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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
TÍTULO:
“ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS CANABINOIDES
EN LA UNIÓN NEUROMUSCULAR DE LA RANA”
Tesis para obtener el grado de:
Doctor en Ciencias Fisiológicas con Especialidad en Fisiología
Presenta:
M. en C. Enrique Alejandro Sánchez Pastor
ASESOR:
Dr. Miguel Huerta Viera
COASESOR:
Dra. Xóchitl A. R. Trujillo Trujillo
Colima, Col. Mayo de 2006.
i
DEDICATORIA
A María Fernanda y Elián Alejandro.
AGRADECIMIENTOS A mis padres, por su cariño y por todo el apoyo que me han brindado.
A la Dra. Xóchitl Trujillo y al Dr. Miguel Huerta, por guiarme durante todo el
tiempo que he estado integrado a su laboratorio.
A la Dra. Elena Castro por su apoyo para realizar la parte de Biología
Molecular en su laboratorio.
A los integrantes del jurado, por todas sus sugerencias para enriquecer el
presente trabajo.
A María Felipa, por todo su apoyo durante mi estancia en el laboratorio.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo
económico durante mis estudios de Doctorado.
Para la realización de este trabajo se recibió apoyo de CONACyT (Proyecto
43446-M) otorgado a Miguel Huerta.
ii
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 1 RESUMEN 3 ABSTRACT 4
INTRODUCCIÓN 5 Unión neuromuscular 5
Participación del Calcio en la liberación de transmisor en la unión neuromuscular 6 Mecanismo de liberación de transmisor y la generación del potencial de placa
terminal 7
Principales canales iónicos en las terminales nerviosas motoras 9
A) Los canales de Ca2+ 9
B) Los canales de K+ 11
C) Los canales de Na+ 12
D) Los canales de Cl- 13
Características de las fibras musculares esqueléticas 13
Canabinoides y liberación de transmisor 14
Receptores a Canabinoides 15
Endocanabinoides 17
Ligandos que se unen a los Receptores a Canabinoides 19
Activación de los Receptores a Canabinoides 20
ANTECEDENTES INMEDIATOS 22
Los canabinoides y la unión neuromuscular 22
JUSTIFICACIÓN 25
iii
HIPÓTESIS 27
OBJETIVOS 28
METODOLOGÍA 29
A) Disección 29
B) Detección de ARNm para el receptor CB1 29
1.- Extracción de ARN 30
2.- RT- PCR 30
3.- Transfección en Células HEK293 32
C) Efecto de los Canabinoides sobre la transmisión sináptica 33
1.- Registro del potencial miniatura de placa terminal 33
2.- Acción de los canabinoides 33
3.- Efecto de la toxina pertussis 33
4.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ 34
5.- Soluciones 34
6.- Medición y análisis 34
RESULTADOS 36
Detección de ARNm para CB1 por RT-PCR convencional y RT-PCR Tiempo Real
36
Efecto de canabinoides sintéticos sobre la liberación espontánea de transmisor
en la unión neuromuscular de rana 39
Curva dosis efecto obtenida con WIN 55,212-2 39
Efecto del WIN 55,212-2 40
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de PTX 41
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM630 42
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM281 43
Curva dosis efecto obtenida con ACPA 46
Efecto del ACPA 46
Efecto del ACPA en presencia de PTX 48
iv
Efecto del ACPA en presencia de AM281 50
Histogramas de distribución de los potenciales miniatura 53
Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ sobre la liberación espontánea de
transmisor 56
Nifedipina 56
ω-conotoxina-GVIA 57
Efecto de ACPA sobre la liberación espontánea de transmisor después de
bloquear los canales de Ca2+ tipo N, con ω-conotoxina-GVIA 60
DISCUSIÓN 62 CONCLUSIONES 67
PERSPECTIVAS 68
MANUSCRITOS EN PREPARACIÓN 69 TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS 70 REFERENCIAS 71
ABREVIACIONES 85
1
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1.- Clasificación de los canales de calcio activados por voltaje. 10
Figura 1.- unión entre una terminal nerviosa motora y una fibra muscular. 5
Figura 2.- Ilustración de registros representativos de los Potenciales miniatura en la
unión neuromuscular de la rana. 6
Figura 3.- Acople excitación-contracción. 8
Figura 4.- Representación esquemática de los canales de Ca2+ dependientes de
voltaje. 10
Figura 5.- Estructura química del principal componente activo de la marihuana, el Δ-
9-tetrahidrocanabinol. 15
Figura 6.- Esquema de los receptores a canabinoides CB1 y CB2. 16
Figura 7.- Estructuras químicas de cinco endocanabinoides identificados. 18
Figura 8.- Estructuras químicas del delta-9 tetrahidrocanabinol y otros agonistas de
receptores a canabinoides. 19
Figura 9.- Estructuras químicas de algunos antagonistas de los receptores sensibles
a canabinoides. 20
Figura 10.- Representación esquemática de las vías de activación de CB1 y CB2 por
canabinoides. 21
Figura 11.- Gel representativo en el que se corrieron muestras de ADN de β-actina
(control) y de CB1. 36
Figura 12.- Promedios de la expresión de ARNm para CB1 en células HEK293,
HEK293 transfectadas con CB1, los músculos EDL y cruralis de rana. 37
Figura 13.- Expresión de ARNm para CB1 RT-PCR Tiempo Real. 38
Figura 14.- Curva dosis-efecto del canabinoide sintético WIN55,212-2. 39
Figura 15.- Efecto de WIN (10 μM) sobre los potenciales miniatura. 40
Figura 16.- Efecto de WIN (10 μM) después de incubar el músculo con Toxina
pertussis (2 μg/ml.) durante 22-24 horas a 4 oC. 41
Figura 17.- La presencia de WIN en un músculo tratado con Toxina pertussis no
provoca cambios significativos sobre los PMPT. 42
2
Figura 18.- Efecto de WIN (10 μM) en presencia de AM630 (1 μM) sobre los
potenciales miniatura. 43
Figura 19.- Efecto de WIN (10 μM) en presencia de AM281 (1 μM) sobre los
potenciales miniatura. 44
Figura 20.- Resumen del efecto de WIN sobre los potenciales miniatura. 45
Figura 21.- Curva dosis-efecto con el agonista selectivo de CB1 ACPA. 46
Figura 22.- Efectos de ACPA (1 μM) sobre los potenciales miniatura. 47
Figura 23.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA. 48
Figura 24.- Efecto de ACPA en presencia de PTX sobre los potenciales miniatura. 49
Figura 25.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de PTX. 50
Figura 26.- Efecto de ACPA en presencia de AM281 sobre los potenciales miniatura.
51
Figura 27.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de AM281.
52
Figura 28.- Resumen del efecto de ACPA sobre los potenciales miniatura. 53
Figura 29.- Histogramas representativos de experimentos realizados en presencia de
canabinoides. 54
Figura 30.- Histograma representativo de un experimento realizado en un músculo
previamente incubado con PTX. 55
Figura 31.- Registro de potenciales miniatura en presencia de Nifedipina. 56
Figura 32.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para Nifedipina. 57
Figura 33.- Efecto de la ω-conotoxina-GVIA (5 μM) sobre la amplitud y la frecuencia
de los potenciales miniatura. 58
Figura 34.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ω-conotoxina-GVIA. 59
Figura 35.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ sobre los potenciales
miniatura. 59
Figura 36.- El bloqueo de los canales de Ca2+ tipo N con ω-conotoxina-GVIA evita el
efecto de ACPA sobre los potenciales miniatura. 60
Figura 37.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de ω-
conotoxina-GVIA. 61
3
RESUMEN
Los canabinoides, derivados de la marihuana, interactúan con receptores sensibles a
canabinoides (CB1 y/o CB2) presentes en la membrana de las células causando
efectos psicoactivos y motores cuando se consume esta planta. En el músculo
esquelético podría residir parte de los efectos motores de los canabinoides
reportados en estudios clásicos, como la reducción de la actividad locomotora. De
esta manera, con el fin de explorar el efecto de los canabinoides sobre la liberación
espontánea de transmisor y determinar si éste es mediado por CB1 y/o CB2, se
registraron potenciales miniatura de placa terminal (PMPT) en la placa
neuromuscular del músculo cutaneous pectoris de la rana en presencia de agonistas
(WIN 55212-2 y ACPA) y antagonistas (AM281 y AM630) de los receptores sensibles
a canabinoides. Con el propósito de investigar si estos efectos están mediados por
las proteínas Gi/o exploramos los PMPT en presencia de un bloqueador del acople-
activación de estas proteínas (toxina pertussis, PTX), junto con canabinoides. El
registro de los PMPT en presencia de WIN (0.1-50 μM) o de ACPA (0.01-50 μM)
muestra que estos agonistas disminuyen la frecuencia de aparición y la amplitud de
los PMPT dependiendo de la concentración, siendo estos efectos antagonizados por
el AM281 1 μM, lo que sugiere que sus efectos son mediados por CB1. Además, en
músculos incubados previamente con PTX, estos canabinoides no ejercen ningún
efecto, indicando así que el mecanismo involucra proteínas Gi/o. Estos resultados nos
indican que el efecto de los canabinoides en la unión neuromuscular de la rana es a
través de CB1. Además, el bloqueador de canales de Ca2+ tipo N ω-conotoxina GVIA,
disminuye la frecuencia de aparición de los PMPT, y cuando estos canales de Ca2+
son bloqueados previamente con ω-conotoxina GVIA, la presencia de ACPA en el
baño no ocasiona un efecto inhibitorio adicional sobre la frecuencia de los PMPT, sin
embargo, sí disminuye la amplitud de los PMPT, lo que sugiere un efecto
postsináptico. Estos resultados sugieren que los canabinoides activan a los
receptores CB1, y éstos, a través de proteínas Gi/o, inhiben a los canales de Ca2+ tipo
N, ocasionando así la disminución en la liberación de transmisor.
Palabras clave: Canabinoides, músculo esquelético, unión neuromuscular.
4
ABSTRACT
Cannabinoids, the active components of Cannabis sativa (marijuana), cause
psychoactive and motor effects when this plant is consumed. Effects are produced by
interaction of these compounds with membrane receptors named CB1 and CB2.
Although it is known that cannabinoids reduce motor activity at the central nervous
level in humans as in others mammals, few information exists about their effects on
skeletal muscle. Therefore, the aim of this study was to investigate the function of the
cannabinoid receptor in the neuromuscular junction of the frog (Rana pipiens). The
miniature end-plate potentials (MEPPs) were recorded using the intracellular
electrode recording technique in the cutaneous pectoris muscle in the presence of the
cannabinoid agonists WIN55,212-2 and ACPA, and the cannabinoid antagonists
AM281 and AM630. Adding WIN to the external medium decreased the frequency
and amplitude of the MEPPs; the WIN EC50 value was 5.8 ± 1.0 μM. Application of
ACPA, a selective agonist of CB1, also decreased the frequency of the MEPPs; the
ACPA EC50 value was 115.5 ± 6.5 nM. The CB2 antagonist AM630 did not inhibit the
effects of WIN, indicating that its action is not mediated through the CB2 receptor.
However, the CB1 antagonist AM281 inhibited the effects of WIN and ACPA,
suggesting that their actions are mediated through the CB1 receptor. Pretreatment
with the Pertussis toxin inhibited the effects of WIN and ACPA, suggesting that their
effects are mediated through Gi/o-protein activation. Aditionally, the N-type Ca2+-
channel blocker ω-conotoxin GVIA diminished the frequency of the MEPPs. Blocking
the N-type Ca2+-channels with ω-conotoxin GVIA before addition of ACPA in the bath
had no additional inhibitory effect on the MEPPs frequency; however the MEPPs
amplitude is diminished indicting a postsynaptic effect of ACPA. These results
suggest that cannabinoids activate CB1 cannabinoid receptors in the nerve ending,
and through the Gi/o proteins they inhibit the N-type Ca2+-channels and thus they
modulate transmitter release in the endplate of the frog neuromuscular junction.
Keywords: Cannabinoids, skeletal muscle, neuromuscular junction
5
INTRODUCCIÓN
Unión neuromuscular
La unión entre la terminal de una neurona motora y una fibra muscular se
llama unión neuromuscular, también conocida como placa terminal (Figura 1). Los
impulsos propagados a través de las motoneuronas que inervan las fibras
musculares esqueléticas causan que éstas respondan con una contracción. La
terminal presináptica contiene cientos de vesículas sinápticas, que almacenan al
neurotransmisor acetilcolina (ACh). Estas vesículas se agrupan en regiones
específicas de la terminal llamadas zonas activas. El espacio que separa la terminal
nerviosa (axónica) de la célula muscular (membrana postsináptica) se denomina
hendidura sináptica o espacio sináptico. Este espacio sináptico está compuesto de
una matriz fibrosa que contiene acetilcolinesterasa, una enzima que hidroliza a la
acetilcolina una vez que ésta es liberada al espacio sináptico (Byrne, 1992).
Figura 1.- Muestra la unión entre una terminal nerviosa motora y una fibra muscular (unión neuromuscular). Además, se observan la hendidura sináptica, las vesículas, las zonas activas y los receptores a acetilcolina en la membrana postsináptica (modificado de www.bioon.com/book/ biology).
6
La acetilcolina se libera de la terminal presináptica por exocitosis membranal
(en forma de paquetes) al espacio sináptico, donde cada paquete de transmisor
produce en la fibra muscular un potencial llamado potencial sináptico unitario o
potencial miniatura (Ver Figura 2). Fatt y Katz (1952), al hacer registros en la
membrana postsináptica de la unión neuromuscular de rana, encontraron que sin
estimulación de la terminal presináptica aparecían potenciales espontáneos de
aproximadamente 0.5 mV de amplitud, similares a los presentados en la Figura 2. En
condiciones normales un potencial de acción, al propagarse a la terminal sináptica,
causa que se liberen sincrónicamente varios paquetes que contienen acetilcolina,
generando así el potencial de placa.
Figura 2.- Ilustración de registros representativos de los Potenciales miniatura en la unión neuromuscular de la rana (Modificado de Matthews, 2000).
Participación del Calcio en la liberación de transmisor en la unión neuromuscular
Para que el transmisor (acetilcolina) sea liberado de la terminal presináptica se
requiere la entrada del ión calcio, el cual fluye al interior de la terminal a través de los
canales de calcio dependientes de voltaje situados en la zona activa de la terminal
7
nerviosa. Estos canales de Ca2+ se abren con la despolarización que ocurre con la
propagación del potencial de acción en la terminal axónica. En reposo, la
concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) es muy baja (~10 7 M), pero con la
despolarización, esta concentración se incrementa substancialmente (> 200 μM)
(Meir y cols., 1999). Además de la entrada de Ca2+, también puede haber liberación
de Ca2+ de los almacenes intracelulares (mitocondrias y retículo endoplásmico,
principalmente) afectando la [Ca2+]i (Meir y cols., 1999). El incremento en la [Ca2+]i
causa la unión de los iones calcio a sensores especiales de la [Ca2+]i. La
sinaptotagmina I es uno de los principales sensores de calcio en la terminal
presináptica (Bommert y cols., 1993; Debello, Betz y Augustine, 1993; Nishiki and
Augustine, 2004). Las sinaptotagminas son una gran familia de proteínas de
membrana con regiones citoplásmicas que contienen dominios de unión al Ca2+
llamados dominios C2 (Chapman y cols., 1996; Sugita, Hata y Südhof, 1996; Südhof,
2002). Estos dominios C2 operan en coordinación con fosfolípidos membranales
para conferir la capacidad de unión del Ca2+ a la sinaptotagmina (Brose y cols., 1992;
Sutton y cols., 1995; Fernández y cols., 2001). Aunque ambos dominios C2 son
capaces de unir Ca2+, el segundo dominio C2 (C2B) parece tener un papel más
importante como sensor de Ca2+ (Fernández-Chacón y cols., 2002; Mackler y cols.,
2002; Stevens y Sullivan, 2003). La unión del Ca2+ dispara cambios rápidos en las
propiedades bioquímicas de la sinaptotagmina, causando una rápida unión a varios
componentes moleculares involucrados en la fusión con la membrana, incluyendo
proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
receptor) y lípidos de membrana (Davis y cols., 1999; Bai y cols., 2004).
Mecanismo de liberación de transmisor y la generación del potencial de placa terminal
Con la despolarización y la entrada de Ca2+ a la terminal nerviosa, varias de
las vesículas que se encuentran en su interior se fusionan con la membrana de la
8
terminal nerviosa (Figura 3) y liberan su contenido hacia la hendidura sináptica,
frente a un área especializada de la membrana postsináptica que contiene un grupo
de canales-receptores transmembranales (receptores a acetilcolina nicotínicos). Los
receptores sensibles a acetilcolina se encuentran formados por 5 subunidades: 2 α, 1
β, 1 δ y 1 γ. Este receptor presenta dos sitios de unión a acetilcolina. Al unirse la
acetilcolina liberada por las vesículas, se abre el canal permitiendo la entrada de
iones Na+ y la salida de iones K+, y causando una despolarización de la membrana
conocida como potencial de placa terminal (Kandel, 2000). El potencial de placa
terminal representa la suma de todos los potenciales unitarios; generalmente es de
aproximadamente 50 mV de amplitud y cuando es mayor que el nivel umbral (-55
mV) de los canales de Na+ dependientes de voltaje, se genera el potencial de acción
y en consecuencia se produce la contracción muscular.
Figura 3.- Acople excitación-contracción: a) llegada del potencial de acción a la terminal axónica motora; b) apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje; las vesículas sinápticas se movilizan hacia la membrana presináptica y se fusionan con ella liberando su contenido; c) la acetilcolina se une al receptor a acetilcolina, lo que origina la apertura del poro y la entrada de Na+ y salida de K+; se genera el potencial de placa, y cuando es mayor que el umbral del potencial de acción, éste se genera conllevando a la contracción muscular. Finalmente, la acetilcolinesterasa hidroliza a la acetilcolina a colina y ácido acético (http://www.frontrangecommunitycollege.com/images/pages/Neuromuscular_Junction.jpg).
9
El potencial de placa terminal es un evento transitorio que persiste por
aproximadamente 10 ms (Byrne, 1992), restaurándose en un breve periodo (1-2 ms).
El potencial de membrana de la fibra muscular (aproximadamente -85 mV) se
reestablece por la salida de iones de K+; éste es el llamado periodo refractario.
Principales canales iónicos en las terminales nerviosas motoras
En las terminales nerviosas se han descrito diferentes canales iónicos. Los
canales iónicos son máquinas moleculares (proteínas) muy simples que existen en
dos principales estados: abierto y cerrado. Cuando los canales iónicos, de acuerdo a
su gradiente electroquímico, se abren y fluyen iones a través de ellos, ocurren tres
cambios principales: 1) hay cambios en la concentración de los iones relevantes
dentro de la terminal nerviosa y en el espacio extracelular; 2) hay un cambio en el
potencial de membrana, y 3) hay un cambio en la resistencia de la membrana (Meir y
cols., 1999). A continuación se describen los principales canales iónicos presentes
en las terminales nerviosas:
A) Los canales de Ca2+ Los iones de calcio tienen varias funciones en las neuronas, incluyendo el
disparo rítmico, el crecimiento neuronal, la expresión génica y la liberación de
transmisor (Clapham, 1995). Existe una gran diversidad de canales de Ca2+ en el
sistema nervioso y éstos se distinguen por sus distintas propiedades a la regulación
por voltaje, por su sensibilidad específica a los bloqueantes farmacológicos y por su
actividad fisiológica específica.
En cuanto a los canales de Ca2+ activados por voltaje (VGCC, por sus siglas
en inglés), fueron primeramente clasificados de acuerdo a sus propiedades
biofísicas, en canales activados por bajo y alto voltaje (LVA y HVA, respectivamente)
[Carbone y Lux, 1984]. Los VGCC son heteromultímeros compuestos por una
subunidad α1 y tres subunidades, α2-δ, β y γ (Figura 4).
10
Figura 4.- Representación esquemática de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Estos canales están formados por diferentes subunidades, una subunidad α1 y tres subunidades: a2-δ, β y γ (modificada de Stotz y cols., 2004).
En 1994 se adoptó una nueva nomenclatura en la cual las subunidades α1
fueron referidas como α1S, por ser la isoforma presente en el músculo esquelético y
α1A a α1E a las que se descubrieron posteriormente (Birnbaumer y cols., 1994). En
2000 se adoptó otra nomenclatura (Ertel y cols., 2000) basada en la nomenclatura de
los canales de potasio. Los canales de Calcio fueron llamados empleando su símbolo
químico (Ca), con el principal regulador fisiológico (voltaje) indicado como subíndice
(CaV). El identificador numérico corresponde a la subfamilia del gen de la subunidad
α1 (1-3) y al orden de descubrimiento de la subunidad α1 en cada subfamilia. De
acuerdo a esto, en la tabla 1 se resume la nomenclatura de los VGCC (Catterall y
cols., 2005).
Canal Tipo Subunidad α1 Localización Bloqueador
CaV1.1
CaV1.2
CaV1.3
CaV1.4
L
L
L
L
α1S
α1C
α1D
α1F
Músculo esquelético
Músculo cardiaco y liso, células
endocrinas, neuronas
Células endocrinas, neuronas
Retina, médula espinal
Dihidropiridinas,
Fenilalkilaminas y
Benzotiazepinas
CaV2.1
CaV2.2
CaV2.3
P/Q
N
R
α1A
α1B
α1E
Neuronas
Neuronas
Neuronas
ω-Agatoxina IVA
ω-Conotoxina GVIA
SNX-482
CaV3.1
CaV3.2
CaV3.3
T
T
T
α1G
α1H
α1I
Neuronas, músculo cardiaco
Neuronas, músculo cardiaco y liso
Neuronas, músculo liso
Tabla 1.- Clasificación de los canales de calcio activados por voltaje (modificado de Catterall y cols., 2005).
11
Los tipos de VGCC difieren entre especies biológicas y también en su
localización anatómica. En terminales nerviosas motoras, se han encontrado casi
todos los tipos de canales de Ca2+ (L, N, P/Q) en diferentes especies. En las
terminales nerviosas los canales de Ca2+, caracterizados a la fecha, son activados
por la invasión de un potencial de acción a la terminal nerviosa. En las terminales
nerviosas motoras de la rana se han encontrado los tipos L y N (Kerr y Yoshikami,
1984; Feng y Dai, 1990; Hattori y Maehashi, 1991; Robitaille, Adler y Charlton, 1993;
Robitaille, García, Kaczorowski y Charlton, 1993; Arenson y Hill, 1996).
Respecto al bloqueo de canales de Ca2+ existen toxinas naturales muy útiles
como bloqueadores de los diferentes tipos de canales de Ca2+ (Tabla 1). Los canales
tipo N pueden ser bloqueados por la ω-conotoxina-GVIA, una toxina del caracol
marino Conus geographus (McCleskey y cols., 1987). Los canales tipo P/Q son
inhibidos por la ω-agatoxina-IVA, una toxina de la araña Agelenopsis aperta (Protti y
Uchitel, 1993). Estas dos toxinas se unen irreversiblemente o son reversibles muy
lentamente (Olivera y cols., 1994) y bloquean la liberación de transmisor en la unión
neuromuscular de la rana y de mamífero, respectivamente, donde son los canales
tipo N y P los que permiten la entrada de Ca2+ para liberar al transmisor (Meir y cols.,
1999). Por otra parte, los canales de Ca2+ tipo L son bloqueados por las
dihidropiridinas como la Nifedipina (Lacinova, 2005; Triggle, 2006).
B) Los canales de K+ Una de las funciones de los canales de potasio es contribuir al mantenimiento
del potencial de membrana en reposo en la terminal nerviosa, y son los encargados
de la repolarización de la membrana durante los potenciales de acción. También
participan en la posthiperpolarización y modulan la velocidad de disparo. Como
resultado de esas acciones, los canales de potasio están involucrados en la
regulación de la liberación del transmisor (Meir y cols, 1999).
Los diferentes tipos de canales de K+ se distinguen por sus propiedades de
apertura, y los que se encuentran en terminales nerviosas principalmente son:
canales de potasio rectificadores tardíos, canales de potasio tipo A, canales de
12
potasio activados por calcio (KCa) y canales dependientes de ATP (KATP) (Meir y cols,
1999).
Los tipos de canales de K+ que han sido encontrados en las terminales
nerviosas motoras de rana son los canales de potasio rectificadores tardíos (Hevron,
David, Arnon y Yaari, 1986; Miralles y cols., 1994; Shakiryanova y cols., 1994) y los
canales de potasio activados por calcio (Anderson y cols., 1988; Katz y cols., 1995).
Los canales de potasio rectificadores tardíos pueden ser bloqueados por
tetraetilamonio (TEA) y por 4-aminopiridina (4-AP) aplicados externamente. Por su
parte, los canales de potasio activados por calcio pueden ser bloqueados por TEA
aplicado extracelular o intracelularmente (Blundon y cols., 1995) y por toxinas como
la caribdotoxina (Anderson y cols., 1988; Blundon y cols., 1995; Katz y cols., 1995).
Además, se cree que los canales de potasio tipo A están presentes en la
mayoría de las terminales nerviosas. Estos canales son activados por voltaje,
originando con ello una corriente llamada transitoria de salida, que se activa y
desactiva más rápido que en otros canales de K+. Estos canales contribuyen al
funcionamiento de las neuronas regulando la frecuencia de disparo, los periodos de
latencia y contribuyendo a la repolarización del potencial de acción (Elphick y
Egertová, 2001).
C) Los canales de Na+ La principal función de las terminales nerviosas presinápticas en la unión
neuromuscular es liberar el transmisor cuando llega una señal, la cual en la mayoría
de los casos es el potencial de acción. En prácticamente todas las terminales, el
potencial de acción es generado por canales de sodio dependientes del voltaje.
Además de la generación del potencial de acción, los canales de sodio también
tienen un papel en la determinación de la concentración de Na+ intracelular, la cual
afecta a su vez la [Ca2+]i debido a la existencia del intercambiador Na+/Ca2+ (Luther y
cols., 1992; Meir y cols., 1999).
Los canales de sodio han sido encontrados en las terminales nerviosas de
casi todas las preparaciones estudiadas. Fueron encontrados primeramente en la
sinapsis neuromuscular de la rana por Katz y Miledi (1967a). Entre las toxinas que
13
bloquean a los canales de sodio se encuentra la tetrodotoxina (TTX). El efecto
bloqueante de la TTX en las terminales nerviosas se conoce desde hace más de 30
años (Nishi y Sato, 1966; Katz y Miledi, 1967a).
D) Los canales de Cl- Los canales de Cl- están involucrados en: 1) la regulación del pH intracelular
(Brown y Dudley, 1996), 2) el volumen celular (Nilius y cols., 1996), 3) la excitabilidad
nerviosa y 4) contribuyen a la determinación del potencial de reposo (Albertson y
cols., 1996).
El ión cloro es el anión fisiológico extracelular más abundante. Los canales de
cloro contribuyen a mantener el potencial de reposo de las terminales nerviosas
dependiendo de su número relativo y conductancia; además se ha encontrado,
sobretodo en el sistema nervioso central, que estos canales de Cl- también están
involucrados en la inhibición presináptica (Dudel y Kuffler, 1961). El incremento en la
conductancia de estos canales conduce a una reducción en la amplitud del potencial
de acción y, de esta manera, a la liberación del transmisor (Graham y Redman,
1994). Un bloqueador de los canales de Cl- es el ácido 5-Nitro-2-(3-fenilpropilamino)
benzoico (NPPB) (Kirkup y cols., 1996).
Características de las fibras musculares esqueléticas
En cuanto a las fibras del músculo esquelético, existen dos tipos: las rápidas y
las lentas o tónicas (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953a, b; Stefani y Steinbach, 1969;
Huerta y Stefani, 1981). Las fibras musculares rápidas son las responsables de los
movimientos fásicos (rápidos) y las fibras musculares lentas o tónicas participan en el
mantenimiento de la postura y, junto con las fibras rápidas, son responsables de los
movimientos finos, como los que realizan por ejemplo los músculos extraoculares.
Por lo general, los músculos esqueléticos presentan ambos tipos de fibras, las cuales
se encuentran entremezcladas; sin embargo, las fibras rápidas pueden encontrarse
14
en músculos como el posterior latissimus dorsi de las aves, el extensor digitorum
longus, el sartorio y el cutaneous pectoris de los anfibios. En contraste, las fibras
musculares lentas se encuentran abundantemente en los músculos extraoculares de
los mamíferos y en fascículos tónicos de los músculos cruralis y piriformis de la rana.
La actividad conjunta de ambos tipos de fibras musculares rápidas y lentas coordina
el movimiento y determina la velocidad de contracción del músculo completo.
En la rana, las fibras musculares lentas constituyen un grupo de fibras
fácilmente distinguible de las fibras rápidas por ciertas características mecánicas,
bioquímicas, morfológicas y eléctricas. Las fibras rápidas, por lo general, poseen una
placa terminal única que recibe inervación de una sola motoneurona, cuyos axones
motores son gruesos y su estimulación genera potenciales de acción en la fibra
muscular. Estos potenciales son seguidos de una sacudida rápida; además, al ser
bañadas en solución con alto contenido de K+ generan una contractura transitoria que
relaja espontáneamente. En contraste, las fibras musculares lentas o tónicas cuentan
con una inervación múltiple establecida por axones motores delgados y, en
particular, estas fibras son incapaces de producir potenciales de acción y generar
sacudidas por carecer de canales de Na+ dependientes de voltaje. Otra característica
es que las fibras tónicas (lentas) mantienen la tensión durante despolarizaciones
prolongadas con soluciones de alto K+ (Stefani y Steinbach, 1969; Elizalde, Huerta y
Stefani, 1983; Lipská y cols., 1998). Así, los dos tipos de fibras musculares
esqueléticas difieren en las propiedades electrofisiológicas de su membrana y
también de los axones motores que las inervan.
Canabinoides y liberación de transmisor
Los canabinoides son derivados de la marihuana (Cannabis sativa), una de las
primeras drogas consumidas por los adolescentes en México y que es considerada
como la vía de acceso a otro tipo de drogas mayormente nocivas, como la cocaína y
las metanfetaminas (Medina-Mora y cols., 1998). Los canabinoides son los
causantes de los efectos psicoactivos y motores producidos por el consumo de esta
15
planta, siendo el principal componente activo el Δ-9-tetrahidrocanabinol (Gaoni y
Mechoulam, 1964) (Figura 5).
Figura 5.- Estructura química del principal componente activo de la marihuana, el Δ-9-tetrahidrocanabinol (Gaoni y Mechoulam, 1964).
Se ha descubierto que la acción de los canabinoides disminuye la liberación
de transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols., 2006; Liang y
cols., 2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004; Szabo y Schlicker,
2005). En este sentido, se han propuesto 3 mecanismos por los cuales los
canabinoides pueden influenciar la liberación de transmisor: mediante la activación
de canales de potasio tipo A, el bloqueo de canales de Ca2+ dependientes de voltaje
(Elphick y Egertová, 2001; Diana y cols., 2002), y por inhibición directa de la
maquinaria de liberación vesicular (Takahashi y Linden, 2000).
Receptores a Canabinoides
Los canabinoides ejercen sus efectos al interactuar con receptores presentes
en la membrana de las células (Begg y cols., 2001). A la fecha, se han identificado
dos tipos de receptores a canabinoides: los CB1 y los CB2 (Howlett y cols., 2002), de
las siglas en inglés cannabinoid brain, mientras que los números 1 y 2
corresponden al orden en que fueron descubiertos. Fueron llamados receptores
sensibles a canabinoides porque responden al unirse a canabinoides, como el Δ-9-
tetrahydrocannabinol y a sus análogos sintéticos biológicamente activos. Estos
receptores a canabinoides pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a
16
proteínas G, por lo que constan de 7 regiones transmembranales. La distinción entre
estos receptores está basada en sus diferencias en la secuencia de sus aminoácidos
(Figura 6), en los mecanismos de señalización, en su distribución en los tejidos y en
su sensibilidad a ciertos agonistas y antagonistas.
Figura 6.- Esquema de los receptores a canabinoides CB1 y CB2. Los círculos negros ejemplifican cada aminoácido que conforma al receptor CB1 mientras que los círculos blancos corresponden a cada uno de los aminoácidos que constituyen a CB2 (modificada de Watson y cols., 2000).
Los receptores CB1 han sido clonados del sistema nervioso central de rata
(Matsuda y cols., 1990), ratón (Chakrabarti y cols., 1995) y tejidos humanos (Gérard
y cols., 1990) y exhiben entre un 97-99% de homología entre las distintas especies.
Además, estos receptores se han encontrado en el sistema nervioso periférico y en
ciertos tejidos no neuronales, como en células del sistema inmune.
En el cerebro, los receptores CB1 están altamente localizados en el
hipocampo, cerebelo y sustancia nigra (Glass, Dragunow y Faull, 1997) y también
han sido localizados en nervios periféricos que inervan al intestino, vaso deferente y
vejiga (Pertwee y cols., 1996). También han sido descritos receptores CB1 en la
retina de diferentes animales, como el mono Rhesus, el ratón, la rata, el pollo, el pez
dorado (Straiker y cols., 1999) y en el anfibio (salamandra) (Soderstrom y cols.,
17
2000), así como en músculo liso (Filipeanu y cols., 1997) y en ciertas células del
sistema inmune (Parolaro, 1999).
Por su parte, los receptores CB2 han sido encontrados principalmente en
células del sistema inmune y en algunos tejidos como el hígado (Di Marzo y Deutsch,
1998a). Este tipo de receptores ha sido clonado y exhiben el 44% de similitud en la
secuencia de aminoácidos con los receptores CB1 (Figura 6) (Munro y cols., 1993;
Howlett y cols., 2002).
También se ha encontrado una variante del Receptor CB1, el CB1A (Rinaldi-
Carmona y cols., 1996; Shire y cols., 1995). El CB1A tiene 61 aminoácidos menos que
el CB1. Además, el ARNm de CB1A se ha encontrado en los mismos tejidos que CB1,
pero su nivel de expresión es menor al 20% de CB1. El Receptor CB1A exhibe todas
las propiedades del CB1, pero un poco atenuadas (Rinaldi-Carmona y cols., 1996).
Endocanabinoides
El hallazgo de los receptores a canabinoides y de la existencia de potentes y
selectivos canabimiméticos condujo a la rápida identificación de una familia de
transmisores lipídicos, que sirven como ligandos naturales para los receptores a
canabinoides y fueron llamados Endocanabinoides (De Petrocellis, Cascio y Di
Marzo, 2004). Se encontró que las propiedades farmacológicas de los
endocanabinoides son muy similares a las de los canabinoides sintéticos. Los
endocanabinoides más conocidos son la araquidoniletanolamida (anandamida,
derivado del ácido araquidónico) (Devane y cols., 1992) y el 2-araquidonil glicerol (2-
AG) (Mechoulam y cols., 1995; Sugiura y cols., 1995), dos compuestos que pueden
servir como neuromoduladores o neurotransmisores (Di Marzo y cols., 1998b;
Mechoulam y cols., 1996; Pertwee, 2001).
La Figura 7 muestra la estructura química de 5 endocanabinoides: la
anandamida, el 2-AG, la virodamina (Porter et al., 2002), el noladin éter (Hanus et al.,
2001) y el N-araquidonil-dopamina (Bisogno y cols., 2000). Todos estos
18
endocanabinoides han sido encontrados en el cerebro, en plasma y en tejidos
periféricos como nervio vago, tracto gastrointestinal, tejido adiposo e hígado (Matías
y cols., 2006).
Figura 7.- Estructuras químicas de cinco endocanabinoides identificados (Modificado de De Petrocellis, Cascio y Di Marzo, 2004).
La descripción subsecuente de una vía bioquímica compleja para la síntesis,
liberación (Di Marzo y cols., 1994; Cadas y cols., 1996), transporte (Beltramo y cols.,
1997) y degradación (Cravatt y cols., 1996) de los endocanabinoides completa la
cascada de un nuevo sistema de señalización llamado “sistema endocanabinoide”.
Desde el descubrimiento de la anandamida, se han explorado ampliamente los
aspectos principales del sistema endocanabinoide. Este sistema actúa como un
modulador de las funciones, no sólo del sistema nervioso central sino también del
sistema nervioso autónomo, del sistema endocrino, del sistema inmune, del tracto
gastrointestinal, del sistema reproductor y actúa también en la modulación de la
microcirculación (Di Marzo y cols., 1998b).
19
Ligandos que se unen a los Receptores a Canabinoides
Se han reportado cuatro clases de agonistas de los receptores sensibles a
canabinoides (Figura 8) (Pertwee, 1999). Estos son: 1) los canabinoides “clásicos”
(por ejemplo, el delta-9 tetrahidrocanabinol); 2) los canabinoides no clásicos (como el
CP55940); 3) los aminoalquilindoles (como el WIN 55212-2); y, 4) los eicosanoides
(como la anandamida y el ACPA). De éstos, el delta-9 tetrahidrocanabinol y el
CP55940 presentan poca diferencia en sus afinidades por los receptores CB1 y CB2;
en contraste, la anandamida presenta cierta selectividad por los receptores CB1;
mientras que el WIN 5521-2 presenta una modesta selectividad por los receptores
CB2. Por su parte, la metanandamida presenta una mayor selectividad y mayor
afinidad por los receptores CB1 (Pertwee, 2001). El ACPA es un agonista con mayor
afinidad y selectividad por los receptores CB1 (Hillard y cols., 1999).
Figura 8.- Estructuras químicas del delta-9 tetrahidrocanabinol y otros agonistas de receptores sensibles a canabinoides (Modificado de Howlett y cols., 2002).
Respecto a los antagonistas de los receptores sensibles a canabinoides
existen dos clases: 1) los diarilpirazoles (como el SR141716A) (Figura 9) y, 2) los
que pertenecen a otras series químicas, tales como los benzofuranos (como el
20
LY320135) y los aminoalquilindoles (como el AM630). El SR141716A es un potente y
selectivo antagonista de los receptores CB1 y 2 análogos de éste compuesto (el
AM251 y el AM281), también bloquean los efectos mediados por los receptores CB1.
El AM281 tiene 350 veces mayor afinidad por los receptores CB1 que por los CB2. De
la misma manera, el AM251 presenta mayor selectividad por los receptores CB1
(Howlett y cols., 2002). El AM630 es un potente antagonista de los receptores CB2
presentando 165 veces mayor afinidad que para el CB1 (Ross y cols., 1999).
Figura 9.- Estructuras químicas de algunos antagonistas de los receptores sensibles a canabinoides (Modificado de Howlett y cols., 2002).
Activación de los Receptores a Canabinoides
Los dos subtipos de receptores a canabinoides previamente mencionados
alteran la actividad celular a través de la activación de proteínas G del subtipo Gi/o
sensibles a la toxina pertussis (Figura 10) [Soderstrom y cols., 2000]; aunque en
algunos reportes se sugiere que también puede activar a la adenilil ciclasa a través
de proteínas Gs (Howlett, 1985; Bayewitch y cols., 1995; Calandra y cols., 1999;
Glass y Felder, 1997).
La activación del sistema de proteínas G (Gi/o) por los receptores CB1 y CB2
conduce a la disminución en la actividad de la enzima adenilil ciclasa, y esto a su vez
a reducir los niveles intracelulares de AMPc, lo que da por consecuencia una
21
disminución en la fosforilación de proteínas por la proteincinasa A, entre ellas las de
canales iónicos (Soderstrom y cols., 2000). También la activación de las proteínas G
por los receptores a canabinoides ha sido implicada en la modulación de la vía de
señalización de la proteincinasa activada por mitógeno (MAPkinasa) [Bouaboula y
cols., 1995; 1996]. Además, se ha mostrado que la activación de CB1 está acoplada
negativamente a través de Gi/o a canales de calcio tipo L, N y P/Q neuronales, y
positivamente acoplada a canales de potasio rectificadores entrantes (Mackie y Hille,
1992; Mackie y cols., 1995; Twitchel y cols., 1997; Guo e Ikeda, 2004).
Figura 10.- Representación esquemática de las vías de activación de CB1 y CB2 por canabinoides. Los detalles de la figura se describen en el texto. Los signos negativo y positivo indican inhibición y activación de la vía, respectivamente (Modificado de Henderson y cols., 1999).
22
ANTECEDENTES INMEDIATOS
Los canabinoides y la unión neuromuscular
Para caracterizar los mecanismos celulares que se producen una vez
activados los receptores sensibles a canabinoides, se han utilizado varios modelos
animales y más recientemente, ya clonados los receptores CB1 y CB2, las líneas
celulares establecidas (Vásquez y cols., 2003). Como se mencionó anteriormente, la
acción de los canabinoides ha sido implicada en la disminución de la liberación de
transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols., 2006; Liang y cols.,
2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004; Szabo y Schlicker, 2005), y
se ha propuesto que los mecanismos por el cuales los canabinoides influyen en la
liberación de transmisor son: la activación de canales de potasio tipo, por el bloqueo
de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (Elphick y Egertová, 2001; Diana y cols.,
2002), y por inhibición directa de la maquinaria de liberación vesicular (Takahashi y
Linden, 2000; Szabo y Schlicker, 2005). Por ejemplo en las preparaciones nervio-
músculo liso (vaso deferente de ratón e íleo de cobayo), las cuales responden a
agonistas de los receptores a canabinoides con una inhibición de la contracción. Se
cree que esta inhibición es el resultado de una disminución en la liberación de
transmisor (Pertwee, 1992; Ishac y cols., 1996).
En la unión neuromuscular (músculo sartorio) de la rana, Kumbaraci y Nastuk
(1980) reportaron que el delta-9 tetrahidrocanabinol (30 μM) disminuía la frecuencia
de aparición de los potenciales miniatura y que se modificaba el contenido cuántico
de las vesículas sinápticas, siendo esto un efecto a nivel presináptico. Sin embargo,
la amplitud de los potenciales miniatura se incrementó en presencia de este
canabinoide, sugiriendo un efecto a nivel postsináptico. Más tarde, Turkanis y Karler
(1986) reportaron en este tipo de unión neuromuscular que los canabinoides
causaban cambios en la liberación del neurotransmisor, encontrando que el delta-9
tetrahidrocanabinol 0.1 μM aumentaba la frecuencia de aparición de los potenciales
miniatura, mientras que el 11-hidroxitetrahidrocanabinol (0.1-1 μM) no causaba
23
cambios significativos. En contraste, el canabidiol (0.1-1 μM) causaba una
disminución de la frecuencia de aparición de estos potenciales. Además, la amplitud
de estos potenciales fue reducida en presencia de los tres canabinoides estudiados.
También reportaron que, inicialmente, el contenido cuántico que da origen al
potencial de placa aumentaba (a los 20 minutos de incubación) y después se reducía
(50 minutos de incubación) cuando se usaban el Δ-9 tetrahidrocanabinol y el 11-
hidroxitetrahidrocanabinol, mientras que con el canabidiol sólo había una reducción
del potencial de placa terminal. Estos autores coinciden con Kumbaraci y Nastuk
(1980) en atribuir el cambio en la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura
y en el contenido cuántico a un efecto presináptico de los canabinoides, mientras que
los cambios en la amplitud de estos potenciales se atribuyen a un efecto
postsináptico.
Por su parte, Van der Kloot (1994) encontró en el mismo tipo de unión
neuromuscular de rana, que utilizando el endocanabinoide anandamida (2 μM) se
inhibía el incremento del contenido cuántico producido por soluciones hipertónicas.
También encontró que la anandamida reducía la frecuencia de aparición de los
potenciales miniatura después de que fue aumentada por un agonista del AMPc (Sp-
cAMPS) permeante. Este autor fue el primero en sugerir la presencia de receptores a
canabinoides en la terminal nerviosa motora y postular que la acción de la
anandamida al unirse al receptor era bloquear a la enzima adenilil ciclasa. Sin
embargo, otros autores (Elphick y Egertová, 2001) consideran que no hay suficientes
evidencias de que los receptores a canabinoides sean expresados en las neuronas
motoras o células musculares que median el control voluntario del músculo
esquelético.
Por otro lado, se ha observado que algunos canabinoides sintéticos como el
WIN 55212-2, aplicado directamente al músculo, reduce la tensión producida por
potasio o cafeína en las fibras musculares lentas (Vásquez y cols., 2000) y en las
fibras rápidas de la rana (Velasco, 2002). En fibras lentas, el WIN 55212-2 redujo la
tensión hasta en un 20%, mientras que en las fibras rápidas se redujo alrededor del
10%. Estos efectos sugieren la presencia de receptores sensibles a canabinoides en
la membrana de las fibras musculares esqueléticas rápidas y lentas; sin embargo,
24
aún se desconocen muchas de las acciones directas e indirectas de los canabinoides
en el músculo esquelético.
25
JUSTIFICACIÓN
Hasta ahora, a pesar del considerable avance en el conocimiento de la acción
de los canabinoides, para el caso del músculo esquelético su mecanismo de acción
es poco comprendido, siendo un tejido en el cual podrían residir parte de los efectos
motores de los canabinoides reportados en estudios clásicos —como es la reducción
de la actividad locomotora; un efecto que también ha sido descrito en ratones
(movimiento reducido)— donde se ha expuesto a los individuos (primates, seres
humanos) en forma aguda a extractos de marihuana (Dewey, 1986; Hollister, 1986;
Sañudo-Peña y cols., 2000). Además, existen estudios en los cuales se ha visto que
los canabinoides sintéticos reducen el temblor y la espasticidad (Baker y cols., 2000;
Baker y cols., 2001) y mejoran la coordinación motora (Arévalo-Martín y cols., 2003)
en modelos animales de miastenia gravis.
Por otra parte, hasta ahora los resultados experimentales de los estudios del
efecto de los canabinoides en la unión neuromuscular son contradictorios y se
realizaron antes de que se tuviera conocimiento de los dos tipos de receptores
sensibles a canabinoides (CB1 y CB2) y de que se sintetizaran agonistas y
antagonistas específicos para cada uno de los dos tipos de receptores a
canabinoides. Por lo tanto, resulta interesante caracterizar la acción de algunos
agonistas de los receptores a canabinoides sobre la liberación del neurotransmisor
en la unión neuromuscular, empleando el músculo cutaneous pectoris (rápidas), y
usando como modelo animal la rana y además, determinar la presencia del receptor
en las fibras musculares esqueléticas, tanto lentas como rápidas. Sin duda, esto
constituye un estudio interesante para comprender mejor las acciones asociadas al
efecto motor producido por los canabinoides. Por otro lado, mediante el uso de
antagonistas selectivos para cada tipo de receptor sensible a canabinoides se
posibilita determinar su presencia en un estado tónicamente activo, de manera
similar a como ha sido descrito en otros tejidos. En este sentido, el uso de
antagonistas como el AM281 (CB1) y el AM630 (CB2) contribuiría a complementar la
26
descripción de la acción de los agonistas de receptores sensibles a canabinoides en
el músculo esquelético.
27
HIPÓTESIS
Los canabinoides modifican la liberación de transmisor en la unión
neuromuscular de la rana, a través de los receptores sensibles a canabinoides
asociados a proteínas G.
28
OBJETIVOS
Objetivo General
Caracterizar los efectos de los canabinoides sobre la transmisión sináptica en
la unión neuromuscular y determinar la presencia de receptores sensibles a
canabinoides en las fibras musculares esqueléticas de anfibio.
Objetivos específicos
1.- Identificar la presencia de ARNm que codifica para el receptor a canabinoides
(CB1) en fibras musculares rápidas y lentas de la Rana. 2.- Investigar el efecto de los agonistas de los receptores a canabinoides WIN55212-
2 (CB1 y CB2) y ACPA (CB1), sobre la frecuencia de aparición y la amplitud de los
potenciales miniatura, en la preparación neuromuscular del músculo cutaneous
pectoris de la rana.
3.- Conocer si el efecto de los agonistas de los receptores a canabinoides es inhibido
por antagonistas selectivos, tanto para el receptor CB1 (AM281) como para el
receptor CB2 (AM630).
4.- Estudiar si el efecto de los canabinoides es a través de proteínas Gi/o, estudiando
los canabinoides en músculos previamente tratados con la toxina pertussis, que se
conoce bloquea estas proteínas.
5.- Estudiar el efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ sobre la frecuencia de
aparición y la amplitud de los potenciales miniatura en la unión neuromuscular de la
rana, en conjunto con los canabinoides, para dilucidar si el mecanismo de acción de
los canabinoides ocurre a través del bloqueo de los canales de Ca2+ de la terminal
presináptica.
29
METODOLOGÍA
Para determinar la presencia del receptor a canabinoides CB1 en fibras
musculares esqueléticas, se utilizaron en los experimentos células cultivadas
HEK293 y ranas adultas de la especie Rana pipiens. Las ranas fueron utilizadas de
acuerdo a las normas para el manejo de animales del Institute for Laboratory Animal
Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De las ranas
una vez sacrificadas, se disecaron los músculos cruralis (fibras lentas) y el extensor
digitorum longus (fibras rápidas). Para explorar el efecto de los canabinoides sobre la
liberación de transmisor (potenciales miniatura) se utilizó la unión neuromuscular del
músculo cutaneous pectoris.
A) Disección: Las ranas fueron sacrificados por decapitación, disecando los
músculos de interés de acuerdo a Huerta y Stefani (1986). Los músculos (cutaneous
pectoris) fueron colocados en una caja de Petri con fondo de resina transparente
(Sylgard) e inmersos en solución Ringer normal (ver soluciones más adelante). Los
músculos fueron fijados con alfileres entomológicos al fondo de la caja de Petri y bajo
microscopio estereoscópico se obtuvieron las preparaciones libres de fascia y tejido
conectivo mediante disección fina.
B) Detección de ARNm para el receptor CB1: En los métodos de extracción de
ARN que se utilizaron, las soluciones y los materiales estaban totalmente libres de
ARNasas. Por ello, se trataron todos los recipientes con NaOH 0.2 M por un tiempo
mínimo de 15 minutos, y posteriormente fueron lavados con agua milliQ libre de
ARNasas. Se utilizaron guantes durante todo el proceso de la extracción.
30
1.- Extracción de ARN: Para la extracción de ARN los músculos fueron congelados
con nitrógeno líquido, pulverizados en un mortero con pistilo y colocados en 1 ml de
Trizol (Tiocianato de Guanidinio y Fenol, Invitrogen Life Technologies, USA)
[Chomczynski y Sacchi, 1987]. Posteriormente se agregaron 0.2 ml de cloroformo, se
agitó en vórtex por 30 segundos a máxima velocidad, se incubó a temperatura
ambiente por 3 minutos y se centrifugó a 10,000g/15 min/4oC (12,000 rpm). La fase
acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se agregaron 0.5 ml de isopropanol. Se
agitó por inversión e incubó a temperatura ambiente por 10 minutos. Después de
centrifugar a 13,000g/10 min/4oC (16,000 rpm) se eliminó el sobrenadante por
decantación y se lavó con 0.5 ml de etanol al 75%. Finalmente, se eliminó el etanol
con un sistema de vacío, el ARN total se resuspendió en 50 μl de agua tratada con
dietilpirocarbonato (H2O-DEP), y se cuantificó en un Biofotómetro eppendorf (Ausubel
y cols., 2003).
2.- RT- PCR: La presencia de ARNm que codifica para el receptor CB1 fue
determinada por RT-PCR convencional y Tiempo Real empleando el kit
SuperScript™ One-Step RT-PCR (Invitrogen Life Technologies, USA). Primeramente
se diseñaron primers en nuestro laboratorio tomando las secuencias de Entrez
Nucleotide del National Center of Biotechnology information (NCBI) con clave de
acceso AY098532. Posteriormente los primers fueron construidos por GibcoBRL/Life
Technologies. Los primers diseñados para reconocer la secuencia de CB1 son los
siguientes:
Primer sentido: 5’-GCAGTGTAATTTTTGTCTACAG-3’
831-850
Primer antisentido: 5’-GAGGGCCCCAACAAATGATT-3’
1390-1409
31
Para realizar la RT-PCR, cada una de las muestras de ARN total fue colocada
en un cóctel que contenía lo siguiente:
Componentes Volumen/50 μl Concentración final
Reaction Mix 2X 25 μl 1X
RNA total 2 μl 1 μg
Primer sentido 1 μl 0.2 μM
Primer antisentido 1 μl 0.2 μM
RT/Platinum® Taq mix 1 μl ---------
MgSO4 5 mM 1 μl ---------
Agua destilada autoclave a 50 μl ---------
Luego, el contenido de este cóctel se mezcló asegurándose que todos los
componentes se encontraban al fondo del tubo. Para realizar la RT-PCR
Convencional se empleó un Termociclador (Bio-Rad mod. iCycler) y para la RT-PCR
Tiempo Real un Termociclador (Rotor-Gene™ 3000). El termociclador se programó
para que la síntesis de cDNA fuera seguida inmediatamente por la amplificación con
PCR de manera automática. Para sintetizar y predesnaturalizar el cDNA. Se ejecutó
un ciclo durante 30 minutos a 50 oC seguido de un ciclo por 2 minutos a 94 oC.
Luego, se aplicaron 40 ciclos para la amplificación del cDNA. Cada ciclo consistió en
lo siguiente: 15 s a 94 oC, 30 s a 50 oC y 1 min a 72 oC, con un ciclo de extensión
final de 8 minutos a 72 oC. Con el producto de la amplificación se realizó
electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El cDNA amplificado se mezcló con el buffer
de carga (Ficoll 20 %, EDTA 500 mM pH 8.0, Azul de Bromofenol 0.05 % y Azul de
Xilencianol 0.1 %) y se corrieron los geles durante 2 horas a 110 V en una cámara
horizontal, empleándose como buffer de corrimiento TBE 1X (Tris base 50 mM,
H3BO3 50 mM, EDTA 2.5 mM, pH 8.3). El tamaño esperado para el ARNm de CB1
fue de 579 pb y se comparó con el de β-actina de 1053 pb. Los geles fueron teñidos
con Bromuro de Etidio (10 mg/ml) y las imágenes fueron adquiridas con un
transiluminador UV con el programa Gel doc (Bio-Rad, USA) y analizadas utilizando
32
el software Quantity One versión 9.2.1 (Bio-Rad, USA). En la RT-PCR Tiempo real se
utilizaron muestras de ARNm de concentración conocida para calcular la
concentración de ARNm de CB1 de cada una de las muestras. Mediante el software
Rotor Gene 5 se realizó el análisis para obtener la concentración de dichas muestras.
3.- Transfección de Células HEK293 con CB1: En la determinación del ARNm para
CB1 se emplearon como control negativo células HEK293 y como control positivo las
mismas células, pero transfectadas con CB1 (Donado por la Dra. Deborah Lewis,
Medical College of Georgia, Augusta, GA, USA). Antes de transfectar las células
HEK293 amplificamos el plásmido con el fin de tener la cantidad suficiente para la
transfección. Para esto se empleó el Kit Invitrogen S.N.A.P.™ MidiPrep. Para la
transfección, las células fueron cultivadas en cajas de Petri con medio de cultivo
completo de Dubbelco (DMEM, GibcoBRL) adicionado con 10% de suero bovino fetal
(GibcoBRL) y mantenidas a 37oC en una atmósfera de 95% O2 y 5% CO2. Las
células fueron transfectadas (vía precipitación con CaCl2) con CB1 humano insertado
en el vector de expresión de mamífero PCI (Promega, Madison, Wis, USA) y
expresado bajo el control de un promotor citomegalovirus (CMV). Primero, se
precipitó el DNA con acetato de sodio y etanol permitiendo secarse perfectamente.
La pastilla de DNA se resuspendió en un ml de HBS estéril con vórtex. Se
adicionaron 62 ml de CaCl2 2 M y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente, sin
mover. A las células HEK293 en monocapa se les retiró el medio de cultivo y se
adicionó la mezcla de transfección gota a gota. Se dejó incubar 30 minutos a
temperatura ambiente y se agregaron 5 ml de medio completo. Nuevamente se
incubó durante 4 horas a 37 oC y finalmente se les cambió el medio de cultivo e
incubaron a 37 oC durante 3-4 días para verificar la transfección mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1 %.
33
C) Efecto de los Canabinoides sobre la transmisión sináptica
1.- Registro del potencial miniatura de placa terminal: Se utilizó un amplificador
corriente-voltaje (Axoclamp 2B, Axon Instruments, Foster City, CA, USA) y, a través
de un microelectrodo de vidrio (A-M Systems, Inc., Sequim, WA, USA) lleno de KCl
3M e insertado en la región de la placa terminal del músculo cutaneous pectoris de la
rana, se registraron los potenciales generados espontáneamente por la liberación
cuántica del transmisor antes y después de la aplicación de las drogas de prueba. El
recambio de las soluciones se realizó a través de una llave de tres vías y las
soluciones fueron retiradas de la cámara a través de un sistema de succión. Las
señales se digitalizaron a través de una interfase analógico-digital (Digidata 1322A,
Axon Instruments). Los registros eran visualizados y almacenados en una
computadora (HP, Pentium III) para su posterior análisis. Para adquirir los registros
se empleó la subrutina Clampex y para el análisis la subrutina Clampfit del programa
pClamp (versión 9.2 de Axon Instruments).
2.- Acción de los canabinoides: Se probó la acción de los canabinoides ACPA y
WIN 55212-2 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA) con concentraciones variables
para construir una curva dosis-respuesta, explorando rangos desde 0.01 a 50 μM y
se exploró también el efecto de los antagonistas AM281 y AM630 (Tocris Bioscience)
a una concentración de 1 μM. En todos los experimentos en que se empleó el ACPA,
una vez que lo adicionamos a la preparación, continuamos el experimento en
oscuridad debido a que este canabinoide es fotosensible.
3.- Efecto de la Toxina pertussis: Los músculos fueron incubados en solución
Ringer normal que contenía toxina pertussis (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 2 μg/ml
durante 22 a 24 horas a 4 oC (Sigiura y Ko, 1997). A esta temperatura las fibras
musculares se conservan en mejor estado que a temperatura ambiente. Después de
la incubación, se realizaron experimentos en presencia de los canabinoides.
34
4.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+: Se utilizó la ω-conotoxina-GVIA
(Sigma) preparada en solución acuosa 0.5 mg/ml, a una concentración de 5 μM para
bloquear los canales de Ca2+ tipo N y la Nifedipina (Sigma) 10 μM para bloquear los
canales de Ca2+ tipo L. Para el caso de la Nifedipina, su manipulación y aplicación a
la preparación fueron realizadas en oscuridad, ya que esta droga también es
fotosensible, realizando el resto del experimento en las mismas condiciones. 5.- Soluciones: En los experimentos se utilizaron las siguientes soluciones:
La solución Ringer normal tenía la siguiente composición (en mM): NaCl,
117.5; KCl, 2.5; CaCl2, 1.8. El pH fue ajustado a 7.4 con Imidazol-Cl (2mM).
A la solución anterior se le agregó el volumen necesario de los agonistas a
canabinoides ACPA y WIN 55212-2, así como de los antagonistas AM281 y AM630,
para obtener las concentraciones requeridas de cada uno de ellos. Estas drogas
fueron preparadas previamente como soluciones madre 10 mM, diluidas en
dimetilsulfóxido (DMSO) o etanol, siendo la concentración de estos diluyentes
<0.01% (Velasco y cols., 2003). Las soluciones fueron almacenadas a –20°C hasta
su uso. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (22-24°C).
En cuanto a los bloqueadores de canales de Ca2+, se preparó una solución
stock de Nifedipina a una concentración de 100 mM en etanol. La ω-conotoxina-GVIA
fue preparada a una concentración de 0.5 mg/ml. Estas drogas fueron adicionadas a
la solución Ringer normal para obtener las concentraciones requeridas de cada una
de ellas.
La toxina pertussis fue preparada en albúmina de suero bovino (Sigma) 5
mg/ml, a una concentración de 50 μg/ml y se adicionó a la solución Ringer normal
para obtener la concentración requerida para los experimentos (2 μg/ml).
6.- Medición y Análisis: En los registros de potencial miniatura se midió la amplitud,
así como la frecuencia de aparición de estos potenciales antes y después de la
aplicación de las drogas, utilizando la subrutina Clampfit de pClamp 9.2 (Axon
35
Instruments). Se elaboraron las gráficas del efecto de cada uno de los fármacos
probados con respecto al tiempo utilizando el programa Sigmaplot 9.0. Para realizar
la curva dosis-respuesta se utilizó el programa Origin 6.0 y los datos se ajustaron a la
ecuación de Hill:
I=Imax/(1+(EC50/x)h)
Donde I es el porcentaje de inhibición, Imax es el valor máximo de inhibición, EC50 es
la concentración efectiva media, x es la concentración de la droga y h representa el
coeficiente de Hill. En el caso de la frecuencia de aparición de los potenciales
miniatura, se probó la significancia de los promedios mediante la prueba t de student,
considerando como significativos aquellos valores de p < 0.05 en los efectos antes y
después de la aplicación de cada uno de los canabinoides. En el caso de la amplitud
se elaboraron histogramas de amplitud acumulativa para determinar la distribución
de los potenciales miniatura empleando la subrutina Clampfit 9.2 y se realizó el
análisis estadístico de estos datos empleando la prueba de Kolmogorov-Smirnov,
considerando una p < 0.05 (Liang y cols., 2004; Szabo y cols., 2004).
36
RESULTADOS
Detección de ARNm para CB1 por RT-PCR convencional y RT-PCR Tiempo Real
Mediante la técnica RT-PCR convencional determinamos la presencia de
ARNm para el receptor CB1 en las fibras musculares esqueléticas rápidas y en las
fibras musculares lentas de rana. De igual manera, luego de haber transfectado
células HEK293 con ADNc de CB1, éstas expresan el ARNm para dicho receptor. En
la Figura 11 se muestra la imagen de un gel de agarosa representativo de un
experimento, en el cual se corrieron los productos de la RT-PCR. En la línea 1, se
observa el marcador de pares de bases empleado (λ DNA/Hind III); en las líneas 2 y
3, células HEK293 sin transfectar y transfectadas, respectivamente; y en las líneas 4
y 5, los músculos rápido (EDL) y fascículo lento (cruralis). Para comprobar el buen
estado de nuestras muestras, el cóctel para la RT-PCR contenía los primers para β-
actina. En el gel podemos observar que en todas las muestras se encuentra la banda
correspondiente a la β-actina. Además, en las células HEK293 sin transfectar (línea
2) no se observa la banda que correspondería a CB1. Se puede apreciar también que
la intensidad de la banda de CB1, correspondiente a las células HEK293
transfectadas, es muy parecida a la banda que corresponde a las fibras musculares
rápidas. El tamaño esperado para el ADN del receptor CB1 fue de 579 pb y el de β-
actina 1053 pb.
Figura 11.- Gel representativo en el que se corrieron muestras de ADN de β-actina (control) y de CB1 en: 1) λ DNA/Hind III, 2) células HEK293, 3) HEK293 transfectadas con CB1, 4) los músculos EDL y 5) cruralis de rana.
23130941665574361
23222027
564
β-Actina
CB1
37
En la Figura 12 se muestra la gráfica obtenida de la relación de ARNm de
CB1/ARNm de actina para cada una de las muestras, obtenida ésta del análisis de
los geles de agarosa al 1%. En las células HEK293 no transfectadas, la relación dio
un valor de 0.11 ± 0.04, mientras que en las células transfectadas con el CB1
humano esta relación fue mayor: 0.96 ± 0.01. En las muestras de rana, en las fibras
rápidas (EDL) y lentas (cruralis) observamos una relación 2:1 aproximadamente, 0.99
± 0.03 y 0.51 ± 0.10, respectivamente (n = 6).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Expr
esió
n AR
Nm
CB
1/E
xpre
sión
AR
Nm
act
ina
HEK293 HEK293 Transf
EDL Cruralis
Figura 12.- Promedios de la expresión de ARNm para CB1 en células HEK293, HEK293 transfectadas con CB1, de los músculos EDL y cruralis de rana.
Se realizó un experimento empleando la técnica de RT-PCR Tiempo Real. En
la gráfica de la Figura 13 se muestran los resultados del experimento con el equipo
de RT-PCR Tiempo Real. La línea superior corresponde a la muestra de músculo
rápido de rana, y se observa que alrededor del ciclo 25 comienza a aparecer la
fluorescencia que nos indica el inicio del proceso de multiplicación del ADN. La línea
inferior corresponde a la muestra del músculo lento de rana. Para esta muestra, la
fluorescencia aparece alrededor del ciclo 27. De esta manera, el hecho de que
aparezca fluorescencia primero en la muestra del músculo rápido, nos indica que hay
una mayor concentración de ARNm de CB1 que en el músculo lento. Los valores
38
obtenidos de concentración de ARNm fueron de 5.07 μg/μl para el músculo rápido y
2.60 μg/μl para el músculo lento o tónico de la rana. Estos valores nos indican una
relación aproximada de 2:1, lo que concuerda con los resultados semicuantitativos
obtenidos por RT-PCR convencional.
Figura 13.- Expresión de ARNm para CB1 RT-PCR Tiempo Real. El trazo superior corresponde a la expresión de ADNc del receptor CB1 en el músculo EDL. El trazo inferior corresponde a la expresión de ADNc del receptor CB1 en el músculo cruralis. La expresión de ADNc en el EDL fue aproximadamente el doble que en el cruralis.
Fluorescencia
Ciclo
39
Efecto de canabinoides sintéticos sobre la liberación de transmisor en la unión
neuromuscular de rana
Curva dosis efecto obtenida con WIN 55,212-2
Al estudiar el efecto de WIN 55,212-2 sobre la frecuencia de aparición y
amplitud de los potenciales miniatura registrados en la unión neuromuscular del
músculo rápido cutaneous pectoris, observamos una disminución en ambos
parámetros, siendo este efecto dependiente de la concentración. El rango de
concentración explorada fue entre 0.1 y 50 μM. El efecto de este canabinoide
comenzó a una concentración de 1 μM, llegando a un efecto máximo con 50 μM. Al
realizar la curva dosis-efecto encontramos un valor de EC50 (Concentración efectiva
media) de 5.8 ± 1.0 μM, de acuerdo a la ecuación de Hill (Figura 14). El Imax
obtenido con esta ecuación fue de 52.68 ± 3.26 μM y la constante de Hill 0.96 ± 0.11.
Se utilizó una sola dosis en cada experimento. El número de experimentos fue entre
4 y 6 para cada una de las dosis exploradas.
Figura 14.- Curva dosis-efecto del canabinoide sintético WIN55,212-2. La EC50 calculada con la ecuación de Hill fue de 5.8 ± 1.0 µM. La Imax fue de 52.68 ± 3.26 µM y la constante de Hill 0.96 ± 0.11.
0,01 0,1 1 10 100
0
10
20
30
40
50
Inhi
bici
ón d
e la
Fre
cuen
cia
(%)
Concentración de WIN55,212-2 (μM)
I = Imax/(1+(EC50/x)h)
40
Efecto del WIN 55,212-2
Para ver el efecto de WIN 55,212-2 se realizó el registro de potenciales
miniatura cada 5 minutos. Primeramente se registraron estos potenciales durante 15
minutos en solución Ringer normal; posteriormente se agregó WIN a concentraciones
de 0.1-50 μM y se continuó registrando cada 5 minutos durante media hora. Se utilizó
una sola dosis en cada experimento. En la Figura 15 (A y B) se muestran las gráficas
de los datos obtenidos al registrar los potenciales miniatura en ausencia y presencia
de WIN 10 μM.
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120WIN 10 μM
* ***
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 μM
* ***
*
C
Figura 15.- Efecto de WIN (10 μM) sobre los potenciales miniatura. A y B) Gráficas de amplitud y frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de los experimentos realizados en presencia de WIN.
41
Con esta concentración de WIN, la amplitud disminuyó hasta un valor de
89.4% ± 2.9%, mientras que la frecuencia disminuyó hasta un valor de 74.7% ± 3.2%
con respecto al control. La disminución en la amplitud fue significativa después de 15
minutos (P = 0.021), mientras que la disminución de la frecuencia es significativa a
los 10 minutos (P = 0.001; n = 4). En C, se muestran trazos representativos de estos
experimentos.
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de PTX
Para determinar si el efecto de WIN era a través de la activación de proteínas
G se incubó el músculo cutaneous pectoris con la toxina pertussis (2 μg/ml) durante
22-24 horas a 4 oC. Después de esto se realizaron los experimentos en presencia de
WIN (10 μM) de la misma manera en que se realizaron los anteriores experimentos,
resultando que el WIN no tuvo ningún efecto significativo sobre la frecuencia de
aparición ni en la amplitud de los potenciales miniatura (P > 0.05; n = 4). Los valores
de amplitud y frecuencia encontrados a los 30 minutos de registrar datos en
presencia de WIN fueron de 101.3% ± 6.3% y 101.2% ± 5.6%, respectivamente
(Figura 16). Esto nos sugiere que el efecto de WIN es mediado por proteínas Gi/o,
puesto que su efecto fue bloqueado al inactivar dichas proteínas.
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120WIN 10 μM
PTX 2 μg/ml
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120WIN 10 μM
PTX 2 μg/ml
Figura 16.- Efecto de WIN (10 μM) después de incubar el músculo con Toxina pertussis (2 μg/ml) durante 22-24 horas a 4 oC.
42
En la siguiente Figura se muestran registros obtenidos durante un experimento
realizado en un músculo tratado previamente con toxina pertussis (2 μg/ml).
Podemos observar que tanto la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura
como su amplitud se mantienen a valores similares 30 minutos después de la adición
de WIN (10 µM).
Figura 17.- La presencia de WIN en un músculo tratado con Toxina pertussis no provoca cambios significativos sobre la frecuencia de aparición ni en la amplitud de los PMPT.
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM630
Para determinar si el efecto de WIN era mediado por los receptores CB2, se
empleó el AM630 (1 μM), un antagonista específico de estos receptores. Después de
incubar con AM630 durante 5 minutos previos a la adición de WIN, no se produjo
ningún cambio significativo en el efecto de WIN. En presencia de este antagonista, el
WIN continúa ejerciendo su efecto sobre la amplitud y la frecuencia de los
potenciales miniatura (Figura 18). Los valores de amplitud a los 30 minutos son de
90.8% ± 3.4% (P = 0.028) y de la frecuencia 75.5% ± 5.1% (P = 0.023), con respecto
al control (n = 5). Esto nos sugiere que el efecto de WIN no es mediado por los
receptores CB2. Adicionalmente, se realizaron experimentos en presencia
únicamente de AM630 a una concentración de 1 μM para determinar su efecto sobre
los potenciales miniatura, y no se observó ningún cambio significativo (datos no
mostrados; P > 0.05; n = 4).
43
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
* ***
WIN 10 μMAM630 1 μM
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
* ****
WIN 10 μMAM630 1 μM
C
Figura 18.- Efecto de WIN (10 μM) en presencia de AM630 (1 μM) sobre los potenciales miniatura. A y B) gráficas de amplitud y frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de estos experimentos. El antagonista de los receptores CB2 no evita el efecto de WIN.
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM281
Para determinar si el efecto de WIN es mediado por los receptores CB1, se
empleó el antagonista específico de estos receptores, el AM281, a una concentración
de 1 μM. Debido a que el AM281 actúa como agonista inverso en algunas
preparaciones; es decir, causa un efecto por sí mismo contrario al de los agonistas,
primeramente se realizaron experimentos sólo con AM281 (1 μM) y no observamos
44
ningún cambio significativo sobre los parámetros estudiados (datos no mostrados; P
> 0.05; n = 4). Después de comprobar que el AM281 a esta concentración no ejerce
ningún efecto sobre los potenciales miniatura, registramos los potenciales miniatura
en condiciones control y después incubamos el músculo durante 5 minutos con 1 μM
de AM281 y adicionamos WIN (10 μM) (Figura 19). En estos experimentos no se
observa una disminución significativa en la amplitud ni en la frecuencia de los
potenciales miniatura, 98.1% ± 5.0% y 96.7% ± 2.8%, respectivamente (P > 0.05; n =
4), lo que nos indica que el efecto de WIN es mediado por los receptores CB1.
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 μMAM281 1 μM
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 μMAM281 1 μM
C
Figura 19.- Efecto de WIN (10 μM) en presencia de AM281 (1 μM) sobre los potenciales miniatura. A y B) Gráficas de amplitud y frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de esta serie de experimentos. El antagonista de los receptores CB1 evita el efecto de WIN anteriormente observado.
45
En la Figura 20 se resumen los resultados obtenidos en los experimentos en
que se exploró el efecto de WIN 55,212-2 (10 µM). Podemos observar que la
presencia de WIN (10 µM) causa una reducción significativa, tanto de la amplitud
como de la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. Estos efectos de
WIN fueron bloqueados tanto por el tratamiento con PTX como por la presencia del
antagonista de los receptores CB1 (AM281). Mientras que en presencia del
antagonista de CB2 (AM630), el WIN causa un efecto similar que en ausencia del
antagonista.
Ampl
itud
de P
MPT
(%)
0
20
40
60
80
100
120
Contro
l
WIN
10 μM
WIN
10 μM +
PTX 2 μg/m
l
WIN
10 μM +
AM630 1μΜ
WIN 10
μM +
AM281 μΜ
* *
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
Contro
l
WIN
10 μM
WIN 10
μM +
PTX 2 μg/m
l
WIN
10 μM
+
AM630 1μΜ
WIN
10 μM +
AM281 μΜ
* *
Figura 20.- Resumen del efecto de WIN sobre los potenciales miniatura. Se observa el efecto de WIN tanto en la amplitud como en la frecuencia de los potenciales miniatura. Este efecto fue bloqueado por el tratamiento con la PTX o la presencia del antagonista de CB1 AM281. La presencia del antagonista de CB2 no bloquea el efecto del WIN.
46
Curva dosis efecto obtenida con ACPA
Cuando estudiamos el efecto de un agonista específico de los receptores a
canabinoides CB1 (el ACPA) observamos una disminución de la amplitud y la
frecuencia de los potenciales miniatura dependiente de la concentración. El efecto de
ACPA comenzó a una concentración de 20 nM y llegó a un máximo efecto con una
concentración de 10 μM. En la Figura 21 se muestra la curva dosis-efecto con la cual
encontramos un valor de EC50 de 115.5 ± 6.5 nM, de acuerdo a la ecuación de Hill. El
Imax obtenido con esta ecuación fue de 67.94 ± 0.78 μM y la constante de Hill 1.40 ±
0.10. En cada experimento se empleó solamente una concentración de ACPA. El
número de experimentos fue entre 4 y 6 para cada una de las dosis exploradas.
Figura 21.- Curva dosis-efecto con el agonista selectivo de CB1 ACPA. La EC50 calculada con la ecuación de Hill es de 115.5 ± 6.5 nM. La Imax fue de 67.94 ± 0.78 µM y la constante de Hill 1.40 ± 0.10.
Efecto del ACPA
Para determinar el efecto de ACPA se realizó el mismo procedimiento que
cuando se empleó el WIN, registrando los potenciales miniatura cada 5 minutos.
1E-3 0,01 0,1 1 10 100
0
10
20
30
40
50
60
70
Concentración de ACPA (μM)
Inhi
bici
ón d
e la
Fre
cuen
cia
(%)
I = Imax/(1+(EC50/x)h)
47
Después de registrar los potenciales miniatura durante 15 minutos en solución Ringer
normal, se agregó ACPA a concentraciones desde 0.01 hasta 50 μM y se continuó
registrando cada 5 minutos durante media hora. En cada experimento se empleó
solamente una concentración de ACPA. En la Figura 22 se muestran las gráficas (A y
B) y trazos representativos (C) de los resultados obtenidos al emplear 1 μM de
ACPA. La disminución, tanto en la amplitud como en la frecuencia de aparición de los
potenciales miniatura es significativa desde el primer registro (n = 5). Esta
disminución se vuelve estable a partir de los 30 minutos siendo los valores en la
amplitud de 64.8% ± 10.1% (P = 0.0049) y en la frecuencia 36.9% ± 2.9% (P = 1.8 X
10-6) con respecto al control.
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 μM
*******
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 μM
**
**
**
*
C
Figura 22.- Efectos de ACPA (1 μM) sobre los potenciales miniatura. A) Gráficas de amplitud y B) frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. Ambos parámetros disminuyen rápidamente al adicionar el ACPA. C) Trazos representativos de esta serie experimental.
48
En la siguiente Figura (23) se muestra la gráfica de probabilidad acumulativa
obtenida de los potenciales miniatura registrados en condiciones control (línea
continua) y después de agregar ACPA (línea punteada). Se puede observar que en
presencia de ACPA hay un desplazamiento de la curva hacia la izquierda, el cual
corresponde a una menor amplitud de los potenciales miniatura registrados en
presencia de este canabinoide (P < 0.001, prueba de Kolmogorov–Smirnov).
Amplitud (mV)0 0.5 1
Pro
babi
lidad
Acu
mul
ativ
a
0
0.5
1
Figura 23.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA. La línea continua representa la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La línea punteada corresponde a la amplitud en presencia de ACPA (1 µM). En la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar ACPA (trazo rojo).
Efecto del ACPA en presencia de PTX
Al realizar experimentos después de incubar con la toxina pertussis (2 μg/ml)
para determinar si el efecto de ACPA es a través de proteínas Gi/o, observamos que
el ACPA no tuvo efecto significativo sobre la amplitud y la frecuencia de aparición de
los potenciales miniatura (P > 0.05; n = 4), siendo los valores para la amplitud
100.6% ± 5.8% y para la frecuencia 100.7% ± 3.6%. En la Figura 24, en A y B se
muestran las gráficas de amplitud y de frecuencia, respectivamente, obtenidas con
los datos de estos experimentos y en C se muestran trazos representativos. Estos
resultados indican que el efecto de ACPA es mediado por proteínas Gi/o.
49
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 500
20
40
60
80
100
120
Am
plitu
d de
PM
PT (%
)
ACPA 1 μMPTX 2 μg/ml
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120ACPA 1 μM
PTX 2 μg/ml
C
Figura 24.- Efecto de ACPA (1 μM) en presencia de PTX (2 μg/ml) sobre los potenciales miniatura. A y B) Gráficas de amplitud y frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de estos experimentos.
A continuación se muestra la gráfica de distribución obtenida en los
experimentos con ACPA en músculos tratados con PTX (Figura 25). Puede ser
observado que en estos experimentos, el tratamiento previo con PTX bloquea el
efecto del ACPA sobre la amplitud de los potenciales miniatura, de tal manera que no
hay diferencia significativa en la probabilidad acumulativa con respecto al control (P =
0.92, prueba de Kolmogorov–Smirnov).
50
Amplitud (mV)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Pro
babi
lidad
Acu
mul
ativ
a
0
0.5
1
Figura 25.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de PTX. La línea continua representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La línea punteada corresponde a la amplitud registrada en presencia de ACPA (1 µM) en músculos tratados con PTX. En la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar ACPA en un músculo tratado con PTX (trazo rojo).
Efecto del ACPA en presencia de AM281
Cuando realizamos experimentos con ACPA (1 μM) después de incubar 5
minutos previamente con el antagonista de los receptores CB1, el AM281 (1 μM), el
efecto de ACPA fue bloqueado casi completamente. La disminución que permanece
no es significativa (P > 0.05; n = 4). La amplitud promedio tiene un valor de 95.2% ±
3.2%, mientras que la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura tiene un
valor de 95.9% ± 4.1% con respecto al control (Figura 26). De la misma manera, en
las gráficas de distribución de los potenciales miniatura (Figura 27), no se observa
diferencia significativa en presencia de ACPA + AM281 comparado con el control (P
> 0.05, prueba de Kolmogorov-Smirnov).
51
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 500
20
40
60
80
100
120A
mpl
itud
de P
MPT
(%)
ACPA 1 μM
AM281 1 μM
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 μM
AM281 1 μM
C
Figura 26.- Efecto de ACPA (1 μM) en presencia de AM281 (1 μM) sobre los potenciales miniatura. A y B) El antagonista de los receptores CB1 evita el efecto de ACPA anteriormente observado sobre la amplitud y frecuencia de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de esta serie experimental.
52
Amplitud (mV)0 0.5 1 1.5 2
Prob
abili
dad
Acu
mul
ativ
a
0
0.5
1
Figura 27.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de AM281. La línea continua representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones de control. La línea punteada corresponde a la amplitud en presencia de ACPA (1 µM) y AM281 (1 µM). En la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar ACPA en presencia del antagonista AM281 (trazo rojo).
En la Figura 28 se resumen los datos obtenidos en los experimentos
empleando ACPA (1 µM). La primera barra corresponde al control registrado al inicio
de los experimentos, mientras que las otras barras corresponden a los datos
obtenidos en cada una de las diferentes condiciones experimentales en que se
empleó el ACPA. La adición de ACPA al baño causó una disminución significativa,
tanto en la amplitud como en la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura.
Este efecto fue bloqueado cuando los músculos fueron tratados con PTX o con el
antagonista de CB1 (AM281). Sin embargo, la presencia del antagonista de CB2
(AM630) no bloquea el efecto de ACPA.
53
Am
plitu
d de
PM
PT
(%)
0
20
40
60
80
100
120
Control ACPA 1 μM ACPA 1 μM +PTX 2 μg/ml
ACPA 1 μM +AM281 μΜ
*
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
*
Control ACPA 1 μM ACPA 1 μM +PTX 2 μg/ml
ACPA 1 μM +AM281 μΜ
Figura 28.- Resumen del efecto de ACPA (1 μM) sobre los potenciales miniatura. Se observa la disminución significativa en la amplitud y en la frecuencia de los potenciales miniatura en presencia de ACPA. Este efecto fue bloqueado por el tratamiento con la PTX o la presencia del antagonista de CB1 AM281. La presencia del antagonista de CB2 no bloquea el efecto del WIN. Las barras corresponden a los datos obtenidos a los 30 minutos en cada condición.
Histogramas de distribución de los potenciales miniatura
A continuación, en la Figura 29, se muestran los histogramas de distribución
de la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura registrados en diferentes
condiciones experimentales. Al lado izquierdo se muestran los histogramas de
frecuencia obtenidos en un experimento, en el cual se empleó ACPA a una
concentración de 1 μM. En A podemos observar la distribución de los potenciales
miniatura en condiciones control al inicio del experimento. En B se muestra cómo en
presencia de ACPA (1 μM), la distribución de los potenciales se corre hacia la
izquierda de la gráfica; además, podemos apreciar la disminución en el número de
eventos comparado con su control (A). Al lado derecho de la figura se muestran los
histogramas de frecuencia obtenidos en un experimento donde se empleó el ACPA
(1 μM) en presencia de AM281 (1 μM). En C se muestra la distribución de los
potenciales miniatura al inicio del experimento, y en D después de 30 minutos de
registrar los potenciales en presencia del ACPA y del AM281. Podemos apreciar que
54
en presencia de ACPA y AM281, la distribución de los potenciales miniatura se
mantiene similar que en condiciones control.
Figura 29.- Histogramas representativos de experimentos realizados en presencia de canabinoides.
En la siguiente Figura (30) se muestran los histogramas de distribución de los
potenciales miniatura registrados en un experimento, en el cual se incubó el músculo
cutaneous pectoris con toxina pertussis. En A se muestra el histograma
representativo obtenido del análisis del registro hecho al inicio del experimento, el
cual fue registrado en solución Ringer normal. En B se muestra cómo después de
registrar durante 30 minutos en presencia de ACPA (1 μM), la distribución de los
potenciales miniatura se mantiene similar a las condiciones de control.
A C
B D
55
Figura 30.- Histograma representativo de un experimento realizado en un músculo previamente incubado con PTX.
56
Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ sobre la liberación espontánea de
transmisor
Nifedipina
Se estudió el efecto de la Nifedipina (10 μM), que se sabe bloquea los canales
de Ca2+ tipo L (Lacinova, 2005; Triggle, 2006), con el fin de determinar si estos
canales de Ca2+ participan en el proceso de liberación espontánea de transmisor.
Con la concentración empleada no se observa ningún efecto sobre los potenciales
miniatura; tanto la amplitud como la frecuencia se mantienen a valores similares que
en solución Ringer (P > 0.05; n = 4). Los valores promedio para la amplitud y la
frecuencia después de registrar durante 30 minutos en presencia de Nifedipina
fueron de 98.6% ± 5.1% y 102.8% ± 5.7%, respectivamente (Figura 31).
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Ampl
itud
de P
MPT
(%)
0
20
40
60
80
100
120Nifedipina 10 μM
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120 Nifedipina 10 μM
C
Figura 31.- Registro de potenciales miniatura en presencia de Nifedipina (10 μM). A y B) Gráficas de amplitud y frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. C) Registros representativos de los experimentos con Nifedipina.
57
En la Figura 32 se muestra la gráfica de distribución y se puede observar que
no hay diferencias significativas en presencia de Nifedipina, si se compara con las
condiciones control (P > 0.05, prueba de Kolmogorov-Smirnov).
Amplitud (mV)0 0.5 1 1.5
Pro
babi
lidad
Acu
mul
ativ
a
0
0.5
1
Figura 32.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para Nifedipina. La línea continua representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La línea punteada corresponde a la amplitud en presencia de Nifedipina (10 µM). En la esquina inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar Nifedipina (trazo rojo).
ω-conotoxina-GVIA
Para determinar la participación de los canales de Ca2+ tipo N en la liberación
espontánea de transmisor, se empleó la ω-conotoxina-GVIA 5 μM, que se sabe
bloquea este tipo de canal de Ca2+ (Kasai, Aosaki y Fukuda, 1987; McCleskey y
cols., 1987; Stocker y cols., 1997; Tsien y cols., 1988). Después de registrar los
potenciales miniatura durante 15 minutos, se adicionó la toxina y observamos una
disminución tanto en la amplitud como en la frecuencia de los potenciales miniatura.
A los 30 minutos de exposición con la conotoxina, la amplitud tiene un valor de
85.9% ± 4.9% (P = 0.028) y la frecuencia 34.4% ± 5.2% con respecto al control (P =
1.7 X 10-5; n = 4; Figura 33).
58
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Ampl
itud
de P
MPT
(%)
0
20
40
60
80
100
120
*** *
ω−Conotoxina-GVIA 5 μM
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e PM
PT
(%)
0
20
40
60
80
100
120 ω−Conotoxina-GVIA 5 μM
****
*
*
*
C
Figura 33.- Efecto de la ω-conotoxina-GVIA (5 μM) sobre la amplitud y la frecuencia de los potenciales miniatura.
En la Figura 34 se muestra la gráfica de probabilidad acumulativa donde se
observa que no hay diferencias en la distribución de los potenciales miniatura en
presencia de ω-conotoxina-GVIA con respecto al control (P > 0.05, prueba de
Kolmogorov-Smirnov), indicando que el cambio observado en la amplitud promedio
en presencia de ω-conotoxina-GVIA es un efecto secundario a la disminución en la
frecuencia de aparición de los potenciales miniatura.
59
Amplitud (mV)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Pro
babi
lidad
Acm
ulat
iva
0
0.5
1
Figura 34.- Gráfica de Probabilidad acumulativa para ω-conotoxina-GVIA. La línea continua representa la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La línea punteada corresponde a la amplitud en presencia de ω-conotoxina-GVIA (5 µM). En la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar al baño ω-conotoxina-GVIA (trazo rojo).
A continuación se muestra el resumen de los resultados obtenidos a los 30
minutos en la presencia de los bloqueadores de canales de Ca2+. En la gráfica se
muestra que la Nifedipina no causa ningún cambio significativo en la frecuencia de
aparición de los potenciales miniatura. Por su parte, la ω-conotoxina-GVIA causa una
disminución significativa en la frecuencia de estos potenciales miniatura con respecto
al control (P = 1.7 X 10-5; n = 4).
Figura 35.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca2+ sobre los potenciales miniatura. La Nifedipina no causa ningún cambio significativo en la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. Sin embargo, en presencia de ω-conotoxina-GVIA (5 µM), la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura disminuye significativamente hasta valores de 34.4% ± 5.2% con respecto al control.
Frec
uenc
ia d
e PM
PT (%
)
0
20
40
60
80
100
120
Control Nifedipina 10 μM
ω−Conotoxina GVIA 5 μM
*
60
Efecto de ACPA sobre la liberación espontánea de transmisor después de
bloquear los canales de Ca2+ tipo N con ω-conotoxina-GVIA
Con el fin de determinar si el ACPA disminuye la liberación espontánea de
transmisor a través de un mecanismo que involucre la inhibición de los canales de
Ca2+ tipo N presentes en la terminal nerviosa motora, realizamos experimentos en los
cuales primeramente bloqueamos estos canales de Ca2+ con ω-conotoxina-GVIA
durante 30 minutos. Posteriormente registramos durante 15 minutos más para tener
nuestra basal y adicionamos al baño el ACPA (1 µM). Los resultados que obtuvimos
se muestran en la Figura 36.
A B
C
Figura 36.- El bloqueo de los canales de Ca2+ tipo N con ω-conotoxina-GVIA (5 µM) por 45 min, evita el efecto de ACPA (1 µM) sobre los potenciales miniatura. Sin embargo, la amplitud de estos potenciales miniatura es disminuida por ACPA aún estando bloqueados los canales de Ca2+ tipo N.
Time (min)
0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia d
e P
MPT
(%)
0
20
40
60
80
100
120 ω−Conotoxin-GVIA 5 μMACPA 1 μM
Time (min)
0 10 20 30 40 50
Am
plitu
d de
PM
PT
(%)
0
20
40
60
80
100
120
***
*
ω−Conotoxin-GVIA 5 μM
**
ACPA 1 μM
61
En la Figura 36 se observa que después de 30 minutos en presencia de ACPA
no hubo ningún cambio significativo en la frecuencia de aparición de los potenciales
miniatura (99.6% ± 2.05%, P > 0.05). Sin embargo, la presencia de ACPA ocasionó
una rápida disminución significativa en la amplitud de estos potenciales miniatura
(74.6% ± 3.5%, P = 0.002; n = 4), como se observa en la gráfica de amplitud de los
potenciales (A) y en los trazos representativos de estos experimentos (C).
En la Figura 37 se muestra la gráfica de probabilidad acumulativa obtenida de
los potenciales miniatura registrados después de bloquear a los canales de Ca2+ tipo
N (línea continua) y después de agregar ACPA (línea punteada). Se observa que aún
estando bloqueados los canales de Ca2+ tipo N, la presencia de ACPA en el baño
ocasiona un desplazamiento de la curva hacia la izquierda, el cual corresponde a una
menor amplitud de los potenciales miniatura registrados en presencia de este
canabinoide (P < 0.001, prueba de Kolmogorov–Smirnov).
Amplitud (mV)0 0.5 1 1.5
Pro
babi
lidad
Acu
mul
ativ
a
0
0.5
1
Figura 37.- Gráfica de Probabilidad acumulativa. La línea continua representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control (Canales de Ca2+ tipo N bloqueados con ω-conotoxina-GVIA). La línea punteada corresponde a la amplitud en presencia de ACPA (1 µM). En la esquina inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos después de agregar ACPA en un músculo tratado con ω-conotoxina-GVIA (trazo rojo).
62
DISCUSIÓN
Es conocido que los canabinoides, presentes en la marihuana, son los
causantes de los efectos psicotrópicos y motores producidos por el consumo de esta
planta, y se ha establecido también que dichos efectos se presentan al interactuar
estos canabinoides con receptores membranales llamados receptores a
canabinoides CB1 y CB2 (Begg y cols., 2001; Howlett y cols., 2002). Hasta la fecha se
ha sugerido que los efectos motores de los canabinoides se deben a la acción que
ejercen éstos sobre el SNC (Dewey, 1986; Sañudo-Peña y cols., 2000), pero aún no
se ha estudiado si dichos canabinoides tienen efecto directo sobre los receptores que
pudieran estar presentes en la unión neuromuscular del músculo esquelético. Por
otro lado, existen trabajos que reportan que los canabinoides provocan disminución
en la liberación del transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols.,
2006; Liang y cols., 2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004;
Takahashi y Linden, 2000) y que el Tetrahidrocanabinol modifica la amplitud y la
frecuencia de los potenciales miniatura (Kumbaraci y Nastuk, 1980; Turkanis y
Karler, 1986; Van der Kloot, 1994); sin embargo, los resultados de estos trabajos son
contradictorios; por lo tanto, en la presente tesis exploramos el efecto de
canabinoides sintéticos sobre la liberación del transmisor en la unión neuromuscular
esquelética de la rana y la presencia de los receptores a canabinoides en dicha
unión.
Un indicio de la presencia de los receptores sensibles a canabinoides es
determinar la presencia de ARNm para dichos receptores. Para determinar si en las
fibras musculares esqueléticas rápidas de la rana está presente el ARNm para CB1,
empleamos las técnicas RT-PCR convencional y RT-PCR tiempo real. También se
estudió si en las fibras musculares esqueléticas lentas se expresa el ARNm para
CB1. Como control negativo empleamos células HEK293 y como control positivo
transfectamos células HEK293 con ADNc de CB1 humano (ver metodología). El
análisis de los resultados obtenidos mediante RT-PCR convencional nos indica la
presencia de ARNm para CB1 tanto en las fibras esqueléticas rápidas como en las
63
lentas de la rana, y que en las fibras rápidas éste se expresa aproximadamente el
doble que en las lentas. Esto fue confirmado empleando la técnica RT-PCR tiempo
real (ver resultados).
Durante la disección retiramos la mayor cantidad posible de tejido conectivo,
vasos sanguíneos y terminales nerviosas presentes. Aunque no podemos descartar
que nuestras muestras tuvieran restos de las terminales nerviosas, pensamos que el
ARNm que detectamos está presente en las fibras musculares, que en proporción es
muchísimo mayor que algunos restos de tejido nervioso que no se hubieran podido
retirar. Además, las fibras rápidas generalmente son monoinervadas y las fibras
lentas son multiinervadas, de tal manera que si el ARNm que detectamos se debiera
a la presencia en las terminales nerviosas de las uniones neuromusculares,
esperaríamos encontrar mayor expresión en las fibras musculares lentas. Sin
embargo, encontramos el doble de expresión de ARNm en las fibras musculares
rápidas que en las fibras musculares lentas.
Por otra parte, para determinar el efecto de los canabinoides sobre la
liberación del transmisor en la unión neuromuscular, se registraron potenciales
miniatura en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de los receptores a
canabinoides. El primer canabinoide sintético que empleamos fue el WIN 55,212-2 y
encontramos que causa una disminución en la amplitud y la frecuencia de aparición
de los potenciales miniatura con una EC50 de 5.8 ± 1.0 μM. Este valor de EC50 es
similar en magnitud al reportado en trabajos recientes realizados con modelos
neuronales para determinar su efecto sobre la liberación de transmisor, en los que se
observan efectos de WIN, en el rango micromolar, mediados por los receptores CB1
(Kreitzer y Regehr, 2001; Liang y cols., 2004; Szabo y cols., 2004; Takahashi y
Linden, 2000).
También, se conoce que los receptores sensibles a canabinoides, al ser
activados, se acoplan a proteínas Gi/o y éstas son bloqueadas por la toxina pertussis
(Bockoch y cols., 1983). La PTX cataliza la ribosilación de las subunidades α de las
proteínas Gi, Go, y Gt. Esto previene la interacción de los heterotrímeros de las
proteínas G con los receptores, bloqueando así su acople y activación. Esto debido a
que las subunidades Gα permanecen en su estado inactivo (unidas a GDP). De esta
64
manera, para determinar si el efecto observado en presencia de WIN es mediado a
través de proteínas Gi/o se realizaron registros de potenciales miniatura después de
incubar con la toxina pertussis y observamos que el WIN no ejerce efecto sobre
estos potenciales, lo cual nos indica que el efecto de WIN se da través de receptores
acoplados a proteínas Gi/o.
Por otro lado, este canabinoide presenta afinidad para ambos tipos de
receptores, los CB1 y los CB2 (Howlett y cols., 2002), por lo cual, para establecer si
este efecto es mediado por receptores a canabinoides y determinar cuál de los dos
tipos de receptores a canabinoides está ejerciendo dichos efectos, empleamos
antagonistas específicos para cada uno de los dos tipos de receptores. Así, al
realizar experimentos con WIN en presencia del antagonista de CB2, AM630 (Ross y
cols., 1999), observamos el mismo efecto que sólo se da en presencia de WIN.
Cuando registramos los potenciales miniatura en presencia de WIN y del antagonista
de CB1 AM281 (Howlett y cols., 2002), encontramos que el WIN ya no ejerce efecto
en la amplitud ni en la frecuencia de dichos potenciales. Estos resultados nos indican
que el efecto de WIN sí es mediado por receptores a canabinoides y lo hace a través
de los CB1 y no por los CB2.
Para confirmar que la liberación de transmisor es disminuida por la interacción
de los canabinoides con los CB1 empleamos un agonista selectivo de estos
receptores, el ACPA (Hillard y cols., 1999). Cuando registramos potenciales
miniatura en presencia de este canabinoide encontramos una mayor disminución en
la amplitud y la frecuencia de estos potenciales que en presencia de WIN. Al igual
que en presencia de WIN, cuando empleamos la toxina pertussis, el ACPA no ejerce
efecto en la amplitud ni en la frecuencia de los potenciales miniatura, indicando que
éste ocurre a través de proteínas Gi/o. En presencia del antagonista selectivo de CB1
AM281, el ACPA no ejerce efecto sobre los potenciales miniatura. De esta manera se
confirma que el efecto de estos canabinoides sobre los potenciales miniatura está
mediado por receptores CB1.
Debido a que la frecuencia de los potenciales miniatura depende de la
cantidad de transmisor liberado (Fatt y Katz, 1952), el hecho de observar una
65
disminución en este parámetro en presencia de canabinoides nos indica que éstos
provocan la disminución en la liberación de transmisor.
Adicionalmente, se conoce que la entrada de Ca2+ a través de canales de Ca2+
dependientes de voltaje es esencial para la liberación de transmisor (Katz y Miledi,
1967b) (ver introducción). Para determinar el tipo de canales de Ca2+ involucrados en
la liberación espontánea de transmisor en la unión neuromuscular de la rana,
registramos los potenciales miniatura en presencia de dos distintos bloqueadores de
canales de Ca2+. En las terminales nerviosas motoras de la rana se han encontrado
los canales de Ca2+ tipos L y N (Kerr y Yoshikami, 1984; Feng y Dai, 1990; Hattori y
Maehashi, 1991; Robitaille, Adler y Charlton, 1993; Robitaille, García, Kaczorowski y
Charlton, 1993; Arenson y Hill, 1996; Meir y cols., 1999), por lo cual empleamos la
Nifedipina para bloquear los canales de Ca2+ tipo L y la ω-conotoxina-GVIA para
bloquear los tipos N (Kasai, Aosaki y Fukuda, 1987; McCleskey y cols., 1987;
Plummer y cols., 1989; Regan y cols., 1991; Stocker y cols., 1997; Triggle, 2006). El
hecho de encontrar que la Nifedipina no afecta la frecuencia de aparición de los
potenciales miniatura, nos indica que el Ca2+ necesario para la liberación de
transmisor no fluye a través de los canales de Ca2+ tipo L. Sin embargo, el haber
encontrado una clara disminución en la liberación de transmisor en presencia de la
ω-conotoxina-GVIA nos indica la participación de los canales de Ca2+ tipo N, lo cual
concuerda con lo reportado por Grinnell y cols. en 1989.
Finalmente, en los experimentos en que se bloquearon los canales de Ca2+
tipo N y después se adicionó el ACPA, este canabinoide no causó ningún cambio
significativo en la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura. Estos
resultados nos sugieren que el mecanismo por el cual ACPA ejerce su efecto
involucra el bloqueo de los canales de Ca2+ tipo N. Sin embargo, aunque la
frecuencia de aparición de los potenciales miniatura no fue modificada por el ACPA
en estos experimentos, la amplitud de los potenciales miniatura fue disminuida por el
ACPA, sugiriendo que esta disminución es debida a un efecto postsináptico.
Se ha propuesto que la disminución en la liberación de transmisor ocasionada
por los canabinoides (Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004) es debida al
bloqueo de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Además, al encontrar que
66
estando bloqueados los canales de Ca2+ tipo N con la ω-conotoxina-GVIA, el ACPA
no ejerce ningún efecto sobre la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura,
nos permite sugerir que al ser activados los receptores a canabinoides (CB1) por los
canabinoides, se acoplan a proteínas Gi/o y esto conduce a la inhibición de los
canales de Ca2+ tipo N, lo cual provoca a su vez una disminución en la liberación de
transmisor.
En cuanto a las evidencias encontradas en este trabajo acerca de un efecto
postsináptico ocasionado por los canabinoides, se sabe que los receptores a
acetilcolina pueden ser bloqueados por proteínas G (Butt y Pitman, 2002); de esta
manera, nuestros resultados nos indican que los canabinoides estarían activando al
receptor CB1 y se acoplan a proteínas Gi/o, conduciendo a una inhibición de los
canales-receptores a acetilcolina y causando de esta manera la disminución en la
amplitud de los potenciales miniatura.
67
CONCLUSIONES
1.- El ARNm para el receptor CB1 está presente en los músculos rápidos y lentos o
tónicos de la rana.
2.- El nivel de expresión en las fibras musculares rápidas de la rana es
aproximadamente el doble que en las fibras musculares lentas.
3.- Los canabinoides WIN 55212-2 y ACPA disminuyen la amplitud y la frecuencia de
aparición de los potenciales miniatura de una manera dependiente de la
concentración.
4.- El efecto de ambos canabinoides es sensible a toxina pertussis, lo que implica
que el efecto es a través de proteínas Gi/o.
5.- El efecto de WIN 55212-2 no es antagonizado por el AM630, antagonista
selectivo de CB2, lo que implica que el efecto de WIN no es a través de los
receptores CB2.
6.- Los efectos de WIN 55212-2 y de ACPA son antagonizados por el AM281,
antagonista selectivo de CB1, lo que sugiere que el efecto de estos canabinoides es
a través de CB1.
7.- ACPA actúa como un inhibidor de los potenciales miniatura, más potente y más
eficaz que WIN.
8.- El bloqueo de canales de Ca2+ tipo L no afecta la amplitud ni la frecuencia de
aparición de los potenciales miniatura.
9.- La presencia de un bloqueador selectivo de canales de Ca2+ tipo N (Cav 2.2)
provoca una disminución en la frecuencia de aparición de los potenciales miniatura,
lo que implica que estos canales de calcio participan en la liberación espontánea del
transmisor.
10.- Los canabinoides activan a los receptores CB1, y éstos a través de proteínas
Gi/o, inhiben a los canales de Ca2+ tipo N, ocasionando de esta manera la
disminución en la liberación de transmisor.
11.- WIN y ACPA producen un efecto postsináptico, sugiriendo la presencia
postsináptica de receptores CB1.
68
PERSPECTIVAS
1.- Determinar de manera directa la presencia de los receptores a canabinoides en el
músculo esquelético mediante el uso de anticuerpos específicos. Para esto,
primeramente debe establecerse el protocolo para la extracción de proteínas de
membrana. Después, realizar la separación de dichas proteínas de membrana
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, y así transferirlas a una membrana
empleando la técnica Western blot. Finalmente, se hace la detección de la proteína
de interés empleando los anticuerpos específicos para dicha proteína.
2.- Explorar la localización de los receptores a canabinoides en la unión
neuromuscular empleando anticuerpos marcados. El empleo de anticuerpos
marcados permitiría ubicar a los receptores a canabinoides y así conocer si están co-
localizados con la placa terminal, en los túmulos t o en toda la fibra muscular, así
como su localización en la terminal presináptica.
3.- Estudiar el efecto de los canabinoides sobre la liberación del transmisor evocada.
Es conveniente realizar estos experimentos para poder determinar si los
canabinoides causan una disminución significativa en el potencial de placa.
4.- Estudiar el efecto de los canabinoides sobre la liberación de calcio del retículo
sarcoplásmico inducida por cafeína o midiendo la concentración intracelular de calcio
en el músculo esquelético mediante el empleo de la microscopía de fluorescencia y
marcadores de Ca2+.
69
MANUSCRITO
Sánchez-Pastor, E. A., Trujillo, X., Huerta, M., Vásquez C. Montoya-Pérez, R.
y Andrade, F. Effects of cannabinoids on synaptic transmission in the frog
neuromuscular junction. Enviado para publicación.
70
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS
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ABREVIACIONES
PMPT: potenciales miniatura de placa terminal.
MEPPs: miniature end-plate potentials.
PTX: toxina pertussis.
ACPA: Araquidonil ciclopropil amida.
ACh: acetilcolina.
SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor.
VGCC: canales de Ca2+ activados por voltaje.
LVA: canales activados por bajo voltaje.
HVA: canales activados por alto voltaje.
KCa: canales de potasio activados por calcio.
KATP: canales de potasio dependientes de ATP.
TTX: tetrodotoxina.
NPPB: ácido 5-Nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzoico.
CB: cannabinoid brain.
2-AG: 2-araquidonil glycerol.
EDL: Extensor digitorum longus.
H2O-DEP: agua tratada con dietilpirocarbonato.
RT-PCR: Reverse transcriptase-polimerase chain reaction.
NCBI: National Center of Biotechnology information.
DMSO: dimetilsulfóxido.
![Universidad de Colima “ANÁLISIS, DISEÑO Y …digeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/Carlos_Alberto_Perez_Ovando.pdf · Los dispositivos computacionales móviles de bolsillo [Butler2001]](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5bad0dc209d3f29b4f8ce3de/universidad-de-colima-analisis-diseno-y-los-dispositivos-computacionales.jpg)
