IRMA FITRIYANI3415111390PBR’2011

Variasi dalam Ritme dari Respirasi dan Fiksasi Nitrogen pada Anggota uniseluler

Diazotrophic Cyanobacterial Genus Cyanothece

Dalam rangka mengakomodasi proses fisiologi yang tidak cocok dari fotosintesis dan fiksasi

nitrogen dalam sel yang sama, fiksasi nitrogen uniseluler cyanobacteria harus menjaga profil

metabolik yang dinamis dalam kondisi terang maupun gelap dari siklus sel. Transisi dari

fotosintetik ke fase fiksasi nitrogen ini ditandai oleh munculnya berbagai tanggapan biokimia

dan tindakan pengaturan, yang utama bagi lingkungan intraseluler untuk aktivitas

nitrogenase. Respirasi selular memainkan sebuah peran penting selama transisi ini, semisal

oksigen yang dihasilkan oleh fotosintesis dan dengan memberikan energi yang dibutuhkan

untuk proses tersebut. Walaupun prinsip mendasar dari fiksasi nitrogen memprediksi fiksasi

nitrogen unicellular cyanobacteria , untuk berfungsi dengan cara tertentu, variasi yang

signifikan diamati pada perilaku diazotrophic mikroba ini. Dalam upaya untuk memperjelas

perbedaan yang mendasar dan kesamaan yang mengatur kemampuan fiksasi nitrogen dari

uniselular diazotrophic cyanobacteria, kita mengaanalisis enam anggota genus Cyanothece.

Cyanothece sp. ATCC 51142, anggota genus ini, telah memperlihatkan untuk melakukan

efisien fiksasi nitrogen dalam kiondisi aerob dan produksi hidrogen.

Studi kami mengungkapkan perbedaan yang signifikan dalam pola respirasi dan fiksasi

nitrogen antara Cyanothece spp. strain yang tumbuh di bawah kondisi kultur yang sama,

menyarankan bahwa proses ini tidak hanya dikendalikan oleh isyarat dari siklus diurnal tetapi

bahwa ketegangan tertentu oleh sinyal metabolik intraseluler memainkan peran utama.

Meskipun ada perbedaan ini, kemampuan untuk melakukan fiksasi nitrogen aerob dan

produksi hidrogen yang tinggi, menjadi ciri khas dari genus ini.

Fiksasi nitrogen adalah sebuah fenomena global yang penting dalam molekuler

nitrogen, salah satu yang paling banyak komponennya pada atmosfer bumi, diubah bentuknya

dalam bentuk yang direduksi sehingga cocok/sesuai untuk bergabung ke dalam sistem

kehidupan. Sebagian besar fiksasi nitrogen ini dicapai dengan cara biologi melalui aktivitas

mikroorganisme (Burris dan Roberts, 1993; Raymond et al. , 2004; Rubio dan Ludden, 2008).

Proses ini adalah energi intensif, dan nitrogenase, enzim yang kompleks terlibat dalam reaksi

biologis fiksasi nitrogen, adalah pada umumnya sangat sensitif terhadap oksigen (Robson dan

Postgate, tahun 1980 ; Hill et al. , 1981; Berman-Frank et al. , 2005). Oleh karena itu,

sebagian besar mikroba berpartisipasi dalam proses ini fiksasi nitrogen hanya ketika kondisi

anaerob atau kondisi microaerobic dibentuk pada keadaan sebaliknya di lingkungan yang

kaya oksigen. Namun, beberapa pengikat nitrogen (diazotrophic) mikroba memiliki manfaat

yang dapat mengikat nitrogen di lingkungan aerob. Menonjol di antaranya adalah prokaryotes

fotosintetik disebut cyanobacteria, yang berhasil dengan baik pada grup dari mikroba dengan

ciri-ciri seperti tumbuhan. Mikroba ini dianggap sebagai leluhur kloroplas tumbuhan.

Cyanobacteria melakukan keduanya, saat oksigen-berkembang melakukan fotosintesis dan

saat oksigen sedikit melakukan fiksasi nitrogen, dengan demikian memberikan tempat untuk

energi yang paling mahal secara proses metabolik biologis (Simpson dan Burris, 1984)

dengan energi surya.

Di antara pengikatan nitrogen oleh cyanobacteria , dalam bentuk berfilamen telah

dipelajari secara luas untuk kontribusi mereka dalam siklus nitrogen ekosistem laut dan darat

(Mulligan dan Haselkorn, sekitar tahun 1989 ; Kaneko et al. , 2001; Meeks et al. , 2001;

Sañudo-Wilhelmy et al. ,2001; Wong dan Meeks, tahun 2001 ; Gomez et al. , 2005).

Beberapa bentuk berfilamen dikembangkan oleh sel khusus disebut heterocysts yang

memungkinkan pemisahan ruang dari fotosintesis dan fiksasi nitrogen. Heterocysts juga

memiliki tingkat konsumsi respirasi oksigen yang tinggi, yang akan berakibat menghasilkan

lingkungan anoxic untuk enzim nitrogenase (Bergman et al. ,1997). Semua sel heterocyst

diketahui untuk mengikat nitrogen secara aerob. Sebaliknya, sel nonheterocyst cyanobacteria,

kekurangan kompartemen oksigen bebas dan sering memerlukan inkubasi di bawah

microoxic atau kondisi anaerobik untuk fiksasi nitrogen (Rippka dan Waterbury, 1977;

Rippka et al. , 1979; Tembaga et al. , 1992). Namun, beberapa sel nonheterocyst

cyanobacteria dapat memfiksasi nitrogen di bawah kondisi aerob. Termasuk beberapa genus

berfilament (berserabut) seperti Trichodesmium spp., Lyngbya spp., dan Oscillatoria spp.

(Jones, tahun 1990 ; Janson et al., 1994; Finzi-Hart et al., tahun 2009 ) serta genus unicellular

seperti Gloeothece spp. dan Cyanothece spp. (Wyatt dan Silvey, 1969; Rippka dan

Waterbury, 1977; Huang dan Chow, 1988; Van Ni et al. , 1988; Schütz et al. ,2004).

Dalam perbandingan dengan cyanobacteria berfilamen, yang telah lama diakui

kemampuan fiksasi nitrogennya, pentingnya uniseluler cyanobacteria sebagai komponen

kunci dari siklus nitrogen di lingkungan telah terungkap. Studi dalam satu dekade terakhir

telah membuktikan bahwa unicellular seperti Crocosphaera spp., Cyanothece spp., dan

UCYN-sebagai pemain penting dalam siklus nitrogen di laut (Zehr et al., 2001; Montoya et

al., 2004; Zehr, 2011). Sejak unicellular diazotrophic cyanobacteria memanfaatkan

memanfaatkan platform seluler yang sama untuk fotosintesis dan fiksasi nitrogen, mereka

diharuskan untuk menyesuaikan metabolisme selular mereka untuk mengakomodasi dua

proses yang antagonis/berlawanan. Studi tingkat sistem dalam genus uniseluler Cyanothece

telah mengungkapkan pemisahan sementara pada dua proses, fotosintesis yang terjadi selama

siang hari dan fiksasi nitrogen terjadi pada malam hari (Stockel et al., 2008; Toepel et al.,

2008; Welsh et al., 2008). Respirasi seluler memainkan peran penting selama masa transisi

dari satu fase berikutnya, menghasilkan oksigen secara fotosintetik, dibebaskan dengan cepat

ke lingkungan intraseluler dan menerjemahkannya dan menginduksi aktivitas nitrogenase.

Selain itu, respirasi juga menopang proses fiksasi nitrogen, tidak hanya dengan menjaga

lingkungan rendah oksigen yang diperlukan untuk menjalankan enzim nitrogenase tetapi juga

memobilisasi energi matahari yang disimpan untuk bahan bakar proses energi khusus.

Diazotrophs uniseluler menunjukkan keragaman yang besar dalam efisiensi fiksasi

nitrogen serta dalam proses pengaturan fisiologis. Sebagai contoh, anggota genus Gloeothece

mengikat nitrogen secara aerob di siang hari, tetapi pada konsentrasi oksigen terlarut 0%,

fiksasi nitrogen bergeser seluruhnya saat periode gelap (Ortega-Calvo dan Stal, 1991;

Taniuchi et al., 2008). Sebaliknya, beberapa jenis Synechococcus spp. dapat mengikat

nitrogen hanya ketika diinkubasi di bawah kondisi anoxic (lingkungan tanpa oksigen)

(Steunou et al., 2006). Anggota genus Cyanothece telah dilaporkan terlibat fiksasi nitrogen

dalam kondisi baik aerob maupun anaerob, dengan aktivitas nitrogenase memuncak pada

malam hari(Reddy et al., 1993; Bergman et al., 1997; Turner et al., 2001). Hal ini

menunjukkan bahwa, selain pengaturan yang ditetapkan oleh siklus diurnal, isyarat

intraseluler jenis yang spesifik mengatur proses fiksasi nitrogen dalam uniseluler

cyanobacteria, yang mungkin bervariasi menurut genotipe atau ecotipe setiap jenis.

Anggota cyanobacteria uniseluler genus cyanothece yang diazotrophs berkembang di

lingkungan laut maupun terestrial. Genus ini awalnya dikelompokkan bersama-sama dengan

Synechococcus spp. tetapi kemudian dipisahkan berdasarkan perbedaan morfologi dan

biokimia yang berbeda antara dua genus (Komarek, 1976; Rippka dan Cohen-Bazire, 1983).

Beberapa fitur yang mendefinisikan sebagian besar keheterogenan genus Cyanothece adalah

sel-sel oval hingga silindris, ukurannya lebih besar dari 3 µm (diameternya dapat mencapai

24 µm), thylakoid tersusun radial, dan lapisan berlendir sekitar sel (Komarek dan Cepak,

1998; Porta et al., 2000; Liberton et al., 2011).

Baru-baru ini dipertunjukkan bahwa Cyanothece sp. ATCC 51142, salah satu anggota

genus Cyanothece, memiliki kemampuan unik untuk menghasilkan molekul hidrogen dengan

tingkat yang luar biasa di bawah kondisi aerob (Bandyopadhyay et al., 2010). Pengamatan

menarik ini dikaitkan dengan sistem enzim nitrogenase sp. Cyanothece ATCC 51142.

Penelitian kami juga menunjukkan bahwa tingginya tingkat respirasi jenis ini mungkin

berkontribusi terhadap produksi pengolahan nitrogenase hidrogen secara aerob. Gliserol

ditemukan menjadi sumber efisien bagi reduktor dan energi untuk proses ini. Dalam upaya

untuk menyelidiki apakah sifat atipikal cyanobacterial ini adalah karakteristik dari genus

Cyanothece, lima tambahan jenis Cyanothece spp. dari habitat ekologi yang berbeda yang

diurutkan penyempurnaanya. Enam jenis menampilkan lebih dari 90 % identitas dalam urutan

16S ribosom RNA mereka tetapi menunjukkan variabilitas mencolok sehubungan dengan

ukuran genom mereka ( dengan genom terbesar 7.8mb dan terkecil yang 4,4 mb ), jumlah

plasmids, dan persentase pseudogenes ( bandyopadhyay et al. , 2011 ). Selain itu, dua jenis

memiliki unsur-unsur kromosom yang linier, fitur-fitur yang tidak diketahui terjadi dalam

setiap kali mensekuen bakteri fotosintetik lain, yang dapat memberikan spesifik nisia untuk

jenis tersebut. Analisis urutan genom jenis Cyanothece spp. menunjukkan kehadiran gugus

gen nitrogenase di semua lima jenis, dan analisis awal menunjukkan bahwa empat dari lima

jenis mampu memfiksasi nitrogen dalam kondisi aerob dan memproduksi hidrogen

(Bandyopadhyay et al., 2011). Dalam penelitian ini, kita berfokus pada pola fiksasi nitrogen

dan respirasi pada enam jenis Cyanothece spp. yang berbeda dalam upaya untuk menjelaskan

perbedaan dan persamaan yang mendasar dalam proses-proses pada jenis diazotrophic

uniseluler dengan dengan genotip yang sama tetapi bervariasi latar belakang ekologinya.

Penelitian kami menunjukkan perbedaan dalam pengaturan proses-proses ini, yang mungkin

dikendalikan oleh sinyal selular jenis-spesifik. Namun, meskipun perbedaan dalam pola-pola

aktivitas nitrogenase, fiksasi nitrogen aerobik dan produksi hidrogen ditemukan menjadi

karakteristik genus ini, dengan sebagian besar anggota menunjukkan produksi nitrogenase-

dimediasi hidrogen pada tingkat lebih tinggi dari cyanobacteria jenis lain.

HASIL

Berbagai Jenis Cyanothece spp. Menunjukkan Beragam Fenotipe

Enam jenis cyanothece spp. diisolasi dari berbagai daerah geografis menunjukkan

heterogenitas sehubungan dengan ukuran sel, bentuk, dan warna ( fig. 1 ). Keenam jenis

memiliki sel-sel yang lebih besar dari 3 µm (Fig. 2), dan semua jenis kecuali Cyanothece sp.

PCC 7425 memiliki wilayah membran tilakoid yang tersusun radial, sesuai dengan definisi

dari genus Cyanothece (Komarek, 1976; Rippka dan Cohen-Bazire, 1983). Cyanothece sp.

PCC 7822 memiliki sel terbesar (8-10 µm), diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 7424 (6-8 µm).

Cyanothece sp. PCC 7425 memiliki ukuran sel terkecil ( 3-4 µm) dan bentuknya lebih kokoid

dibandingkan bentuk oval sel Cyanothece spp. lainnya. Di tingkat, ultrastructural, jenis

cyanothece spp. yang berbeda dalam arsitektur membran thylakoid serta jenis morfologi

tubuh ( fig. 2 ). Tiga jenis yang telah diisolasi dari ecotipe terestrial (Cyanothece sp. PCC

8801, PCC 7424, dan PCC 7822) memiliki pigmen phycoerythrin, yang menanamkan warna

hijau kecoklatan ke sel (Fig. 1, A dan B). Cyanothece sp. ATCC 51142 adalah jenis laut,

sedangkan lainnya jenis Cyanothece spp. telah diisolasi dari sawah. Jenis tersebut

menunjukkan karakteristik pertumbuhan yang berbeda di bawah kondisi azotrophic dan

diazotrophic ( fig. 3 ). Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, sel-selnya memiliki

kecenderungan untuk membentuk rumpun, dan dua jenis ini tumbuh lebih lambat

dibandingkan dengan jenis lainnya baik dalam kehadiran dan tidak adanya kombinasi

sumber-sumber nitrogen dalam media ( fig. 3A ). Jenis tersebut menunjukkan panjang fase

lag di bawah kondisi fiksasi nitrogen dan panjang fase lag bervariasi di antara setiap jenis.

( Fase lag = Pertumbuhan pada fase ini berjalan lambat, dengan sedikit atau bahkan tidak ada

proses pembelahan sel atau perkembangan sel, organisme beradaptasi terhadap medium

baru). Dari keenam jenis, Cyanothece sp. ATCC 51142 tampaknya yang paling efisien dalam

memfiksasi nitrogen atmosfer diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 8802, berkembang pesat di

bawah kondisi saat fiksasi nitrogen ( fig. 3B ). Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822, dan

PCC 8801 juga tumbuh di media kurang sumber nitrogen tetap, tapi mereka menunjukkan

reduksi dua kali lipat. Sebaliknya, Cyanothece sp. PCC 7425 sel-selnya yang tidak efisien

dalam memfiksasi nitrogen, terjadi perubahan menjadi kuning dalam beberapa hari

pertumbuhan dalam media yang kurang nitrogen ( fig. 3b ).

Analisis Perbandingan Fiksasi Nitrogen dan Produksi Hidrogen pada Berbagai Jenis

Cyanothece spp.

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa anggota genus Cyanothece dapat terlibat

dalam fiksasi nitrogen anaerobik atau aerobik (Waterbury dan Rippka, 1989; Turner et al.,

2001; Bandyopadhyay et al., 2011). Dua dari lima jenis Cyanothece spp. (PCC 7424 dan PCC

7425) termasuk dalam studi ini dikategorikan sebagai strain fiksasi nitrogen anaerobik

(Bergman et al., 1997). Kami mempelajari enam jenis Cyanothece spp. karena kemampuan

mereka untuk mengikat nitrogen dan menghasilkan hidrogen di bawah variasi pertumbuhan

dan kondisi inkubasi. Berdasarkan uji semua kondisi, Cyanothece sp. ATCC 51142

menunjukkan tingkat aktivitas nitrogenase dan produksi hidrogen tertinggi. Aktivitas

nitrogenase diukur dari reduksi asetilen dan ditunjukkan dengan produksi etilen ( oda et al. ,

2005 ). Produksi etilen atau hidrogen pada sel-sel Cyanothece sp. ATCC 51142 tumbuh di

bawah kondisi fotoautotrof dan diinkubasi di udara adalah sekitar 150 µmol mg-1 klorofil h-1

( Fig. 4; Tabel I dan II ). Kondisi serupa, Cyanothece sp. PCC 8802 nitrogen tetap di sekitar

100 µmol etilen mg-1 klorofil h-1 dan menghasilkan hidrogen sekitar 50 µmol mg-1 klorofil h-1.

Aktivitas nitrogenase terendah (kira-kira 50 µmol mg-1 klorofil h-1) diamati pada Cyanothece

sp. PCC 7424 dan PCC 7822, dan tingkat produksi hidrogen pada dua jenis tersebut sekitar

50 µmol mg-1 klorofil h-1. Cyanothece sp. PCC 8801 menunjukkan tingkat menengah

aktivitas nitrogenase ( sekitar 75 µmol etilen mg-1 klorofil h-1 ), sementara produksi hidrogen

sekitar 40 µmol mg-1 klorofil h-1. Pada Cyanothece sp. PCC 7425 sel diinkubasi di bawah

kondisi aerobik, aktivitas nitrogenase atau hidrogen produksi tidak dapat dideteksi.

Ketika sel-sel yang tumbuh di bawah kondisi fotoautotrof yang diinkubasi dalam

lingkungan anoxic, tingkat tertentu dari fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen yang secara

signifikan ditingkatkan. Di bawah inkubasi anaerobik, tingkat kegiatan nitrogenase pada sel-

sel Cyanothece sp. ATCC 51142 lebih dari 230 µmol mg -1 klorofil h-1, dan dibandingkan

dengan ini, tingkat produksi hidrogen secara signifikan lebih tinggi (sekitar 350 µmol mg -1

klorofil h-1). Pada Cyanothece sp. PCC 7425 diinkubasi pada kondisi anoxic, tingkat etilen

dan produksi hidrogen sekitar 40 µmol mg-1 klorofil h-1. Pada semua jenis Cyanothece spp.

yang lain, tingkat spesifik fiksasi nitrogen anaerobik dan produksi hidrogen bervariasi antara

150 dan 200 µmol mg-1 klorofil h-1, dengan tingkat produksi hidrogen lebih tinggi dari atau

sama dengan tingkat produksi etilen. Pertumbuhan photomixotrophic dalam kehadiran

gliserol menunjukkan peningkatan tingkat produksi hidrogen pada Cyanothece sp. ATCC

51142 ( Bandyopadhyay et al. , 2010 ). Kami menguji efek gliserol terhadap fiksasi nitrogen

dan produksi hidrogen pada jenis Cyanothece spp. lainnya. Tidak seperti Cyanothece sp.

ATCC 51142, yang memanfaatkan gliserol untuk produksi biomassa (Feng et al., 2010), jenis

Cyanothece spp. lain tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam tingkat

pertumbuhan ketika tumbuh dengan kehadiran gliserol (data tidak ditampilkan). Namun,

beberapa jenis Cyanothece spp. dapat menggunakan gliserin untuk fiksasi nitrogen dan

produksi hidrogen (Tabel I dan II). Pada Cyanothece sp. ATCC 51142, sel-sel dilengkapi

dengan gliserol nitrogen tetap lebih dari 200 µmol etilen mg -1 klorofil h-1 dan produksi

hidrogen lebih dari 25 µmol mg-1 klorofil h-1 ketika diinkubasi di bawah kondisi aerob.

Diinkubasi pada kondisi anaerobik, sekitar 300 dan 450 µmol mg-1 klorofil h-1, berturut-turut.

Pada Cyanothece sp. PCC 7425, gliserol meningkatkan tingkat fiksasi nitrogen (sekitar 60

µmol etilen mg-1 klorofil h-1) dan produksi hidrogen (sekitar 80 µmol mg-1 klorofil h-1)

sekitar 1.5 sampai 2 kali lipat. Pada Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, gliserol juga

berkontribusi terhadap tingkat produksi lebih tinggi fiksasi nitrogen dan hidrogen (tabel I dan

II). Sebaliknya, gliserol memiliki efek buruk pada fiksasi nitrogen di Cyanothece sp. PCC

8801 dan PCC 8802, meskipun produksi hidrogen tetap tidak berubah.

Perbedaan Fase pada Siklus Diurnal terhadap aktivitas Nitrogenase Jenis Cyanothece

spp.

Kami menilai irama diurnal pada aktivitas nitrogenase lima dari enam jenis

Cyanothece spp. di mana aktivitas nitrogenase dapat diukur diinkubasi di bawah kondisi

aerob. Sel-sel tumbuh di bawah kondisi diazotrophic dan dikenakan pada siklus cahaya/gelap

12 jam diambil sampel setiap 2 jam selama periode ketiga untuk analisis aktivitas

nitrogenase. Enam jenis berbeda sekali sehubungan dengan batas waktu dalam siklus diurnal

ketika aktivitas nitrogenase diinduksi, periode ketika aktivitas berlangsung, serta aktivitas

spesifik enzim nitrogenase ( Fig. 5 ). Pada cyanothece sp. ATCC 51142, aktivitas nitrogenase

ini diinduksi ke arah setengah kemudian dari fase cahaya, antara L6 dan L10, dan aktivitas

memuncak pada awal fase siklus gelap ( antara D2 dan D6 ). Sebaliknya, aktivitas

nitrogenase empat jenis lainnya Cyanothece spp. diinduksi di awal atau pertengahan fase

gelap dan memuncak antara D6 dan D12. Periode aktivitas nitrogenase yang bisa dideteksi

terpanjang di cyanothece sp. ATCC 51142, dan itu bisa tahan hingga 12 jam. Pada

Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, aktivitas berlangsung antara 8 dan 10 jam.

Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822 menunjukkan induksi nitrogenase yang tertunda,

dengan aktivitas terdeteksi di D6. Aktivitas ini berlangsung selama 6 jam di kedua jenis

tersebut. Sementara di Cyanothece sp. ATCC 51142, aktivitas nitrogenase tidak terdeteksi

setelah akhir siklus gelap, pada jenis lain Cyanothece spp., aktivitas nitrogenase diperluas ke

fase awal siklus cahaya (L2). Dari lima jenis, aktivitas nitrogenase tertinggi ditemukan di

cyanothece sp. ATCC 51142, diikuti oleh Cyanothece sp. PCC 8802, PCC 8801, dan PCC

7822 ( fig. 5 ).

Sinkronisasi Temporal Respirasi dan Aktivitas Nitrogenase pada Jenis Cyanothece spp.

Kami mempelajari respirasi dan aktivitas nitrogenase di berbagai jenis Cyanothece

spp. tumbuh di bawah 12 jam siklus cahaya / gelap. Tingkat oksigen terlarut dalam biakan

mencerminkan aktivitas respirasi sel, sedangkan aktivitas nitrogenase ditentukan oleh

pengukuran tingkat konversi asetilena ke ethylene. Pengamatan kami mengungkapkan

perbedaan yang signifikan dalam aktivitas respirasi dan fiksasi nitrogen dalam mempelajari

berbagai jenis (Fig. 6). Menariknya, fluktuasi dalam tingkat oksigen terlarut, sesuai dengan

aktivitas fotosintetik dan respirasi sel, bervariasi dalam enam Cyanothece spp. budaya yang

tumbuh di bawah kondisi yang identik. Laju penyerapan respirasi oksigen ini secara

signifikan berbeda pada setiap jenis,i yang dinyatakan oleh perbedaan kemiringan. Tingkat

oksigen terlarut yang menurun sampai hampir menyentuh 0 µm pada puncak respirasi gelap

dalam beberapa kebudayaan, sementara pada yang lain turun hingga hanya 50 % dari

konsentrasi yang dicapai pada puncak fotosintesis. Waktu tingkat minimum oksigen yang

dipertahankan di setiap jenis selama periode gelap juga bervariasi. Ini jelas dalam lebar

lembah pada titik-titik waktu yang sesuai. Pada Cyanothece sp. ATCC 51142, peningkatan

yang tajam pada tingkat oksigen diamati pada awal siklus cahaya, dan konsentrasi oksigen

tertinggi sesuai dengan aktivitas puncak fotosintetik dicapai dalam beberapa jam pertama

siklus ini (Fig. 6A). Setelah mencapai puncak, tingkat oksigen mengalami penurunan 10%

diamati pada tengah hari. Konsentrasi oksigen ini dipertahankan sampai awal periode gelap,

ketika penurunan tajam diamati, membawa oksigen terlarut sekitar 40% dari tingkat puncak.

Konsentrasi oksigen dipertahankan pada tingkat ini (sekitar 175 µM) untuk seluruh periode

gelap.

Berbeda dengan Cyanothece sp. ATCC 51142, Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822,

PCC 8801 dan PCC 8802 menunjukkan peningkatan tingkat oksigen terlarut untuk hampir

sepanjang periode cahaya, dan konsentrasi mulai turun hanya pada awal periode gelap

(gambar 6, B, D, dan E). Juga berbeda dengan Cyanothece sp. ATCC 51142, penurunan

tingkat oksigen terlarut bertahap pada jenis tersebut, penurunan sepanjang periode gelap.

Konsentrasi oksigen pada akhir periode gelap mendekati 0 µM pada Cyanothece sp. PCC

7424, PCC 7822 dan PCC 8802. Pada Cyanothece sp. PCC 8801, pergeseran diamati dalam

konsentrasi oksigen terlarut selama periode pengujian 72 jam di bioreaktor, dengan

konsentrasi terendah yang tercatat di pertengahan gelap, akhir gelap, dan awal fase cahaya

dari siklus diel. Jenis ini, konsentrasi oksigen terendah dicapai saat puncak respirasi pada 50

µM. Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7822 dan PCC 8801, konsentrasi oksigen terlarut

minimal dipertahankan selama jangka waktu singkat, sedangkan pada Cyanothece sp. PCC

8802, sebuah pola yang mirip dengan Cyanothece sp. ATCC 51142 diamati, dimana kadar

oksigen minimal tetap dipertahankan selama beberapa jam. Respirasi pada cyanothece sp.

Pcc 7425 berbeda dari jenis Cyanothece spp. yang lain, dengan kadar oksigen terlarut

menurun perlahan-lahan di seluruh periode gelap sekitar 30% dari tingkat awal kemudian

meningkat secara bertahap pada seluruh periode cahaya. Sementara sampai batas tertentu ini

menyerupai pola yang diamati pada Cyanothece sp. ATCC 51142, tidak seperti Cyanothece

sp. ATCC 51142, tingkat oksigen dalam Cyanothece sp. PCC 7425 tidak stabil pada

konsentrasi terendah dan menunjukkan kenaikan segera setelah mencapai titik terendah. Hasil

ini menunjukkan bahwa fotosintesis dan respirasi yang diatur berbeda di enam jenis

Cyanothece spp. mengalami isyarat eksterna yang identik, yang menunjukkan perbedaan

dalam status metabolisme sel, yang diterjemahkan ke dalam sinyal pengaturan yang berbeda.

Secara paralel, kami menguji aktivitas nitrogenase dalam enam Cyanothece spp. kultur,

mengambil sampel setiap 2 jam untuk jangka waktu 3 d. Tingkat tertinggi fiksasi nitrogen

terlihat di Cyanothece sp. ATCC 51142 (120 µmol mg-1 klorofil h-1). Pada jenis ini, aktivitas

nitrogenase diinduksi bertepatan dengan penurunan konsentrasi oksigen terlarut sebelum

akhir periode cahaya, mencapai puncaknya dengan dalam beberapa jam pertama periode

gelap, dan berkurang sebelum akhir periode gelap (Fig. 6A). Pada Cyanothece sp. Pcc 7424,

aktivitas nitrogenase diinduksi di tengah siklus gelap dan mencapai puncaknya menjelang

akhir periode gelap, bertepatan dengan puncak respirasi. Aktivitas meluas sampai ke siklus

cahaya dan berkurang ketika konsentrasi oksigen meningkat. Pada Cyanothece sp. PCC 7822,

aktivitas nitrogenase terdeteksi menuju akhir beberapa jam yang periode gelap dan juga

meluas beberapa jam ke dalam siklus cahaya berikutnya. Dengan demikian, di kedua

Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822, periode aktivitas enzim nitrogenase pendek, yang

berlangsung antara 6 sampai 8 jam. Di Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, aktivitas

nitrogenase diinduksi antara awal gelap ( D2 ) dan akhir fase gelap, tergantung pada

konsentrasi oksigen terlarut. Meskipun puncak aktivitas reda sebelum akhir periode gelap,

rendahnya tingkat aktivitas dapat dideteksi bahkan di tengah periode cahaya di kedua jenis

ini. Pada Cyanothece sp. Pcc 7425, tidak ada aktivitas nitrogenase yang dapat diukur dibawah

pengujian ini.

Penggugusan Kromosom dari Gen-gen Nitrogenase pada Uniseluler, Pengikatan

Nitrogen secara aerob pada Cyanobacteria

Untuk menentukan apakah kemampuan untuk melakukan fiksasi nitrogen aerob dan

produksi hidrogen diberikan oleh ciri yang unik pada gugus gen nitrogenase ( nif ) anggota

genus Cyanothece, kami memeriksa tingkat konservasi seluruh gugus kromosom yang

mengandung gen nif. Analisis mencantumkan ke-12 urutan uniseluler pemfiksasi nitrogen

jenis Cyanobacterial: Cyanothece sp. ATCC 51142, CCY 0110, PCC 7424, PCC 7425, PCC

7822, PCC 8801, dan PCC 8802, Crocosphaera sp. Wh 8501, Cyanobacterium UCYN-A, dan

tiga pemfiksasi nitrogen anaerobik jenis Synechococcus spp. Kami menggunakan Cyanothece

sp. ATCC 51142, jenis dengan gugus gen nif berdekatan terbesar (Welsh et al., 2008;

Bandyopadhyay et al., 2011) dan dengan kemampuan pemfiksasi nitrogen dan menghasilkan

hidrogen tertinggi, sebagai referensi jenis dan membandingkan urutan dengan 11 jenis

lainnya. Kami memilih 28.3-kb satu wilayah yang terletak berdekatan antara posisi 555,439

dan 583,778 di genom Cyanothece sp. ATCC 51142. Wilayah ini terdiri dari 35 gen

pengkode protein ( cce _ 0545-cce _ 0579 ), yang mencakup sebagian gen nif. Gen-gen

berkumpul dalam dua kelompok, berorientasi pada arah yang berlawanan, seperti yang

ditunjukkan dalam Gambar 7.

Jenis Cyanothece sp. laut CCY 0110 menunjukkan tingkat tertinggi homologi untuk

cyanothece sp. Atcc 51142, dengan sekitar 90 % identifikasi di tingkat nukleotida, dan berisi

hampir seluruh urutan referensi ( kecuali 171 bp; berwarna hitam di Gb. 7 ) sebagai daerah

yang berdekatan di genom tersebut. Crocosphaera sp. Wh 8501, jenis laut lain, berikutnya

menunjukkan tingkat konservasi tertinggi, dengan sekitar 82 % secara keseluruhan

mengidentifikasi di daerah selaras. Namun, tidak ada daerah homolog yang sesuai dengan

urutan gen-gen pengkode protein cce _ 0551, cce _ 0556, cce _ 0558, dan cce _ 0577 yang

ditemukan dalam genom ini. Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802 menunjukkan pola

barisan yang sangat mirip, dengan sekitar 80% dan 75% cakupan dari urutan referensi,

berturut-turut. Cyanobacterium laut yang tak berkultur UCYN-A, jenis yang telah mengalami

reduksi genom drastis, mempertahankan gugus gen nif, bagiannya sekitar 65.2% homolog

dengan urutan dari referensi. Cyanothece sp. PCC 7424 dan PCC 7822 menunjukkan sekitar

65% dan 60% homolog dengan urutan referensi, berturut-turut. Analisis kami

mengungkapkan bahwa beberapa Cyanothece sp. ATCC 51142 daerah gugus nif ( diwakili

oleh garis arsir ) yang hadir pada lokasi yang jauh pada genom dari Cyanothece sp. PCC

7424, PCC 7822, pcc 8801, dan PCC 8802 ( Gb. 7 ), menyarankan kemungkinan penataan

ulang dari genom tersebut selama evolusi.

Di antara enam jenis Cyanothece spp., Cyanothece sp. PCC 7425 tampaknya memiliki

gugus gen nif yang paling berbeda, berbagi hanya 42 % identitas dengan urutan referensi.

Gugus nif di jenis ini dibagi menjadi dua segmen besar, yang berada pada posisi yang jauh

dalam genom dipisahkan oleh sebuah fragmen dari lebih dari 2,5 Mb. Di tingkat kromosom,

segmen yang besar dari gugus referensi ditemukan hilang dalam Cyanothece sp. PCC 7425,

seperti yang diwakili oleh segmen hitam dalam gambar 7. Meskipun sebagian besar gen-gen

nif yang hadir dalam jenis pemfiksasi nitrogen aerobik hadir di suatu tempat pada genom

Cyanothece sp. PCC 7425, integritas lingkungan gen pada gugus nif hancur, menunjukkan

bahwa pengaturan fungsi mungkin terganggu.

Tiga jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. termasuk dalam analisis ini

menunjukkan seperti Cyanothece sp. PCC 7425 sejalan dengan jenis referensi, menunjukkan

kurang dari 45% Homologi dengan gugus nif Cyanothece sp. ATCC 51142. Meskipun bagian

dari gugus di semua keempat jenis menunjukkan identitas sekitar 60% sampai 80% di

tingkat nukleotida dengan jenis uniseluler diazotrophic lainnya yang termasuk dalam analisis

ini, lebih dari 50% cluster tidak menunjukkan ada kesamaan di tingkat nukleotida. Kami

membuat pohon filogenetik menggunakan urutan protein nifH dari 103 jenis cyanobacterial

dengan urutan nifH Cyanothece sp. 51142 ATCC sebagai referensi (tambahan Gb. S1).

Semua jenis pemfiksasi nitrogen aerobik yang bercabang dari node yang sama sebagai

Crocosphaera watsonii dan UCYN-A dan berkumpul bersama-sama. Sebaliknya, Cyanothece

sp. PCC 7425 nampaknya telah bercabang secara independen dari titik yang juga

memunculkan beberapa jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik berserabut Oscillatoria spp..

Jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. muncul pada cabang terpisah dari

Cyanothece sp. PCC 7425. Analisis ini mengungkapkan bahwa gugus nif jenis uniseluler di

laut Cyanothece sp. ATCC 51142 dan CCY 0110 dan Crocosphaera sp. WH 8501 hampir

menyerupai satu sama lain dalam hal sintesis gen serta dalam konservasi dari gugus urutan

nukleotida. Gugus nif pada jenis pemfikasi nitrogen anaerobik uniseluler, di sisi lain,

memegang ciri berbeda dari jenis di laut yang menunjukkan sebuah garis evolusi independen.

DISKUSI

Pemfiksasi nitrogen uniseluler Cyanobacteria menunjukkan keragaman yang besar

dalam perilaku diazotrophic mereka, khususnya dalam efisiensi fiksasi nitrogen, induksi

aktivitas nitrogenase, fase siklus diurnal ketika aktivitas nitrogenase puncak, dan kemampuan

mereka untuk melakukan fiksasi nitrogen aerobik versus anaerobik. Perbedaan tersebut dapat

dikaitkan ke keadaan genotyp jenis serta tekanan selektif yang dikenakan pada mereka di

habitat tertentu. Analisis kami terhadap segi morfologi dan metabolik, berbeda dari keenam

anggota genus Cyanothece mengungkapkan bahwa tingkat variasi ini cukup bahkan pada

tingkat intragenus. Namun, meskipun bervariasi, tingkat fiksasi nitrogen aerobik tinggi dan

hidrogen produksi muncul menjadi karakteristik dari genus ini, dengan lima dari enam jenis

menunjukkan tingkat produksi hidrogen aerobik lebih tinggi daripada jenis wild-type

Cyanobacterial lain yang dikenal ( Dutta et al. , 2005 ). Cyanothece sp. PCC 7425 adalah

satu-satunya pengecualian di mana aktivitas nitrogenase atau produksi hidrogen tidak dapat

terdeteksi kecuali disediakan sebuah inkubasi lingkungan anaerobik. Pengamatan ini

menguatkan studi sebelumnya, yang mengindikasikan bahwa Cyanothece sp. PCC 7425 unik

di antara jenis Cyanothece spp. lainnya (Porta et al., 2000; Bandyopadhyay et al., 2011) dan

dalam beberapa hal menyerupai pemfiksasi nitrogen anaerobik, Synechococcus spp. Studi

analisis perbandingan, mengungkapkan perbedaan signifikan antara Cyanothece sp. PCC

7425 dan pemfiksasi nitrogen anaerobik Synechococcus spp. di tingkat genom dan

menunjukkan kedekatan dengan Acaryochloris marina dalam pohon filogenetik

(Bandyopadhyay et al., 2011). Dengan demikian, Cyanothece sp. PCC 7425 tampaknya jenis

yang berkembang secara independen yang mungkin statusnya dianggap di luar genus

Cyanothece. Aktivitas tertentu enzim nitrogenase bervariasi dalam enam jenis Cyanothece

spp., mengakibatkan tingkat yang berbeda pada fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen. Rasio

aktivitas nitrogenase dengan produksi hidrogen di bawah kondisi aerobik dan anaerobik juga

bervariasi antara keenam jenis tersebut (Gambar 4). Pengamatan ini bisa disebabkan oleh

perbedaan dalam efisiensi nitrogenase dan penyerapan enzim hydrogenase, perbedaan dalam

tingkat toleransi oksigen dari enzim nitrogenase, serta kontribusi dari sistem dua fungsi

enzim hydrogenase menuju produksi hidrogen. Selain itu, gugus nif berbeda secara signifikan

antara jenis Cyanothece spp., faktor yang mungkin juga berkontribusi untuk mengamati

perbedaan fisiologis. Perbandingan dari gugus ini antara uniseluler Cyanobacteria

mengungkapkan konfigurasi yang berbeda pada jenis pemfiksasi nitrogen anaerobik, dengan

pengurangan yang signifikan dalam ukuran gugus (gambar 7), menunjukkan kemungkinan

bahwa segmen tertentu dari gugus diperlukan untuk fiksasi secara aerob. Pengamatan

menarik lain adalah kemiripan gugus nif pada jenis di laut yaitu Cyanothece sp. ATCC 51142

dan CCY 0110 dan Crocosphaera spp. memamerkan lebih dari 90% identitas di tingkat

nukleotida. Studi yang berfokus pada kemampuan memfiksasi nitrogen dari tiga jenis tersebut

dapat mengakibatkan kesimpulan penting tentang kepentingan gugus ini dalam fiksasi

nitrogen secara aerob dan produksi hidrogen. Meskipun tak satu pun dari genom Cyanothece

spp. tampaknya mengandung gen untuk fasilitator penyerapan gliserol (GlpF), sebagian besar

jenis Cyanothece spp. mampu memanfaatkan gliserol, menyatakan bahwa transportasi

gliserol ke sel dimediasi oleh difusi pasif (da Silva et al., 2009). Tidak seperti Cyanothece sp.

ATCC 51142, yang memanfaatkan gliserol untuk produksi biomassa serta memediasi

nitrogenase produksi hidrogen, Cyanothece spp. lain itu tidak mampu untuk memanfaatkan

gliserol untuk pertumbuhan mixotrophic. Namun, beberapa jenis ( Tabel I dan II ) secara

signifikan menunjukkan aktivitas nitrogenase jauh lebih besar, menyatakan bahwa gliserol

mengalami metabolisme dalam sel dan dapat digunakan sebagai sumber reductants. Di

catatan yang sama, Feng et al. ( 2010 ) menunjukkan bahwa Cyanothece sp. ATCC 51142

bisa memetabolisme glc, tapi sumber karbon ini tidak berkontribusi terhadap produksi

biomassa. Pada Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802, gliserol berpengaruh kurang baik

terhadap fiksasi nitrogen, menunjukkan perbedaan metabolisme yang melekat pada jenis

tersebut. Anehnya, dua jenis Cyanothece spp. tersebut memiliki gliserol kinase, gen yang

hadir di Cyanothece sp. ATCC 51142, jenis yang menunjukkan peningkatan pertumbuhan

dalam kehadiran gliserol. Ketidakmampuan Cyanothece sp. PCC 8801 dan PCC 8802 untuk

memanfaatkan gliserol bagi pertumbuhan dan produksi hidrogen memungkinkan perbedaan

dalam jalur hilir.

Fiksasi nitrogen dan respirasi, dua proses metabolisme yang terkait erat dalam

diazotrophic Cyanobacteria. Tekanan parsial oksigen dalam sel untuk mengetahui kondisi

efisiensi fiksasi nitrogen, dan beberapa mikroba pemfiksasi nitrogen secara aerob dapat

menyesuaikan tingkat respirasi untuk mencari kelebihan oksigen sebagai strategi untuk

melindungi enzim nitrogenase. Itu menunjukkan bahwa pada Crocosphaera spp., respirasi

gelap memediasi pemasukan konsentrasi oksigen intraseluler adalah prasyarat untuk induksi

aktivitas nitrogenase (Compaor dan Stal, 2010). Respirasi juga menghasilkan energi penting

untuk proses fiksasi nitrogen, yang memerlukan pemeliharaan tingkat respirasi yang stabil

selama periode fiksasi nitrogen (Fay, 1992). Studi di tingkat transkripsi dan translasi di

Cyanothece sp. ATCC 51142 telah menunjukkan bahwa gen yang terlibat dalam respirasi dan

fiksasi nitrogen berkorelasi, dengan kedua kategori gen tersebut diatur naik sepanjang

seluruh periode gelap dan diatur turun sepanjang periode cahaya (St ckel et al., 2008).

Studi kami mengungkapkan hubungan yang dekat antara aktivitas respirasi dan fiksasi

nitrogen dari jenis Cyanothece spp. Konsentrasi oksigen terlarut dalam pertumbuhan media

menunjukkan osilasi kuat atas siklus diurnal, dan pola osilasi bervariasi antara jenis-jenis

Cyanothece spp. Osilasi ini pada oksigen terlarut konsentrasi dalam media terutama timbul

dari kegiatan fotosintetik sel-sel ( yang mengakibatkan oksigen meningkat pada siang hari)

serta dari respirasi gelap ( yang dihasilkan di lembah-lembah ). Selain itu, fotorespirasi dan

reaksi Mehler yang dikenal berkontribusi ke konsentras oksigen bersih ( Kana, 1992 ). Pada

sebagian besar Cyanothece spp. strain, aktivitas respirasi dimulai pada awal masa gelap dan

memuncak menjelang akhir, ketika keadaan puncak, aktivitas nitrogenase ini juga diamati.

Cyanothece sp. ATCC 51142 adalah pengecualian, di mana tingkat fotosintesis yang sangat

tinggi dan awal puncak fotosintetik yang diamati pada periode cahaya diikuti dengan

penurunan konsentrasi oksigen terlarut. Meskipun penurunan konsentrasi oksigen selama

periode cahaya dapat memperlambat atau menghentikan aktivitas fotosintetik, mungkin juga

menunjukkan tingkat basal yang tinggi dari respirasi cahaya sendiri dan konsumsi oksigen

yang simultan oleh proses seperti fotorespirasin dan reaksi Mehler. Tingkat respirasi tinggi

(dianggap tinggi untuk Cyanobacteria), yang meningkat di bawah siklus gelap, telah

dilaporkan untuk Cyanothece sp. ATCC 51142 (Schneegurt et al., 1997). Konsumsi oksigen

secara bebas tersebut terutama dikaitkan dengan reaksi Mehler pada Trichodesmium spp.

( Kana, 1992 ). Karena konsentrasi oksigen dalam Cyanothece sp. ATCC 51142 turun,

permulaan awal kegiatan nitrogenase diamati (Gambar 6). Sebaliknya, Cyanothece sp. PCC

7424 dan PCC 7822 menunjukkan penurunan konsentrasi oksigen terlarut, mulai hanya pada

akhir periode gelap, sementara Cyanothece sp. PCC 7425 dan PCC 8802 menunjukkan

penurunan yang hanya setelah beberapa jam ke periode cahaya. Penundaan pada awal

aktivitas respirasi mungkin menunjukkan tingkat yang lebih lambat awal respirasi pada jenis

tersebut, yang mengambil di L2 di Cyanothece sp. PCC 8802, mengarah ke penurunan yang

terjal. Pada Cyanothece sp. PCC 7425, penurunan konsentrasi oksigen lebih bertahap dan

berlangsung sepanjang periode gelap. Tidak seperti jenis lainnya Cyanothece spp., oksigen

berputar pada Cyanothece sp. PCC 8801 menunjukkan pergeseran fase. Pada siklus diurnal

pertama, konsentrasi oksigen mulai meningkat di pertengahan peroide gelap. Pada periode

diurnal berikutnya, meningkatnya konsentrasi oksigen diamati setelah L9, sedangkan dalam

siklus ketiga, konsentrasi meningkat hanya pada periode cahaya. Anomali ini dalam pola

berputar, sulit untuk menafsirkan dan mungkin menyarankan penghentian awal respirasi dan

mengakibatkan kenaikan atmosfer oksigen terlarut. Hal ini juga menunjukkan bahwa

mungkin ada jeda sebelum jam sirkadian dan diurnal sinkron dengan metabolisme di

Cyanothece sp. PCC 8801 di bawah kondisi bioreaktor.

Sementara kebanyakan jenis menunjukkan tingginya tingkat respirasi selama periode

gelap, pada beberapa jenis, tingkat oksigen terlarut mencapai mendekati nol di puncak

respirasi. Namun, mengherankan, jenis tersebut tidak menunjukkan aktivitas tinggi

nitrogenase. Sebaliknya, Cyanothece sp. ATCC 51142 menunjukkan tingkat awal respirasi

yang sangat tinggi tapi mempertahankan tingkat oksigen terlarut sepanjang periode gelap, dan

kegiatan nitrogenase di jenis ini adalah yang tertinggi. Dengan demikian, menjaga

konsentrasi oksigen di ambang tertentu untuk jangka waktu tampaknya menjadi faktor yang

memberikan kontribusi terhadap tingginya tingkat aktivitas nitrogenase sp. Cyanothece

ATCC 51142. Tingkat respirasi yang stabil sepanjang periode gelap menunjukkan

ketersediaan cukup reduktan dan energi dalam strain ini. Pengamatan ini juga menyarankan

bahwa tingkat toleransi oksigen dari enzim nitrogenase di Cyanothece spp. strain mungkin

berbeda, dengan beberapa jenis yang membutuhkan sebuah lingkungan yang lebih anaerobik

untuk induksi aktivitas nitrogenase. Pada Cyanothece sp. PCC 7425, laju respirasi lebih

lambat dan tekanan parsial oksigen terlarut tinggi tampaknya menjadi hambatan dalam

kemampuannya untuk fiksasi nitrogen secara aerob dan memerlukan induksi nitrogenase oleh

kondisi anaerob buatan. Beberapa komponen dari gugus nif yang hilang dalam Cyanothece

sp. PCC 7425 dan hadir dalam jenis fiksasi nitrogen aerob mungkin juga memainkan

peranan penting dalam fiksasi nitrogen secara aerob. Contoh ini termasuk gen pengkode 4fe-

4s ferredoxin iron-sulfur mengikat protein domain terletak antara nifB dan nifS pada jenis

fiksasi nitrogen secara aerob serta hipotetis gen lain dalam gugus. Selain itu, cysE2, gen

pertama pada salah satu dari dua unit transkripsi pada gugus di Cyanothece sp. ATCC 51142,

tidak terdapat salah satu gugus nif di Cyanothece sp. PCC 7425. Menariknya, coexpression

jaringan analisis studi mengungkapkan konektivitas temporal yang kuat antara cysE2 dan

nifB, gen pertama di unit transkripsi kedua dari gugus ini di Cyanothece sp. ATCC 51142.

Lokasi dua gen ini terpelihara dalam semua pemfiksasi nitrogen aerobik uniseluler jenis

Cyanobacterial dan konektivitas sementara antara gen ini mungkin melibatkan peran mereka

dalam memulai fiksasi nitrogen aerobik. Periode aktivitas nitrogenase berlangsung juga

beragam dalam Cyanothece spp. strain, dengan Cyanothece sp. ATCC 51142 menunjukkan

aktivitas periode terpanjang, menunjukkan perbedaan pada cadangan karbon dari strain ini

dan kemungkinan cadangan yang digunakan untuk jalur yang berbeda.

Cyanobacteria diazotrophic uniseluler mempertahankan profil metabolik yang

dinamis pada seluruh siklus diurnal. Cyanothece sp. ATCC 51142 menjadi sangat aktif

selama fase gelap dari siang dan periode malam, dengan banyaknya transkrip yang tertinggi

di awal periode gelap. Tingkat pergantian protein juga dianggap lebih tinggi pada periode

gelap (St ckel et al., 2008). Aktivitas seluler selama musim gelap proses berupa seperti

respirasi, fiksasi nitrogen, produksi hidrogen dan degradasi glikogen. Jalur biosintesis asam

amino juga diatur meningkat selama gelap periode. Selama fase cahaya, proses seperti

fotosintesis, fiksasi karbon dan sintesis glikogen dominan. Pengaturan proses biokimia yang

dijaga ketat, merupakan kontrol transisi antara fase terang dan gelap. Sifat-sifat tersebut

membuat anggota genus Cyanothece sangat menarik di mana pengaruh siklus sirkadian dan

siklus diurnal pada metabolisme dapat dipelajari. Studi ini menunjukkan bahwa diazotrophic

uniseluler Cyanobacteria dengan latar belakang genotipe yang sama menunjukkan keragaman

pola diurnal dari pusat proses metabolisme. Variasi muncul dikontrol oleh sinyal spesifik

metabolik intraseluler untuk setiap jenis, seperti konsentrasi intraseluler karbon, nitrogen,

atau oksigen, yang pada gilirannya dikontrol kemampuan sel untuk memfiksasi nitrogen.

Tingginya tingkat respirasi, cukup pasokan energi dan reduktan dari efisien fotosintesis, dan

belum diketahui komponen mesin memfiksasi nitrogen yang muncul menjadi faktor yang

menyebabkan kemampuan menghasilkan hidrogen aerobik unik dari genus Cyanothece.

BAHAN DAN METODE

Pertumbuhan Sel

Cyanothece sp. ATCC 51142 sel ditumbuhkan dalam media ASP2 (Reddy et al.,

1993) dalam labu yang digetarkan 30oC di bawah 30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih dan

ambient CO2. Semua Cyanothece spp. strain yang ditumbuhkan dalam media BG11 (Allen,

1968) di bawah kondisi pertumbuhan yang serupa. Studi produksi hidrogen dan aktivitas

nitrogenase, Cyanothece spp. strain yang ditanam di labu yang digetarkan atau bioreaktor di

media ASP2 atau BG11 (Reddy et al., 1993; Halaman et al., 2012), tanpa dilengkapi NaNO3,

pada 30oC di bawah cahaya 12 jam / 12 jam siklus gelap dan 100 µmol foton m -2 s-1 cahaya

putih. Kurva pertumbuhan di bawah kondisi azotrophic dan diazotrophic yang dihasilkan oleh

sampling dan pengukuran kepadatan optik kultur di 730 nm (OD 730) di BioTek µQuant

piring reader pada interval 24 jam untuk 7 d. Cahaya micrograph dan penyerapan spectra dari

strain diperoleh dari 6 - untuk 7-d-old kultur berkembang dalam kehadiran gabungan sumber

nitrogen. Gambar diperoleh dengan menggunakan mikroskop FluoView FV-1000 (Olympus)

dan kamera digital Olympus DP71 warna, dan spektrum yang diperoleh pada

spectrophotometer Olis DW-2000. Pemfiksasi nitrogen Cyanothece spp. kultur digunakan

dalam kajian ini dibuat dengan menyuntikkan volume 0.25 (5-7 d old, O.D. 730 antara 0,5

dan 0.7) tumbuh di media ASP2 atau BG11 (tanpa sumber nitrogen gabungan) di bawah

cahaya terus-menerus (30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih). Kultur ini pada gilirannya dimulai

oleh penyuntikan sepersepuluh volume dari sel (dari 7 - ke 9-d-old kultur, O.D. 730 sekitar

0.8) di bawah 30 µmol foton m-2 s-1 secara terus-menerus cahaya putih. Analisa pertumbuhan

photomixotrophic, kultur telah ditambah dengan 50 mM gliserol.

Mikroskop Elektron

Dalam persiapan untuk mikroskop elektron, Semua Cyanobacterial strain tumbuh secara

terus-menerus pada 30 µmol foton m-2 s-1 cahaya putih di 30oC. Cyanothece sp. PCC 7424,

PCC 7425, PCC 7822, PCC 8801 dan PCC 8802 dipanen setelah 5 d langsung dari piring

berisi media BG11 padat. Sel dikumpulkan dari piring sebagai sel perekat dan ditransfer

langsung ke aluminium planchettes (papan kecil dengan 2 roda) pada sumur sedalam 100

µm. Cyanothece sp. ATCC 51142 panen sebagai kultur cair yang berkembang di media ASP2

setelah 6 d. Sejumlah kultur (25 ml) disentrifugasi, dan butir sel ditutup kembali dalam

volume medium kecil dan dipipetkan ke planchettes sumur sedalam 200 µm. Semua sel

dibius dengan ultra cepat, pembekuan bertekanan tinggi menggunakan Bal-Tec Freezer

tekanan tinggi (Bal - Tec). Cyanothece sp. PCC 7424, PCC 7425, PCC 7822, PCC 8801 dan

PCC 8802 sampel yang membekukan pengganti di 2% (w/v) osmium pada aseton dan

tertanam dalam Epon/Araldite. Cyanothece sp. ATCC 51142 sampel yang membekukan

diganti dalam 1% (v/v) glutaraldehid ditambah asam tannic 0,1% (w/v) dalam aseton dan

tertanam dalam Spurr’sresin. Membekukan substitusi ini dilakukan selama 3 d pada 80oC dan

15 jam di 60oC, diikuti oleh pencairan yang lambat sampai suhu kamar. Bagian tipis yang

diwarnai dengan uranyl asetat dan timah sitrat dan kemudian tergambar menggunakan LEO

912 energi filter mikroskop elektron transmisi dilengkapi dengan kamera digital ProScan.

Pengukuran Produksi hidrogen, Respirasi dan Aktivitas Nitrogenase

Untuk menentukan tingkat fiksasi nitrogen dan produksi hidrogen, 20 mL dari kultur

(dari kultur cahaya/gelap yang berusia 7 d, 12-jam) dipindahkan pada awal periode gelap dari

bioreaktor dan/atau labu getar botol kaca kedap udara (36 mL) dan diinkubasi di udara di

bawah intensitas cahaya dari 100 µmol foton m-2 s-1 untuk 12 jam. Untuk inkubasi anaerobik,

botol kaca yang dibilas dengan argon selama 15 sampai 30 menit. Untuk percobaan yang

dilakukan selama siklus diel, 10-mL sample yang dikumpulkan setiap 2 jam dari bioreaktor

serta labu getar dan diinkubasi di 36-mL botol untuk 1 h di udara di bawah intensitas cahaya

dari 100 µmol foton m-2 s-1. Aktivitas Nitrogenase kultur ditentukan menggunakan assay

reduksi asetilena (Oda et al, 2005), mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Bandyopadhyay

et al. (2010), dan dinyatakan dalam produksi etilen. Etilena dan hidrogen yang terakumulasi

di ruang kepala cawan tertutup itu ditarik dengan jarum suntik kedap udara dan diukur

menggunakan Agilent 6890N gas chromatograph (Bandyopadhyay et al., 2010). Aktivitas

respirasi sel diukur dalam photobioreactors dilengkapi dengan elektroda oksigen Mettler

Toledo Clark-jenis terpadu (Halaman et al., 2012). Lubang bioreaktor dioperasikan dalam

modus pengadukan untuk mengevaluasi perubahan-perubahan dalam konsentrasi oksigen

terlarut kultur dari kegiatan fotosintetik dan respirasi sel. Kultur ditransfer ke bioreaktor pada

permulaan fasa log pertumbuhan dan dipelajari dalam mode batch kultur di bawah kondisi

pengadukan untuk 7 d. Optik kepadatan kultur tidak berubah secara signifikan selama periode

72-h di mana kultur bersikap sama, seperti yang terlihat dari pola respirasi dan fotosintesis.

Setelah 3 d, variasi budaya yang diamati dalam pola siklus dan sel menunjukkan tanda-tanda

stres. Dengan demikian, data yang diperoleh selama periode 3-d yang disajikan di sini. Total

klorofil a diambil oleh metanol dan diukur secara spetrofotometrik menggunakan

spektrofotometer Olis DW2000. Kandungan klorofil Cyanothece sp. ATCC 51142 kultur

yang tumbuh tanpa sumber eksternal karbon berkisar antara 0,5 dan 2 µg mL-1, sedangkan

kultur dilengkapi dengan gliserol memiliki konsentrasi klorofil yang lebih tinggi (2-5 µg mL-

1). Kandungan klorofil spp. Cyanothece strain lain berkisar antara 0.3 dan 2.8 µg mL -1 di

bawah kondisi fototrof dan photomixotrophic.

Perbandingan Tingkat Nukleotida Gugus nif pada uniseluler Pemfiksasi Nitrogen strain

Daerah Konservasi diidentifikasi menggunakan Pusat Nasional untuk Informasi

Bioteknologi nukleotida BLAST versi 2.2.22 (Altschul et al., 1997) dengan parameter

dust:no, word_size:11, gapopen:5, gapextend:2, penalty:-3 dan reward: 2. Dalam gambar 7,

daerah yang dilestarikan di setiap strain selaras dengan urutan referensi dari Cyanothece sp.

ATCC 51142. Daerah berwarna berdasarkan persentase basis identik dalam masing-masing

daerah. Selain itu, kami mengidentifikasi homologs untuk 35 gen pengkodean protein yang

terdapat di wilayah ini menggunakan Pusat Nasional Informasi Bioteknologi protein BLAST.

Dalam analisis ini, dua gen disebut homologs jika timbal balik BLAST mengakibatkan (1)

nilai E yang kurang dari 1E-4, (2) rasio antara panjang BLAST memukul wilayah dan

panjang protein lengkap yang lebih besar dari 2:3, dan (3) rasio antara nilai mentah untuk

dua-protein BLAST dan nilai baku untuk BLAST yang lebih besar dari 1:3.5.

Pohon filogenetik NifH dibuat menggunakan urutan asam amino NifH di Cyanothece

sp. ATCC 51142 sebagai referensi. Urutan gen homolog di 103 Cyanobacterial strain dikenali

dari database genom mikroba yang terintegrasi dari Departemen Energi-Joint Genome

Institute (Markowitz et al., 2010). ClustalX2 versi 2.1 (Larkin et al., 2007) paket perangkat

lunak yang digunakan untuk melakukan jajaran yang lengkap urutan individu, dan pohon

filogenetik dibuat menggunakan algoritma yang bergabung dengan tetangga dengan

parameter default. Pohon resultan diterjemahkan menggunakan fragmen Versi 0.957b

program perangkat lunak (Han dan Zmasek, 2009).