

S. aureus. Promene u izgledu ovih bakterija pre i nakon tretmana etarskim uljem (0,1%

rastvor, 2 × MIC) su praćene pomoću Transmisionog Elektronskog Mikroskopa (TEM).

Kod oba soja uočene su očigledne morfološke promene kod tretiranih bakterija u

poređenju sa netretiranim, jer su netretirane bakterije imale normalnu, glatku

strukturu, dok se deo tretiranih bakterija deformisao i sjedinio zajedno (slika 3.10). Ovi

21


rezultati su ukazali na to da kod obe vrste bakterija dolazi do oštećenja ćelijske

membrane usled tretmana uljem (Sandasi et al., 2008). Inače, očuvanje strukturnog

integriteta ćelijske membrane je esencijalano za preživljavanje bakterija zato što se sve

osnovne biološke funkcije dešavaju unutar same ćelije (Nazzaro et al., 2013).

SLIKA 3.10. SNIMCI SA TRANSMISIONOG ELEKTRONSKOG MIKROSKOPA (TEM): a) NETRETIRANE

E. COLI, b) E. COLI TRETIRANE ETARSKIM ULJEM H. ITALICUM (0,01%), c) NETRETIRANE S. AUREUS,

d) S. AUREUS TRETIRANE ETARSKIM ULJEM H. ITALICUM (0,01%; PREUZETO IZ CUI ET AL., 2015)

Takođe, uočeno je da apsorpcija supernatanta na 260 nm nakon tretmana uljem

raste sa povećanjem koncentracije ulja, ukazujući na povećani gubitak ćelijskih

sastojaka (npr. nukleinskih kiselina). Na osnovu ovih rezulata je zaključeno da etarsko

ulje H. italicum ima sposobnost da ireverzibilno uništi membranu i omogući curenje

intracelularnih sastojaka, odnosno da ulje pri 2 × MIC i višim koncentracijama ispoljava

pre baktericidno nego bakteriostatsko dejstvo. Takođe, intenzitet fluorescencije

bakterija tretiranih uljem je bio značajno manji u poređenju sa kontrolnom grupom. Ova

merenja su pokazala da je sadržaj DNK u ćelijama bakterija E. coli i S. aureus smanjen za

58,42 , odnosno 55,89%, u poređenju sa kontrolnom grupom. Stoga je, od strane autora,

zaključeno da ispitivano etarsko ulje H. italicum može oštetiti ćelijsku membranu ovih

bakterija i dovesti do curenja DNK, smanjujući njen sadržaj u ćeliji (Cui et al., 2015).

Pored toga, metodom biolumiscencije utvrđeno je da dolazi i do smanjenja sadržaja ATP

u ćelijama tretiranih bakterija (7,35% u slučaju E. coli i 13,31% u slučaju S. aureus), koji

može biti, makar delom, posledica curenja ATP usled povećane permeabilnosti ćelijske

membrane izazvane dejstvom etarskog ulja H. italicum.

Na osnovu prethodno pomenutih eksperimentalnih rezultata, autori ovog rada,

su zaključili da se mehanizam dejstva etarskog ulja vrste H. italicum na E. coli i S. aureus

zasniva na oštećenju ćelijske membrane što dovodi do povećavanja njene

permeabilnost, odnosno vodi ka gubitku intracelularnih sastojaka kao što su materijali

22


koji absorbuju na 260 nm, DNK i ATP (slika 3.11). Sve ove promene na kraju rezultuju

razlaganjem ćelije i njenom smrću, što se odrazilo kroz smanjenje broja preživelih

bakterija. Zbog složenog sastava ispitivanog etarskog ulja deluje malo verovatno da

postoji samo jedan mehanizam delovanja, i iz tog razloga su neophodna dalja

istraživanja kako bi se u potpunosti razumeo mehanizam njegovog antimikrobnog

dejstva (Cui et al., 2015).

SLIKA 3.11. PRETPOSTAVLJENI MEHANIZAM ANTIMIKROBNOG DEJSTVA ETARSKOG ULJA H. ITALICUM

(PREUZETO IZ CUI ET AL., 2015)

3.3.2. ANTIINFLAMATORNA AKTIVNOST

Inflamacija je složeni biološki odgovor organizma na unutrašnje i spoljašnje štetne

stimuluse kao što su patogeni, mrtve ćelije, poremećaj metabolizma, fizička oštećenja i

druge iritirajuće materije. Ova reakcija ima za cilj da zaštiti organizam putem uklanjanja

štetnog stimulusa i započinjanja procesa ozdravljenja tkiva. Ponekad je potrebno

ublažiti simptome gorepomenutog imunog odgovara i u tu svrhu se primenjuju

antiinflamatorni lekovi (Guinoiseau et al., 2013).

Prva detaljna klinička ispitivanja antiinflamatornih osobina biljne vrste H. italicum

sprovedena su još sredinom prošlog veka od strane italijanskog doktora Santinija

(Santini, 1949). Uprkos tome što su dobijeni rezultati bili obećavajući, ovo istraživanje

je zanemareno jer je bilo publikovano u malo poznatom naučnom časopisu. Međutim,

otkriće kontraindikacija izazvanih upotrebom COX-2 inhibitora i trenutno interesovanje

za otkriće novih antiinflamornih agenasa je dovelo krajem prošlog veka do zakasnelog

priznanja revolucionarnog značaja ovih istraživanja (Santini, 2006).

Istraživanja novijeg datuma su pokazala da biljna vrsta H. italicum sadrži

flavonoide i derivate acetofenona i floroglucinola za koje je dokazano, u nekoliko in vivo

i in vitro modela, da poseduju izražena antiinflamatorna svojstva (Antunes Viegasa et al.,

2014; Guinoiseau et al., 2013). Arzanol (42), prenilovani heterodimerni floroglucinol α-

23


piron (slika 3.12), je identifikovan kao glavni antiinflamatorni sastojak metanolnog

ekstrakta H. italicum ekstrakta koji poseduje sposobnost da inhibira biosintezu

proinflamatornih medijatora leukotrijena i prostangladina (Bauer et al., 2011). Inače,

leukotrijeni i prostangladini su jedni od hemijskih medijatora inflamacije, koji

pojačavaju simptome same upale (dolazi do povišenja telesne temperature, bola,

stvaranja edema, itd.), a nastaju iz arahidonske kiseline pod dejstvom enzima

lipogenaze (LO), odnosno ciklooksigenaze (COX). Nesteroidni antiinflamatorni lekovi

deluju upravo tako što smanjuju produkciju prostanglandina blokirajući enzim

ciklooksigenazu (COX-1 i/ili COX-2), ali njihova klinička upotreba je ograničena zbog

niza neželjenih efekata poput oštećenja gastrointestinalnog trakta i bubrega, kao i

povećanog rizika od kardiovaskularnih tegoba (Guinoiseau et al., 2013).

U svom istraživanju, Bauer i saradnici (2011) su pokazali da arzanol (42) inhibira

iducibilnu mikrosomalnu prostaglandin (PG)E2 sintazu, COX-1 i 5-LO u in vitro uslovima

sa IC50 vrednostima u intervalu od 0,4 do 9 μM. Takođe, nađeno je da in vivo, arzanol

(42) suzbija inflamacioni odgovor kod zapaljenja plućne maramice kod pacova

indukovanog karagenanom (3,6 mg/kg, intraperitonealno) sa značajnim sniženjem

nivoa PGE2 (2,27 ng/pacov) u pleuralnim eksudatima. Pomenuti rezultati ukazuju na to

da se arzanol (42) ponaša kao potencijalni dvojni inhibitor za proinflamatorne

medijatore i inflamatorne enzime i, takođe, daju uvid u mehanizam dobro poznatog

antiinflamatornog dejstva vrste H. italicum.

Za razliku od ekstrakata i njegovih sastojaka, antiinflamatorna aktivnost etarskog

ulja vrste H. italicum je slabo proučena. Voinchet i Giraud Robert (2007) su u svom

kliničkom ispitivanju razvili efikasan protokol koji smanjuje lokalnu inflamaciju i

ubrzava nestanak edema, modrica i hematoma kod pacijenata nakon plastičnih i

rekonstrukcionih operacija grudnog koša, a koji se zaniva na desetodnevnoj oralnoj

aplikaciji 2 kapi etarskog ulja vrste H. italicum subsp. serotinum na koju se zatim

nadovezuje lokalna primena 10%-tnog rastvora ovog etarskog ulja (u ulju ploda divlje

ruže) na post-operativne ožiljke u toku 2 do 3 meseca. Testirano ulje je, takođe, sadržalo

neril-acetat (4; 30,9%), γ-kurkumen (6; 11,8%) i italidion I (33; 6,4%) kao glavne

sastojke. Pored toga, Djihane i Mihoub (2016) su utvrdili da etarsko ulje H. italicum

ispoljava in vitro antiinflamatornu aktivnost putem koncentracijski-zavisne inhibicije

denaturacije proteina (IC50 = 296 μg/mL), koja je jača u odnosu na dejstvo pozitivne

kontrole – natrijum-diklofenaka (IC50 = 590 μg/mL). Nažalost, u ovom radu nije dat

sastav testiranog etarskog ulja.

3.3.3. ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Za neke od flavonoida nađenih u vrsti H. italicum, utvrđeno je da pokazuju

antioksidativnu aktivnost koja je blisko povezana sa njihovim antiinflamatornim

svojstvima. Sala i saradnici (2003) su u svom istraživanju ispitivali antioksidativni

potencijal tri flavonoida: gnapfalina (43), pinocembrina (44) i tilirozida (45), i utvrdili

su da je među njima tilirozid (45) najaktivniji (slika 3.12). Sposobnost ovih flavonoida

kao hvatača slobodnih radikla testirana je prvo u in vitro uslovima, a zatim i u in vivo

24


uslovima u različitim modelima inflamacije. Tilirozid (45) se pokazao kao veoma dobar

inhibitor enzimske i neenzimske lipidne peroksidacije (sa IC50 vrednostiima od 12,6,

odnosno 28 μM) i kao hvatač super-oksidnog (IC50 = 21,3 μM), odnosno 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil radikala (DPPH; IC50 = 6 μM).

SLIKA 3.12. STRUKTURE ARZANOLA (42) I FLAVONOIDA (43-45) IZOLOVANIH IZ BILJNE VRSTE H.

ITALICUM KOJI POKAZUJU ANTIINFLAMATORNA/ANTIOKSIDATIVNA SVOJSTVA

U nedavnom istraživanju istaknut je i zaštitni antioksidativni efekat arzanola (42)

kod peroksidacije masti (Rosa et al., 2011). Njegov zaštitni efekat je ispitan u slučaju

oksidativnih modifikacija koje nastaju kod lipida u ljudskim lipoproteinima niske

gustine (LDL) pod uticajem Cu2+ jona, kao i kod lipida u ćelijskim membranama pod

uticajem terc-butil-hidrogenperoksida (TBH). Utvrđeno je da predtretman arzanolom

(42) (u koncentracijskom opsegu od 2 do 50 μM) u značajnoj meri štiti LDL lipoproteine

od oksidativnih oštećenja i sprečava smanjenje nivoa polinezasićenih masnih kiselina i

holesterola. Takođe, nađeno je da primena arzanola (42) (u koncentracijskom opsegu

od 1 do 50 μM), u necitotoksičnim koncentracijama, štiti VERO ćelije od TBH

indukovanog oksidativnog stresa. Na osnovu ovih rezutata, arzanol (42) je

okarakterisan kao potencijalni prirodni antioksidans sa zaštitnim efektom kada je u

pitanju oksidacija lipida u biološkim sistemima.

Ispitana je i antioksidativna aktivnost etarskog ulja H. italicum DPPH metodom i

nađena je IC50 vrednost od 1,37 mg/mL, koja je znatno viša od vrednosti određene za

etanolni ekstrakt (IC50 = 0,99 μg/mL; Kladar et al., 2015). Glavni sastojci u testiranom

etarskom ulju bili su estri nerola, neril-acetat (4; 28,2%) i neril-propanoat (10; 9,1%), i

γ- i ar-kurkumen (6 i 9; 17,8, odnosno 8,3%).

3.3.4. INSEKTICIDNA AKTIVNOST

Vrste komaraca Aedes albopictus i A. aegypti smatraju se glavnim uzročnicima

epidemija tropske i žute groznice (Vontas et al., 2012). Kako je za nekoliko etarskih ulja

već utvrđeno da pokazuju insekticidalnu i/ili larvicidalnu aktivnost protiv komaraca iz

roda Aedes (Araujo et al., 2003), Conti i saradnici (2010) su testirali i efikasnost ulja

25


H. italicum protiv larvi A. albopictus. Rezultati su pokazali da je ovo etarsko ulje izuzetno

toksično za larve A. albopictus jer je pri koncentraciji ulja od 300 ppm nivo smrtnosti

larvi dostigao 100% (LC50 = 178,1 ppm). Za etarsko ulje vrste H. italicum je pokazano da

deluje i kao repelent za komarce vrste A. aegypti. Nezavisno od koncentracije (od 0,1 do

10%) testirano ulje je bilo u stanju da odbije oko 30% komaraca. Rezultati ove dve

studije ukazuju na to da etarsko ulje vrste H. italicum predstavlja interesantan prirodni

agens koji bi možda trebalo uključiti u formulacije protiv komaraca, u kombinaciji sa

drugim aktivnim supstancama (Drapeau et al., 2009).


4. EKSPERIMENTALNI DEO

27


4.1. HEMIKALIJE

Sve hemikalije koje su korišćene u radu (p.a. čistoće): sumporna kiselina (H2SO4),

hlorovodonična kiselina (HCl), fosforna kiselina (H3PO4), tioglikolna kiselina, natrijum-

hlorid (NaCl), kalijum-hlorid (KCl), dinatrijum-hidrogenfosfat (Na2HPO4), kalijum-

dihidrogenfosfat (KH2PO4), natrijum-nitrit (NaNO2), 2,3,5-trifeniltetrazolijum-hlorid

(TTC), sulfanilamid, N-1-naftiletilendiamin, 5-flurouracil, kao i rastvarači: dietil-etar

(Et2O), dimetilsulfoksid (DMSO), izopropanol (iPrOH), heksan nabavljeni su od sledećih

kompanija: Sigma-Aldrich (Sent Luis, Misuri, SAD), Acros Organics (Morris Plains, Nju

Džersi, SAD), Merck (Darmštat, Nemačka), J. T. Baker (Deventer, Holandija) i Zorka

(Šabac, Srbija). Rastvarači su neposredno pre korišćenja predestilovani, dok su ostale

hemikalije upotrebljavane bez prethodnog prečišćavanja.

4.2. METODE ANALIZE

4.2.1. GASNA HROMATOGRAFIJA-MASENA SPEKTROMETRIJA (GC-MS)

GC-MS analiza etarskih ulja i hromatografskih frakcija izvršena je na aparatu HP

6890N, opremljenim sa DB-5MS kapilarnom kolonom (5% fenilmetilsiloksan, 30 m ×

0,25 mm, debljina filma 0,25 mm, Agilent Technologies, Santa Klara, SAD), koji je bio

direktno kuplovan sa 5975B, masenim detektorom iste kompanije. Kao noseći gas,

korišćen je helijum, sa konstantnim protokom od 1 mL/min. Temperaturni uslovi: radna

temperatura injektora i detektora 250 °C, odnosno 320 °C; linearni temperaturni

program zagrevanja kolone u opsegu od 70 do 315 °C, sa brzinom rasta temperature od

5 °C/min, a zatim izotermalni period u trajanju od 10 minuta. Injektirano je 1 µL

rastvora uzorka u etru (10 mg u 1 mL dietil-etra), u pulsnom split modu (40 : 1), pri

protoku od 1,5 mL/min u prvih 30 sekundi, a zatim 1,0 mL/min do kraja analize.

Jonizacija je vršena elektronima energije 70 eV, sa akvizicijom u m/z opsegu 35‒650 i

dužinom trajanja jednog skena od 0,32 s. Procentualni sastav pojedinih sastojaka

određen je na osnovu površina pikova, bez korišćenja korekcionih faktora.

Obrada TIC hromatograma (TIC = Total Ion Current) i masenih spektara vršena je

u programu MestReNova (ver. 6.0.2-5475, Mestrelab Research, Santiago de Compostela,

Španija).

4.2.1.1. IDENTIFIKACIJA SASTOJAKA

Podaci su obrađeni pomoću MSD ChemStation softvera (ver. D.03.00.611, Agilent

Technologies, Santa Klara, SAD) u kombinaciji sa AMDIS (Automated Mass Spectral

Deconvolution and Identification System, ver. 2.70) i NIST MS Search programskim

paketom (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST), SAD). AMDIS je

korišćen za dekonvoluciju masenih skenova, tj. ekstrakciju masenih spektara iz

preklopljenih pikova, dok je NIST MS Search obezbedio algoritam za pretragu biblioteka

masenih spektara. Hemijski sastav ispitivanih uzoraka određen je upoređivanjem

28


linearnih retencionih indeksa pojedinih sastojaka, izračunatih u odnosu na seriju C8‒C25

alkana (van den Dool i Kratz, 1963), sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007),

poređenjem masenih spektara sa spektrima poznatih jedinjenja iz biblioteka Wiley

Registry of Mass Spectral Data 9th Edition, NIST/EPA/NIH MassSpectral Library 11,

MassFinder 2.3, Adams (Adams, 2007) i MS biblioteke "OSA" (Organic Synthesis and

Analysis) istraživačke grupe, na Departmanu za hemiju, PMF-a u Nišu, kao i

koinjektiranjem standardnih supstanci (alkani, alkoholi, ketoni, diketoni, monoterpeni,

monoterpenski estri, seskviterpeni, itd.).

4.3. METODE RAZDVAJANJA

4.3.1. TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA (TLC)

TLC je vršena na aluminijumskim pločama sa prethodno nanešenim slojem

silika-gela 60 UV254 (Merck, Darmštat, Nemačka). Kao eluenti su korišćene smeše

heksana i dietil-etra različite polarnosti. Mrlje na TLC-u su vizualizovane pomoću UV

lampe (254 i 365 nm) i izazivane 50%-tnom H2SO4 (aq.), nakon čega su ploče zagrevane

u sušnici na 80 °C.

4.3.2. DRY FLASH HROMATOGRAFIJA

Za preparativno razdvajanje pomoću dry flash hromatografije korišćena je

jednostavna aparatura koja se sastojala od kolone silika-gela 60 (20-45 m, Carl Roth

GmbH + Co.KG, Karlsrue, Nemačka), napakovane na sinterovanom staklenom levku

srednje poroznosti i veličine, i standardne boce za vakuum filtraciju. Eluiranje je vršeno

pod gradijentnim uslovima smešom heksan/dietil-etar.

4.4. ODREĐIVANJE HEMIJSKOG SASTAVA ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE H.

ITALICUM

Hemijski sastav četiri komercijalna etarska ulja biljne vrste H. italicum sa tržišta

Belgije (ulje 1), Francuske (ulje 2) i Srbije (ulja 3 i 4) je određen GC-MS analizom i dat

je u tabeli 5.1. Hemijski sastav sva četiri ulja je jako složen, pa je u cilju određivanja

doprinosa pojedinih sastojaka, ili klasa jedinjenja, ukupnoj antiinflamatornoj aktivnosti

etarskog ulja H. italicum, ulje 2 podvrgnuto frakcionisanju pomoću dry flash

hromatografije.

4.4.1. HROMATOGRAFSKO RAZDVAJANJE ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Uzorak komercijalnog etarskog ulja sa francuskog tržišta (ulje 2) je podvrgnut

dry flash hromatografiji na koloni silika-gela 60. Primenjen je gradijent od čistog

29


heksana do čistog dietil-etra. Tok hromatografije je praćen pomoću TLC analize.

Dobijeno je ukupno 30 frakcija, a od toga je šest frakcija korišćeno za dalja ispitivanja

antiinflamatorne aktivnosti. Na osnovu GC-MS analize je određen njihov sastav koji je

dat u tabeli 5.5.

4.5. ISPITIVANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

4.5.1. KORIŠĆENI MIKROORGANIZMI

Za određivanje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja korišćeno je pet Gram-

pozitivnih sojeva bakterija, četiri Gram-negativna i jedan fungalni mikroorganizam

(tabela 4.1). Svi korišćeni mikroorganizmi pripadaju referentnim sojevima American

Type Culture Collection (ATCC).

TABELA 4.1. MIKROORGANIZMI KORIŠĆENI ZA ISPITIVANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

GRAM-POZITIVNE BAKTERIJE

Bacillus cereus ATCC 11778

Enterococcus faecalis ATCC 19433

Sarcina lutea ATCC 9431

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

GRAM-NEGATIVNE BAKTERIJE

Acinetobacter baumannii ATCC 19606

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Escherichia coli ATCC 8739

Salmonella enterica ATCC 13076

KVASCI

Candida albicans ATCC 10231

4.5.2. TESTIRANJE IN VITRO ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

Ispitivanje antimikrobne aktivnosti vršeno je mikrodilucionom metodom

(Clinical and Laboratory Standards Institute, 2007). Određivanje minimalne inhibitorne

koncentracije (MIC) vršeno je metodom serije razblaženja na mikrotitarskim pločama

sa 96 bunarića. Bakterije su kultivisane na Miler Hinton (Mueller Hinton) agru (MHA;

Merck, Darmštat, Nemačka), na 37 °C, a gljivice na Sabouraud dekstroznom agru (SDA;

Difco Laboratories, Detroit, SAD), na 30 °C. Posle 18 časova kultivisanja, napravljena je

bakterijska suspenzija u Miler Hinton bujonu, pri čemu je broj mikroorganizama

standardizovan na 0,5 jedinica na Mekfarlandovoj (McFarland) skali što je praćeno

turbidimetrijskom metodom. Konačna koncentracija bakterijskog inokuluma iznosila je

5 × 105 CFU/mL. Suspenzije gljivica su napravljene u Sabouraud dekstroznom agru

(SDA). Broj živih mikroorganizama utvrđen je korišćenjem hemocitometra (za

30


bakterije) i prebrojavanjem u Thoma chamber (za gljivice). Fungalni inokulum je iznosio

1 × 104 CFU/mL.

Uzorci za testiranje su pripremljeni rastvaranjem u 10%-tnom vodenom

rastvoru DMSO-a. Početna koncentracija uzoraka za testiranje iznosila je 10 mg/mL. Za

svaki uzorak je, razblaživanjem u odnosu 1 : 1, napravljena serija od 10 razblaženja

osnovnog rastvora. Mikrotitarske ploče (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsrue, Nemačka)

su, nakon dodavanja inokuluma, u bunariće ploče, inkubirane na 37 °C u toku 24 časa

(bakterije) ili na 30 °C u toku 48 časa (gljivice). Rast bakterija je vizualizovan

dodavanjem 20 µL 0,5%-tnog vodenog rastvora 2,3,5-trifeniltetrazolijum-hlorida (TTC).

Streptomicin i Nistatin (Galenika, Beograd, Srbija) su korišćeni kao pozitivne, a DMSO

kao negativna kontrola. MIC je definisan kao najniža koncentracija ispitivanog uzorka

koja sprečava vidljiv rast mikroorganizma (crveno obojenje na dnu bunarića nakon

dodavanja TTC-a). Testovi su ponavljani tri puta.

4.6. ISPITIVANJE ANTIINFLAMATORNE AKTIVNOSTI

4.6.1. LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE

Za eksperimente su korišćeni mužjaci pacova soja Wistar, telesne mase od 200

do 250 g, koji su uzgajani u Vivarijumu Naučno-istraživčkog centra za biomedicinu pri

Medicinskom fakultetu, Univerziteta u Nišu. Životinje su čuvane u standardnim

laboratorijskim uslovima (temperatura prostorije je održavana na 22 ± 2 ○C, vlažnost

vazduha na 60%, dok je ritam dana i noći bio podešen (12/12 h)). Hrana i voda bile su

dostupne 24 h dnevno svim životinjama. Svi eksperimentalnti su prethodno odobreni

od strane lokalnog Etičkog komiteta (No. 323-07-06862/2016-05/2) i sprovedeni su u

skladu sa Helsinškom deklaracijom i Direktivama Evropske zajednice o upotrebi

laboratorijskih životinja u eksperimentima (EU Directive of 2010; 2010/63/EU).

4.6.2. IZOLOVANJE I KULTIVISANJE MAKROFAGA

Izolovanje elicitiranih peritonealnih makrofaga izvršeno je standardnom

procedurom (Radulović et al., 2017). Sedam dana nakon intraperitonealne injekcije

rastvora 0,05% tioglikolne kiseline u fiziološkom rastvoru (0,9% NaCl), kada veliku

većinu ćelija u peritoneumskom egzudatu čine makrofazi, peritoneum žrtvovanih

životinja je ispran sa 10 mL PBS-a (Phosphate Buffered Saline), a peritoneumske ćelije su

sakupljanje aspiracijom uz pomoć šprica. Ćelijska suspenzija je zatim centrifugirana

(1200 rpm, 10 min na 4 ○C), a dobijeni ćelijski talog je resuspendovan u 1 mL

kultivacionog medijuma (RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Voltam, SAD) koji je bio

obogaćen fetalnim goveđim serumom u finalnoj koncentraciji od 10%). Nakon

resuspenzije izvršeno je brojanje izolovanih ćelija, korišćenjem metode koja uključuje

bojenje ćelija triptan-plavim, u Neubauer komorici za brojanje ćelija. Finalna

31


koncentracija ćelija podešena je na 2,5 × 106 živih ćelija po mL, pri čemu je vijabilnost u

čitavoj suspenziji ćelija bila veća od 95%.

4.6.3. ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI MAKROFAGA MTT TESTOM

(3-(4,5-Dimetil(tiazol-2-il)-3,5-difenil)-tetrazolijum-bromid (MTT) je

tetrazolijum so žute boje, koja može biti supstrat sukcinat-dehidrogenaze, jednog od

enzima u Krebs-ovom ciklusu, a kao proizvod ove reakcije nastaje fromazanski

precipitat, tamno ljubičaste boje (šema 4.1). S obzirom na to da se ova konverzija

događa samo u ćelijama koje su metabolički aktivne, merenjem količine nastalog

formazana moguće je proceniti broj živih metabolički aktivnih ćelija (Grela et al., 2018).

ŠEMA 4.1. METABOLIČKA TRANSFORMACIJA MTT U FORMAZAN

Za određivanje vijabilnosti makrofaga MTT testom korišćena je metoda

Radulovića i saradnika (2017). Iz podešene suspenzije makrofaga po 100 μL je dodato u

bunariće mikrotitarske ploče (sa 96 mesta) da se prvo ćelije adheriraju za površinu

bunarića tokom 1,5 h. Nakon perioda adherencije u bunariće je dodat sveže

pripremljeni RPMI medijum koji je sadržao različite koncentracije etarskih ulja

H. italicum (od 0,1 do 1 × 10‒5 mg/mL) ili hromatografskih frakcija ulja 2 (od 0,1 do 1 ×

10‒5 mg/mL). Ćelije su zatim gajene pri standardnim uslovima na 37 °C, u atmosferi 5%-

tnog (v/v) CO2 tokom 24 h. Po isteku perioda inkubacije, supernatant je odbačen i u

svaki bunarić je dodat rastvor MTT-a (5 mg/mL) u PBS-u. Kristali formazana, koji su se

formirali nakon 4 h, rastvoreni su u zakišeljenom izopropanolu (0,04 M HCl u iPrOH) i

određena je absorbanca rastvora u svakom bunariću na talasnoj dužini od 540 nm

(Multiscan Ascent, Labsystems, Finska). Kao negativna kontrola korišćen je RPMI

medijum, a kao pozitivna 5-fluorouracil (4 × 10‒8 ‒ 7 × 10‒6 mol/L). Citotoksičnost je

iskazana kao % preživelih ćelija pri određenoj koncentraciju ulja ili frakcija u odnosu na

odgovarajuću negativnu kontrolu. Svi eksperimenti su rađeni u triplikatu i ponovljeni

dva puta.

4.6.4. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO OD STRANE MAKROFAGA

Azot-monoksid (NO) je signalni molekul čija se produkcija od strane makrofaga

povećava u uslovima inflamacije. Jedna od najprimenjivanijih metoda za određivanje

koncentracije NO u biološkim uzorcima zasniva se na formiranju diazo-boje u reakciji

32


NO2‒ jona (koji nastaju spontanom oksidacijom NO pri fiziološkim uslovima) sa Griess-

ovim reagensom. Naime, u prisustvu nitrita, u kiseloj sredini, prvo dolazi do

diazotovanja sulfanilamida, a nastala diazonijum so zatim podleže diazo-kuplovanju sa

N-1-naftiletilendiaminom dajući odgovarajuću diazo boju tamno ljubičaste boje (šema

4.2; Giustarini et al., 2008).

ŠEMA 4.2. PRIKAZ HEMIJSKIH REAKCIJA KOJE SE ODVIJAJU PRI ODREĐIVANJU KONCENTRACIJE NO

GRIESS-OVOM METODOM

Makrofagi (1 × 106 ćelija po mL) su inkubirani sa etarskim uljima H. italicum

(u koncentraciji od 0,1 do 1 × 10‒5 mg/mL) u prisustvu lipopolisaharida koji je izolovan

iz bakterije Escherichia coli (LPS (Sigma-Aldrich, Sent Luis, Misuri, SAD); 1 μg/mL)

tokom 24 h. Nakon toga koncentracija NO u supernatantima je izmerena na osnovu

količine formiranih nitritnih jona pomoću Griess-ove reakcije (Radulović et al., 2017).

Jednake zapremine supernatanta i Griess-ovog reagensa (koji je pripremljen neposredno

pre testa) su pomešane, a nakon 10-15 minuta izmeren je intenzitet razvijene boje

rasvora u svakom od bunarića na talasnoj dužini od 545 nm (Multiscan Ascent,

Labsystems, Finska). Koncentracija NO je izračunata korišćenjem kalibracione krive

dobijene na osnovu uzoraka poznatih koncentracija NaNO2 (od 1 μM do 40 μM). Kao

negativna kontrola korišćen je RPMI medijum bez LPS-a, a kao pozitivna 5-flurouracil

(1 × 10‒5 mol/L). Svi eksperimenti su rađeni u triplikatu i ponovljeni dva puta.

4.7. STATISTIČKA ANALIZA

Jednostrana analiza varijanse (ANOVA) korišćena je za statističku obradu

dobijenih podataka i utvrđivanja značajnosti razlika između srednjih vrednosti. U svim

statističkim analizama, interval poverenja bio je 95%.

4.7.1. MULTIVARIJANTNA ANALIZA - METODA ANALIZE GLAVNE KOMPONENTE

Metoda analize glavne komponente (PCA) vršena je pomoću EXCEL plug-in

programa XLSTAT, verzije 2018.3. Metoda je primenjena na sledećim setovima varijabli:

vrednosti dobijene pri testiranju in vitro antimikrobne ili antiinflamatorne aktivnosti sa

(i) originalnim varijablama (procentualni sadržaj sastojaka koji je veći od 1% u makar

jednom od analiziranih etarskih ulja ili jednoj od hromatografskih frakcija) ili (ii)

33


sumama procenata klasa jedinjenja (diketoni (DK), ketoni (K), hemiterpenski estri (HE),

monoterpenski estri (ME), neoksigenovani monoterpeni (M), oksigenovani

monoterpeni (M*), neoksigenovani seskviterpeni (S), oksigenovani seskviterpeni (S*) i

ostalo (O) – kao deveta klasa). Povezanost između dve varijable u setu je procenjena na

osnovu vrednosti njihovog Pearson-ovog koeficijenta korelacije (κ) i to kao: veoma slaba

(0,0 ‒ 0,19), slaba (0,20 ‒ 0,39), osrednja (0,40 ‒0,59), jaka (0,60 ‒ 0,79) i veoma jaka (≥

0,80; Evans, 1996).


5. REZULTATI I DISKUSIJA

35


5.1. HEMIJSKI SASTAV ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Sastav četiri komercijalna etarska ulja biljne vrste H. italicum sa tržišta Belgije

(ulje 1), Francuske (ulje 2) i Srbije (ulja 3 i 4) je dat u tabeli 5.1. U ulju 1 je

identifikovano ukupno 97 sastojaka koji su činili 98,7% ovog ulja, u ulju 2

identifikovano je 85 sastojaka koji su činili 97,7% ovog ulja, u ulju 3 je identifikovano

79 sastojaka koji su činili 96,8% ovog ulja, dok je u ulju 4 identifikovano 82 sastojaka,

što je predstavljalo 95,8% tog ulja. Terpeni su bili najzastupljenija klasa (> 85%) kod

sva četiri ulja sa mnogo većim udelom seskviterpena (50,8%-ulje 3 i 55,2%-ulje 4) u

odnosu na monoterpene (38,5%-ulje 3 i 32,3%-ulje 4) u uzorcima 3 i 4. Suprotan trend

je opažen kod uzorka 2 (54,7% monoterpena naspram 29,8% seskviterpena), dok je

njihov sadržaj u uzorku 1 bio gotovo podjednak (46,9% monoterpena i 47,7%

seskviterpena). Među monoterpenima u uljima 2 i 4 su dominirali monoterpenski estri

(42,7% i 20,7%), od kojih je nazastupljeniji bio neril-acetat (4), u uzorku 3

ugljovodonični monoterpeni (24,7%) sa α-pinenom (5) kao najzastupljenijim

jedinjenjem iz ove klase, dok je u uzorku 1 sadržaj ugljovodoničnih monoterpena i

monoterpenskih estara bio skoro podjednak (21,1% i 23,7%). Sadržaj oksigenovanih

monoterpena bio je relativno mali u svim uljima (2,1 ‒ 5,6%) jer su u najvećoj meri

(prevashodno nerol) bili vezani u obliku estara. Hemiterpeni su u svim uzorcima bili

prisutni, takođe, u obliku estara i to u vrlo malim količinama (0,6 ‒ 2,2%), pri čemu je

najzastupljeniji hemiterpenski estar bio 2-metilbutil-angelat (42; 0,4% ‒ 1,2%). Sadržaj

ugljovodoničnih seskviterpena (poput γ- i ar-kurkumena (6 i 9), β-selinena (7); 22,6 ‒

48,3%) bio je mnogo veći u odnosu na oksigenovane seskviterpene (2,5 ‒ 7,9%) u svim

uljima. Glavni sastojak u uljima 1, 2 i 4 bio je neril-acetat (4; sa 21,2%, 35%, odnosno

15,5%), dok je glavni sastojak u ulju 3 bio α-pinen (5; 19,9%). Drugi najzastupljeniji

sastojak u sva četiri ulja bio je γ-kurkumen (6; sa 16,8%, 10,2%, 12%, odnosno 10%), sa

izuzetkom ulja 1, gde je i α-pinen (5) bio prisutan u istom procentu kao i γ-kurkumen

(6; 16,8%; tabela 5.1).

Iako je samo za ulje 2 poznato (na osnovu navoda proizvođača) da je dobijeno iz

samoniklih biljaka podvrste italicum sa Korzike, odnos količina glavnih sastojaka u

ostala tri ulja, kao i poznata geografska rasprostranjenost podvrste italicum, ukazuje da

su i ona verovatno dobijena iz biljnog materijala ove podvrste. Hemijski sastav ulja 2 je

u skladu sa rezultatima prethodnih ispitivanja etarskih ulja H. italicum subsp. italicum

sa Korzike (Bianchini et al., 2009; Bianchini et al., 2003; Bianchini et al., 2001; Peyron et

al., 1978), odnosno ovo ulje pripada hemotipu (tzv. „Korzikansko ulje“) bogatom neril-

acetatom (4; 35,0%), γ-kurkumenom (6; 10,2%) i neril-propanoatom (10; 5,6%). Ulja 3

i 4 su dobijena iz populacija smilja uzgajanih na plantažama u jugoistočnoj Srbiji, dok je

ulje 1 (prema navodima proizvođača) dobijeno od samoniklih biljaka sakupljenih na

teritoriji Italije i Bosne i Hercegovine. Ulje 3 se odlikuje visokim sadržajem α-pinena (5;

19,9%) i značajno manjom zastupljenošću neril-acetata (4; 9,2%) u odnosu na hemotip

ulja 1 i najpribližnije je po sastavu etarskim uljima dobijenim iz biljnog materijala

skupljenog u bivšoj Jugoslaviji i duž obale Jadranskog mora (tzv. „Balkansko ulje“;

Blažević et al., 1995; Leimner et al., 1984; Malenica Staver et al., 2018; Weyerstahl et al.,

36


1985). Za hemotip ulja 3 karakteristično je i da se u većem procentu u ulju nalaze i

γ-kurkumen (6; 12%), β-selinen (7; 7,9% ) i (E)-β-kariofilen (8; 4,3%). Ulje 4 je slično

po sastavu ulju 3 izuzev u pogledu znatno manjeg udela α-pinena (5; 4,9%) i nešto

većeg sadržaja neril-acetata (4; 15,5%). Prethodno je već pokazano da može doći do

upravo pomenutih varijacija u sastavu balkanskog hemotipa pod uticajem ekoloških

faktora i u zavisnosti od faze vegetativnog ciklusa biljke (Blažević et al., 1995). Ulje 1 je

veoma neobičnog sastava u pogledu toga da sadrži visok procenat i α-pinena (5; 16,8%)

i neril-acetata (4; 21,2%).

Analiza je pokazala da se hemijski sastav komercijalnih ulja smilja međusobno

značajno razlikuje kako u pogledu sadržaja glavnih sastojaka, tako i u pogledu količina

pojedinih klasa jedinjenja (poput ugljovodoničnih monoterpena i seskviterpena,

monoterpenskih estara i diketona) i nekih manje zastupljenih sastojaka (poput nerola

(11), rozifoliola, 2-metilbutil-angelata, 2,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5-diona (34), itd.).

Uočene razlike u sastavu ova četiri ulja mogle bi se objasniti time da su populacije biljne

vrste H. italicum iz koji su izolovana etarska ulja pripadale različitim hemotipovima ove

biljne vrste, i/ili da je do razlika u sastavu došlo pod uticajem različitih uslova životne

sredine u kojima su biljke rasle (Bianchini et al., 2009; Bianchini et al., 2001; Ložiene i

Venskutonis, 2005; Melito et al., 2016; Purohit i Vyas, 2004).

TABELA 5.1. HEMIJSKI SASTAV ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

RIi JEDINJENJE ULJE 1 ULJE 2 ULJE 3 ULJE 4

KLASA METODA

INDENTIFIKACIJEiii %ii

802 2-Metil-2-hepten 0,1 0,2 0,1 –iv O MS, RI

817 4-Metil-3-heksanon 0,1 0,3 0,1 0,1 K MS, RI

900 Nonadekan trv tr – tr O MS, RI, CoI

909 Triciklen tr tr 0,1 tr M MS, RI

928 α-Tujen tr – tr – M MS,RI,CoI

936 α-Pinen 16,8 1,7 19,9 4,9 M MS, RI, CoI

949 α-Fenhen 0,5 0,2 0,6 0,2 M MS, RI

951 Kamfen tr 0,2 tr tr M MS, RI, CoI

981 β-Pinen 0,4 0,4 0,5 0,2 M MS, RI, CoI

992 β-Mircen 0,1 0,1 tr tr M MS, RI, CoI

992 2-Pentilfuran tr – – – O MS, RI

995 trans-Dehidroksilinalool-

oksid

– 0,1 – – M* MS, RI

1003 2-Metilpropil-2-

metilbutanoat

tr tr 0,1 tr HE MS, RI, CoI

1006 (3Z)-Heksenil-acetat – – tr – O MS, RI, CoI

1008 α-Felandren tr 0,1 – – M MS, RI

1010 cis-Dehidroksilinalool-

oksid

– tr – – M* MS, RI

1015 3-Metilbutil-2-

metilpropanoat

– – tr – HE MS, RI, CoI

1019 α-Terpinen 0,1 0,1 0,1 0,1 M MS, RI

1022 p-Metilanizol tr – – – O MS, RI

37


NASTAVAK TABELE 5.1

1026 p-Cimen 0,2 0,3 0,3 0,3 M MS, RI, CoI

1031 Limonen 2,6 3 3,1 2,1 M MS, RI, CoI

1034 Eukaliptol (syn.vi 1,8-sineol)

0,4 0,6 0,3 0,2 M* MS, RI, CoI

1047 (E)-β-Ocimen tr 0,1 tr tr M MS, RI, CoI

1049 2-Metilpropil-angelat 0,1 0,1 0,5 0,3 HE MS, RI, CoI

1060 γ-Terpinen 0,3 0,4 0,2 0,1 M MS, RI

1091 2-Nonanon – 0,3 – – K MS, RI

1091 Terpinolen 0,2 – 0,1 0,1 M MS, RI

1099 2,4-Dimetilhepta-3,5-dion

(diketo tautomer)

– tr – – DK MS, RI, CoI

1101 Linalool 0,4 1,4 1,1 0,8 M* MS, RI, CoI

1104 2-Metilbutil-2-

metilbutanoat

tr 0,1 0,2 0,1 HE MS, RI, CoI

1110 Butil-angelat tr – – – HE MS, RI, CoI

1112 Nepoznato jedinjenje 1vii – tr – –

1117 endo-Fenhol tr tr tr tr M* MS, RI,CoI

1142 Pinokarveol tr – – – M* MS, RI

1148 3-Metilbutil-angelat tr tr tr tr HE MS, RI, CoI

1153 2-Metilbutil-angelat 0,4 0,4 1,2 0,8 HE MS, RI, CoI

1155 Nerol-oksid 0,1 0,2 – – M* MS, RI, CoI

1169 Borneol 0,1 0,1 tr tr M* MS, RI, CoI,

1169 Nepoznato jedinjenje 2vii – tr – –

1180 Terpinen-4-ol 0,2 0,4 0,2 0,1 M* MS, RI, CoI

1188 4,6-Dimetilokta-3,5-dion

(diketo tautomer)

0,2 0,5 0,3 0,2 DK MS, RI, CoI

1194 α-Terpineol 0,3 0,6 0,2 0,2 M* MS, RI, CoI

1201 Metilčavikol – tr – – O MS, RI, CoI

1206 Dekanal tr – – tr O MS, RI, CoI

1230 Nerol 0,7 2,3 0,4 0,6 M* MS, RI, CoI

1233 4,6-Dimetilokta-3,5-dion

(keto-enolni tautomer)viii

tr 0,1 – – DK MS, RI, CoI

1237 Heksil-2-metilbutanoat – – tr – HE MS, RI, CoI

1258 Nepoznato jedinjenje 3vii tr 0,1 tr 0,1

1263 Nepoznato jedinjenje 4vii tr tr tr –

1280 (3Z)-Heksenil-angelat – – tr – HE MS, RI, CoI

1281 Neril-formijat tr tr – – ME MS, RI, CoI

1286 Heksil-angelat 0,2 – 0,3 0,1 HE MS, RI, CoI

1288 Anetol – tr – – O MS, RI

1292 Timol – – – tr M* MS, RI,CoI

1294 2-Undekanon tr 0,1 – – K MS, RI, CoI

1300 Tridekan – tr – – O MS, RI, CoI

1302 Karvakrol – – – 1,7 M* MS, RI,CoI

1349 α-Terpinil-acetat 0,2 tr – – ME MS, RI

1371 Neril-acetat 21,2 35 9,2 15,5 ME MS, RI, CoI

1371 Nepoznato jedinjenje 5vii 0,3 – 0,3 0,3

http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Author=Andriamaharavo%2C+N.R.&Units=SI&Mask=2200

38


NASTAVAK TABELE 5.1

1375 Karvakril-acetat – – – tr ME MS, RI

1376 α-Ilangen 0,2 – 0,3 0,2 S MS, RI

1381 α-Kopaen 2,2 – 2,3 2,2 S MS, RI

1382 iso-Italicen – 0,8 – – S MS, RI

1384 Geranil-acetat 0,2 0,1 – – ME MS, RI, CoI

1400 Tetradekan tr – – – O MS, RI, CoI

1410 Italicen 3,6 3,1 3,2 3,2 S MS, RI

1419 cis-α-Bergamoten 1,1 0,4 0,9 0,8 S MS, RI

1425 (E)-β-Kariofilen 3,5 0,1 4,3 4,3 S MS, RI, CoI

1439 trans-α-Bergamoten 0,9 0,3 0,9 0,9 S MS, RI

1445 4,6,9-TrimetIldec-8-en-

3,5-dion (diketo tautomer)

1,1 3,4 1,2 1,6 DK MS, RI, CoI

1447 Gvaja-6,9-dien 0,5 – 0,8 0,7 S MS, RI

1449 4,6,9-Trimetildec-8-en-3,5-dion (keto-enolni tautomer)viii


1456 Neril-propanoat 1,2 5,6 1,5 2,5 ME MS, RI, CoI


1459 (E)-β-Farnezen – 0,4 – – S MS, RI, CoI

1464 Murola-4,11-dien 0,2 0,6 – – S MS,RI

1469 α-Akoradien 0,4 0,5 0,4 0,4 S MS, RI

1472 β-Akoradien 0,4 0,7 0,4 0,4 S MS, RI

1474 4,5-di-epi-Aristolohen tr – tr tr S MS, RI

1480 Selina-4,11-dien 1,3 – 2,2 2,1 S MS, RI

1484 γ-Kurkumen 16,8 10,2 12 10 S MS, RI, CoI

1487 2,4,6,9-Tetrametildec-8-

en-3,5-dion, dijastereomer

I (diketo tautomer)

0,5 2,7 1 1,1 DK MS, RI, CoI

1492 ar-Kurkumen 2,6 4 3,9 5,5 S

1492 2,4,6,9-Tetrametildec-8-

en-3,5-dion, dijastereomer

II (diketo tautomer)

0,8 3,5 2 2,4 DK MS, RI, CoI

1493 β-Selinen 5,2 – 7,9 8,3 S MS, RI

1498 α-Zingiberen – tr – – S MS, RI

1501 α-Selinen 3,5 – 5,4 5,3 S MS, RI

1504 α-Murolen 0,4 – 0,6 0,5 S MS, RI

1511 β-Bisabolen 0,5 0,4 0,6 0,5 S MS, RI

1513 2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion (keto-enolni tautomer)viii


1515 β-Kurkumen 0,5 0,8 0,5 0,4 S MS, RI

1519 γ-Kadinen 0,4 – 0,4 0,4 S MS, RI

1520 10-epi-Italicen-etar – 0,2 – – S* MS, RI

1523 7-epi-α-Selinen 0,1 – 0,1 0,1 S MS, RI

1527 Nepoznato jedinjenje 7vii – 0,2 – –

1528 δ-Kadinen 0,8 – 1 1 S MS, RI

1535 (E)-γ-Bisabolen 0,1 0,1 0,2 tr S MS, RI

39


NASTAVAK TABELE 5.1

1537 trans-Kadina-1,4-dien tr – tr – S MS, RI

1538 Italicen-etar 0,2 0,4 – 0,2 S* MS, RI

1541 Fenetil-angelat 0,1 tr – – HE MS, RI, CoI

1545 trans-α-Bisabolen 0,1 0,2 0,2 tr S MS, RI

1548 α-Kalakoren tr – tr tr S MS, RI

1565 (E)-Nerolidol tr 0,2 – 0,2 S* MS, RI

1574 (3Z)-Heksenil-benzoat – tr – – O MS, RI

1578 3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer I (diketo tautomer)

0,2 0,5 0,3 0,6 DK MS, RI, CoI

1578 Neril-2-metilbutanoat 0,2 0,5 0,3 0,6 ME MS, RI, CoI

1584 3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer II (diketo tautomer)

0,4 1,2 0,5 1,1 DK MS, RI, CoI

1584 Neril-3-metilbutanoat 0,4 1,2 0,6 1,1 ME MS, RI, CoI

1588 Kariofilen-oksid 0,3 – 0,7 1,3 S* MS, RI, CoI

1598 Nepoznato jedinjenje 8vii tr 0,3 – 0,1

1602 Gvajol 0,2 1,2 0,2 0,6 S* MS, RI

1610 Kopaborneol 0,2 – 0,2 0,4 S* MS, RI

1614 Rozifoliol 0,5 2,3 0,6 2,5 S* MS, RI


1622 Nepoznato jedinjenje 10vii – – – 0,2

1626 10-epi-γ-Eudezmol – tr – – S* MS, RI

1628 Neril-angelat 0,2 0,3 tr 0,4 ME MS, RI

1637 γ-Eudezmol 0,1 0,5 0,1 0,4 S* MS, RI

1640 5-Gvajen-11-ol 0,1 0,9 0,1 0,5 S* MS, RI

1645 epi-α-Kadinol – – tr 0,2 S* MS, RI

1656 β-Eudezmol 0,1 0,7 0,1 0,3 S* MS, RI

1658 α-Eudezmol tr 0,6 – – S* MS, RI

1660 Selin-11-en-4α-ol 0,4 – 0,4 1,2 S* MS, RI

1662 Nepoznato jedinjenje 11vii – 0,3 – –

1672 Bulnezol tr 0,4 – – S* MS, RI

1672 Nepoznato jedinjenje 12vii – – 0,2 0,5

1673 β-Bisabolol 0,3 tr – – S* MS, RI

1674 Neril-tiglat – tr – – ME MS, RI, CoI

1687 α-Bisabolol – 0,1 – 0,2 S* MS, RI

1695 Neril-4-metilpentanoat – – tr 0,2 ME MS, RI, CoI



1731 Neril-heksanoat 0,2 – 0,1 0,4 ME MS, RI, CoI






40


NASTAVAK TABELE 5.1

1785 Nepoznato jedinjenje 20vii tr – 0,6 0,5

1800 Neril-4-metilheksanoat tr – – tr ME MS, RI


1829 Neril-heptanoat tr – – tr ME MS, RI, CoI

1927 Neril-oktanoat tr – – tr ME MS, RI, CoI

2474 Nepoznato jedinjenje 22vii tr – 0,2 0,1

UKUPNO IDENTIFIKOVANO

98,7

(96)ix

97,7

(82)

96,8

(79)

95,8

(82)

DIKETONI (DK)

3,2

(6)

11,9

(7)

5,2

(6)

6,9

(6)

KETONI (K)

0,1

(2)

0,7

(3)

0,1

(1)

0,1

(1)

TERPENI

95,4

(82)

85,1

(66)

91,5

(70)

88,8

(73)

HEMITERPENI

0,8

(8)

0,6

(6)

2,2

(9)

1,3

(6)

ESTRI (HE)

0,8

(8)

0,6

(6)

2,2

(9)

1,3

(6)

MONOTERPENI

46,9

(35)

54,7

(31)

38,5

(27)

32,3

(32)

UGLJOVODONIČNI (M)

21,1

(14)

6,4

(12)

24,7

(13)

8,1

(12)

OKSIGENOVANI (M*)

2,1

(9)

5,6

(10)

2,1

(7)

3,5

(9)

ESTRI (ME)

23,7

(12)

42,7

(9)

11,7

(7)

20,7

(11)

SESKVITERPENI

47,7

(39)

29,8

(29)

50,8

(34)

55,2

(35)

UGLJOVODONIČNI (S)

45,2

(26)

22,6

(16)

48,3

(25)

47,3

(23)

OKSIGENOVANI (S*)

2,5

(13)

7,2

(13)

2,5

(9)

7,9

(12)

OSTALO (O)

0,1

(6)

0,2

(6)

0,1

(2)

tr

(2)

NEPOZNATA JEDINJENJA

1

(8)

0,8

(7)

2,9

(13)

3,9

(17)

i jedinjenja su navedena po redosledu eluiranja sa DB-5MS kolone (RI eksperimentalno određeni retencioni indeksi na

pomenutoj koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C8-C25); ii srednja vrednost tri analize; iii RI - upoređivanjem eksperimentalno dobijenih RI vrednosti sa literaturnim podacima; MS - upoređivanjem masenih spektara

sa spektrima iz biblioteka; CoI - GC koinjektiranjem standardnih supstanci; iv -/ nije detektovano; v tr - trag (<0,05%); vi syn.- sinonim; vii EI-MS spektri nepoznatih jedinjenja dati su poglavlju Prilog; viii strukture ravnotežnih oblika date su u poglavlju Prilog; ix u zagradi je dat broj identifikovanih sastojaka koji pripadaju određenoj klasi.

Karakterističnom mirisu etarskog ulja smilja doprinose i italidioni, β-diketoni

koji su specifični sekundarni metaboliti za ovu biljnu vrstu (Manitto et al., 1972), a koji

su bili prisutni u različitim količinama u analiziranim uljima (3,2%-ulje 1, 11,9%-ulje 2,

41


5,2%-ulje 3 i 6,9%-ulje 4; tabela 5.1). Uzorak ulja H. italicum iz Francuske (ulje 2) je

bio najbogatiji pomenutim β-diketonima gde je identifikovano ukupno 5 pripadnika ove

klase jedinjenja među kojima su najzastupljeniji bili 2,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5-dion

(34, syn. italidion II; detektovana su dva dijastereoizomera u diketo obliku i jedan njihov

keto-enolni tautomer; ukupno 6,2%) i 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-dion (33, syn. italidion

I; detektovan je po jedan diketo i keto-enolni tautomer; ukupno 3,4%).

Naša GC-MS analiza ulja smilja je ukazala na prisustvo i keto-enolnih oblika

pojedinih italidiona (33‒35 i 39) u gasnim hromatogramima pored znatno

zastupljenijih diketo oblika. Zanimljivo je da u prethodnim ispitivanjima sastava

etarskih ulja biljne vrste H. italicum nije primećena ova osobina italidiona da je moguće

razdvojiti njihove diketo i keto-enolne tautomere pri uslovima gasne hromatografije.

Pomenuta osobina β-diketona je prvobitno uočena od strane Masura i saradnika (1987)

koji su ispitivali ponašanje serije pentan-2,4-diona (koji su bili supstituisani u polužaju

C(1) i/ili C(3) različitim alkil/aril grupama) pri uslovima GC-MS analize. Tada je

utvrđeno da je moguće razlikovati tautomere ovih β-diketona kako na osnovu vrednosti

RI (ΔRI = 14-100) tako i na osnovu MS spektra, ali i da redosled eluiranja tautomera sa

GC kolone i način fragmentacije u MS spektru, kao i odnos zastupljenosti tautomera u

ravnoteži, zavise od same strukture β-diketona. Za asimetrične β-diketone kod kojih je

za C atom između dva karbonila vezana jedna alkil grupa (slično italidionima) utvrđeno

je da u ravnoteži dominira diketo tautomer koji i elura prvi sa GC kolone. Pored toga,

utvrđeno je da su osnovne fragmentacije u masenim spektrima i diketo i keto-enolnog

tautomera α-fragmentacije do karbonilnih grupa, s tim što su u masenom spektru

diketo oblika intenziviniji signali od acilijum jona koji nastaju raskidanjem α-C‒C veza

koje se nalaze između dve karbonilne grupe, dok su u masenom keto-enolnog tautomera

intenzivniji signali acilijum jona nastalih raskidanjem α-C‒C veza koje se nalaze sa

spoljašnje stranje 1,3-diketo fragmenta (slika 5.1).

Pažljivim razmatranjem sličnosti i razlika u masenim spektrima (slika 5.1) npr.

jedinjenja koje je eluiralo na RI = 1233 sa β-diketonom 39 (RI = 1188) ili jedinjenja na

RI = 1513 sa dijastereomerima β-diketona 34 (RI = 1487 i 1492), pretpostavljeno je, na

osnovu rezultata Masura i saradnika (1987), da je u reč o tautomernim oblicima

pomenutih β-diketona, što je i potvrđeno GC-MS analizom (pod istim uslovima) njihovih

sintetskih standarda.2 Kod svih italidiona keto-enolni oblik je mnogo manje zastupljen u

odnosu na diketo oblik, što je možda razlog zašto ova pojava nije ranije uočena.

2 Sintetski standardi β-diketona su ljubazno ustupljeni za analizu od strane profesora Nicolas Baldovini sa Institut de

Chimie de Nice, Université Côte d’Azur, Francuska.

42


SLIKA 5.1. a) MASENI SPEKTRI DIKETO (RI = 1188) I KETO-ENOLNOG OBLIKA (RI = 1233)

4,6-DIMETILOKTA-3,5-DIONA (39) SA KARAKTERISTIČNOM FRAGMENTACIJOM, b) MASENI SPEKTRI

DIKETO (RI = 1487) I KETO-ENOLNOG OBLIKA (RI = 1513) 2,4,6,9-TETRAMETIL-8-DECEN-3,5-DIONA

(34) SA KARAKTERISTIČNOM FRAGMENTACIJOM

U ulju 2 su identifikovani diketo i keto-enolni oblici svih prethodno opisanih β-

ketona biljne vrste H. italicum, izuzev odgovarajućih tautomera 5,7,10-trimetilundec-9-

en-4,6-diona (41). Pomenuti β-diketon 41 jedini do sada nije izolovan iz etarskog ulja

smilja, niti je ikad njegova struktura potvrđena koinjekcijom sintetskog standarda, pa u

literaturi nisu dostupni nikakvi spektralni podaci za ovo jedinjenje. U literaturi je jedino

moguće naći vrednosti retencionih indeksa koje variraju u zavisnosti od tipa kolone i

uslova snimanja: RI(DB-5MS) = 1487 (Morone-Fortunato et al., 2010), RI (HP-5MS) =

1503 (Mouahid et al., 2017), RI(BP-1) = 1469 (Bianchini et al., 2001) i RI(Rtx-1) = 1493

43


(Paolini et al., 2006). Imajući u vidu da smo pri analizi ulja 2 utvrdili da keto-enolni

tautomer 2,4,6,9-tetrametil-8-decen-3,5-diona (34) eluira sa DB-5MS kolone na

RI = 1513, kao i relativnu sličnost MS spektara diketo i keto-enolnog oblika ovog

italidiona, moguće je da je u prethodnim radovima ovaj tautomer β-diketona 34

pogrešno identifikovan kao 5,7,10-trimetilundec-9-en-4,6-dion (41) sa kojim je

regioizomeran. Blago odstupanje naše vrednosti RI ovog keto-enolnog oblika jedinjenja

34 u odnosu na literaturne, može biti i posledica širenja odgovarajućih signala u gasnom

hromatogramu usled sporog uspostavljanja tautomerne ravnoteže (Allegretti et al.,

2001).

5.2. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE H. ITALICUM

Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste H. italicum je bila predmet

istraživanja u većem broju radova (Antunes Viegas et al., 2014), pri čemu je utvrđeno da

ulje ove vrste može da ispolji i vrlo jaka, ali i veoma slaba antimikrobna svojstva (tabela

3.4; Chinou et al., 1996; Cui et al., 2016; Cui et al., 2015; Djihane et al.; 2017; Malenica

Staver et al., 2018; Mastelic et al., 2005; Orchard et al., 2017). Razlike u sastavu

testiranih ulja smilja kao posledica postojanja različitih hemotipova, kao i upotreba

različitih sojeva mikroorganizama, otežavaju određivanje odnosa sastava ulja i njegove

aktivnosti, što bi bilo od značaja za postizanje najbolje terapeutske efikasnosti. Imajući

ovo u vidu odlučeno je da se uporedno testira in vitro antimikrobna aktivnost četiri

komercijalna etarska ulja smilja, za koje je prethodno GC-MS analizom utvrđeno da

sadrže različite količine neril-estara, α-pinena, γ- i ar-kurkumena i β-diketona (tabela

5.1.) prema većem broju mikroorganizama, a sa ciljem da se potencijalno pronađe veza

između sastava i antimikrobne aktivnosti ulja.

Testiranje je vršeno mikrodilucionom metodom prema preporukama američkog

Nacionalnog komiteta za kliničke laboratorijske standarde (National Committee for

Clinical Laboratory Standards-NCCLS, 2007). Korišćeni su standardni sojevi American

Type Culture Collection (ATCC). Aktivnost uzoraka je ispitana na devet bakterijskih

sojeva i jedan fungalni mikroorganizam (odeljak 4.5.1). Rezultati testiranja su dati u

tabeli 5.2, a na osnovu njih se može reći da su sva četiri etarska ulja vrste H. italicum

pokazala slabu do umerenu aktivnost u poređenju sa pozitivnim kontrolama

(Streptomicin ili Nistatin). Ulja 3 i 4 su pokazala znatno jaču antimikrobnu aktivnost u

poređenju sa uljima 1 i 2. Ova dva ulja smilja sa tržišta Srbije su ispoljila najizraženije

inhibirajuće dejstvo na rast Gram-pozitivne bakterije Staphylococcus aureus sa MIC

vrednostima od 0,6 i 0,3 mg/mL (tabela 5.2.). Minimalna inhibitorna koncentracija od

0,6 mg/mL je, takođe, nađena za ulje 3 u slučaju još jednog soja roda Staphylococcus ‒

S. epidermidis. Imajući u vidu da se prirodni proizvodi klasifikuju kao antimikrobni

agensi ukoliko pokazuju aktivnost u opsegu MIC vrednosti od 0,1 do 1 mg/mL (Simões

et al., 2009), ulja 3 i 4 se mogu smatrati efikasnim antistafilokoknim agensom. Testirani

sojevi su bili najmanje osetljivi (MIC ≥ 5 mg/mL) prema ulju 1, najbogatijim

ugljovodoničnim mono- i seskviterpenima, prevashodno α-pinenom (5) i

44


γ-kurkumenom (6). U suštini, moglo bi se reći da su sva ulja vrste H. italicum bila nešto

aktivnija prema Gram-pozitivnim sojevima bakterija, u odnosu na Gram-negativne, što

je i u saglasnosti sa rezultatima prethodnih ispitivanja antimikrobne aktivnosti ulja

smilja (Antunes Viegas et al., 2014), a verovatno je posledica razlika u strukturi ćelijskog

zida Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija (odeljak 3.3.1). Testirana ulja su

pokazala i slabu antifungalnu aktivnost protiv gljivice Candida albicans (2,5 ‒ 5 mg/mL).

TABELA 5.2. MINIMALNE INHIBITORNE KONCENTRACIJE (MIC) ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE

H. ITALICUM

MIKROORGANIZMI MIC [mg/mL] MIC [μg/mL]

GRAM-POZITIVNE BAKTERIJE ULJE 1 ULJE 2 ULJE 3 ULJE 4 STRi NYSii

Bacillus cereus ATCC 11778 10 5 1,2 2,5 0,39 -iii

Enterococcus faecalis ATCC 19433 5 10 2,5 2,5 1,56 -

Sarcina lutea ATCC 9431 10 10 2,5 10 1,56 -

Staphylococcus aureus ATCC 6538 10 5 0,6 0,3 0,39 -

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 5 2,5 0,6 1,2 1,56 -

GRAM-NEGATIVNE BAKTERIJE

-

Acinetobacter baumannii ATCC 19606 5 5 1,2 1,2 12,5 -

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 5 5 2,5 2,5 0,39 -

Escherichia coli ATCC 8739 10 10 2,5 2,5 0,78 -

Salmonella enterica ATCC 13076 10 5 5 5 0,39 -

GLJIVICE

Candida albicans ATCC 10231 5 5 2,5 2,5 - 2,34 i Streptomicin; ii Nistatin; iii nije testirano.

U literaturi je dostupno nekoliko radova u kojima je određena minimalna

inhibitorna koncentracije ulja smilja, različitih hemijskih sastava, pomoću

mikrodilucione ili agar-dilucione metode. Cui i saradnici (2015) su ispitali antimikrobnu

aktivnost ulja koje pripada korzikanskom hemotipu (glavni sastojci: neril-acetat (4;

32,6%), γ-kurkumen (6; 11,6%) i 4,6,9-trimetil-8-decen-3,5-dion (33; 7,4%) na tri

Gram-pozitivne i četiri Gram-negativne bakterije, među kojima su bili i sojevi bakterija

S. aureus ATCC 25923 i E. coli ATCC 25922. Dato ulje je inhibiralo rast svih sojeva

mikroorganizama pri koncentraciji od 0,05% (tj. MIC = 0,5 μL/mL ≈ 0,5 mg/mL). Naše

ulje 2, koje je veoma sličnog sastava kao i gore pomenuto ulje, ispoljilo je 10, odnosno

20 puta, slabiju aktivnost prema sojevima bakterija S. aureus i E. coli. Ovako drastična

razlika u aktivnosti je možda posledica toga što su korišćeni različiti standardni sojevi

ove dve bakterije. U prilog ovome idu i rezultati Malenica Staver i saradnika (2018) koji

su utvrdili da je tipično “Balkansko ulje” smilja slabo aktivno prema soju S. aureus ATCC

25923 (MIC = 1,6 mg/mL), dok je naše ulje 3, sličnog sastava, pokazalo znatno bolju

efikasnost prema soju ATCC 6538 (MIC = 0,6 mg/mL). U nedavnom istraživanju Djihane

i saradnici (2017) su našli da etarsko ulje smilja iz Alžira pokazuje izuzetno širok

45


spektar veoma jake antimikrobne aktivnosti. Najosetljiviji soj bakterija, na dejstvo ovog

ulja, bio je Enterococcus cereus ATCC 2035 za koji je određena MIC vrednost od svega

0,79 μg/mL, dok su sojevi S. aureus ATCC 6538 i S. epidermidis ATCC 12228 bili jedni od

najotpornijih sa i dalje veoma niskim MIC vrednostima od 50,6 i 25,3 μg/mL. Dato ulje iz

Alžira je bilo veoma složenog i atipičnog sastava za ovu biljnu vrstu jer su u njemu

glavni sastojci bili α-cedren (13,6%), ar-kurkumen (9; 11,4%) i geranil-acetat (2; 10%),

što može biti razlog njegove jače antistafilokokne aktivnosti u odnosu na naša ulja 3 i 4.

Mastelic i saradnici (2005) su, takođe, našli znatno više vrednosti MIC za etarsko ulje

vrste H. italicum iz Hrvatske prema sojevima bakterija S. aureus (5 μL/mL) i E. coli

(7 μL/mL). Kako su u ovom radu testiranja vršena na istim ATCC sojevima pomenutih

bakterija kao i u radu Cui i saradnika (2015), razlika u aktivnosti se verovatno javila

usled razlike u sastavu ova dva ulja, jer ulje iz Hrvatske sadržalo znatno manje neril-

acetata (4; 11,5%) i ar-kurkumena (9; 4,9%), a znatno više α-pinena (5; 10,2%), i

α-cedren (9,6%) kao jedan od glavnih sastojaka. Pored toga, razdvajanje ulja iz Hrvatske

na terpensku i terpenoidnu frakciju, dovelo je do smanjenja aktivnosti terpenske

frakcije u odnosu na samo ulje, dok je terpenoidna frakcija zadržala aktivnost sličnu

ulju, što je autore navelo na zaključak da su oksigenovani terpeni, poput neril-i geranil-

acetata (4 i 2), odgovorni za uočenu aktivnost ulja (Mastelic et al., 2005). Chinou i

saradnici (1996) su utvrdili da je hemotip ulja smilja iz Grčke (sa geraniolom (1;

35,6%), geranil-acetatom (2; 14,7%) i (E)-nerolidolom (3; 11,7%) kao dominantnim

sastojcima) slabo aktivan prema sojevima S. aureus ATCC 25923 i S. epidermidis ATCC

12228 (MIC = 3,25 mg/mL), a u potpunosti neaktivan prema soju E. coli ATCC 25922 pri

testiranim koncentracijama. Pored toga, nedavno su Orchard i saradnici (2017) tokom

skrininga antimikrobne aktivnosti 59 komercijalnih ulja na patogene mikroorganizme

koji su česti uzročnici infekcija kože, utvrdili da etarsko ulje smilja pokazuje slabu

antibakterijsku (npr. MIC(S. epidermidis ATCC 2223) = 2 mg/mL i MIC(S. aureus ATCC 25923) =

1 mg/mL) i antikandidnu aktivnost (MIC(C. albicans ATCC 10231) = 2 mg/mL). Međutim, ovo

komercijalno ulje smilja, pomalo neuobičajenog sastava za ovu biljnu vrstu sa

β-pinenom (18; 7,6%) 1,8-sineolom (19,4%), (E)-β-kariofilenom (8; 12,4%) i

α-humulenom (14; 15,0%) kao dominantnim sastojcima, se pokazalo veoma efikasnim

prema gljivicama Trichophyton mentagrophytes i Microsporum canis, i prema nekoliko

bakterija iz roda Brevibacillus koje se smatraju jednim od uzročnika pojave neprijatnog

mirisa znoja (MIC = 0,5 mg/mL).

Rezultati dobijeni u našem ispitivanju antimikrobne aktivnosti etarskih ulja vrste

H. italicum, kao i prethodno publikovani rezultati, ukazuju na to da aktivnost etarskog

ulja ove vrste zavisi ne samo od sastava samih ulja već i od sojeva mikroorganizama

(čak i onih koji pripadaju istoj vrsti poput S. aureus, S. epidermidis i E. coli) koji su

korišćeni tokom testiranja, a možda donekle i od metode kojom su određivane

minimalne inhibitorne koncentracije. Stoga, u nameri da eventualno otkrijemo koji od

sastojaka testiranih ulja su nosioci uočene antimikrobne aktivnosti i da li postoji

selektivno dejstvo nekog od sastojaka na određeni mikroorganizam, odlučili smo da

uradimo uporednu statističku analizu sastava i antimikrobne aktivnosti naših ulja.

Korišćena je metoda glavne komponente (PCA) koja je primenjena na dva seta varijabli

46


koje su činile MIC vrednosti dobijene pri testiranju in vitro antimikrobne aktivnosti ulja

sa (i) originalnim varijablama (procentualni sadržaj sastojaka koji je veći od 1% u

makar jednom od analiziranih etarskih ulja) ili (ii) sumama procenata klasa jedinjenja

(diketoni (DK), ketoni (K), hemiterpenski estri (HE), monoterpenski estri (ME),

neoksigenovani monoterpeni (M), oksigenovani monoterpeni (M*), neoksigenovani

seskviterpeni (S), oksigenovani seskviterpeni (S*) i ostalo (O) – kao deveta klasa; tabele

5.1 i 5.2).

Korelaciona matrica dobijena nakon PCA analize (procenat sastojaka ˃ 1%; suma

F1 i F2 faktora bila je 87,1%) je otkrila značajan broj jakih i veoma jakih negativnih

korelacija između sadržaja pojedinih sastojaka i aktivnosti prema određenom

mikrorganizmu (tabela 5.3). U slučaju Gram-pozitivne bakterije S. aureus, prema kojoj

su ulja 3 i 4, pokazala najjaču antimikrobnu aktivnost, nađene su samo dve jake i jedna

veoma jaka korelacija i to sa količinama 2-metilbutil-angelata (κ = ‒ 0,759) i kariofilen-

oksida (κ = ‒ 0,712), odnosno ar-kurkumena (κ = ‒ 0,843) u ulju. Sadržaj ar-kurkumena

(9) je bio najveći u ulju 4 (5,5%), za koje je i nađena najmanja MIC vrednost protiv

bakterije S. aureus od 0,3 mg/mL, a najmanji u najneaktivnijem (MIC = 10 mg/mL) ulju

1 (2,6%). Iako se 2-metilbutil-angelat i kariofilen-oksid mogu okarakterisati kao

malozastupljeni sastojci, njihova nešto veća zastupljenost u ulju 3 (1,2%, odnosno

0,7%) i 4 (0,8%, odnosno 1,3%), u odnosu na ostala dva ulja (0,4%, odnosno ≤ 0,3%), na

osnovu rezultata PCA analize bitna je za ispoljavanje antistafilokokne aktivnosti.

Prethodno su nađene MIC vrednosti od 4 mg/mL za ar-kurkumen (9; Cui et al., 2016) i

0,6 mg/mL za 2-metilbutil-angelat (Bail et al., 2009) protiv bakterije S. aureus. Ove MIC

vrednosti su znatno veće u odnosu na MIC vrednost našeg ulja 4, ali treba istaći da su u

prethodnim isptivanjima korišćeni drugi ATCC sojevi bakterije S. aureus, a ne treba

zanemariti ni mogućnost postojanja nekog sinergističkog efekta ovih sastojaka sa nekim

drugim sastojcima iz ulja. ar-Kurkumen (9) i 2-metilbutil-angelat su, takođe, jedina dva

sastojka koja su pokazala jake negativne korelacije (κ = ‒ 0,783, odnosno ‒ 0,757) i sa

drugom vrstom ovog roda, S. epidermidis, čiji rast je efikasno inhibiralo ulje 3 (MIC = 0,6

mg/mL).

Cui i saradnici (2016) su izvršili uporedno testiranje antimikrobne aktivnosti

etarskog ulja H. italicum (korzikanski hemotip) i nekih njegovih glavnih sastojaka protiv

bakterije S. aureus ATCC 25923 i utvrdili da je najaktivniji neril-acetat (4; glavni

sastojak u ulju sa 33,8%), za koji je određena istovetna MIC vrednost, od 0,5 mg/mL,

kao i za samo ulje. Svi ostali testirani sastojci ulja: α-pinen (5), γ- i ar-kurkumen (6 i 9),

limonen (22), γ-terpinen (20), neril-acetat (4), linalool (12), italidion I i II (33 i 34), su

ispoljili znatno slabije dejstvo prema ovom mikroorganizmu (MIC vrednosti u opsegu od

4 do 8 mg/mL). Iako je neril-acetat (4) glavni sastojak u našim uljima 1, 2 i 4, a treći po

zastupljenosti u ulju 3, u korelacionoj matrici ne postoji ni jedna značajna negativna

korelacija između njegovog sadržaja u ovim uljima i njihove antimikrobne aktivnosti.

Zanimljivo je da su najjače negativne korelacije (κ ˃ ‒ 0,95) uočene između količina šest

seskviterpena: selina-4,11-diena, α-kopaena, (E)-β-kariofilena (8), α-selinena,

β-selinena (7) i δ-kadinena u testiranim uzorcima i njihove aktivnosti prema

bakterijskom soju Enterococcus faecalis. Sadržaj ovih seskviterpena je nešto veći u

47


uljima 3 i 4 koja su i pokazala i jaču aktivnost prema pomenutoj bakteriji u odnosu na

uja 1 i 2.

TABELA 5.3. JAKE (‒ 0,60 > K > ‒ 0,79) I VEOMA JAKE (K > ‒ 0,80) KORELACIJE IZMEĐU SADRŽAJA

POJEDINIH SASTOJAKA U ULJIMA H. ITALICUM I NJIHOVE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

JEDINJENJE KOEFICIJENT KORELACIJE

Κ ˃ ‒ 0, 95 Κ ˃ ‒ 0,80 Κ ˃ ‒ 0,70 Κ ˃ ‒ 0,60

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion E. coli

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion E. coli

2-Metilbutil-angelat

B. cereus S. aureus

E. aerogenes S. epidermidis

S. enterica S. lutea

A. baumannii E. faecalis

C. albicans

Neril-3-metilbutanoat E. coli

α-Pinen B. cereus

Linalool E. coli

Selina-4, 11-dien

E. faecalis S. enterica

A. baumannii

C. albicans

α-Kopaen

E. faecalis E. aerogenes

S. enterica

A.baumannii

C. albicans

(E)-β-Kariofilen


S. enterica

A. baumannii

C. albicans

α-Selinen


S. enterica

A. baumannii

C. albicans

β-Selinen


S. enterica

A. baumannii

C. albicans

δ-Kadinen


S. enterica

A. baumannii

C. albicans

ar-Kurkumen

S. aureus S. epidermidis E. aerogenes

S. lutea S. enterica

E. coli A. baumannii

48


NASTAVAK TABELE 5.3

C. albicans

cis-α-Bergamoten E. faecalis

Kariofilen-oksid

E. faecalis S. aureus

E. aerogenes

S. enterica

A. baumannii

C. albicans

Selina-11-en-4α-ol


S. enterica

A. baumannii

C. albicans

Rozifoliol E. coli

PCA analiza u kojoj su kao varijable korišćene MIC vrednosti ulja smilja i sume

procenata pojedinih klasa jedinjenja u njima (suma F1 i F2 faktora bila je 90,4%)

izdvojila je četiri klase jedinjenja: diketone, hemiterpenske estre, monoterpenske i

seskviterpenske ugljovodonike, kao one od čije zastupljenosti u uljima bi mogla da

zavisi i jačina njihove antimikrobne aktivnosti (tabela 5.4). Hemiterpenski estri su

pokazali jake i veoma jake negativne korelacije sa svim testiranim mikroorganizmima,

izuzev sa bakterijom E. coli, što navodi na zaključak da je sadržaj ove klase jedinjenja u

etarskim uljima smilja značajan za ispoljavanje njihovog antimikrobnog efekta. Na

osnovu vrednosti korelacije od ‒ 0,917, čini se da je sadržaj ove relativno malo

zastupljene klase jedinjenja (0,6 ‒ 2,2%), imao najveći uticaj na uočenu razliku u

aktivnosti testiranih ulja prema bakteriji B. cereus (tabele 5.1 i 5.2). Kako u literaturi

nisu dostupni podaci vezani za aktivnost isparljivih angelil-estara protiv ove Gram-

pozitivne bakterije, dalja ispitivanja bi mogla da idu u ovom pravcu.

TABELA 5.4. JAKE (‒ 0,60 > K > ‒ 0,79) I VEOMA JAKE (K > ‒ 0,80) KORELACIJE IZMEĐU SUMA

POJEDINIH KLASA JEDINJENJA U ULJIMA H. ITALICUM I NJIHOVE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

KLASA JEDINJENJA KOEFICIJENT KORELACIJE

Κ ˃ ‒ 0, 95 Κ ˃ ‒ 0,80 Κ ˃ ‒ 0,70 Κ ˃ ‒ 0,60

Diketoni

E. coli

Hemiterpenski estri

B. cereus E. aerogenes E. faecalis S. aureus

S. enterica

S. epidermidis

A. baumannii

S. lutea

C. albicans

Ugljovodonični monoterpeni

B. cereus

Ugljovodonični seskviterpeni

E. faecalis

E. aerogenes

S. enterica

A. baumannii

C. albicans

49


5.3. ANTIINFLAMATORNI POTENCIJAL ETARSKIH ULJA VRSTE H. ITALICUM

Za razliku od antimikrobnog potencijala, antiinflamatorni potencijal etarskog

ulja biljne vrste H. italicum nije u dovoljnoj meri ispitan (svega 2 rada su dostupna u

literaturi (Djihane i Mihoub, 2016; Voinchet i Giraud Robert, 2007)). Ovo je donekle

iznenađujuće s obzirom da je jedna od najbolje dokumentovanih etnofarmakoloških

upotreba etarskog ulja vrste H. italicum u tretmanu različitih stanja kože jer se smatra

da pomaže pri zarastanju rana, da sprečava nastajanje hematoma i da ublažava

vidljivost ožiljaka (Antunes Vegas et al., 2014), a pored toga danas su na tržištu dostupni

različiti preparati za negu i regeneraciju kože koji kao aktivni sastojak sadrže upravo

ovo etarsko ulje (Sarkić i Stapen, 2018). Imajući ovo u vidu odlučeno je da se ispita

antiinflamatorna aktivnost četiri komercijalna etarska ulja smilja različitog hemijskog

sastava u in vitro uslovima u modelima citotoksičnosti na makrofage i inhibicije

produkcije azot-monoksida od strane makrofaga. Pored etarskih ulja ispitan je i

antiinflamatorni potencijal (u modelu citotoksičnosti na makrofage) odabranih frakcija

dobijenih nakon dry flash hromatografije ulja 2 (korzikanski hemotip), čiji je sastav dat

u tabeli 5.5. Date frakcije su imale jednostavniji hemijski sastav u odnosu na polazno

ulje tj. bile su obogaćene određenom klasom jedinjenja (npr. monoterpenskim i

seskviterpenskim ugljovodonicima, kurkumenima, neril-estrima, β-diketonima ili

oksigenovanim mono- i seskviterpenima). Testiranje antiinflamatorne aktivnosti

pomenutih frakcija imalo je za cilj da se potencijalno identifikuju jedinjenja (ili klase

jedinjenja) koji su nosioci antiinflamatorne aktivnosti ulja smilja.

TABELA 5.5. HEMIJSKI SASTAV ODABRANIH HROMATOGRAFSKIH FRAKCIJA ULJA 2

FRAKCIJA JEDINJENJE %

I

α-Pinen 23,7

α-Fenhen 5,4

β-Pinen 4,3

Limonen 2,1

iso-Iitalicen 10,4

Italicen 44,2

cis-α-Bergamoten 1,8

trans-α-Bergamoten 1,1

α-Akoradien 1

β-Akoradien 1,1

IV

γ-Kurkumen 56,3

ar-Kurkumen 38,3

β-Kurkumen 1,1

XI

Neril-acetat 63,2

Neril-propanoat 31,4

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion 2,1

XXII 4,6,9-Trimetildec-8-en-3,5-dion (diketo tautomer) 18,6

50


NASTAVAK TABELE 5.5

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion, dijasteromer I (diketo tautomer) 19,1

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion, dijastereomer II (diketo tautomer) 30,8

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion (keto-enolni tautomer)i 3,2

Italicen-etar 1,3

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer I (diketo tautomer) 5,9

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer II (diketo tautomer) 13,1

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion (keto-enolni tautomer) i 3,2

XXIV

2-Nonanon 1,7

4,6-Dimetiloktan-3,5-dion (diketo tautomer) 2,9

4,6,9-Trimetildec-8-en-3,5-dion (diketo tautomer) 37,6

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion, dijasteromer I (diketo tautomer) 20,9

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion, dijastereomer II (diketo tautomer) 22,3

2,4,6,9-Tetrametildec-8-en-3,5-dion (keto-enolni tautomer) i 2,1

10-epi-Italicen-etar 1

Italicen-etar 3

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer I (diketo tautomer) 2

3,5,7,10-Tetrametilundec-9-en-4,6-dion, dijastereomer II (diketo tautomer) 5,5

XXX

Linalool 15,6

Terpinen-4-ol 4,9

α-Terpineol 1,3

Nerol 12,4

(E)-Nerolidol 1,1

Nepoznato jedinjenje 8 2,1

Gvajol 13,4

Rozifoliol 19,8

10-epi-γ-Eudezmol 1,3

γ-Eudezmol 4

5-Gvajen-11-ol 8,4

β-Eudezmol 4,6

α-Eudezmol 4,4

Nepoznato jedinjenje 11 2,7

Bulnezol 3,7

i strukture ravnotežnih oblika date su u poglavlju Prilog.

5.3.1. CITOTOKSIČNO DELOVANJE ETARSKIH ULJA I ODABRANIH FRAKCIJA NA MAKROFAGE

Uticaj etarskih ulja smilja i odabranih hromatografskih frakcija na vijabilnost

makrofaga određen je MTT testom, u skladu sa metodom Radulovića i saradnika (2017).

Korišćeni su elicitirani peritonealni makrofagi dobijeni iz mužjaka pacova soja Wistar.

Rezultati testiranja su dati u tabeli 5.6, a na osnovu njih se može reći da su sva ulja

smilja ispoljila umerenu citotoksičnost na makrofage pri najvišoj testiranoj

koncentraciji od 0,1 mg/mL (smanjenje vijabilnosti makrofaga bilo je u opsegu od 64,2

‒ 54,7%). Ulja 1 (LC50= 0,073 mg/mL) i 3 (LC50 = 0,069 mg/mL), sa većim sadržajem

51


ugljovodoničnih mono- i seskviterpena, pokazala su jaču citotoksičnost na makrofage, u

odnosu na ulja 2 (LC50 = 0,082 mg/mL) i 4 (LC50 = 0,094 mg/mL), koja su bogatija

monoterpenskim estrima i oksigenovanim seskviterpenima. Među hromatografskim

frakcijama, one bogate α-pinenom (5) i italicenom (21; frakcija I; LC50 = 0,095 mg/mL;

tabela 5.5), odnosno γ-, ar- i β-kurkumenom (6, 9; frakcija IV; LC50 = 0,096 mg/mL), su

pokazale najjaču aktivnost, što navodi na zaključak da su ulja 1 i 3 najverovatnije

ispoljila veću citotoksičnost usled znatno većeg sadržaja pomenutih sastojaka u odnosu

na preostala dva ulja (tabela 5.1). Međutim, aktivnost ovih frakcija (I i IV) je ipak bila

nešto slabija u odnosu na sama ulja, što ukazuje na mogućnost postojanja sinergističkog

dejstva između sastojaka ulja smilja. U prilog ovoj tvrdnji idu i rezultati istraživanja

Rivas da Silva i saradnika (2012) koji su utvrdili da (+)-α-pinen pri koncentraciji od

0,125 mg/mL smanjuje vijabilnost peritonealnih makrofaga za 33,5% (% preživelih

66,5%), što je značajno manja citotoksičnost u odnosu na onu koju smo odredili za naša

ulja smilja pri koncentraciji od 0,1 mg/mL (tabela 5.6). Sve ostale hromatografske

frakcije su pokazale slabu citotoksičnost pri testiranim koncentracijama.

TABELA 5.6. PROCENAT ŽIVIH MAKROFAGA NAKON TRETMANA UZORCIMA ETARSKIH ULJA H. ITALICUM I

HROMATOGRAFSKIH FRAKCIJA RAZLIČITIH KONCENTRACIJA

UZORAK KONCENTRACIJA [mg/mL]

1 × 10‒1 1 × 10‒2 1 × 10‒3 1 × 10‒4 1 × 10‒5

ULJE 1 % živih ćelija 36 83 93 84,1 85,6

s.d.i 6,4 16,6 2,9 9,1 12,3

ULJE 2 % živih ćelija 45,3 68,4 87,9 85 89,6

s.d. 5,1 20,1 8,6 1,9 0,3

ULJE 3 % živih ćelija 35,8 76,9 84,3 92,6 82,8

s.d. 6,2 8 6,7 14,7 12,6

ULJE 4 % živih ćelija 44,6 125,5 118,3 130,1 121

s.d. 0,3 13,5 16,7 10,3 12,5

FRAKCIJA I % živih ćelija 45,8 117,6 118,6 125,3 121,9

s.d. 0 2,7 1,4 13,4 11,3

FRAKCIJA IV % živih ćelija 46,5 121,2 136,4 122,9 126,3

s.d. 5,1 3,1 1,4 9,8 12,2

FRAKCIJA XI % živih ćelija 66,7 115,2 121,2 129,2 116,1

s.d. 6,5 6,1 3,1 15,3 4,8

FRAKCIJA XXII % živih ćelija 53,3 103,4 119,5 127,2 120

s.d. 0,3 24,9 0,7 7,5 7

FRAKCIJA XXIV % živih ćelija 81,4 114,5 106,5 108,9 110,4

s.d. 0,7 2,4 12,9 7,5 2,7

FRAKCIJA XXX % živih ćelija 92,5 134,9 110,4 117,1 124,8

s.d. 2,7 2 12,9 7,4 4,8

i s.d. – Standardna devijacija.

52


U cilju dodatne racionalizacije dobijenih rezultata izvršena je multivarijantna

statistička analiza (PCA) na šest setova varijabli koje su činile vrednosti dobijene u MTT

testu (procenti živih makrofaga nakon tretmana različitim koncentracijama

ulja/frakcija) sa (i) originalnim varijablama (procentualni sadržaj sastojaka koji je veći

od 1% u makar jednom od analiziranih etarskih ulja i/ili frakcija) ili (ii) sumama

procenata pojedinih klasa jedinjenja u etarskim uljima i/ili frakcijama (tabele 5.1, 5.5 i

5.6). Korelaciona matrica dobijena nakon PCA analize (procenat sastojaka > 1% u ulju i

frakcijama; suma faktora F1 i F2 je bila 56,9%) je otkrila samo tri jake negativne

korelacije između količina limonena (22; κ = ‒ 0,731), cis- i trans-α-bergamotena (24 i

25; κ =‒ 0,602 i κ =‒ 0,681) u uljima i frakcijama i njihove citotoksičnosti pri najvišoj

testiranoj koncentraciji od 0,1 mg/mL.3 Za α-pinen (5) je nađena nešto slabija negativna

korelacija od ‒ 0,589, ali je na grafikonu (biplot) dobijenom kao rezultat ove PCA analize

jedino frakcija I (koja je jedina sadržala limonen i bergamotene, a i bila bogata

α-pinenom (5; tabela 5.5)) bila blisko pozicionirana, u donjem levom kvadrantu, sa

testiranim etarskim uljima smilja (slika 5.2). PCA analiza u kojoj su korišćene sume

pojedinih klasa jedinjenja u etarskim uljima i frakcijama (suma faktora F1 i F2 je bila

58,2%) izvojila je sadržaj ugljovodoničnih seskviterpena u ovim uzorcima kao varijablu

od koje zavisi njihova aktivnost pri koncentraciji od 0,1 mg/mL.

SLIKA 5.2. REZULTATI PCA (BIPLOT) ANALIZE KADA SU KAO VARIJABLE KORIŠĆENI REZULTATI MTT

TESTA I PROCENTUALNI SADRŽAJ SASTOJAKA U ETARSKIM ULJIMA I HROMATOGRAFSKIM FRAKCIJAMA KOJI

JE BIO VEĆI OD 1%

3 Posmatrane su korelacije samo pri najvišoj testiranoj koncentraciji (0,1 mg/mL) jer su pri ostalim koncentracijama ulja i frakcije pokazale zanemarljivu citotoksičnost na makrofage.

53


Da bi povećali sumu faktora F1 i F2, a time pouzdanost statističke analize,

izvršene su i analogne PCA analize zasebno na uzorcima ulja i na hromatografskim

frakcijama. Do značajnog povećanja sume faktora F1 i F2 je došlo samo u slučaju analiza

za koje je set varijabli bio sačinjen od sastava ulja i njihove aktivnosti. PCA analiza u

kojoj su korišćeni procenti sastojaka (> 1%) u uljima i rezultati MTT testa (suma faktora

89,2%) je otkrila samo jednu veoma jaku, sa sadržajem α-pinena (5) u uljima (κ =

‒ 0,987), i četiri jake negativne korelacije (‒ 0,771 ≥ κ ≥ ‒ 0,633), sa sadržajima

α-kopanena, italicena (21), trans-α-bergamotena (25) i γ-kurkumena (6). Ove rezultate

je potvrdila i PCA analiza u kojoj su kao varijable uzete sume procenata klasa jedinjenja

u uljima, koja otkrila jaku i veoma jako negativnu korelaciju između ukupne količine

ugljovodoničnih seskviterpena (κ = ‒ 0,602) i monoterpena (κ = ‒ 0,989), i aktivnosti

ulja pri koncentraciji od 0,1 mg/mL. Najaktivnija etarska ulja (1 i 3) i hromatografske

frakcije (I i IV; tabela 5.6) sadržala su i najveće količine pomenutih jedinjenja tj. klasa

jedinjenja (tabele 5.1 i 5.5).

5.3.2. INHIBITORNO DEJSTVO ETARSKIH ULJA NA PRODUKCIJU NO OD STRANE MAKROFAGA

Azot-monoksid je signalni molekul koji pri normalnim fiziološkim uslovima u

organizmu ima zaštitno antiinflamatorno dejstvo, dok u patofiziološkim uslovima dolazi

do njegove prekomerne produkcije (npr. od strane makrofaga) i tada ovaj molekul

ispoljava proinflamatorno dejstvo. Pored inflamacije, nekontrolisana biosinteza NO u

organizmu dovodi i do drugih neželjenih efekata poput vazokonstrikcije i oštećenja

tkiva (Sharma et al., 2007). Povećano stvaranje NO primećeno je i u patogenezi nekih

bolesti praćenih inflamatornim reakcijama, poput arteroskleroze, dijabetesa,

neurodegerativnih i plućnih bolesti. Stoga razvoj novih medikamenta koji dovode do

inhibicije produkcije NO može biti koristan za kontrolu procesa inflamacije.

NO se biosintetiše iz L-arginina pod dejstvom enzima koji se naziva NO sintetaza

(NOS). U ovoj dvostepenoj reakciji NOS prvo katalizuje oksidaciju L-arginina do

N-hidroksi-L-arginina (intermedijera vezanog za sam enzim), čijom daljom oksidacijom

nastaju NO i L-citrulin (slika 5.3). Kiseonik i NADPH su neophodni kofaktori u ovom

procesu (Stuehr, 2004).

SLIKA 5.3. BIOSINTEZA NO IZ L-ARGININA POD DEJSTVOM NOS

Uticaj etarskih ulja smilja na produkciju NO od strane makrofaga određen je

pomoću modifikovane Griess-ove metode (Radulović et al., 2017; odeljak 4.6.4).

54


Korišćeni su elicitirani peritonealni makrofagi dobijeni iz mužjaka pacova soja Wistar

kod kojih je produkcija NO stimulisana LPS-om. Rezultati testiranja u obliku kriva

inhibicije su prikazani na slici 5.4. Ulja 1-3 su pri najvećoj testiranoj koncentraciji

(od 0,1 mg/mL) u potpunosti inhibirala produkciju NO od strane makrofaga, dok je za

ulje 4 nađen procenat inhibicije od 83,9%. Pri svim testiranim koncentracijama sva ulja

su pokazala značajnu sposobnost inhibicije produkcije NO. Ulje 3 bi se moglo smatrati

najaktivnijim jer je pri svim testiranim koncentracijama pokazalo veći stepen inhibicije

u odnosu na ostala ulja, a čak i najmanja testirana koncentracija ovog ulja od 1×10‒5

mg/mL je dovela do smanjenja produkcije NO za skoro 80%. Koncentraciju IC50 je bilo

moguće odrediti jedino za ulje 1, koje je i najmanje aktivno, i ona iznosi 1,9 × 10‒3

mg/mL. Zanimljivo je da ova dva ulja (1 i 3) sadrže mnogo više α-pinena (5) u odnosu

na ostala dva, a najupečatljivija razlika u njihovom sastavu je u pogledu zastupljenosti

neril-acetata (4) koja je više nego dvostruko veća u ulju 1 (21,2% naspram 9,2%).

Nedavno su Kim i saradnici ispitali različite inhibitorne efekte α-pinena (5), u

koncentracionom opsegu od 0,2 do 20 μM (tj. 2,72 × 10‒5 ‒ 2,72 × 10‒3 mg/mL), na

inflamatorne reakcije kod peritonealnih makrofaga koje su bile indukovane LPS-om i

utvrdili da α-pinen (5), između ostalog, značajno smanjuje produkciju NO, PGE2 i

proinflamatornih citokina (IL-6 i TNF-α), kao i ekspresiju iNOS i COX-2 enzima, što ga

čini veoma efikasnim prirodnim antiinflamatornim agensom. Antiinflmatorni potencijal

neril-acetata (4) u ovom modelu nije do sada ispitan.

SLIKA 5.4. KRIVE INHIBICIJE PRODUKCIJE NO OD STRANE MAKROFAGA ZA ETARSKA ULJA VRSTE

H. ITALICUM

Uporedne statističke analize sastava (procentualna zastupljenost sastojaka ili

klasa jedinjenja) etarskih ulja smilja i njihove sposobnosti inhibicije produkcije NO od

strane makrofaga pri različitim testiranim koncentracijama (0,1 ‒ 1 × 10‒5 mg/mL),

otkrile su relativno mali broj jakih pozitivnih korelacija. Od sastojaka su izdvojeni

limonen (22; 0,733 ≥ κ ≥ 0,882 pri najveće tri koncentracije), linalool (12; 0,618 ≥ κ ≥

0,891, kod svih testiranih koncentracija izuzev najviše) i 2-metilbutil-angelat (0,677 ≥ κ

55


≥ 0,820, kod tri najniže koncentracije), a od klasa jedinjenja hemiterpenski estri (0,647

≥ κ ≥ 0,746, takođe, kod tri najniže koncentracije). Zanimljivo je da u slučaju linaloola

(12) stepen korelacije postepeno opadao sa smanjenjem koncentracije, dok se u slučaju

2-metilbutil-angelata i hemiterpenskih estara mogao uočiti suprotan trend. Od

pomenuta tri malozastupljena sastojka testiranih ulja smilja, prethodno je već utvrđeno

za limonen (22) i linalool (12) da inhibiraju produkciju NO od strane makrofaga

prethodno aktiviranih LPS-om. Za limonen (22) je određena IC50 koncentracija od 70,1

μg/mL (korićena je linija makrofaga RAW 264.7; Conforti et al., 2010), dok je za linalool

(12) utvrđeno da značajno, dozno zavisno, smanjuje količinu oslobođenog NO od strane

makrofaga (linija J774.A) pri testiranim koncentracijama (0,154, 1,54 × 10‒3 i 1,54 ×

10‒5 mg/mL) ne dovodeći do smanjenja ekspresije iNOS enzima. Pored toga, linalool

(12) je inhibirao produkciju PGE2 samo pri najvišoj koncentraciji uz značajno smanjenje

ekspresije COX-2 enzima (Peana et al., 2006). Sve u svemu, potrebno je izvšiti dodatna

istaživanja u kojima bi se uporedo ispitao mehanizam delovanja etarskih ulja smilja na

produkciju NO tokom procesa inflamacije, njegovih glavnih i malozastupljenih

sastojaka, kao i potencijalni sinergizam između njih.


6. ZAKLJUČAK

57


Biljna vrsta Helichrysum italicum (Roth) G. Don, u našem narodu poznatija kao

smilje, od davnina ima reputaciju izuzetno lekovite vrste sa veoma raznovrsnom

etnofarmakološkom upotrebom. Jedna od najčešćih primena etarskog ulja ove biljne

vrste u narodnoj medicini je za ubrzavanje procesa zarastanja rana i u tretmanu drugih

stanja kože, poput hematoma i ožiljaka. Međutim, do promena u terapeutskoj efikasnost

ovog ulja bi moglo doći usled prirodne varijabilnosti njegovog sastava (postojanje

hemotipova), ili zbog promena u sastavu ovog ulja pod uticajem različitih faktora

životne sredine, kao što su klima, tip zemljišta, nadmorska visina, izloženost suncu, faza

vegetativnog ciklusa, itd. (Antunes Viegas et al., 2014).

Stoga je u ovom master radu ispitan uticaj sastava na in vitro antimikrobnu i

antiinflamatornu aktivnost četiri komercijalna etarska ulja smilja (sa tržišta Belgije,

Francuske i Srbije), za koja je prethodno na osnovu GC-MS analize utvrđeno da sadrže

različite količine neril-estara (ulje 1 : ulje 2 : ulje 3 : ulje 4 = 23 : 43 : 12 : 21), α-pinena

(17 : 2 : 20 : 5), γ- i ar-kurkumena (19 : 14 : 16 : 15), i β-diketona (3 : 12 : 5 : 7). Takođe,

izvršeno je i hromatografsko frakcionisanje ulja 2 (sa francuskog tržišta; tzv.

„Korzikansko ulje“) i ispitana je antiinflamatorna aktivnost (u modelu citotoksičnosti na

makrofage) odabranih frakcija sa ciljem da se potencijalno identifikuju jedinjenja (ili

klase jedinjenja) koji su nosioci antiinflamatorne aktivnosti ulja smilja.

Ulja sa srpskog tržišta (3 i 4; tzv. „Balkansko ulje“) su pokazala znatno jaču

antimikrobnu aktivnost u odnosu na ostala ulja. Najosetljiviji soj je bila Gram-pozitivna

bakterija Staphylococcus aureus gde su nađene MIC vrednosti od 0,6 (ulje 3) i 0,3

mg/mL (ulje 4). S obzirom da se prirodni proizvodi klasifikuju kao antimikrobni agensi

ukoliko pokazuju aktivnost u opsegu MIC vrednosti od 0,1 do 1 mg/mL (Simões et al.,

2009), data ulja koja pripadaju balkanskom hemotipu se mogu smatrati efikasnim

antistafilokoknim agensom. Testirani sojevi su bili najrezistentniji (MIC ≥ 5 mg/mL)

prema ulju sa tržišta Belgije (ulje 1). Međutim, ovo ulje (LC50= 0,073 mg/mL) i ulje 3

(LC50 = 0,069 mg/mL), koja su bogatija ugljovodoničnim mono- i seskviterpenima, kao

što su α-pinen i γ-kurkumen, pokazala su jaču citotoksičnost na makrofage, u odnosu na

ulje 2 (LC50 = 0,082 mg/mL) i ulje 4 (LC50 = 0,094 mg/mL), kod kojih su zastupljeniji

monoterpenski estri i oksigenovani seskviterpeni. Među hromatografskim frakcijama,

one bogate α-pinenom i italicenom (LC50 = 0,095 mg/mL), odnosno γ-, ar- i β-

kurkumenom (LC50 = 0,096 mg/mL), su pokazale najjaču aktivnost, što ukazuje na to

ulja 1 i 3 najverovatnije ispoljila veću citotoksičnost na makrofage uled znatno većeg

sadržaja pomenutih sastojaka u odnosu na preostala dva ulja. Međutim, aktivnost ovih

frakcija je ipak bila nešto slabija u odnosu na sama ulja, što ukazuje na mogućnost

postojanja sinergističkog dejstva između sastojaka ulja smilja.

Kada je u pitanju dejstvo ulja smilja na stvaranje NO od strane makrofaga, pri

najvećoj testiranoj koncentraciji (od 0,1 mg/mL) ulja 1-3 su u potpunosti inhibirala

produkciju NO, dok je za ulje 4 nađen procenat inhibicije od 83,9%. Sva ulja su se

pokazala izuzetno efikasnim u ovom pogledu i pri nižim konentracijama (1 × 10‒2

mg/mL ‒ 1 × 10‒5 mg/mL), pri kojima ova ulja ili uopšte (poput ulja 4) nisu bila

citotoksična ili su ispoljila neznatnu citotoksičnost na makrofage. Ulje 3 (sa tržišta

Srbije) bi se moglo smatrati najaktivnijim jer je pri svim testiranim koncentracijama

58


pokazalo veći stepen inhibicije u odnosu na ostala ulja. Kako je čak i najmanja testirana

koncentracija ovog ulja dovela do smanjenja produkcije NO za skoro 80%, u budućnosti

bi trebalo sprovesti dalja ispitivanja kojim bi se potencijalno otkrio mehanizam kojim

ovo ulje dovode do inhibicije produkcije NO od strane makrofaga.

Dobijeni rezultati nesumljivo pokazuju da pomenute biološke aktivnosti ulja

smilja zavise od njegovog sastava i da najbolja antimikrobna i antiinflamatorna svojstva

pokazuje ulje 3 koje je imalo najveći sadržaj α-pinena, a najmanji neril-acetata u odnosu

na ostala ulja. U cilju dodatne racionalizacije dobijenuh rezultata izvršeno je i statističko

poređenje (PCA analiza) razlika u sastavu ovih ulja i njihovog antimikrobnog i

antiinflamatornog potencijala. Rezultati PCA analize ukazuju na to da uočene razlike u

aktivnosti testiranih ulja H. italicum nisu posledica samo različite zastupljenosti glavnih

sastojaka (poput α-pinena i ar-kurkumena) u njima, već i različitog sadržaja nekih

malozastupljenih sastojaka ili klasa jedinjenja kao što su: (i) 2-metilbutil-angelat i

kariofilen-oksid kod antistafilokokalne efikasnosti ulja; (ii) ukupni sadržaj

hemiterpenskih estara u slučaju aktivnosti protiv bakterije Bacillus cereus; (iii) limonen,

cis- i trans-α-bergamoten u slučaju citotoksičnosti na makrofage; (iv) ili pak limonen,

linalool i 2-metilbutil-angelat kada je u pitanju inhibicija produkcije NO od strane

makrofaga.

Pretragom podataka dostupnih u literaturi nađeno je da sastojci koji su pokazali

jake (negativne ili pozitivne) korelacije u PCA matricama poseduju manji antimikrobni i

antiinflamatorni potencijal od testiranih ulja što sugeriše da ukupna aktivnost ulja

najverovatnije nastaje kao rezultat sinergističkog dejstva između pojedinih sastojaka.

Ovo je u saglasnosti sa stavom da je odbrana biljaka npr. od patogena uglavnom

zasnovana na proizvodnji (biosintezi) velikog broja potencijalno biološki aktivnih

metabolita od kojih su samo nekoliko (retko samo jedan) efikasni (najčešće

sinergistički) u datim situacijama (Radulović et al., 2017). Stoga je poželjno izvršiti dalja

ispitivanja u vezi sinergističkog efakta između sastojaka ulja smilja, a ovi rezultati mogu

biti važni pri razvoju novih preparata za tretman infekcija izazvanih pomenutim

mikroorganizmima ili za smanjenje simptoma inflamacije.

Rezultati dobijeni u okviru ovog master rada jasno su potvrdili da efikasnost

etarskog ulja smilja kao antimikrobnog i antiinflamatornog agensa umnogome zavisi od

njegovog sastava. Imajući u vidu široku primenu ovog ulja u aromaterapiji, poželjno je u

budućnosti ispitati sa ovog aspekta i ostale hemotipove, kao i mehanizme njihovog

delovanja i potencijalni sinergizam između njihovih sastojaka, a sve u cilju postizanja

maksimalne efikasnosti odgovarajućih preparata (npr. za negu kože) na bazi etarskog

ulja smilja koju su u sve većem broju dostupni na tržištu.


7. LITERATURA

60


Adams RP (2007) Identification of Essential Oil Components by Gas

Chromatography/Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream,

IL, USA

Allegretti PE, Schiavoni MM, Di Loreto HE, Furlong JJP, Della Vedova CO (2001) J Mol

Struct 560: 327‒335

Antunes Viegas D, Palmeira DOA, Salgueiro L, Martinez DOJ (2014) J Etnopharmacol

151: 54–65

Araujo EC, Silveira ER, Lima MA, Neto MA, de Andrade IL, Santiago GM, Mesquita AL

(2003) J Agr Food Chem 51: 3760–3762

Bauer J, Koeberle A, Dehma F, Pollastro F, Appendino G, Northoff H, Rossi A, Sautebin L,

Werz O (2011) Biochem Pharmacol 81: 259–268

Bail S, Buchbauer G, Jirovetz L, Denkova Z, Slavchev A, Stoyanova A, Schmidt E, Geissler

M (2009) J Essent Oil Res 21: 283–286

Bianchini A, Santoni F, Paolini J, Bernardini AF, Mouillot D, Costa J (2009) Chem

Biodivers 6: 1014–1033

Bianchini A, Tomi P, Bernardini AF, Morelli I, Flamini G, Cioni PL, Usa M, Marchetti M

(2003) Flavour Fragr J 18: 487–491

Bianchini A, Tomi P, Costa J, Bernardini AF (2001) Flavour Frag J 16: 30–34

Biondi E (2007) Fitosociologia 44: 3–10

Blažević N, Petričić J, Stanić G, Maleđ Ž (1995) Acta Pharm 45: 517–522

Blumenthal M, Busse WR, Goldberg A, Gruenwald J, Hall T, Riggins CW, Rister RS (1998)

The Complete German Commission E Monographs ‒ Therapeutic Guide to Herbal

Medicines, American Botanical Council, Austin, TX, USA

Budzikievicz H, Djerassi C, Williams DH (1967) Mass Spectrometry of Organic

Compounds, Holden-Day, San Francisco, CA, USA

Charles DJ, Simon JE (1991) HortScience 26: 69–70

Chinou IB, Roussis V, Perdetzoglou D, Loukis A (1996) Planta Med 62: 377–379

Clinical and Laboratory Standards Institute (2007) Performance standards for

antimicrobial susceptibility testing. Seventeenth informational supplement. Document

M 100–S17, NCCLS, Wayne, PA, USA

Conforti F, Tundis R, Marrelli M, Menichini F, Statti GA, De Cindio B, Menichini F,

Houghton PJ (2010) J Med Food 13: 137‒141

Conti B, Canale A, Bertoli A, Gozzini F, Pistelli L (2010) Parasitol Res 107: 1455–1461

Cui H, Li W, Li C, Lin L (2016) Int J Food Sci Tech 51: 2493–2501

Cui H, Zhao C, Lin L (2015) J Food Process Pres 39: 2663–2672

61


Dennis JS (2004) J Nutr 134: 2748S–2751S

Djihane B, Wafa N, Elkhamssa S, Pedro DHJ, Maria AE, Mihouba ZM (2017) Saudi Pharm

J 25: 780–787

Djihane B, Mihoub ZM (2016) Pharmacia Lettre 8: 41–44

Drapeau J, Fröhler C, Touraud D, Kröckel U, Geier M, Rose A, Kunz W (2009) Flavour

Frag J 24: 160–169

Evans JD (1996) Straightforward Statistics for the Behavioral Sciences, Brooks/Cole

Publishing, Pacific Grove, CA, USA

Ferrarese L, Uccello A, Zani F, Ghirardini A (2005) Cosmetic News 28: 228‒231

Galbany-Casals M, Blanco-Moreno JM, Garcia-Jacas N, Breitwieser I, Smissen RD (2011)

Plant Biol 13: 678–687

Galbany-Casals M, Sáez L, Benedí C (2006) Can J Bot 84: 1203–1232

Giamarellou H (2010) Int J Antimicrob Ag 36: 50–54

Giustarini D, Rossi R, Milzani A, Dalle-Donne I (2008) Method Enzymol 440: 361–380

Grela E, Kozłowska J, Grabowiecka A (2018) Acta Histochem 120: 303–311

Guinoiseau E, Lorenzi V, Luciani A, Muselli A, Costa J, Casanova J, Berti L (2013) In:

Méndez-Vilas A (Ed.), Microbial pathogens and strategies for combating them:

science, technology and education, Vol 2, Formatex Research Center, Spain, pp.

1073‒1080

Hellivan P-J (2009) Perfum Flavor 34: 34–40

Hinou JB, Harvala CE, Hinou EB (1989) Pharmazie 44: 302–303

Josifović M (1974) Flora SR Srbije, Tom VI, SANU, Naučno delo, Beograd, Srbija

Kim DS, Lee HJ, Jeon YD, Han YH, Kee JY, Kim HJ, Shin HJ, Kang J, Lee BS, Kim SH, Kim SJ,

Park SH, Choi BM, Park SJ, Um JY, Hong SH (2015) Am J Chinese Med 43: 731‒742

Kladar NV, Anačkov GT, Rat MM, Srđenović BU, Grujić NN, Šefer EI, Božin BN (2015)

Chem Biodivers 12: 419–431

Leimner J, Marschall H, Meier N, Weyerstahl P (1984) Chem Lett 13: 1769–1772

Leonardi M, Ambryszewska KE, Melai B, Flamini G, Cioni PL, Parri F, Pistelli L (2013)

Chem Biodivers 10: 343–355

Lorenzi V, Muselli A, Bernardini AF, Berti L, Pages JM, Amaral L, Bolla JM (2009)

Antimicrob Agents Ch 53: 2209–2211

Lourens AC, Viljoen AM, van Heerden FR (2008) J Ethnopharmacol 119: 630–652

Ložienė K, Venskutonis PR (2005) Biochem Syst Ecol 33: 517–525

Maksimović S, Tadić V, Skala D, Zizović I (2017) Phytochemistry 138: 9–28

62


Malenica Staver M, Gobin I, Ratkaj I, Petrovic M, Vulinović A, Dinarina-Sablic M, Broznic

D (2018) J Essent Oil Bear Pl 21: 77–91

Manitto P, Monti D (1972) Phytochemistry 11: 2112–2114

Mastelic J, Politeo O, Jerković I (2008) Molecules 13: 795–803

Mastelic J, Politeo O, Jerkovic I, Radosevic N (2005) Chem Nat Compd+ 41: 35–40

Masur M, Grützmacher H-F, Münster H, Budzikiewicz H (1987) Organic Mass

Spectometry 22: 493–500

McCullough MJ, Ross BC, Reade PC (1996) Int J Oral Max Surg 25: 136–144

Melito S, Petretto GL, Podani J, Foddai M, Maldini M, Chessa M, Pintore G (2016) Ind Crop

Prod 80: 242–250

Morone-Fortunato I, Montemurro C, Ruta C, Perrini R, Sabetta W, Blanco A, Lorusso E,

Avato P (2010) Ind Crop Prod 32: 639–649

Mouahid A, Dufour C, Badens E (2017) J CO2 Util 20: 263–273

Nazzaro F, Fratianii F, De Martino L, Coppola R, De Feo V (2013) Pharmaceuticals 6:

1451–1474

Nostro A, Blanco AR, Cannatelli MA, Enea V, Flamini G, Morelli I, Sudano Roccaro A,

Alonzo V (2004) FEMS Microbiol Lett 230: 191–195

Nostro A, Bisignano G, Cannatelli AM, Crisafi G, Germano PM, Alonzo V (2001) Int J

Antimicrob Ag 17: 517–520

Nostro A, Cannatelli MA, Musolino AD, Procopio F, Alonzo V (2002) Lett Appl Microbiol

35: 181–184.

Nostro A, Germano MP, D'Angelo V, Marino A, Cannatelli MA (2000) Lett Appl Microbiol

30: 379–384

Orchard A, Sandasi M, Kamatou G, Viljoen A, van Vuuren S (2017) Chem Biodivers 14:

e1600218

Paolini J, Desjobert, J-M, Costa J, Bernardini A-F, Castellini CB, Cioni P-L, Flamini G,

Morelli I (2006) Flavour Fragr J 21: 805–808

Peana AT, Marzocco S, Popolo A, Pinto A (2006) Life Sci 78: 719–723

Peris JB, Stübing G, Romo A (2001) Plantas Medicinales de la Peninsula Iberica e Islas

Baleares, Ediciones Jaguar, Madrid, Spain

Peris JB, Stübing G, Vanaclocha B (1995) Anales del Jardín Botánico de Madrid 53: 289–

290

Perrini R, Morone-Fortunato I, Lorusso E, Avato P (2009) Ind Crop Prod 29: 395–403

Petersen D (2015) Journal of the American Herbalist Guild 13: 21–27

Peyron L, Acchiardi J, Bruni B, Rossi JC, Granger R (1978) Perfum Flavor 3: 25

63


Proença da Cunha A, Nogueira MT, Rodrigues Roque O, Gonçalves Barroso JM (2012)

Plantas Aromáticas e Óleos Essenciais: Composição e Aplicações (1st edn.), Fundação

Calouste Gulbenkian, Lisbon, Portugal

Purohit S, Vyas S (2004) Medicinal Plant Cultivation: A Scientific Approach Including

Processing and Financial Guidelines (1st edn.), Agrobios, Jodhpur, India

Radulović NS, Todorovska MM, Zlatković DB, Stojanović NM, Randjelović PJ (2017) Food

Chem Toxicol 110: 94–108

Radulović NS, Genčić MS, Stojanović NM, Randjelović PJ, Stojanović-Radić ZZ, Stojiljković

NI (2017) Food Chem Toxicol 105: 355‒369

Rivas da Silva AC, Lopes PM, Barros de Azevedo MM, Costa DC, Alviano CS, Alviano DS

(2012) Molecules 25: 6305‒6316

Rosa A, Pollastro F, Atzeri A, Appendino G, Melis MP, Deiana M, Incani A, Loru D, Dessì M

(2011) Chem Phys Lipids 164: 24–32

Sala A, Recio MC, Schinella GR, Máñez S, Giner RM, Cerdá-Nicolás M, Ríos JL (2003) Eur J

Pharmacol 461: 53–61

Sala A, Recio MC, Giner RM, Manez S, Rios JL (2001) J Nat Prod 64: 1360–1362

Sandasi M, Leonard CM, Viljoen AM (2008) Food Control 19: 1070–1075

Santini L (2006) Erboristeria Domani 300: 65–71

Santini L (1949) Atti Soc Lomb Sci Med Biol 5: 18

Satta M, Tuberoso CIG, Angioni A, Pirisi FM, Cbras P (1999) J Essent Oil Res 11: 711–715

Sarkić A, Stappen I (2018) Cosmetics 5: 11

Scarborough J (1978) J Hist Biol 11: 353–385.

Schnaubelt K (1999) Medical Aromatherapy – Healing with Essential Oils (1st edn.), Frogs

Ltd., Berkeley, CA, USA

Sergio T, Gaetano DM (1967) Tetrahedron Lett 2: 143–148

Shafie MSB, Zain Hasan SM, Shah MS (2009) Plant Omics J 2: 127–134

Sharkey AG, Shultz L, Friedel RA (1956) Anal Chem 28: 926–934

Sharma JN, Al-Omran A, Parvathy SS (2007) Inflammopharmacology 15: 252–259

Simões M, Bennett RN, Rosa EA (2009) Nat Prod Rep 26: 746–757

Tucker AO, Maciarello MJ, Charles DJ, Simon JE (1997) J Essent Oil Res 9: 583–583

Tundis R, Statti GA, Conforti F, Bianchi A, Agrimonti C, Sacchetti G, Muzzoli M, Ballero M,

Menichini F, Poli F (2005) Nat Prod Res 19: 379–387

Van Den Dool H, Kratz PD (1963) J Chromatogr 11: 463–471

Voinchet V, Giraud-Robert A-M (2007) Phytothérapie 5: 67–72

64


Vontas J, Kioulos E, Pavlidi N, Morou E, della Torre A, Ranson H (2012) Pestic Biochem

Phys 104: 126–131

Weyerstahl P, Marschall-Weyerstahl H, Weirauch M, Meier N, Manteuffel E, Leimner J,

Scholz S (1985) In: Brunke E-J (Ed.) Proceedings of the International Symposium on

Essential Oils, Holzminden/Neuhaus, Germany, September 18–21, pp. 177


8. PRILOG

66


PRILOG 1. STRUKTURE RAVNOTEŽNIH OBLIKA KETO-ENOLNIH TAUTOMERA 4,6,9-TRIMETILDEC-8-EN-

3,5-DIONA (33)

PRILOG 2. STRUKTURE RAVNOTEŽNIH OBLIKA KETO-ENOLNIH TAUTOMERA 2,4,6,9-TETRAMETILDEC-

8-EN-3,5-DIONA (34)

PRILOG 3. STRUKTURE RAVNOTEŽNIH OBLIKA KETO-ENOLNIH TAUTOMERA 3,5,7,10-

TETRAMETILUNDEC-9-EN-4,6-DIONA (35)

PRILOG 4. STRUKTURE RAVNOTEŽNIH OBLIKA KETO-ENOLNIH TAUTOMERA 4,6-DIMETILOKTA-3,5-

DIONA (39)

PRILOG 5. MASENI SPEKTAR I RETENCIONI INDEKS NEPOZNATOG JEDINJENJA 1:

RI (DB-5MS) = 1112; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 154 (17,4), 125 (35,2), 97 (28,3),

86 (40), 69 (54,9), 67 (28,7), 57 (68,4), 55 (100), 43 (67,6), 41 (98,7).


RI (DB-5MS) = 1169; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 136 (8,7), 100 (15,4), 95 (100), 93

(29,9), 83 (33,2), 77 (17,4), 67 (20,4), 59 (16,2), 55 (38,9), 43 (40,2).

67




(17,4), 57 (30,1), 55 (55,5), 53 (13,1), 43 (12), 41 (27).



(7,6), 69 (15,9), 57 (26,5), 55 (59), 53 (14,9), 41 (31,4).


RI (DB-5MS) = 1371; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 204 (28,1), 161 (51), 133 (30),

119 (32,7), 105 (100), 93 (73,1), 77 (36,2), 67 (24,5), 43 (39), 41 (70,3).


RI (DB-5MS) = 1459; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 204 (5,5), 147 (15), 133 (18), 121

(25,9), 93 (100), 91 (39,9), 79 (35), 69 (44,9), 53 (25,6), 41 (62,2).



105 (44,7), 96 (57), 79 (35,5), 69 (64,3), 57 (42,3), 55 (67,8), 43 (60,7), 41 (100), 39

(33,6).


RI (DB-5MS) = 1598; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 208 (10,5), 193 (34,2), 120 (100),

107 (35), 93 (43,5), 79 (46,5), 77 (32,2), 67 (29,2), 59 (54,9), 53 (22,1), 41 (43,5).



147 (30,8), 135 (43,3), 119 (45), 105 (54,6), 91 (61,2), 81 (80), 67 (95,3), 55 (52,7), 41

(100), 39 (44,3).


RI (DB-5MS) = 1622; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 236 (17), 207 (28,9), 179 (43,4),

154 (38,1), 139 (38,5), 109 (69,1), 83 (54), 69 (44,7), 43 (68), 41 (100), 39 (28,2).

68



RI (DB-5MS) = 1662; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 236 (3,9), 204 (71,5), 189

(59,2),161 (67,8), 119 (55), 106 (80), 91 (100), 79 (73,5), 59 (68,6), 41 (49,6).



135 (35,6), 119 (50,5), 107 (94,8), 93 (94,6), 82 (44,5), 79 (63,4), 67 (53,4), 55 (40,8),

43 (56,6), 41 (100), 39 (37,4).



151 (56,7), 109 (84,5), 83 (60,8), 69 (58,9), 55 (46,3), 41 (100), 39 (46,6).


RI (DB-5MS) = 1704; MS (EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 250 (44,9), 196 (100), 151 (55,4),

139 (66), 109 (79,8), 83 (76,6), 81 (53), 69 (99,3), 67 (44,1), 41 (93,3).



95 (38,3), 82 (92), 67 (41,6), 55 (75), 53 (29,8), 43 (42,3), 41 (100).



119 (73,4), 117 (40,8), 105 (61), 93 (46,6), 91 (47,7), 77 (42,5), 55 (66,2), 41 (100), 39

(48,9).



109 (53,7), 105 (92,3), 91 (85,7), 79 (45,6), 77 (62,3), 69 (43,5), 55 (43,5), 41 (100), 39

(47,5).

69




117 (36,9), 109 (60,7), 105 (80,5), 91 (81,6), 77 (51,4), 55 (49,1), 43 (41,3), 41 (100).



117 (43,7), 105 (63,1), 91 (74,5), 69 (42,2), 55 (41,5), 43 (46,3), 41 (100).



105 (45,9), 98 (100), 91 (50,3), 82 (55,4), 69 (43,8), 55 (50,5), 43 (55,2), 41 (98,5).



121 (19), 108 (21), 91 (36,9), 67 (33,5), 55 (43), 53 (26), 43 (100), 41 (73,8).



105 (35,3), 91 (59,3), 81 (48,9), 69 (81,2), 67 (37,5), 55 (31,4), 43 (32,5), 41 (100).

Documents

HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST …...UNIVRZIT T U NIŠU PRIRODNO-MAT MATIČKI AKULT T DEPARTMAN ZA HEMIJU HEMIJSKI SASTAV I BIOLOŠKA AKTIVNOST ETARSKIH ULJA BILJNE VRSTE Helichrysum