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Universidad de ColimaFACULTAD DE MEDICINA
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
CANALES IONICOS Y FOTOCORRIENTESEN
PLANTAS VASCULARES
Tesis que para Obtener el Grado de:
Doctor en Ciencias Fisiológicascon Especialidad en Fisiología
Presenta:
Leandro Sandoval Alvarez
Asesor: Dr. J. Jesús Muñiz MurguíaCo-asesor: Dr. Igor Pottosin
Colima, Col. 1998
2
AGRADECIMIENTOS
A los asesores de esta tesis:Dr. J. Jesús Muñiz Murguía
Dr. Igor Pottosin
Al CONACYT por el apoyo económico para realizar los estudioscorrespondientes
3
INDICE DE CONTENIDOS
INDICE DE CONTENIDOS ................................................................................... 3
INDICE DE FIGURAS ........................................................................................... 5
INDICE DE TABLAS ............................................................................................. 7.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
REVISION DE CONCEPTOS BASICOS Y OBJETIVO DEL TRABAJO . . . . . . . . . . . . . 8
1.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 8
1.1.1 El proceso fotosintktico.. ......................................................................................................... .81.1.2 Organización Espacial y funcional de las reacciones lumínicas en la fotosíntesis ................. l l1.1.3 Métodos y técnicas de investigación del proceso fotosintético ............................................. .22
1.1.3.1 La técnica de “Patch Clamp”. .............................................................................................. 24
1.2. ANTECEDENTES A ESTE TRABAJO ......................................................................................... 29
1.3 OBJETIVO ...................................................................................................................................... 39
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
EQUIPO, MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS ................................................ 40
2.1 EQUIPO DE EXPERIMENTACIÓN Y REGISTRO ..................................................................... .40
2.2 PREPARACIÓN ............................................................................................................................. .42
2.3 MICROELECTRODOS ................................................................................................................... 44
2.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.. ....................................................................................... .44
2.5 EXTENSIÓN DE LA MEMBRANA TILACOIDE ........................................................................ 46
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
CANALES IONICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 473.2 RESULTADOS.. .............................................................................................................................. 473.3 DISCUSION ......... ........................................................................................................................... 60
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
CORRIENTES FOTOINDUCIDAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.1 RESULTADOS ................................................................................................................................ 654.1.1 Resultados generales. ............................................................................................................ .654.1.2 Cinética de las fotocorrientes: efecto de los estados previos de iluminación. ....................... .784.1.3 Efectos de la preiluminación sobre la cinética del transiente de corriente fotoinducida. ...... .804.1.4 Efecto de la duración del pulso de luz sobre la cinética del transiente de corrientefotoinducida .................................................................................................................................... 84
4.2 DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88................................................4.2.1 Observaciones generales ........................................................................................................ 884.2.2 Efectos de la Preiluminación Sobre la Cinética del Transiente de Corriente Fotoinducida. ..9 1
5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
CONCLUSIONES ................................................................................. 955,1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95
5.2 Conclusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
REFERENCIAS .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Anexo: copia de artículo publicado en relación con el presente trabajo
5
Figura 1.1 Esquema para la electrólisis del agua.
Figura 1.2 Cloroplasto.
Figura 1.3 Detalle de la forma en que se dobla la membrana tilacoidea.
Figura 1.4 Componentes de la membrana tilacoidea.
Figura 1.5 Detalle de los componentes de la membrana tilacoidea.
Figura 1.6 Esquema Z.
Figura 1.7 Detalle del Esquema Z desde el punto de vista energético
Figura 1.8 Detalles de componentes y procesos en la membrana tilacoidea.
Figura 1.9 Comparación entre mitocondria y cloroplasto
Figura 1.10 Fluorescencia y asimilación del carbono.
Figura 1. II Técnica de “Patch Clamp “.
Figura 1.12 Configuración “Ce11 Attached”.
Figura 1.13 Conjiguración “Inside Out ”
Figura 1. I4 Conjiguración ” Whole Ce11 “.
Figura 1.15 Variación fotoinducida del potencial de membrana en Peperomiametallica.
Figura 1.16 Comparación entre el potencial de membrana fotoinducido en Pep-eromia metallica medidosimultaneamente con micropipeta y con lectrodo sensi-ble a pH
Figura 1.17 Separación de los componentes del gradiente electroquímico
Figura 1.18 Registros de corriente y voltaje fotoinducidos y configuracionescorresuondientes urobables
10
l l
12 ’
13
14
16
17
20
21
24
26
27
27
28
31
33
34
36
Figura 2.1 “Set” experimental
Figura 2.2 Instrumental de registro
Figura 3.1 Registros de canal en cloroplasto de Amaranthus
Figura 3.2 Fracción de registros de canal de cloroplastos de Amaranthus
Figura 3.3 Gráfico L/Vpara canal en Amaranthus
Figura 3.4 Registro de canal en cloroplasto de Zea maiz
Figura 3.4a Modelo para los flujos de H+ y Cl-
Figura 3.5 Comparación entre canales de Nitelopsis y Amaranthus
Figura 4.1 Acceso de la pipeta al interior del cloroplasto
Figura 4.2 Fotocorrientes en Amaranthus
Figura 4.2a Registros de fotocorrientes en Amaranthus
Figura 4.3 Fotocorrientes en Zea mays
Figura 4.4 Cinética de la fotocorriente en Amaranthus
Figura 4.5 Efecto de la preiluminación en la cinética de la fotocorriente
Figura 4.6 Efecto de la oscuridad en la cinética de la fotocorriente
Figura 4.7 Amplitud del componente rápido VS. tiempo en la oscuridad
Figura 4.8 Amplitud del componente rápido VS. duración del prepulso
Figura 4.9 Detalle del esquema Z desde el punto de vista de los procesos
41
42
49
57
58
59
61 ,
63
65
66
68
78
79
82
83
85
86
94
7
INDICE DE TABLAS
Tabla 1.1 Ecuación del transporte fotosintético
Tabla 2.1 Solución aisladora
Tabla 2.2 Solución de pipeta
Tabla 2.3 Solución para obtener blebs
Tabla 4.1 Cinética de fotocorrientes
18
43
44
46
81
8
REVISION DE CONCEPTOS BASICOS Y OBJETIVO DEL TRABAJO
1.1 INTRODUCCIÓN
1.1.1 El proceso fotosintético
La fotosíntesis es la base de casi la totalidad de la vida actual en la tierra. Es la única
manera de transformación de la energía solar en la energía química de los
componentes biológicos. Además el proceso fotosintético es el responsable de la
recuperación del oxígeno atmosférico y del mantenimiento de la vida, particularmente
la de la especie humana.
El proceso fotosintético es representable mediante la fórmula
luznH2O + nC02 + CnH2nOn + nO2
que representa el transporte de electrones del agua al bióxido de carbono y la posterior
formación de azúcares y liberación de oxígeno.
Las reacciones que tienen lugar durante la fotosíntesis se pueden agrupar en dos
categorías muy amplias:
1) Las reacciones de transferencia electrónica fotosintética o reacciones
lumínicas, y
2) Las reacciones fijadoras de carbón, o reacciones oscuras.
El transporte electrónico fotosintético (categoría 1) es un proceso de reducción
representable por la analogía del proceso de electrólisis del agua como se ve en la figura
1.1. En presencia de luz la celda genera una corriente eléctrica por un proceso de
excitación básicamente similar a la excitación lurnínica de la clorofila. Así, la energía
lumínica se convierte en energía eléctrica que es usada luego para romper los enlaces O-H
y obtener el hidrógeno en el lado del cátodo y el oxígeno en el lado del ánodo.
El proceso electrolítico es análogo a la fotosíntesis en el sentido de que en éste
último la energía lumínica es usada para romper enlaces O-H con liberación de oxígeno
generando una corriente eléctrica en una reacción que incluye a la clorofila (molécula
sensible a la luz y en la que se inicia el proceso de conversión energética) en un proceso
similar, en lo fundamental, al que ocurre en una celda fotoeléctrica.
La diferencia entre ambos procesos radica en que el transporte de los electrones en
la fotosíntesis sucede como una transferencia de un transportador a otro en un proceso de
oxidación/reducción y no como un flujo de electrones a través de un conductor metálico,
como sucede en un sistema de electrólisis.
10
+“c$
022H20
+
c----- 2H++2OH-
Fotocelda e- l e-
Fig. 1.1 En este esquema se muestra el proceso de electrólisis del agua utilizando una fotocelda comofuente de la energía eléctrica necesaria para la descomposición del agua. El proceso mostrado aquí esanálogo al fenómeno de liberación de oxígeno en la fotosíntesis. El trabajo realizado por la energíaeléctrica, en la que ha sido transformada la energía luminica, descompone dos moléculas de agua en dosprotones que se mueven hacia el cátodo donde aprovechan dos electrones para formar una molécula con dosátomos de hidrógeno, y dos hidroxilos que se recombinan liberando una molécula de agua, un átomo deoxígeno y dos electrones, siendo éstos últimos donados al ánodo.
ll
1.1.2 Organización espacial y funcional de las reacciones luminicas en la fotosintesis
En las plantas verdes la fotosíntesis se lleva a cabo en un organelo intracelular
llamado cloroplasto y que se encuentra en algunas células vegetales.
La apariencia externa de los cloroplastos es lenticular y se encuentran inmersos en
el citoplasma de la célula que los contiene. Un cloroplasto está limitado externamente por
una cubierta conformada por una doble membrana (membranas interna y externa), y en su
interior se encuentra una estructura con la forma de apilamiento de discos, a los que se
llama grana, inmersos en una substancia a la que se llama estroma. La membrana que
conforma los grana es la membrana tilacoidea y es en ella que se encuentran alojados los
fotosistemas en los que se realiza la transformación energética que caracteriza la
fotosíntesis (Fig. 1.2).
Fig. 1.2 Cloroplasto de planta de arroz en la que se observa los granaformados por la membrana tilacoidea además de algunos granos dealmidón (modificada de Laza et al, 1993)
12
La membrana tilacoidea tiene insertas varias proteínas que desempeñan diferentes
funciones directamente relacionadas con la transformación de la energía lumínica en
energía adecuada para síntesis de moléculas altamente energéticas que a su vez
proporcionan la energía para la síntesis de compuestos orgánicos. Contiene, pues, todos
los sistemas transformadores de energía del cloroplasto. La imagen de los cloroplastos
ofrecida mediante microfotografia parece sugerir que la membrana tilacoidea es una
conformación de arreglos separados de pequeños discos o vesículas aplanadas, sin
embargo los resultados de microfotografías de membrana tilacoidea congelada y
fracturada parecen mostrar que se trata de una sola membrana complejamente plegada
(Fig. 1.3). La membrana tilacoidea está doblada de manera tal que separa un espacio,
llamado espacio intratilacoideo, del interior del cloroplasto al que se llama estroma.
Fig. 1.3 Detalle en la que se muestra la manera compleja en que lamembrana tilacoidea se pliega formando los grana (modificada deSchönknechcht, 1990)
13
Existe todavía mucho por conocer sobre la forma exacta como se distribuyen los
diferentes componentes en la membrana tilacoidea y de la forma como interactúan entre
ellos, así como de la estructura precisa de cada una de tales proteínas. La figura 1.4
presenta la organización principal de los componentes de la membrana fotosintética,
incluyendo los complejos fotosintéticos 1 y II, los complejos colectores de luz y el factor
de acoplamiento de H+ ATPasa. Un esquema más detallado que incluye los elementos de
los fotosistemas I y II, se muestran el la figura 1 5.
GRANA ESTROMA /
Fig. 1.4 Forma en que los componentes proteicos de la membranatilacoidea están organizados. PSI es el fotosistema 1, PSI1 es elfotosistema II, LHC es el complejo colector de luz, CF1 es un factor deacoplamiento llamado ATPasa, CFO es la base del factor de acoplamiento(modificado de Walker 1992).
14
ESTR
TILACOIDE
. REDUCTASA
4H+ ESPACIOINTRATIIACIDEO
COMPLEJO PROTEINICGCLOROFILICO DE PSI
TIIACOIDE
Fig. 1.5 Los complejos proteicos-clorofílicos colectores de luz llevan la energía deexcitación a P680, el centro de reacción de PSII, el cual eleva electrones hasta Q, y deahí, vía la plastoquinona y el citocromo f hasta P 700, el centro de reacción de PSI y queno aparece representado en esta figura. La excitación lumínica de PSI eleva electroneshasta una proteína de hierro- azufre, y de ahí a través de la ferredoxina hasta laNADPreductasa. El transporte de electrones genera un gradiente de protones a través dela membrana tilacoidea que se descarga a través de la ATPsintetasa generando ATP deADP y fosfato inorgánico (tomado de Walter 1992).Abreviaturas:ADP=difosfato deadenina; ATP = ácido adenosin-trifosfórico; CFl, CFO=elementos de la ATPasa;Q=quinona; P=pigmento f o t o - s e n s i t i v o ; Cyt-citocromo; Pc=plastocianina; Z ,Y=sistema ensimático desintegrador de agua; A=aceptor; B=molécula conectora deplastoquinona; PQ= plastoquinona; Pi=fosfato inorgánico.
1 5
En la propuesta del esquema Z para la fotosíntesis que se muestra en la figura 1.6
se incluyen los diferentes eventos y la secuencia en que se dan durante el proceso
fotosintético. Es de notarse la existencia de procesos vectoriales de transporte electrónico
a través de la membrana tilacoidea en los complejos fotosintéticos 1 y II; el acoplamiento
del transporte electrónico y protónico entre fotosistemas; dos sitios de reacciones
protónicas adicionales: uno de liberación de protones en el complejo de desintregación
del agua y otro de absorción de protones por la reducción de NADP+. Lo anterior se
resume en la siguiente ecuación:
4hv+ H2O+ 3H+ + NADP’ + 1+O2 + 4H’ + NADPH(+Ap)
donde A$ es la diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana. En otras
palabras, el proceso fotosintético lleva a la formación de un gradiente electroquímico de
H+, según la siguiente ecuación,
AP/p =Av+ApH
El transporte de protones desde el lumen hasta el estroma en la dirección del
gradiente electroquímico a través del canal protónico CFo esta acoplado con síntesis de
ATP en el factor de acoplamiento CFI de la ATPasa. Este concepto, que es el fundamento
del bioenergética moderna, fue expresado por primera por P. Mitchell(l96 1, 1966).
1 6
òk,,AeS
;i ‘1Te-PP C 700
e-
ESTROMA
NADP+\
?r‘ 0 H+2 2
H+
LUMEN
Fig. 1.6 Esquema-Z de la fotosínteis. Los pasos electrogénicos se marcan con flechas huecas (movimientode cargas +). PQ/PQH2 es por plastoquinona/plastoquinol. PC es por plastocianina. FeS es por proteina deReske. Cyt f es por citocromo f. Los donantes primarios de PSI y PSII se designan como PToo y Pw,. Fd esferredoxina y A es un aceptor.
El papel que la luz desempeña en los procesos fotosintéticos puede ser entendido por
el diagrama energético mostrado en la figura 1.7 que en principio no es mas que el
esquema 2 presentado como un diagrama energético: absorción de la luz por los
pigmentos Pb80 y P700 con un cambio de nivel electrónico, el consecuente potencial
redox de aproximadamente 1.9 V y 1.8 V respectivamente. Una parte de la excitación
de los pigmentos se convierte en procesos fotosintéticos que siempre van
termodinámicamente cuesta abajo con disminución de la energía libre.
17
PSI-IA,
I’
-11
-10
- 0 8i
- o h -
- 0 . 4 -..
-01-
o -& )
OS?-
OA-
OR-2”2O
0.8 -1
-e,-
1.0 -?2+4.H(tUacorde)?2-
ZNADP+
/z+H+
-1 (estroma)
IZNADPH
Figura 1.7 Detalle del esquema z para la fotosíntesis desde el punto de vista de la energía. Seobserva cómo los electrones excitados van perdiendo su energia hasta quedar en un estanque demoléculas de plastoquinona (Q), convirtiendose en plastoquinol que reduce al citocromo b6f, el quetransfiere electrones con la consiguiente translocación de protones hacia el espacio tilacoideo. Elcitocromo bf6 transfiere los electrones a la plastocianina (PC) que regenera al fotoxidadado P700.Los electrones excitados en P700 también caen energéticamente hasta el sitio donde se da lareducción de NADP’ en NADPH. Los electrones de P700 pueden regresar a b6f en proceso cíclico.
18
Los productos de la fotosíntesis se estabilizan mediante los tres siguientes mecanis-
mos cinéticos:
- a) La primera transferencia electrónica es extremadamente rápida,
alrededor de 3 ps de modo que se evita la reacción inversa de des-
excitación, esto es, la fluorescencia;
- b) las transferencias electrónicas posteriores son cada vez más lentas
(al menos por un factor de lo), y
- c) una pérdida energética en pago por la estabilidad resultante.
Lo anterior dicho que expresado resumidamente en la tabla 1 .l para el caso del
fotosistema II, pero la estrategia es la misma para el fotosistema 1.
[Z 4ím Pheo QA QB 1&hv
[Z P&, Pheo Q, Q, ]
4
[Z f& Pheo- QA QJ-1
[Z ps8,, Pheo QA QB]4
[z’ eS,, Pheo QA QJAe-
[Z esO Pheo QA QB]&
[Z &, Pheo QA Qi]
(centros abiertos)
(3 PS)
(250-300 ps)
(centros cerrados)(20 ns- PS)
(50 ,us-1.3 ms)
(1 OO-200 #as)(centros abiertos)
Tabla 1.1 Ecuación que describe de manera breve los eventos involucrados en el transporte fotosintético deelectrones en el centro de reacción del PS II. Pheo es feofitina; QA y QB son aceptores de electrones tipoquinona del fotosistema II; P es un pigmento; 2 es el donador secundario del fotosistema II; (tomada de
.G.H. Krause y E. Weis, Chlorophyll Fluorescente and Photosynthesis. The Basics, en Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mal. Biol. 1991. 42:3I3-349)
19
.
La transferencia electrónica entre los fotosistemas 1 y II incluye transportadores de
uno y dos electrones. La interacción de transportadores de dos electrones, la quinona, con
una cadena de transportadores monoelectrónicos se realiza con la ayuda del ciclo Q el que
incluye el complejo b6f (ver figura 1.8). Este mecanismo es discutido por Andréasson y
colaboradores (1988).
Otro mecanismo interesante que aparece en el fenómeno del transporte electrónico
es el representado por el acoplamiento entre el proceso de desintegración del agua que
lleva 4 electrones para producir una molécula de oxigeno y la cadena monoelectrónica en
el núcleo del PSI1 está tratado en detalle por Beck y dePaula (1989), y Brudvig (199 1).
Finalmente, prestaremos atención a un aspecto importante referente a la
composición del gradiente electroquímico de H’ en los cloroplastos, el cual es muy
diferente en comparación con el de la mitocondria. (ver figura 1.9). En el cloroplasto el
diferencial electroquímico (A& es casi en su totalidad compuesto por ApH, mientras que
en la mitocondria éste está formado casi en su totalidad por un diferencial de potencial
eléctrico (A<p). Desde el punto de vista del funcionamiento de la ATPasa la composición
del gradiente electroquímico no tiene importancia, pero sí la tiene para propósitos de la
regulación del transporte electrónicolprotónico [Weis (1987), Heber (1992).
20
embrana externa
Membrana interna
2H+ + 2NADP+\
Estmma
Lumentilacoideo
Figura 1.8 Representación esquemática de la membrana tilacoidea mostrando los componentes dela cadena transportadora de electrones. El sistema consiste de tres complejos proteicos: PSII, elcomplejo de citocromos b6f y PSI, los que están conectados elCctricamente entre sí por la difusiónde los transportadores de electrones plastoquinol (Q) y plastocianina (PC). El transporte deelectrones fotoinducido desde Hz0 a NADP’ formando NADPH origina el transporte de protoneshacia el espacio tilacoideo (Fd es por ferredoxina). Los protones adicionales son obtenidos del aguapor el complejo productor de oxígeno (OEC), produciendo 02. El gradiente protónico resultante dala energía necesaria para la síntesis de ATP en la ATPasa CFICFO translocadora de protones. En lamembrana también existen complejos colectores de luz cuya clorofila y otros cromoforostransfieren sus excitaciones a PSI y PSI1
2 1
MITOCONDRIA
pH7 pH*1
estroma\
membrana membranainterna externa
\i J
PH5 PH8 ti7CLOROPLASTO
13 =ATPasa
Figura 1.9 Comparación entre las estructuras de la mitocondria y el cloroplasto. Es de notarse elhecho de que aunque ambos organelos tienen sistemas ATPasa que funcionan gracias a ungradiente electroquímico, la proporciones del gradiente correspondientes a los componenteseléctrico y químico son diferentes en cada organelo. En el caso del cloroplasto es el componentequímico el preponderante, mientras que en la mitocondria se invierte la proporción.
22
1.1.3 Métodos y técnicas de investigación del proceso fotosintético
Los métodos para investigar los diferentes aspectos involucrados en el proceso
fotosintético son de lo mas variado y responden al aspecto específico que se quiere
estudiar, ya se trate de la parte lumínica del proceso o de la parte oscura del mismo. La
parte oscura incluye sobre todo técnicas bioquímicas, mientras que la parte lurnínica se
estudia sobre todo por técnicas biofkicas.
Una lista no exhaustiva de tales métodos incluye:
- Evolución del oxigeno para estudiar el transporte electrónico en el fotosistema
II.
- Espectroscopia en diferentes rangos de la radiación electromagnética ha sido
utilizada para averiguar la orientación de las estructuras proteicas secundarias y
las reacciones primarias en la fotosíntesis. Por ejemplo, la espectroscopia de
absorción laser es usada para el estudio de los procesos rápidos en los centros de
reacción; la espectroscopia de absorción diferencial que ha sido usada en el
estudio de transporte electrónico en el interior de los fotosistemas.
- Resonancia electroparamagnética: uasada para el estudio de centros redox
mediante la detección electrones no apareados. Por ejemplo, en el complejo de
desintegración de agua, en la semiquinona y los centros FeS; en parte de los
aceptores de PSI y en el complejode citocromos b6f.
- Resonancia magnética nuclear: Para indagar sobre las características funcionales
y estructurales de los diferentes elementos que participan en el proceso
fotosintético.
- Por último, pero no siendo por ello la técnica menos importante, tenemos el
análisis de la fluorescencia que permite el estudio del estado abierto y cerrado de
23
los centros de reacción y la consecuencia de ello en la regulación y control de la
fotosíntesis.
El estudio de la fluorescencia en las plantas, en particular, es uno de los métodos
que, junto con otras técnicas, ha sido muy esclarecedor de lo que ocurre en el fenómeno
fotosintético.
La fluorescencia de la clorofila, cuando es emitida desde una hoja, ofrece
información importante sobre el fenómeno de la fotosíntesis. Se origina en el fotosistema
II (PSII) alcanzando hasta un 3% de la luz absorbida, a diferencia del 30% para la
clorofila a en solución. Desde hace mucho tiempo se propuso que debe existir una
relación inversa entre la fluorescencia de la clorofila a emitida por las hojas y la
asimilación fotosintética del carbono.
La idea es que si la fotosíntesis es activada por el estado excitado de electrones de
la molécula de clorofila, entre más energía de excitación sea usada para el propósito
fotosintético menos de ella estará disponible para ser disipada en forma de luz o calor.
En la Figura 1.10 se muestra como la asimilación del carbono, representada por la
producción de oxígeno, empieza lentamente cuando la hoja, previamente en la oscuridad,
se ilumina abruptamente, mientras que la fluorescencia inicia con un valor muy alto para
luego irse invirtiendo los valores. Eso es precisamente lo que se esperaría que sucediera si
se supusiera que a los procesos bioquímicos de la fotosíntesis que no requieren de la luz
como fuente de energía, procesos a los que suele llamarse “bioquímica de la oscuridad”,
les toma algún tiempo iniciar, mientras que la fenómenos fotoquímicos empiezan
inmediatamente después de iniciado el flujo de fotones.
24
,
OX/GF/vO ,xr’/-/
/,,,’
#’<
,’. FLUORESCENCIA/.-
I I I I I I2 4 6 8 1 0 12 14 16 18
TIEMPO CMI N)
Fig. 1.10 La asimilación fotosintetica del carbón inicia lentamente cuando una hoja que esta en la oscuridadse ilumina abruptamente. Durante un periodo de inducción la fluorescencia se eleva rápidamente paraluego decaer, a veces mostrando picos secundarios, hasta un nivel de estado estable (tomado de Wulker,David Energy, Plants and Man, Editorial Oxigraphics, segunda edición, 1992). Las unidades no vienenindicadas en la referencia, pero en la literatura se reportan en uM para el O2 y unidades relativas para lafluorescencia.
1.1.3.1 La técnica de “Patch Clamp”.
Hemos visto ya que se han usado diferentes técnicas para estudiar los procesos
fotosintéticos, cada una de ellas facilitando la observación de diferentes facetas del objeto
de estudio. Uno de los fenómenos relacionados con todas las membranas celulares o
membranas en organelos es el de los flujos de iones a través de ellas. Desde los anos
cincuenta los biólogos han tenido la capacidad de estudiar tales flujos a nivel
macroscópico, pero es solo a partir de los años setenta que se contó con una técnica que
permitiese el estudio de los canales individuales responsables de los flujos iónicos a
través de las membranas: es la técnica denominada en inglés “Patch Clamp” e inventada
por Erwin Neher y Bert Sakmann, trabajo por el que se hicieron acreedores al premio
Nobel en 199 1 (Neher y Sakmann, 1992).
25
La técnica es esencialmente simple. Consiste en colocar la punta’de una pipeta de
vidrio, con un perfil adecuado, sobre la superficie de la célula u organelo de manera que
los bordes de la pipeta establezcan un sello que aísle del resto de la membrana la fracción
de la misma que queda al interior del hueco en la pipeta. Presumiblemente, la fracción de
membrana ahlada contendrá algunos canales que se pue&n estua!iíar. Los canales
La técnica también permite al investigador separar el pedazo de membrana en la
punta de la pipeta para exponer la superficie interna al exterior, o abrir una ventana al
interior de la célula u organelo vivos abriendo la posibilidad de alterar controladamente
los componentes al interior.
Neher y Sakmann se enfocaron, en 1973, a resolver un problema que existía para
la medición de eventos unitarios en las señales sinápticas: el ruido de fondo asociado con
las corrientes de iones cruzando las membranas de la células (Neher y Sakman, 1992). Si
bien ese ruido es del tamaño de una diezmillonésima de ampere, es 100 mayor que la
magnitud de la corriente correspondiente a un evento unitario de flujo iónico en el canal.
Su esfuerzo concluyó con la técnica mencionada antes.
En esta técnica se incluyen tres maneras o configuraciones principales de lograr el
“patch”:
- “Cell Attached”: Presionando la pipeta de Patch sobre la superficie
limpia de una célula (Fig. 1.11) se le aplica una succión suave,
pudiendo lograr de esta manera un sello en el orden de los GR (Fig.
1.12). En estas condiciones se pueden aplicar diferentes estímulos a la
26
fracción de membrana desde el interior de la pipeta y medir las
respuestas de los canales aislados.
- “Inside Out”: Una vez establecido el sello, en vez de aplicar
estímulos inmediatamente se puede separar la fracción de membrana
sellada y exponer la abertura inferior de los canales (Fig. 1.13).
- “Whole Cell”: La tercera opción es la de romper la fracción de
membrana sin destruir el sello para exponer de esta manera el interior
de la célula o del organelo (Fig. 1.14).
Existe una cuarta configuración llamada “Outside Out” que es equivalente a
“Whole Cell” en el sentido de que el interior de la membrana queda expuesta al contenido
en la pipeta y el exterior de la misma es expuesta al medio exterior.
La técnica de “Patch Clamp” fue utilizada hasta antes de este trabajo para estudiar
corrientes iónicas fotoinducidas a través de las diferentes membranas de cloroplastos
gigantes (ver sección de antecedentes a este trabajo).
Figura 1.11 En la técnica de “Patch Clamp” la pipeta se coloca y se presiona sobre la superficie dela membrana u organel para aislar una fracción de la superficie.
27
Figura 1.12 Al hacer succión se aisla una tiacción de la membrana del resto de la membrana. Aesta configuración se le denomina “Cell Attached”.
Figura 1.13 Estando en la configuración “Ce11 Attached” se puede separar la fracción de lamembrana aislada mediante un ligero tirón. A esta configuración se le denomina “Inside Out”
28
Figura 1.14 Estando en la configuración “Ce11 Attached” se puede, mediante una succiónadecuada, romper Ia membrana y exponer el interior de la célula. A ésta configuración se ledenomina “Whole Cellt”.
29
1.2. ANTECEDENTES A ESTE TRABAJO
Los antecedentes al trabajo presentado en esta tesis están conformadas
básicamente por tres líneas de estudio: la primera se refiere al uso de electrodos para
estudiar procesos fotosintéticos en células vegetales, la segunda es el uso de métodos
indirectos para el estudio de variaciones de voltaje y de pH en el mismo tipo de objetos de
estudio y la tercera es el registro de canales únicos en membranas de cloroplasto.
En una serie de experimentos clásicos A. A. Bulychev (1972), utilizando la
técnica de microelectrodos, pudo registrar cambios de voltaje a través de la cubierta de
cloroplastos gigantes de Peperomia metdica. La existencia de potenciales eléctricos en
la membrana fotosintética del cloroplasto y su estudio eran importantes para aclarar la
conexión entre la electrogénesis y la fotosíntesis ya que la generación de un potencial
eléctrico inducido por luz en dicha membrana es una característica esencial de la hipótesis
quimiosmótica de P. Mitchel (1968). Los resultados obtenidos por Bulychev son de
mucho interés y son una confirmación de la hipótesis quimiosmótica.
Los experimentos de Bulychev fueron realizados colocando un electrodo en el
interior del cloroplasto y otro en el citoplasma. Se encontraron diferencias medias de
potencial in situ entre el interior del cloroplasto y el citoplasma, que variaban desde + 15
mV hasta -60 mV dependiendo de varias condiciones. El potencial de membrana en
cloroplastos aislados se midió entre -20 mV y +30 mV. El acto de iluminar la célula con
luz blanca provocó dos tipos de cambio en el potencial de membrana: uno lento y uno
rápido, pudiéndose en algunos casos observar ambos simultáneamente.
El cambio lento de potencial fotoinducido se observó asociado con un
deslizamiento en la dirección negativa de lo-20 mV durante un lapso de tiempo de l-3
30
min, estabilizándose posteriormente. Al apagar la luz el potencial regresa a su estado
original. Los cambios rápidos de potencial se dan mediante un deslizamiento en la
dirección positiva de 1 O-30 mV que tiene lugar en un periodo de tiempo de lo-50 ms,
estabilizándose posteriormente en un valor constante. Bulychev comprendió que el
tiempo de elevación del potencial bien podría ser menor que 10 ms, pues ese era el límite
de resolución de su equipo.
Como ya se dijo, los registros de voltaje se realizaron tanto in situ como en
cloroplastos aislados, repitiéndose, en lo esencial, los resultados previos. En la figura 1 se
muestran algunos de los registros logrados por Bulychev.
La presencia de DCMU [3-(dichlorophenyl)- 1, 1 -dimethylurea], un bloqueador
del proceso fotosintético, inhibió los cambios de potencial tanto los rápidos como los
lentos, y la adición de “phenazine methasulpahate”, un transportador electrónico similar a
la quinona, pero mas rápido, restaura las variaciones. En cloroplastos aislados los
cambios de potencial quedaron inhibidos por un desacoplador de fosforilación, el
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxy-phenylhydrazone (FCCP), tal como lo exige la
teoría quimiosmótica de Mitchel. La reversibilidad y la magnitud del efecto, el modo de
acción de los inhibidores y el espectro de acción son un indicador de que lo que se
registró no es un artefacto.
Los cambios fotoinducidos corresponden, en tiempo, a los cambios de
concentración de H+ fotoinducidos en cromatóforos de bacteria y en cloroplastos de
plantas superiores descubiertos por varios autores como Chance y colaboradores (1970) e
Izawa y colaboradores (1967).
3 1
El decaimiento del potencial de membrana se podía interpretar cómo producto de
un proceso compensatorio de transporte iónico a través de la membrana tilacoidea.
On
0 5 10
S
Figura 1.15 En la parte izquierda de la figura se muestra el registro de una variación lenta del potencialde membrana en un cloroplasto gigante de Peperomia metallica, mientras que en la parte derecha semuestran varios registros de la variación rápida a varios intensidades de luz, según Bulychev (1972).
Bulychev y colaboradores, hicieron estudios posteriores utilizando la misma
técnica de electrodos en cloroplastos gigantes tanto para refinar la técnica como para
investigar aspectos particulares de los resultados obtenidos en los cambios de potencial
fotoinducidos. En particular existía interés en esclarecer la relación entre los cambios de
potencial inducidos por luz y los cambios de la permeabilidad a H+ inducidos por luz en
membranas del cloroplasto.
32
Para 1986 era generalmente aceptado que el transporte electrótiico fotoinducido
en la membrana del cloroplasto estaba acoplado a la síntesis de ATP mediante un
diferencial electroquímico de H+,
A&f+
Para poder evaluar la contribución al gradiente electroquímico correspondiente a
cada uno de los componentes eléctrico (Acp) y químico (ApH) se hacía necesario realizar
las mediciones del potencial de membrana del gradiente de pH en las membranas
tilacoideas bajo condiciones y métodos similares. RemiS y colaboradores (1986)
utilizaron microelectrodos de antimonio aislados con vidrio sensibles a pH para medir la
diferencia de potencial entre el microelectrodo colocado en el interior de un cloroplasto
gigante de Peperomia metallica y un electrodo de referencia colocado en el exterior
durante una estimulación luminosa, comparando el resultado con el cambio de potencial
fotoinducido en la membrana.
Se detectaron dos componentes, uno rápido y uno lento, y se obtuvieron dos
conclusiones principales de los experimentos realizados:
l- Las propiedades del componente lento de la fotorespuesta registrada con
los electrodos de pH son consistentes con la sugerencia de que este
componente refleja una acidificación del interior de los tilacoides en
presencia de luz.
2- Una reducción en el gradiente de pH a través de la membrana tilacoidea
utilizando NH&1 es acompañada por un incremento en el potencial de
membrana.
En las figuras 1.16 y 1.17 se muestran algunos de los resultados obtenidos.
33
Vale hacer notar que el voltaje registrado por el electrodo de pH cuando la punta
del mismo se encuentra en el interior del cloroplasto está dada por la ecuación,
AV = Ap- F(pH, - p H , )
en la que Acp es el potencial de membrana fotoinducido, pH¡ es el pH interno en tilacoides
iluminados, pHd es el pH interno en tilacoides en la oscuridad, R es la constante de los
gases, T es temperatura absoluta y F la constante de Faraday.
A
pH 25
Figura 1.16. (A) Potencia l de membrana fotoinducido en un c loroplas to a is lado de Peperomia metal l ica regis t radocon microelectrodos capilares. (B) Sefial de voltaje fotoinducido registrado con un electrrodo de antimonio para pHen un cloroplasto aislado (según RemiS et al, 1986).
34
La variación fotoinducida de pH en el estroma es entre 4 y 5 veces más pequeño
que la variación correspondiente en el interior de los tilacoides, por lo que se puede
asumir que (pH¡-pHd) es casi igual a la diferencia de pH a través de la membrana
tilacoidea y, que por tanto, AV representa aproximadamente el curso temporal la
formación del diferencial electroquímico a través de la membrana tilacoidea.
Figura 1.17. Una representación esquemática de la seiíal registrada con un electrodo de antimonio para pHcomo la suma de dos componentes, e l potencial de membrana y el cambio de pH en el lumen t i lacoideo.
En el proceso de estudio de los fenómenos producidos por la luz en los tilacoides
de cloroplastos se había determinado ya, como hemos visto antes, que el transporte
electrónico fotosintético está asociado con la introducción de protones al interior del
cloroplasto y la formación de un diferencial de potencial eléctrico a través de la
membrana. La cinética del desarrollo del potencial eléctrico en las membranas tilacoideas
35
en presencia de luz sigue un patrón complejo, y su relación con los diferentes flujos
iónicos era entendida solo parcialmente a través del método indirecto de análisis de los
cambios de absorvancia electrocrómica (Junge y Jakson, 1982) y los esfuerzos realizados
con técnicas basadas en uso de varios tipos de microelectrodos, como hemos visto
previamente.
Se había determinado que el diferencial electroquímico genera un transporte
positivo de iones entre los tilacoides y el estroma del cloroplasto. Se había establecido
que la ATPasa produce un flujo inverso de H’ a través de canales disparado por la síntesis
de ATP. También se habían descubierto eflujos de K” y Mg2+ junto con la toma de Cl- en
presencia de luz (Hind et al, 1974; y Bulychev y Vrenderberg, 1976), flujos iónicos que se
consideraban mediados por canales iónicos y que forman parte de los mecanismos de
compensación eléctrica que hace que el diferencial electroquímico a través de la
membrana tilacoidea sea sobre todo un gradiente de pH y muy poco de potencial
eléctrico.
Schönknecht y colaboradores (1988) lograron caracterizar un canal de cloro
dependiente de voltajes en blebs de tilacoide de Peperomia metallica y Tester y Blatt
(1989) observaron canales de K” en membranas lípidas planas con tilacoides de espinaca
integradas. Pottosin (1992) y Thaler y colaboradores (1992) han detectado canales de
cloro en Nitellopsis y Eremospheara viridis mediante la técnica de “patch- clamp” y
microelectrodos selectivos de iones.
Tratando de clarificar algunos detalles observados en los registros de potencial
fotoinducido Bulychev y colaboradores registraron corrientes fotoinducidas bajo
potencial de membrana controlado utilizando la técnica de patch-clamp en la membrana
de cloroplastos aislados de Peperomia metallica tratando de distinguie los componentes
36
relacionados con la translocación primariade K’ y los flujos iónicos secundarios con base
en las diferentes dependencias del potencial de membrana.
En la figura 1.18 se muestran algunos de los resultados obtenidos en cuanto al
registro de corriente, registro de potencial de membrana y las posibles configuraciones en
que se realizaron las mediciones.
h4 12”bt
J - b -d+
Figura 1.18 En (a) se muestra un corriente ionica entrante a un potencial de membrana de 0 mV. En(b) se trata de la fotorespuesta del potencial de membrana en el mismo cloroplasto. En (c) se muestra laprobable configuración de patch-clamp ilustrando el origen de la focorriente entrante. En (d) se muestrala inversión de una fotocorriente después de la separación de a la vesícula localizada en la punta de lapipeta. En (e) se muestra un diagrama que explica el origen de una focorriente saliente después de quese separó la vesícula en la pipeta. Las flechas muestran el encendido y apagado de la luz (segúnBulychev et al, 1992).
La idea que en el momento se tema era de que la transferencia de electrones
fotoinducida en la membrana fotosintética produce el bombeo activo de H” hacia el
interior del lumen tilacoideo produciendo un gradiente de pH a través de la membrana,
gradiente que activa una ATPasa translocadora de protones para la síntesis de ATP,
37
mientras que la alcalinización del estroma es necesario para la activación de enzimas
importantes en el ciclo de fijación de CO2 (Junge y Jakson, 1982; Heldt et al, 1973; Baler
y Latzko, 1975).
En resumen, al momento de iniciar este trabajo la formación del gradiente
electroquímico para protones a través de la membrana tilacoidea en presencia de luz ha
sido explorado previamente por diferentes métodos indirectos incluyendo mediciones con
colorantes sensitivos a pH y a potenciales eléctricos (Auslander y Jung, 1974;
Schuurmans et al, 1978), el monitoreo de cambios de absorbaucia electrocrómicos de
pigmentos fotosintéticos a 515 nm (Junge y Jakson, 1982) y mediciones de intensidad de
fluorescencia desfasada (Bulychev et al, 1985). El registro directo mediante técnicas de
microelectrodo (Bulychev et al, 1972; 1976; 1985; Vrendenberg, 1976; RemiS et al, 1986)
solo había sido posible en dos especies de plantas, la Peperomia metallica y Anthoceros
sp., las cuales tienen cloroplastos anormalmente grandes. Recientemente Bulychev y
colaboradores (1992) demostraron la aplicabilidad de la técnica standard de “patch-
clamp” en la medición de la transferencia electrónica inducida por luz a través de la
membrana fotosintética de Peperomia metallica. La ventaja del método de “patch-clamp”
es la posibilidad de trabajar con objetos pequeños, en el rango de unos cuantos Pm y se ha
empleado con éxito en el estudio de canales iónicos en la cubierta de cloroplastos intactos
del alga Charophyte, Nitellopsis obtusa (Pottosin, 1992; 1993).
Igualmente, la actividad de los canales de la cubierta del cloroplasto también ha
sido investigada en diferentes sistemas reconstituidos (Flügge y Benz, 1984; Keller et al,
1988; Wang et al, 1993; Mi et al, 1994). Hasta antes de realizar este trabajo, no pudimos
conseguir ningún reporte sobre el uso de la técnica de “patch clamp” con este propósito
en cloroplastos de plantas vasculares.
38
Dado lo anterior consideramos que podía resultar productivo aplïcar la técnica de
“patch clamp” tanto para registrar fotocorrientes como la actividad de canales en
cloroplastos de plantas vasculares cuyo tamaño es menor al de las especies hasta ahora
estudiadas.
39
1.3 OBJETIVO
En este trabajo exploramos la aplicación de la técnica de “patch-clamp” para
estudiar los fenómenos electrofisiológicos de canales iónicos en la cubierta de
cloroplastos y corrientes fotoinducidas en la membrana tilacoidea en cloroplastos intactos
obtenidos de hojas de las plantas vasculares C4 Amaranthus hibridus y Zea mayz.
40
EQUIPO, MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
2.1 EQUIPO DE EXPERIMENTACIÓN Y REGISTRO
Para realizar los experimentos se utilizó un “set” que incluyó: un microscopio
Nikon DIAPHOT-TMD, un amplificador electrónico de bajo ruido (descrito en el
siguiente párrafo), un sistema de iluminación con fibra óptica, el cuerpo de una cámara
Minolta XG-1, y una jaula de Faraday (ver Fig. 2.1). Además se utilizaron un
estirapipetas y una microforja para la fabricación de las pipetas utilizadas en los
experimentos.
El amplificador electrónico usado fue construido por Gilberto Ornelas
(CUICBAS, Universidad de Colima) y Carlos Onetti (CUIB, Universidad de Colima)
según el diseño descrito por F.J. Sigworth en “Electronic Design at the Patch Clamp” (en:
Single Channel Recording, B. Sackmann y E. Neher, eds; Plenum Press, 1983).
También se utilizaron una computadora y un osciloscopio para registro de
respuestas a los estímulos aplicados a las membranas, y una cámara tipo polaroid para
tomar fotografías de los registros en la pantalla del osciloscopio.
4 1
Punta de prueba
Amplificador
Fuente de iluminación
Fibra óptica
Fig. 2.1 “Set” utilizado para los experimentos realizados en este trabajo. Todo el conjunto, con excepciónde la fuente de luz y el amplificador, va dentro de una jaula de Faraday, a su vez cubierta con tela obscurapara control de la luz. La fibra óptica permite llevar la luz desde la fuente de iluminación hasta la cámaraque controla la duración de los pulsos de luz.
42
La computadora fue utilizada además para controlar los patrones de voltaje
utilizados en los experimentos. En la Figura 2.2 se muestra un diagrama de bloques para
las conexiones entre las partes del equipo relacionadas con el registro de repuestas y el
control de estímulos.
PIPETA YELECTRODO
ELECT& & l0sc.lDEL BAiiO
Fig. 2.2 Diagrama de bloques representando lasconexiones entre los diferentes equipos relacionadoscon el registro de respuestas y control de estímulos.
2.2 PREPARACIÓN
Las plantas de las que se obtuvieron las hojas utilizadas para la experimentación
fueron plantas silvestres para el caso del Amaranthus hybridus, mientras que para Zea
mays se recurrió a plantas de los maizales cercanos al laboratorio (aunque al principio se
cultivaron ambas plantas, fueron mas las dificultades que las ventajas en hacerlo). Las
hojas se recolectaron por la mañana y se mantuvieron a 4 “C a lo largo del día, evitando
de esa manera la formación de almidón.
Después de la recolección de las hojas, el paso siguiente fue el aislamiento de los
cloroplastos a utilizar en los experimentos. Se probaron varios métodos para aislar
cloroplastos, incluyendo algunos que implicaban un proceso de centrifugado. Finalmente
43
llegamos a determinar un procedimiento mecánico muy sencillo descrito por Bulychev et
al (1972): se colocan trozos de hoja en una solución similar a la descrita en la Tabla 2.1,
retirando cuidadosamente la cutícula con una navaja; luego se raspa, con mucha suavidad,
el tejido descubierto para romper las células y liberar los cloroplastos en la solución.
Cuando se realiza la operación con suficiente cuidado no queda mayor cantidad de
residuos, pero si sucediera así, la solución con cloroplastos se filtra en gasa triple, y
posteriormente se transfiere una porción de la misma a la cámara experimental que
previamente se llena con una solución similar a la usada para el aislamiento.
Tabla 2.1 Solución Aisladora
KCl 5 0 . 0 mM
Sorbito1 250 .0 mM
EGTA 0 . 5 mM
HEPES-KOH 5.0 mM
pH=7.2
Para nuestros experimento se escogieron cloroplastos intactos de 10-l 5 Pm. La
observación al microscopio nos mostró que estos cloroplastos son de aproximadamente el
doble del tamaño medio y se encuentran localizados generalmente en las células de la
vaina.
44
2.3 MICROELECTRODOS
Los microelectrodos se hicieron tanto de vidrio suave (hematocrito) como de
vidrio duro (7052 AM-system) por jalón en dos pasos. Los electrodos hechos de vidrio
suave requirieron en general de un pulido adicional por calor. Las pipetas se llenaron con
una solución filtrada a 0.2 Pm compuesta según lo indicado en la tabla 2.2. Después de la
inserción del electrodo de “patch” en la solución, el potencial de unión se corrigió
mediante la electrónica del amplificador, y se verificó al final del experimento por
interrupción del “patch” (alteración menor a f2 mV).
Tabla 2.2 Solución de Pipeta
KCl 100 .0 mM
EGTA 0 . 5 n-M
CaCI 1.5 mM
HEPES-KOH 5 .0 mM
2.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Los registros exitosos (n=142) se obtuvieron con electrodos que en promedio
tuvieron una resistencia de ll Mo. En la mayoría de los casos (82% de los registros
exitosos), el vidrio suave mostró mejor adherencia a la cubierta del cloroplasto. Para los
registros de canal iónico se usó la técnica standard de “patch-clamp” en las
45
configuraciones “attached” e “inside-out”. El rompimiento secuencial de las membranas
externa e interna del cloroplasto y de la membrana tilacoidea dio acceso al lumen
tilacoideo haciendo posible la medición y registro de la transferencia fotoactivada de
protones a través de la membrana tilacoidea; la configuración correspondiente de registro
se consideró similar a “wholecell”.
Las fotocorrientes se indujeron mediante pulsos cortos de flash cuya intensidad
lurnínica máxima medida en el lugar de la muestra fue E=1388 W/m2, y cuya anchura, a
la mitad de la altura, fue de 1 ms; o mediante pulsos largos de luz blanca continua, con
una intensidad lumínica, medida también en el lugar de la muestra, E=8.2 W/m2. La luz
para los pulsos largos se generó en una fuente de luz Dolar-r-Janner del tipo Fiber-Lite,
modelo 170-D, (con una lampara de cuarzo-halógeno) y se llevó hasta la entrada del
microscopio mediante un cable de fibra óptica de 90 cm (36 pulgadas) de longitud. A la
entrada del microscopio se colocó una cámara para controlar la duración de los pulsos. La
duración de los estímulos de luz continua varió entre 1 y 1000 ms, y se determinó
mediante el control de exposición y el disparador del cuerpo de una cámara Minolta XG-
1 (ver Fig. 2.1).
La medición de la intensidad del flash o del pulso luminoso se hizo utilizando una
fotocelda conectada a un amplificador construido por Arturo Gonzalez (CGIC,
Universidad de Colima) y cuya respuesta en longitud de onda se caracterizó en el
Laboratorio Nacional de la Energía Solar y se corroboró en el Instituto de Materiales,
ambos de la UNAM.
La intensidad, tanto del flash como de la luz continua, se redujo mediante una
serie de filtros oscuros neutros (ND2 y ND4). De este modo se determinó que cuando la
intensidad del flash se redujo a un 6.5 % de la máxima intensidad (en un experimento de
46
tres eventos, n=3, y una desviación estandar S.E.=1.3 %) la corrieñte medida en la
membrana tilacoidea como respuesta a ese estímulo fue el 90% de la respuesta máxima,
garantizando así que el estímulo estaba más allá del nivel de saturación.
Todos los voltajes que se reportan están referidos al interior del cloroplasto y las
corrientes negativas significan el movimiento de cargas positivas al interior del mismo.
Los registros se filtraron a 1 KHz, se digitalizaron, se almacenaron en disco duro, ylo se
desplegaron en la pantalla del osciloscopio de donde se fotografiaban.
2.5 EXTENSIÓN DE LA MEMBRANA TILACOIDE
Con el fin de estimar la extensión de la membrana tilacoidea de los cloroplastos
usados en los experimentos se obtuvieron blebs (membranas tilacoideas infladas) por un
procedimiento similar al reportado en: Schönknecht et al, (1988). Los cloroplastos, que se
aislaron según el procedimiento descrito antes, se sometieron a un esfuerzo osmótico para
romper la cubierta. Los blebs empiezan a aparecer aproximadamente 15 minutos después
de que los cloroplastos se aislan en una solución preparada según se indica en la tabla 2.3.
La medición del diámetro de los blebs se realiza 15 minutos después de que se observa el
primer bleb.
Tabla 2.3 Solución para obtener blebs
KCl 20.0 mM:
MgCl 5.0 mM:
Trizma 10.0 mM
~H=7.2
47
CANALES IONICOS
3.1 INTRODUCCIÓN
Los primeros experimentos realizados estuvieron orientados a explorar la
aplicación de la técnica de “patch clamp” registrando macrocorrientes y probando
diferentes soluciones.
Una fase importante del procedimiento fue la obtención de cloroplastos con
membrana limpia, el acercamiento a los mismos y el contacto con la membrana externa.
A continuación se describen los resultados en cuanto a registros de corrientes a nivel de
canal único.
3.2 RESULTADOS
Después del acercamiento al cloroplasto con el microelectrodo el sello se logró,
por lo general, en dos fases:
48
Fase l.- Después de la aplicación de una succión ligera la resistencia se
incrementaba hasta SO-100 MQ.
Fase 2.- La resistencia se elevaba espontáneamente hasta 0.5-10 GQ alcanzando
ahí un nivel sostenido.
En la segunda fase, la aplicación de un potencial “holding” positivo (= 30 mV) o
un pulso de succión ayudaba en muchos casos a mejorar la resistencia.
No todos los intentos de registro de canal (después de obtener el sello) fueron
exitosos. El porcentaje de éxito en el registro de actividad de canales únicos en
membranas intactas de plantas de Amaranthus hybridus de 4-5 semanas de edad fue de
alrededor del 20%.
Al realizar excisión del “patch” no se observaron cambios significativos en la
actividad de los canales, y los “patches inside-out” fueron generalmente estables a menos
que se aplicaran pulsos de potencial negativo relativamente grandes (< -30 mV).
En la Figura 3.1 se muestran registros típicos de actividad del canal detectado.
En la Fig. 3.2 se muestra un ejemplo de canal único a diferentes potenciales
obtenido en Amaranthus hybridus. En este registro se observa que ademas del estado
abierto existen subestados con una amplitud de corriente de menor tamaño y que
corresponden a una conductancia de aproximadamente 130 PS.
4 9
Fig.3.1 Enseguida se muestran algunos registros típicos de canales iónicos en membrana de Amaranthushibridus. En cada caso se da el potencial de membrana utilizado para ese registro en paiticular. Al final delregistro se da la escala temporal y la escala para la corriente.
Registro realizado a un potencial de 40 mV.
50
3072 0 15
100 ms110 pA
51
Registro realizado a un potencial de 0 mV.
52
5120 0 lls
100 ms1 I20pA
53
Registro realizado a un potencial de - 10 mV.
0 ms
1
54
5 1 2 0 0 "5
6144 0 ms
!168 0 ms
8 1 9 2 0 .5
9 2 1 6 0 m
.
Registro realizado a un potencial de-30 mV.
256 OO ms
56
20 ms
30 pA
40 mV
0
C
2 0 m V
C
0 #Mp~
OmV
C
0
B5?L-
250 ms
2 0 m V
Fig. 3.2 Registro de actividad de canal iónico encloroplastos de Amaranthus hybridus. 0 y C correspondena los estados totalmente abierto y totalmente cerradorespectivamente. Las flechas indican los estados de bajaconductancia.
Se encontró que la frecuencia de aparición del estado abierto disminuye
irreversiblemente con tiempos largos de incubación, pero los subestados de 130 pS en
100/50 mM KCl se mantienen estables en el tiempo. Una cinética similar se obtuvo
cuando el potencial se elevó a valores positivos grandes (~40 mV), observándose que
cuando el voltaje retornó a valores bajos había una recuperación lenta (en segundos) de la
cinética original. Los pulsos de potencial a valores negativos tienen en general un efecto
menor, pero se registró un incremento en el ruido de la corriente en estado abierto (Ver
Fig. 3.2).
PA
5 8
Fig. 3.3 Gráfico W para el estado abierto del canal de Amaranthus.Las medias se obtuvieron promediando los datos de 10 muestras. Lasbarras indican el error estandard. La línea sólida es un ajuste de losdatos según un polinomio de bajo orden. La solución en la pipeta de“patch” contenía 100 mM KCl mientras que la solución del bafíocontenía 50 m KCl. El potencial de Nemst para K’, bajo lascondiciones dadas, fue de +17 mV. El potencial de inversión fue de +
7.8 mV, indicando una selectividad débil de K+ sobre Cl-.El signo devoltaje definido como positivo corresponde al lado interno delcloroplasto con referencia al ba?io. La corriente corresponde a laafllwncia caticinica hacia el clnronlxto
Con el fin de calcular la selectividad del canal se analizó la relación corrientehol-
taje (IN) del canal en estado abierto en un gradiente 100/50 mM KCl (Fig. 3.3). El
potencial de inversión de la curva, Vr, calculado mediante la ecuación Goldman-
Hodgkin-Katz, fue 7.8+1.4 mV (n=lO), lo que implica poca selectividad de K+ sobre Cl-:
PK+ / PC,- = 2.94. Se observa una ligera rectificación de la curva UV lo que probablemente
tiene que ver con un flujo catiónico mayor desde el lado con mayor concentración salina.
Mediante regresión lineal se obtuvo una conductancia principal de 73Ok40 pS para el
estado abierto en fas condiciones íchicas indicadas.
59
Con los cloroplastos de maíz nunca logramos una resistencia de’sello >lOO MR.
Estos cloroplastos mostraron generalmente muy poca adhesión a la pipeta de patch, y en
la mayor parte de los casos fuimos incapaces de succionar suficiente área de cubierta
cloroplástica dentro del electrodo como para mejorar el sello (al menos la resistencia de
<cl
3 Lc250 ms
Fig. 3.4 Registro de la actividad de un canal iónico en Zeamuys. 0 y C corresponden a los estados completamenteabierto y cerrado respectivamente. La flecha indica el estadode baja conductancia del canal.
fuga y el artefacto capacitivo permanecieron sin cambio durante el pulso de succión).
Finalmente, la aplicación de un pulso de succión muy fuerte provocó el rompimiento de
la cubierta y la lisis del plástido. Sin embargo, en 3 intentos, de entre más de 100,
pudimos detectar actividad de canal único con una baja resistencia de sello (50-100 MR).
En la Fig. 3.4 se muestra un ejemplo del registro hecho a OV. Los resultados sugieren que
estos dos canales tienen conductividad y selectividad similares, pero no pudimos
60
comprobarlo de manera definitiva pues las corriente iónicas en los cloróplastos de maíz
solo se pudieron estudiar en un rango limitado de voltajes cercanos a cero.
3.3 DISCUSION
El canal catiónico de alta conductancia que se describe en nuestro trabajo tiene un
comportamiento que se asemeja mucho al comportamiento del canal catiónico de 1 nS
(en solución simétrica de 100 mM KCl) encontrado en cloroplastos de N. obtusa
(Pottosin, 1992), aunque con una razón menor de permeabilidad JS+/Cl- (2.8 comparado
con 4.6 para el canal de 1 nS) y una menor conductancia (730 pS en 100/50 mM KCl
comparado con 1016 pS en 100 rnM KCl simétrica), consecuencia probable de la menor
concentración salina. Ambos canales se mantuvieron principalmente en estado abierto
para voltajes negativos (respecto al interior del cloroplasto), mientras que a potenciales
positivos cambian a estados de conductividad menores. En la Figura 3.5 se muestran
simultáneamente las curvas de conductancia promedio en el tiempo como una función del
potencial de membrana para los canales de la cubierta de cloroplastos de N. obtusa
obtenidos por Pottosin (1992) y de Amaranthus según nuestros resultados; se observa un
patrón similar lo que puede implicar que esos canales podrían ser un componente
obligatorio de la cubierta de cloroplastos estudiados in situ. Esto favorecería el influjo de
cationes en el cloroplasto a través del canal el cual estaría localizado en membrana
interna de la cubierta del cloroplasto.
La conductancia del canal catiónico de 730 pS que se describe en este trabajo
tiene una conductancia muy similar al de el canal de 720 pS (100 mM KCl en la fase
acuosa) reportado por Flügge y Benz (1984) en la membrana externa del cloroplasto de
espinaca; resultados obtenidos mediante técnicas de reconstitución en bicapas lípidas. La
conductancia de este canal resultó ser una función de la concentración de KCl (a una
61
concentración de 10 mM la conductancia fue de 80 PS, mientras que para 1 M fue de
7000 PS), pero no fue completamente descrito por los autores por lo que no se podría
aventurar alguna semejanza más allá de la coincidencia en al conductancia y de que se
encuentra en la misma región de estudio.
Thaler y colaboradores (1992) usando microelectrodos ión-selectivos realizaron
mediciones de la actividad de Cl- y H+ en el citoplasma de células vegetales
(Ermosphaera viridis) obteniendo resultados que mostraron que aproximadamente la
mitad del H+ que entra al cloroplasto cuando la célula fue expuesta a iluminación se
compensa eléctricamente por una entrada de aniones; el resto de la compensación debe
ser realizada por una salida de cationes. Seguramente el canal catiónico descrito en este
trabajo es parte de ese mecanismo de compensación. Schönknecht y colaboradores (1992)
proponen un diagrama del sistema de flujos iónicos que se activa cuando actúan los
mecanismos fotosensibles en la membrana tilacoidea del cloroplasto (ver Figura 3.4a).
’ /f LumenII Tilacoideo [H+]II: M e m b r a n a [Cat.‘]j, ) [Cat.+ 1 t .I Tilacoidea
3 r’ Cubierta
Citoplasma
[H+llW-IJ -
[Cat.‘]t
r‘lasmalema
Y
Célula Vegetal
Figura 2.4a c’n modelo para los flujos de H’ y Cl- depenaientes de luz. Durante la iluminación el flujo de H’activado por luz a traves de la membrana tilacoidea es en parte eléctricamente compensado por un flujo paralelo deCl a través de un canal de cloro dependiente de voltaje en la membrana tilacoidea. Esto da origen a cambios en laactividad de W y Cl en el estroma. Las observaciones hechas por los autores (Schönknecht et al, 1992) evidencianque !a mismp asctividad SC transmite hasta el citoplasma y que es compensada, al menos en parte, por flujos de H’y Cl a través de la cubierta. El resto del flujo cationico compensatorio se debe probablemente a K+ o Mg*. En laoscuridad los flujos se invierten.
62
Como se dijo previamente, el sello logrado en los experimentos reportados en esta
parte del estudio osciló entre 0.5 y 10 GQ similar a los sellos reportados por Pottosin
(1992) que oscilaron entre 3 y 10 Ga en los cloroplastos gigantes estudiados por él. Este
hecho añadido a la similitud entre las características y las conductancias de los canales
descritos por él y por nosotros nos hace suponer que la punta de nuestro electrodo estuvo
registrando un canal localizado en la membrana interna de la cubierta del cloroplasto,
aunque la configuración del sello pudo haber sido el de un sandwich con la membrana
externa en medio; en tal configuración la permeabilidad estaría limitada por la menor
conductancia de la membrana interna.
Como se desprende de los párrafos anteriores, se han reportado resultados de
estudios sobre la estructura de las membranas y sobre la estructura de los canales
realizados utilizando una variedad de técnicas, entre las que se encuentra la reconstitución
de cubiertas de cloroplasto, previamente solubilizadas con detergente, en bicapas lípidas
planas.
Estudios recientes de cubiertas de cloroplasto mediante la técnica mencionada en
el párrafo anterior han revelado canales catiónicos independientes del voltaje con una
conductancia de 120-l 80 pS (Mi et al, 1994). Estas propiedades se asemejan al
comportamiento del subestado de 130 pS del canal catiónico de alta conductancia
registrado por nosotros, y que fue el más frecuente al envejecer la preparación.
Fuks y Homblé (1995) reportan la identificación de un canal amónico
(Pcr/P~=l.6) dependiente de voltaje y de tipo porín en la membrana interna de
cloroplastos de espinaca mediante la técnica de fusión en bicapa lípida ; la conductancia
fue de 525 pS en 150 mM KCl simétricos. Después de agregar anhídrido succínico el
canal se convierte en catiónico. Este canal permanece generalmente cerrado a voltajes
63
.negativos y generalmente abierto a voltajes positivos; la probabilidad de apertura se
incrementa despues de agregado el anhídrico succínico; a -50 mV y 60 mV el canal
presenta un subestados de aproximadamente 260 PS. La conductividad del canal es
dependiente de la concentración de KCl, siendo para el caso de 100 mM KCI de
aproximadamente 349 pS (entre AO y +40 mV)
También se ha propuesto que un canal multiestado de gran conductancia (G=l - 1.3
nS) existente en la membrana interna de la mitocondria de y características similares al
l0
U
0 I I I I- 6 0 - 4 0 - 2 0 0 20 40 6 0 so
POTENCIAL DE MEMBRANA, mV
Fig.3.5 Gráfica de las conductancias, promediadas en el tiempo, paralos canales catiónicos en la envoltura de cloroplastos de Nitellopsisobtusa y Amaranthus hybridus. La conductancia de los canales enNitellopsis fue de 1020 pS (1 OO/ 1 OO mM KCl) y de 720 pS (1 lo/50 mMKCI) en Amaranthus. Cada punto representa la corriente del canal,promediada a partir de registros de 1 O- 15 s a un potencial dado, tomadacon relación a la amplitud máxima de la corriente de canal al mismopotencial. los símbolos llenos y los vacíos corresponden a muestrasdiferentes. 0, W: Nitellopsis. 0, Cl:: Amaranthus.
subestado de 130 pS reportado en este trabajo; estaría formado por un cierto numero de
poros en la membrana interna y un poro grande en la membrana externa (Kinnally et al,
1992). Esta estructura hipotética implica uu cierto grado de flexibilidad, con una variedad
64
de niveles de conductancia dependientes de la integridad del sitio de contacto. Un modelo
similar resulta atractivo como una explicación para el patrón de cambios de conductancia
en el canal catiónico tanto en preparaciones avejentadas como en sistemas reconstituidos
65
CORRIENTES FOTOINDUCIDAS
4.1 RESULTADOS
4.1.1 Resultados generales.
La formación inicial de un contacto con la cubierta del cloroplasto, sello de 50-
100 MQ no necesariamente daba lugar a un incremento posterior de la resistencia en la
forma descrita en la sección de resultados en canales iónicos. En muchos casos la
resistencia decrecía espontáneamente hasta 20-50 Mn. Este cambio iba acompañado por
un incremento en el artefacto capacitivo, fenómeno que interpretamos como indicativo de
Fig. 4.1 Forma en se cree que se accede al interior del cloroplasto y se succiona la membrana tilacoidea,entrando ésta al interior de la pipeta.
66
que se daba un rompimiento de la cubierta del cloroplasto y del acceso de la pipeta al
interior del mismo (estroma), como se muestra en la Fig. 4.1. En esta etapa todavía no se
podía registrar ninguna fotocorriente, pero la aplicación de succión adicional producía
una respuesta a la luz con dirección positiva (Figs. 4.2 y 4.3). Posteriormente, se aplicaba
un pulso de succión intenso y corto que causaba una inversión en la polaridad de la
fotocorriente (Fig. 4.2). La magnitud de la corriente disminuía usualmente de 2 a 3 veces
en los primeros minutos de registro, pero se podían registrar de modo típico respuestas de
magnitud similar a las mostradas en la Figs. 4.4 y 4.6A-E por lapsos de tiempo mayores
(30 a 90 min.).
En los cloroplastos de plantas de edad avanzada (8 a 10 semanas), generalmente
se observaron fotocorrientes más estables, pero en ocasiones se dificultaba invertir la
polaridad; se requerían grandes pulsos de voltaje (50-100 mV) acompañados de succión
fuerte para facilitar la inversión. Con cloroplastos de maíz solo se pudieron obtener unos
cuantos registros (Fig. 4.3); las fotocorrientes fueron mucho más pequeñas en magnitud
que las obtenidas con Amaranthus y no pudimos invertir la corriente ni con voltajes altos
ni mediante la aplicación de succión fuerte.
Para el análisis solo se utilizaron fotocorrientes hacia el interior en cloroplastos de
Amaranthus debido a que esta configuración fue la más estable en el tiempo, pues para
corrientes positivas la polaridad se invertía, generalmente, de manera espontánea en los
primeros minutos. En la figura 4.2a se muestran varios registros con los detalles en que se
llevaron a cabo.
67
Fig. 4.2 Diferentes respuestas al estímulo lumínico para el mismo cloroplasto de Amaranthus hybridus:(a) y (b) antes, (c) y (d) después del rompimiento de la membrana tilacoide mediante un pulso desucción corto. (a) y (c) son respuestas a flash saturante, (b) y (d) lo son a luz continua. Las flechasindican encendido y apagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.
6 8
Fig. 4.2a Registros de fotocorrientes. Al pie de cada fotografía se dan detalles de las condiciones
en que fueron efectuados.
i. - Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de -14 mV, provocada por un pulso deluz regulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 500 mshiiv. y unaescala de corriente de 2OpMdiv.
ii.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un pulso deluz regulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 msIdiv. y una escalade corriente de 2OpA/div.
iii.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un pulso deluz regulado por una cámara fotogr@ca, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escalade corriente de 20 pA/div. El registro se tomó de un cloroplasto redondo y pequeño (aproximadamente7pm). En este registro es clara una inversión de la corriente.
6 9
iv- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 5 mV, provocada por un pulso deluz regulado por una dmara fotográfìca, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escalade corriente de 20 pkfiv. El registro se tomo de un cloroplasto redondo y pequeño (aproximadamente7wJ.
5 f
v.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un flash yregistrada con una escala temporal de 100 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div. El registro setomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente 10~
I:.
/’ .,>,
:
vi. - Registro de fotocom’ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por una serie desiete Jhshes. Registrados sobreimpuestos en la misma pantalla con una escala temporal de 1 OO ms/div. yuna escala de comente de 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamenteIOF
7 0
vii.- Registro de fotocom’ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, por un pulso de luz reguladopor una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corrientede 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente IOptn El registro serealizó después de 13 min de adaptación a la oscuridad
viii.- Registro de fotocom.ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, por un pulso de luzregulado por una cámara fotográjica, y registrada con una escala temporal de 500 ms/div. y una escalade corriente de 2OpAIdiv El registro se tomd de un cloroplasto redondo de aproximadamente IOpm. Elregistro se realizó después de 3 min de adaptacih a la oscuridad
ix.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generaso por un pulso de luzregulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala decorriente de 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente 1 Oprn
7 1
x.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generada por un flash, yregistrada con una escala temporal de 20 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div El registro se tomó deun cloroplasto redondo, achatado en unpolo, y de aproximada-mente 10,u.m Hubo unintervalo de oscuridadde 9 minutos entre el primer trazo y los úliimos.
xi.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un flash elprimer trazo y un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica el segundo; y registrada con una escalatemporal de 20 ms/div el primero y 100 m.&div. el segundo, y una escala de corriente de 20 pMdiv. paraambos.
xii- Registro de fotocotiente con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un pulso de luzregulado por una cámara fotográfka, y registrado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala decorriente de 20 pA/div
72
xiii.- Registro de /òtocorriente con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un pulso de luzregulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de .corriente de IOpA/div. Interesante corte en la cinética al interrumpir el pulso de luz
xiv. - Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV, generado porjlash y registrado con unaescala temporal de 100 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div . Después del primer flash pasaronalgunos minutos de incubación y luego se aplicó succión.
xx- Potencial de membrana: 0 mV. El primero y último trazos generados porflash y el ceniralporpulso. Escalatemporal de 1 OO ms/div. y de corriente de 20 pA/div.
73
xvi.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo 1 fue segundo en el tiempo,generado por un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de200 ms/div.; el trazo dos fue el primero en el tiempo y generado por por flash con una escala temporal de 50ms/div. Para ambos, una escala de corriente de 2OpA/div
xvii.- Registro de fotocom.ente con un potencial de membrana de -10 mV. El trazo 1 fue segundo en el tiempo,generado por un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de200 ms/div.; el trazo dos fue el primero en el tiempo y generado por por flash con una escala temporal de 50ms/div. Para ambos, una escala de corriente de 20 pA/div Es notable la magnitud de la fotocorriente enrespuesta al estimulo controlado por la cámara
74
xviii.- Registro de fotocom’ente con un potencial de membrana de 0 mV. Ambos trazos fueron generados porflash, pero para el primero se agregó un filtro x2. La escala temporal fue de 50 ms/ div. Y la escala decorriente fue de 20 pA/div. Es de notarse que aunque la intensidad de la luz se disminuyó a la mitad, nosucedió lo mismo con la fotocom’ente
xix.- Registro de fotocom’ente con un potencial de membrana de 0 mV. La fotocorriente fue generada conflash, habiendo agrado u filtro x2. La escala temporal fue de 50 ms/div. y la escala de corriente de 20pA/div. Es notable la magnitud de la corriente de respuesta a pesar de la exiktencia delfiltro.
75
xx- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. Generado por un flash y registradocon una escala temporal de 50 m.s/div. y una escala de corriente de 2OpA/div. Es de notarse la magnitudtan grande de la fotocorriente en respuesta alflash.
xxi.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV El trazo 1 fuegenerado por dospulso de luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar perohabiendo dejado transcurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y unaescala de corriente de 2OpAIdiv
76
xrii.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El frazo 1 fue generado por dos pulsode luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar pero habiendo dejadotranscurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corriente de2OpA/div Es de notarse que hay una diferencia en la tercer respuesta comparado con el registro xci, teniendoel mismo protocolo y el mismo cloroplasto. Sin embargo, en el registro xxiii se reproduce el xui (siendotodavía el mismo cloroplasto.
xxiii.-Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo I fue generado por dos pulsode luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar pero habiendo dejadotranscurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corriente de20 pA/div. Se reproduce muy de cerca el resultado mostrado en la figura 21 (se trata del mismo cloroplasto).
77
xxiv. -Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo 1 fue generado por un flash a50 muäiv. y 20 pA/div. El trazo dos fue generado por dos pulsos de luz regulados por una cámara fotográficaa 200 ms/div y 20 pA/div. Se dejaron pasar algunos segundos entre los dos trazos.
78
4.1.2 Cinética de las fotocorrientes: efecto de los estados previos de iluminación.
La cinética de las fotocorrientes resultó un tanto compleja: una elevación rápida,
solo parcialmente resuelta, debido a la rapidez de la misma; decaimiento bifásico en
presencia de luz hasta un estado estable; y un decaimiento posterior que se observaba en
la etapa de oscuridad. El último decaimiento estaba muy a menudo acompañado de una
pequeña inversión de la corriente, que se observaba mejor en muestras de reciente
preparación, con un decaimiento lento (en el rango de segundos) hasta el nivel inicial en
la oscuridad (Fig. 4.4).
Los parámetros de la cinética de las fotocorrientes se dan en la Tabla 4.1 y se
midieron, tanto en preparaciones adaptadas a la luz como en las adaptadas a la oscuridad,
entre 10 y 50 min después de la inserción del electrodo en el interior del tilacoide.
a
50 ms
I 20 pA
b ----n
t 200s
Fig. 4.3 Fotocorrientes en Zea muys: (a) respuesta inducida porflash, (b) respuesta a luz continua. Las flechas indican encendidoy apagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.
79
En aquellas preparaciones en las que la muestra se mantuvo en-la oscuridad un
minuto o mas, la amplitud del componente rápido (~6 ms) (estimado por el ajuste del
curso temporal a una función de doble exponencial) nunca excedía el 25% de la amplitud
máxima (ver la sección de discusión).
También encontramos que la amplitud del componente lento de la fotocorriente (z
=100 ms) así como la corriente de estado estable decreció con el envejecimiento de la
muestra (decenas de minutos). La amplitud del componente rápido también decrecía,
aunque este cambio era relativamente pequeño; en cambio, se encontró un incremento cIe
la fracción del componente rápido no adaptable -es decir, el componente rápido presente
tanto en preparaciones adaptadas a la luz como en las adaptadas a la oscuridad.
I 20 pA
Fig. 4.4 La compleja cinética de la fotocorriente en Amuranthus: componente rápida (R) y lenta (L) de larespuesta; (1) inversión de la dirección de la corriente al apagar la luz. Las flechas indican encendido yapagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.
El curso temporal de las fotorespuestas inducidas por flash se podía, en la mayor
parte de los casos, ajustar a una función monoexponencial (ver z en Tabla 4.1). Existía
80
una gran variación en z y en amplitud de muestra a muestra (l-60 ‘ms y 7-300 pA,
respectivamente). En el caso de los flashes la amplitud de la respuesta iba decreciendo
con la serie de los mismos (aplicados entre dos y tres segundos de separación), y se
restablecía en parte cuando la muestra se mantenía algunos minutos en la oscuridad. Sin
embargo, con muestras incubadas por mucho tiempo (decenas de minutos) se observó un
decremento irreversible en amplitud de las respuestas inducidas por flash así como una
aceleración en la cinética de decaimiento (algunas ocasiones multiplicado varias veces).
En consecuencia, para el análisis solo se tomó en cuenta el primer flash de cada
experimento, estimando mediante la ecuación
(4.1)
que la carga promedio equivalente transferida por flash para todos los experimentos
(n=50) fue de (3.84f0.57)xlO -13 C (donde 1 es por corriente registrada).
4.1.3 Efectos de la preiluminación sobre la cinética del transiente de corrientefotoinducida.
En la Tabla 4.1 se muestra que la magnitud de la corriente inicial de respuesta a
luz continua es diferente en un 64%, en promedio, entre cloroplastos adaptados a la
oscuridad y los preiluminados. Esto se debe a que en las preparaciones adaptadas a la
oscuridad la amplitud del componente rápido es, por lo general, menor.
8 1
Tabla 4.1. Cinética de las fotocorrientes
I
Parámetro
Media
S .E .
N. de exp.
Luz CCAmplitud de corriente de
pico @A) adaptada a:luz oscuridad
14.6 40.7
2.1 5.4
1 8 1 8
tinuaCorriente de estado
estable (PA)
7.4
0.6
35
FlashesTransiente Amplitud Tiempo de
lumínico (ms) W) decaimientoz ráp. z lento (ms)
I II
5.5 1 110.9 I 44.9 I 120.0
0.7 j 9.5 1 6.7 1 1.8 ’
lDando el segundo pulso a los OS-l.0 s después del primero, se produjo un gran
incremento en la magnitud del componente rápido (Fig. 4.9, pero la amplitud del
componente lento fue menor para el segundo pulso y la recuperación de la magnitud
original requería de varios segundos de adaptación a la oscuridad. Por otro lado, la
amplitud del componente rápido, medido a los 0.5 s del prepulso, en muestras adaptadas a
la oscuridad por lapsos de tiempo pequeños no presentaba variación notable; sin embargo,
para periodos más largos de adaptación (lo-30 s) se observó un decremento abrupto del
componente rápido (Fig. 4.6B-E). En 18 de 25 muestras mantenidas por un lapso de 30 a
60 s en la oscuridad, la amplitud del componente rápido disminuyó a menos del 25% del
máximo, e incluso, en algunos casos, desapareció. El efecto de la adaptación a la
oscuridad se estudió con detenimiento en cuatro muestras (Fig. 4.7A-B). La distribución
temporal de la amplitud mostró una forma sigmoidea, esto es, sin cambio en los primeros
lo-30 s, y una caída abrupta hasta un nivel bajo sostenido (O-20% del máximo) que
permanecía sin cambio hasta 10 min de adaptación a la oscuridad.
8 2
La fracción “no adaptable” del transiente rápido creció irreversiblemente para
tiempos muy largos de incubación (> 1 h), por tanto, el experimento se detuvo cuando
este alcanzó un nivel del 30%.
Fig. 4.5 Efecto de la preiluminación en la cinética de lafotocorriente a 0 mV. Los dos pulsos de luz de 0.25 sestán separados por un intervalo de oscuridad de 0.6 s. Lamuestra se mantuvo en la oscuridad por varios minutosantes del experimento.
Los datos experimentales se ajustan mejor a una función exponencial de potencia,
f = c+(100-C)[1-(l-e-~)“], (4.2)
que a una función monoexponencial,
f =C+(lOO-C)e$ (4.3)
(C es la fracción “no adaptable” del componente rápido máximo, expresado como
porcentaje).
Los valores de mejor ajuste para z y n fueron 16 y 3.1, respectivamente (ver Fig.
4.7A).
8 3
A causa de las variaciones de z para cada muestra, la región de transición para la
curva promedio es difusa. Como resultado, ‘ t se sobrestima mientras que n se subestima
cuando se compara con muestras particulares. Por ejemplo, para el caso mostrado en la
Fig. 4.7A, la curva de mejor ajuste se obtuvo con n=35, que es mayor que el valor 3.1
promedio, y ~=10 el cual es menor que el valor de 16 s obtenido para el mejor ajuste.
A
B
C
D
E
-J 20 pA
200 ms
Fig. 4.4 Efecto de la adaptación a la oscuridadsobre la amplitud del componente rápido de lafotocorriente. La duración en segundos delintervalo de oscuridad que precede al pulso es,en secuencia: (A) 62, (B) 8, (C) 22, (D) 26, y(E) 39.
84
4.1.4 Efecto de la duración del pulso de luz sobre la cinética del transiente decorriente fotoinducida.
Otra cuestión que surgió al estudiar los efectos de la preiluminación sobre la
cinética del transiente de corriente fotoinducidad fùe la determinación de la duración del
pulso de preiluminación necesario para producir la amplitud máxima del componente
rápido.
Encontramos que un flash saturante corto no era suficiente, al menos cuando el’
pulso de prueba de luz continua se daba entre 200 y 1000 ms después del flash (n=7).
Tampoco los pulsos de luz continua blanca intensa de duración menor a 8 ms fueron
suficientes. Por tanto, se pudo determinar la existencia de un tiempo de retardo en el
desarrollo del transiente rápido, tiempo de retardo que se pudo expresar como una
función del periodo de preiluminación (Fig. 4.8A).
En dos experimentos, de un total de cinco, se analizó más cuidadosamente la
región de transición. Para ello en cada muestra se repitieron, al menos tres veces, todos
los puntos en el intervalo en donde la amplitud del transiente rápido cambió entre 10% y
90% se repitieron al menos tres veces en cada muestra. Esto permitió un ajuste más
preciso de la dependencia observada en una curva modelo. En ambos experimentos la
función monoexponencial ofreció un ajuste insatisfactorio a los puntos, mientras que la
función exponencial de potencia del tipo
f = lOO(l-e?)” (4.4)
85
0 30 6
Tiempo de adaptación a la oscuridad (s)
Fig. 4.7 (A) Amplitud del componente rapido expresado como porcentaje del control (pulso deprueba dado a los OS-l.0 s antes) VS. duración del intervalo de oscuridad. La línea discontinua es elmejor ajuste a los datos por una funcih monoexponencial, ~40 s. La línea sólida es el mejor ajustepor una función exponencial de potencia, n=35, ~=10 s y C=25%. (B) Resultados de cuatroexperimentos independientes como el de (A). Para la función monoexponencial ~=39 s, y parafunción de potencia n=3.1,5=16 s y C=20%. Ver el texto para la explicación de los parámetros.
8 6
Duracidn del PrePa0 de luz9 nw
Fig. 4.8 Dependencia de la amplitud del componente rápido respecto de la duración delprepulso. Se usó un protocolo de tres pulsos: el priemr pulso para una preparación adaptadaa la oscuridad era de duración variable, el segundo y el tercer pulsos fueron de 250 ms cadauno. El intervalo de oscuridad entre pulsos fue de 0.5 y 1.0 s, en ese orden. La amplitud delcomponente rápido medido para el segundo pulso se tomó como una relación con elobtenido para el tercero en forma de porcentaje. A: Gráfico para un solo experimento; lasbarras so el S.E. para tres valores, la línea sólida es el mejor ajuste a una funciónexponencial de potencia, n=9.5 y 7=20 ms; la línea punteada es el mejor ajuste a unafunción monoexponencial, ~80 ms. B: Gráfico correspondiente a los resultados de citoexperimentos como el de A; el S.E. corresponde a la media a las medias obtenidas endiferentes experimentos. La interpretación de las líneas es como en Fig. 4.7A. Los valoresde los parámetros para la función exponencial de potencia y para la funciónmonoexponencial son ~=22 ms, n=1.6, y ~~33 ms, respectivamente. Ver el texto para laexplicación de los parámetros.
87
se ajustaba muy bien a los datos para n=7.8 (9.8) y T= 12 (20) ms en el primer y (segundo)
experimento, respectivamente. Cuando los datos de los cinco experimentos se juntaron se
encontró un aparente incremento en z (22 ms) y un aparente decremento en n (1.6), lo que
probablemente es el resultado de la dispersión en la región de transición por las
variaciones en las diferentes muestras.
88
4.2 DISCUSION
4.2.1 Observaciones generales.Nuestros resultados confirmaron lo habían reportado Bulychev y colaboradores
(1992) en el sentido de que la técnica de “patch-clamp” puede aplicarse al estudio de
corrientes fotoinducidas en membranas fotosintéticas.
Los mismos autores sugieren que la aplicación dé la técnica de “patch clamp”
para la medición de fotocorrientes puede ser muy general, con la posible excepción de los
cloroplastos de células de la vaina en plantas C4 avanzadas (Panicoid grasses), los que no
contienen un sistema tilacoide bien desarrollado (Coombs y Greenwood, 1976; Stahelin,
1986).
Muy de acuerdo con lo anterior, en este estudio solamente pudimos obtener unos
cuantos registros de fotocorrientes (que no pudimos invertir) en cloroplastos de Zea mays,
mientras que con cloroplastos de células de la vaina de la planta dicotiledones C4
Amaranthus hibridus que posee grana bien desarrollados (Fisher y evert, 1982), los
registros se hicieron mucho más fácilmente y de una forma bastante repetible.
Hasta donde sabemos, esta fue la primera vez que se estudiaron plantas C4 por
técnicas electrofisiológicas. Por tanto, resultó interesante encontrar una cinética
cualitativamente similar a la obtenida en los registros de Bulychev y colaboradores (1992)
89
quienes usaron cloroplastos gigantes de la planta C3 Peperomia metallica. Estos autores
compararon la cinética de las fotocorrientes obtenidas con microelectrodos
convencionales y con la técnica de “patch-clamp”, encontrando que son muy similares.
Sus resultados sugieren que la pipeta de “patch” tiene un acceso de baja resistencia al
lumen tilacoideo, y que es posible medir la transferencia electrogénica a través de la
membrana tilacoidea. Hemos confirmado esa noción verificando la secuencia de pasos,
que finalmente llevan al registro de una corriente dirigida al interior en nuestra
preparación (Fig. 4.2 y Fig. 4.3).
Hemos considerado que una fotocorriente positiva se registra en una
configuración “thylakoid attached”, mientras que lo contrario corresponde a una
configuración “whole thylakoid”. Dado que la amplitud de corriente debe ser proporcional
a la superficie de la membrana en ambas configuraciones, se hace necesario dar una
explicación a la amplitud de corriente relativamente grande registrada en la configuración
“thylakoid attached” comparada con la corriente medida en la configuración “whole
thylakoid” (Fig. 4.2 b, d).
La superficie de la membrana tilacoidea se puede medir inflando el sistema
tilacoideo en un medio hipotónico, lo que produce la formación de vesículas esféricas
grandes (blebs). Nuestros experimentos con Amaranthus mostraron blebs con un diámetro
promedio de 13.5 Pm (k1.2, n=lOO) que corresponde a un área aproximada de 573 pm2.
La fracción de la superficie de membrana jalada al interior de la pipeta se puede estimar
solo indirectamente ya que la membrana tilacoide intacta forma un sistema intensamente
doblado. La distancia entre bicapas vecinas en una pila de tilacoides es de cerca de 0.02 p
m con un diámetro promedio por pila de 0.5 Pm (Junge y Jakson, 1982). El tilacoide se
90
puede jalar hasta 10 Pm dentro de la pipeta de “patch”, según lo que podemos observar al
microscopio. Por tanto, el área de membrana en la pipeta puede ser de por lo menos 100 ~1
m2, suponiendo una sola pila de grana. Sin embargo, esto puede ser una subestimación
dado que a 10 p,rn de la punta la pipeta se hace suficientemente ancha como para que
quepan varias pilas de grana en paralelo.
Cualquier translocación de carga a través de la membrana debe ser detectada bajo
condiciones de fijación de voltaje. Las reacciones electrogénicas fotoinducidas en la
membrana fotosintética ocurren en los centros de reacción fotosintéticos de los
fotosistemas 1 y II localizados transmembranalmente (Junge y Jakson, 1982). Según el
esquema Z fotosintético simplificado (Witt, 1979; Junge y Jakson, 1982) la transferencia
de electrones fotoinducida en el centro de reacción del PSI1 resulta en la liberación de H’
al interior del lumen tilacoideo y en la reducción de moléculas de plastoquinona (PQ) que
toman H+ desde el exterior y los envían en forma electroneutra
(PQH2,plastohidroquinona) hacia el lado interno de la membrana (Esquema 1). Estos
protones son liberados con la reoxidación de PQH2 en el complejo b6f (paso limitante de
la taza de la reacción) mientras los electrones son transferidos al centro de reacción de
PSI, apoyando, por tanto, su capacidad de transferencia electrónica.
Uno puede obtener una estimación directa de la electrogénesis en los centros de
reacción de PSI y PSI1 durante una sola etapa de funcionamiento midiendo la
transferencia de carga a través de la membrana tilacoidea inducida por flash corto y
saturante de luz. El numero de centros de reacción de PSI y PSI1 es de 1200-1700 y 850-
1300 por Pm2 respectivamente (Stahelin, 1986), lo que implica 1.2-l .7x106 centros de
reacción por cada 572.6 Pm2 de superficie de membrana tilacoidea (un bleb de diámetro
de 13.5 Pm). La carga translocada por etapa de funcionamiento debe ser entonces 1%
9 1
2.7x10-13 C, que es un valor cercano al valor 3.9x10-l3 C que medimos aquí (hay que
recordar que estos cálculos son para tamaños promedio, mientras que nosotros escogemos
los cloroplastos de mayor tamaño para nuestros experimentos).
Bajo condiciones de luz continua las reacciones de transferencia electrónica en
PSI y PSII están acopladas al sitio de reoxidación de PQH2 en el complejo bgf, un paso
limitante de las reacciones de transferencia electrónica intersistemica. La taza de esta
reacción disminuye con la acumulacion de H+ en el lumen tilacoideo, con un valor típico
de 15-20 ms a pH neutro y una desaceleración lineal con un factor aproximado de 2 por
unidad de disminución de pH (Junge y Jakson, 1982; Tikhonov et al, 1984; Van Kooten
et al, 1986; Joliot et al, 1992). Suponiendo el número de fotosistemas por membrana
tilacoidea dada antes, la transferencia electrónica transmembranal implica una
fotocorriente en el rango 9.6-17.6 PA. El valor 14.6 pA para preparaciones adaptadas a la
oscuridad que hemos obtenido aquí (Tabla 4.1) se ajusta a estos límites, mientras que el
valor menor de 7.6 pA medido al final del pulso largo de luz puede ser el resultado de la
acumulación de protones en el lumen tilacoideo iluminado. De acuerdo a Junge y Jakson
(1982), tras la inserción del microelectrodo la acidificación del lumen tilacoideo no debe
ser tan elevada como en los tilacoides intactos (3-4 unidades pH). Sin embargo también
se ha medido una disminución de hasta 2 unidades pH tras el empalamiento con el
microelectrodo (RemiS et al, 1986).
4.2.2 Efectos de la Preiluminación Sobre la Cinética del Transiente de CorrienteFotoinducida
El resultado más intrigante de este estudio fue, sin duda, el efecto de
preiluminación sobre la fotocorriente. La amplitud inicial de la fotocorriente en
cloroplastos preiluminados creció transientemente por un factor de 3 (Tabla 4.1).
92
Los estudios previos de electrogénesis de PSI y PSII por separado y en serie han
mostrado que el transiente y el crecimiento rápido de la fotocorriente esta determinado
por PSI (Rêmis et al, 1981). Esto es consecuencia de un paso más rapido de
funcionamiento de PSI cuando el suministro de electrones desde el “pool” donador de
PSI, Proteina FeS Rieske, citocromo f y plastocianina (ver Esquema Z en la Fig. 4.9) no
está limitado (Junge y Jakson, 1982). Sin embargo, este “pool” se vacía después de unas
cuantas etapas de funcionamiento a causa de la existencia de un paso limitante de la
transferencia antes que él, y la rapidez de funcionamiento de PSI en estado estable debe
ser limitada por la reoxidación de PQH2. Por tanto, el componente de transiente de la
fotocorriente puede explicarse.
Pero surge la pregunta: ¿Por qué se observa transiente rápido de la fotocorriente
solamente en cloroplastos preiluminados? Las mediciones previas de fotoelectrogénesis
en cloroplastos de Peperomia en condiciones en que la transferencia de electrones entre
fotosistemas fue cortocircuitada por un aceptor de electrones externo mostró la ausencia
de un transiente rápido en cloroplastos adaptados a la oscuridad (RemiS et al, 1981).
Después de que el cloroplasto fue preiluminado el transiente rápido reapareció, siempre
que el intervalo de oscuridad después de la preiluminación fuese corto. Esto se interpretó
como una fotoreducción parcial de los donadores de PSI. Pensamos que el efecto de la
preiluminación sobre las fotocorrientes en los cloroplastos de Amaranthus tiene el mismo
origen.
Los gráficos en Figs. 4 y 5 muestran que la magnitud del transiente rápido
depende tanto del intervalo de oscuridad entre pulsos como de la duración del prepulso de
luz. La dependencia de la duración del prepulso de iluminación correlaciona bien con el
curso temporal de la fotorreducción del “~001” de PQ bajo luz saturante (Joliot et al,
93
1992). Se ha encontrado que la reoxidación del pool redox intersistémico completo es un
proceso de pseudo-primer orden con un tiempo característico de alrededor de 25 s
(Renger y Schulze, 1985). La dependencia de la amplitud del transiente rápido, como
función de la duración del intervalo de oscuridad se ajustó mediante una función
exponencial de potencia con un tiempo característico de 16 s, cercano al valor anterior
(25s) (Fig. 4). La reducción por PQH2 (plastohidroquinona) de los donadores de PSI es
termodinámicamente favorable y ocurre tanto en presencia de luz como en la oscuridad.
Por lo tanto, la oxidación de los donadores de PSI en la oscuridad debería verse
solamente hasta después de la reoxidación completa de PQH2, lo que explicaría el retraso
observado en el curso temporal presentado en la Fig. 4. Debido a la gran variación en el
valor del parámetro n, de 3 a 35, no podemos hacer ninguna comparación directa sobre el
tamaño del “pool” de PQ. Sin embargo, por lo menos, el valor de 12 equivalentes por PSI1
reportado por otros autores (Joliot et al, 1992) se encuentra en este rango.
94
1. - - 4
H l H I
ESTROMA l
7‘0 ’2 2
&e'
LUMEN
‘ADPH
3
Fig. 4.9 Esquema-Z de la fotosínteis. Los pasos electrogénicos se marcan con flechas huecas (movimiento de cargas f).PQ/PQH2 es por plastoquinona/plastoquinol. PC es por plastocianina. FeS es por proteina de Rieske. Cyt f es porcitocromo f. Los donantes primarios de PSI y PSII se designan como P,OO y PssO. Fd es ferredoxina y A es un aceptor.
95
5CONCLUSIONES
5.1 INTRODUCCIÓN
En este trabajo se estudió el uso de la técnica de “patch clamp” para estudiar dos
aspectos del cloroplasto, a saber, canales iónicos en la cubierta del mismo, y las corrientes
fotoinducidas a través de la membrana tilacoidea. Por claridad las discusiones se
realizaron por separado al reportar los resultado del estudio de cada aspecto en las
secciones correspondientes. En este capítulo se enumeran las conclusiones generales de
este trabajo.
5.2 CONCLUSIONES
l.- Se elaboró una técnica para registro de canales iónicos y corrientes fotoinducidas en
las membranas de cloroplastos de plantas verdes.
2.- Se determinó la existencia de un canal grande en la cubierta del cloroplasto, el cual
parece ser un acompañante obligado en los cloroplastos de plantas verdes.
3.- Con equipo y técnicas de “patch clamp” se mostraron directamente eventos
electrogénicos por el transporte de electrones entre PI y PI1 en membrana tilacoidea.
4.- Se mostró evidencia de regulación del transporte de electrones entre los fotosistemas 1
y II, transporte que es dependiente del estado REDOX del pool de quinona. La existencia
de un pool de quinona reducida inplica la existencia de un componente rápido en la
fotocorriente.
96
REFERENCIAS .
Auslander, W., y Junge W-(1974). Biochim. Biophys. Acta 357,285298.
Andréasson, L.-E. y Vänngard, T. (1988) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mal. Biol. 39,
379-411.
Andrianov, V.K., Svintitskikh, V.A., Sineshchecov, O.A., y Rubin, A.B. (1982) Doklady
Akademii Nauk U.S.S.R., 266,758-761.
Baler, D., y Latzko E. (1975). Biochim. Biophys. Acta 396, 141-148.
Beck, W.F. y dePaula, J.C. (1989) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 18 25-46.
Brudvig, G.W. (1991) Acc. Chem. Res., 24,311-316.
Bulychev, A.A., Andrianov, V.K., Kurella, G.A., y Litvin, F.F. (1972). Nature 236, 175
177.
Bulychev, A.A., Andrianov, V.K., Kurella, G.A., y Litvin, F.F. (1976). Biochim. Biophys.
Acta 420,336-35 1.
Bulychev, A.A., Vrenderberg, W.J., (1976) Biochi. Biophys. Acta, 449 48-58.
Bulychev, A.A., Andrianov, y V.K, Kurella, G.A. (1980) Biochimica et Biophysica Acta,
590,300-308
97
Bulychev, A.A., Niyazova, M.M., y Turovetsky, V.B. (1985). Biochim. Biophys. Acta
808, 186-191.
Bulychev A.A., Antonov V.F. y Schevchenko, E.V. (1992). Biochim. Biophys. Acta 1099,
16-24.
Coombs, J. y Greenwood, A.D. (1976). In The Intact Chloroplast: Compartmentation of
the Photosynthesis (J. Barber, ed.), Elsevier, Amsterdam-NY-Oxford, pp. l-52.
Chance, B. Crofts, A.R., Nisimura, N., y Price, B., Europ. J. Biochemi., 13,364, (1970)
Duysens LNM, Sweers HE (1963). Mechanism of the two photochemical reactions in
algae as studied by means offluorescence. In: Studies on microalgae and photosynthetic
bacteria. University of Tokyo Press, Tokuo, pp 353-372.
Fisher, D.G. y Evert, R.F. (1982). Bot. Gazette, 143, 146-155.
Fuks, B. y Homblé, F. (1995). The Journal of Biological Chemistry, 270, 17,9947-9952.
Fhigge, U.I. y Benz, R. (1984). FEBS Lett. 169, 85-89.
Ghirardi, M.L., y Melis A. (1983). Arch. Biochem. Biophys. 224, 19-28.
Green, Beverley R., Pichersky, Eran y Kloppstech, KIaus (1991) Tren& in Biochemical
Sciences 16/5, 181-186.
98
Heber, U., Neimanis, S., Siebke, K., Schönknecht, G. y Katona, E. (1992) Photosynthesis
Res. 34 436-447.
Heldt, H.W., Werdan, K., Milovancev M., y Geller G. (1973). Biochim. Biophys. Acta
314,224-241.
Hind, G., Nakatami, H.Y. e Izawa, S., (1974) Proc. Natl. Atad. Sci USA 71, 1484-1488.
Holzwarth, Alfred R. (1993). Biophys. J 64, 1280- 128 1.
Izawa, S., y Hind, G. (1967) Biochim. Biophys. Acta., 143,377.
Joliot, P., Lavergne, J., y Beal, D. (1992). Biochim. Biophys. Acta 1101, 1-12.
Junge, W., y Jakson, B. (1982). En Photosynthesis: Energy Conversion by Plants and
Bacteria. Vol. 1: The development of electrochemical potential gradients across
photosynthetic membranes. (Govindjee, ed.), Academic Press, NY, pp. 589-646.
Kautsky H., Appel W., Amann H. (1960). Biochem Z. 332,277-292.
Keller, B. U., Hedrich, R., Vaz, W.L.C., y Criado, M. (1988). PjZuegers Arch. 411, 94-
100.
Kinnally, K.W., Antonenko, Yu. N., y Zorov, D.B. (1992). J. Bionerg. Biomembr. 24, 99-
110.
Knoetzel, J., Svendsen, 1. y Simpson, D.J. (1992) Eur. J. Biochem. 206,209-215.
99
.
Krause, G.H. y Weis, E.. (1991) Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42,313-349
Kiihlbrandt, Werner, Wang, Da Neng y Fujiyoshi, Yoshinori (1994) Nature 367,6 14-62 1.
Laza, R., Bergman, B., y Vergara, B. (1993) Journal of Experimental Botany 441268,
1643-1648.
Mi, F., Peters, S.J., y Berkowitz, G.A. (1994) Plant Physiol. 105, 955-964.
Mitchel, P., (1961), Nature, 191, 144-148.
Mitchel, P., (1966), Biol. Rev., 41,445-502.
Mitchel, P. (1968) Bodmin Glinn. Res.
Muñiz, J.J, Pottosin, 1.1. y Sandoval L. (1995) Journal of Bioenergetics and
Biomembranes 27/2,249-258.
Neher, E. y Sakmann, B. (1992) Scietzjic Ameritan 26613 28-35.
Pottosin, 1.1. (1992). FEBS Lett. 308, 87-90.
Pottosin, 1.1. (1993). FEBS Lett. 330,2 1 l-2 14.
Pottosin, 1.1. y Schönknecht, G. (1996) J. Membrane Biol. 152,223-233.
Renger, G., y Schulze, A. (1985). Photochem. Photobiophys. 9,79-87.
100
RemiS, D., Bulychev, A.A., y Kurella, G.A. (1981). J. Exp. Bot. 32, 979-987.
RemiS, D., Bulychev, A.A., y Kurella, G.A. (1986). Biochim. Biophys. Acta 852, 68-73.
Svintitskikh, V.A., Andrianov, V.K. y Bulychev, A.A. (1985) Journal of Experimenthal
Botany, 36/170 1414-l 429.
Schönknecht, G., Hedrich, R., Junge, W. y Raschke, K. (1988). Nature 336, 589-592.
Schönkecht, G. , (1990). Ionenströme in Thylakoiden Tesis Doctoral, Facultad de
Biología/Química de la Universidad de Osnabrück, Alemania
Schönkecht, G., Thaler, M., Simonis, W. (1992). Light-dependent H’ fluxes are
compensated by Cl- fluxes. En Research in Phtosynthesis (N. Mm-ata, ed.). Kluwer
Academic Publishers, Netherlands, Vol. III, pp. 777-780.
Schuurmans, J.J., Casey, R.P., y Kraayenhof, R. (1978). FEBS Lett. 94,405-409.
Staehelin, L.A. (1986). Chloroplast structure and supramolecular organization of
photosynthetic membranes. En Encyclopedia of Plant Physiology, v. 19 (L.A. Staehelin y
C.J. Arntzen, eds), Springer, Berlin-Heidelberg- NY-Tokyo, pp. l-84.
Tester, M. y Blatt, M.R., (1989) Plant Physiology 91,249-252
Tikhonov, A.N., Khomutov, G.B. y Ruuge, E.K. (1984). Photobiophys. 8,26 l-269.
Thaler, M., Simonis, W., y Schönknecht, G. (1992). Plant Physiology 99, 103-l 10.
101
.
Schönknecht, G., Thaler, M., y Simonis (1992). Light Dependent H+ Fluxes are
Compensated by Cl- Fluxes. En N. Mm-ata (ed.) Research in Photosynthesys, Vol. II,
777-780.
Trissl, H.-W., Gao, Y., y Wulf, K. (1992), Biophys. J 64,974-988.
Van Kooten, O., Snel, J.F.H., y Vredenberg, W.J. (1986). Photosynth. Res. 9,21 l-227.
Vredenberg, W.J. (1976). En The Intact Chloroplast (J. Barber, ed.), Elsevier,
Amsterdam-NY-Oxford, pp. 53-88.
Vredenberg, Wim, Bulychev Alexander, Dassen, Hans, Jan Snel y Voorthusen, Tijmen
van (1995) Biochimica et Biophysica Acta 1230,77-80.
Walker, David, Energy, Plants and Man, Editorial Oxigraphics, 1979, segunda edición,
1992.
Wang, Xue-Chen; Berkowitz, Gerald A.; Peters, Jeanne S. (1993). Proc. Natl. Atad Sci.
USA 90,4981-4985.
Weis, E., Ball, J.T., y Berry, J. (1987) en Progress in Photosynthesis research, Ed.
Biggins, J. pp. II. ll .553-B. 11.556.
Witt, H.T. (1979). Biochim. Biophys. Acta 505, 355-427.
Journal of Bioenergetics and Biomembranes, Vol. 27, No. 2, 1995
Patch-Clamp Study of Vascular Plant Chloroplasts:Ion Channels and Photocurrents
J. Jesus Muñiz,’ Igor 1. Pottosin,2 and Leandro Sandoval’
Received March 23, 1994; accepied December 12, 1994
This article presents direct measurements of large-conductance cation channel (G = 730 pS in100/50mM KCl; PK+/Pcl- = 2.8) and light-induced current (photocurrent) in chloroplastsfrom C4 plants, Amaranthus hybridus and Zea muys, using the conventional patch-clamptechnique. It was shown that preillumination of chloroplast gave rise to a fast decayingtransient (7 z 6ms) in the light-induced current for the second and following light pulses.This transient increase of photocurrent was interpreted as a consequence of photoreducingof the redox pool between photosystems.
KEY WORDS: Chloroplast; patch-clamp; ion channel; light-induced current; Amaranfhus hybridus, Zeamays.
INTRODUCTION
Light-driven electron transfer in photosyntheticmembrane causes active H’-pumping into the thyla-koid lumen. The pH gradient built up across thethylakoid membrane is used by vectorial proton-translocating ATPase for ATP synthesis, whilestroma alkalinization is necessary for the activationof key enzymes in the COZ fixation cycle (Junge andJakson, 1982; Heldt et al., 1973; Baler and Latzko,1975).
The formation of electrochemical gradient forprotons across the thylakoid membrane in light hasbeen previously explored by a set of indirect methodsincluding measurements with pH- and potential-sen-sitive dyes (Auslander and Junge, 1974; Schuurmanset al., 1978) monitoring of electrochromic absorbancechanges of photosynthetic pigments at 5 15 nm (Jungeand Jakson, 1982) and measurements of delayedfluorescente intensity (Bulychev et al., 1985). Onlytwo plant species, Peperomia metallica and Antho-ceros sp., which have abnormally large chloroplasts,
’ Biomedical Research Center, University of Colima, Apdo. Postal199, 28000 Colima, Col., Mexico.
2 Laboratory of Membrane Biophysics, Institute of Cell Biophysics,
Russian Academy of Sciences, Pushchino 142292, Russia.
allowed direct recordings using microelectrode tech-niques (Bulychev et al., 1972; 1976, 1985; Vredenberg,1976; RemiS et al., 1986). Recently, Bulychev et al.(1992) showed the applicability of standard patch-clamp technique for measurements of light-inducedcurrent across the photosynthet ic membrane ofP. metallica. The advantage of the patch-clampmethod is the possibility to work with smallerobjects, say of a few micrometer in size. Accordingly,the patch-clamp technique has been successfullyapplied to study the ion channels in the intact envelopeof chloroplasts from Charophyte alga Nitellopsisobtusa (Pottosin, 1992, 1993), although the activity ofthe chloroplasts envelope channels was also investi-gated in different reconstituted systems (Flügge andBenze, 1984; Keller et al., 1988; Schwarz and Wagner,1992; Mi et al., 1994).
In this paper we describe the procedure of appli-cation of the patch-clamp technique to study the ionchannels in the envelope as well as the photocurrentsin the thylakoid membranes with intact chloroplastsfrom two C4 plants. We found a significant differenceof photocurrents in dark- and light-adapted prepara-tions. Its possible origin is discussed in relation tothe function of the photosynthetic electron transferchain.
2 4 90145-479X/95/0400-0249$07 SO/0 0 1995 Plenum Publishing Corporation
250 Muñiz, Pottosin, and Sandoval
MATERIALS AND METHODS (maximal light intensity measured at the sample posi-tion, E = 1388 W/m2; full-width at half-height of
Leaves were collected from the field-grown plants 1 ms) or long pulses of white light (E = 8.2 W/m2).early in the morning and kept at 4°C during the day o f T h e duration of continuous light stimulus (1-the experiment to avoid starch formation. Chloro- 1000 ms) was controlled by means of the exposureplasts were obtained mechanically as described in controller and the shutter of a Minolta XG-1 cam-Bulychev et al. (1972). Briefly, the pieces of the leaf era. Flash and light intensity could be decreased bywere placed in a solution containing (mM): KC 5 0Sorbitol, 250; EGTA, 0.5; and HEPES-KOH 5 (pH
a series of neutral dark filters (ND2 and ND4). Theresponse to the flash was 90% of maximum when the
= 7.2). Cuticle was gently removed using a sharp razor fl-=&.G~t~~Gf~y was reduced to 6.5% of maximal inten-I-J=&L. Then one t i s s u e was scraped so the leaf cells sity (S.E. = 1.3%, n = 3).were broken and chloroplasts were released in the Voltages given throughout are in reference to themedium. t h e preparation was filtered to remove ceI1 intrachloroplast side, and negative currents are thedebris, and an aliquot containing chloroplasts was movement of positive charges into the chloroplast.transferred into the experimental chamber filled with Records were filtered at 1 kHz, digitized and storedthe same solution. For the patch-clamp measure- in hard disc, and/or displayed and photographedments, intact unbroken chloroplasts of 10-15 µm from the oscilloscope screen. Analyses were carriedsize from Amaranthus hybridus and 6-8µm from out in part using p-Clamp 5.1 acquisition softwareZea mays were selected. Microscopic analysis of leaf and Plot50, as w e l l a s -- ~mfiiü2iíy.sectrons QbflVl&+&& t!nese were approximately twice Blebs (swollen thylakoids) were obtained by aas large as compared to the average size chloroplasts procedure si-m&% +c, l L’m; ene hescfibed in Schon-and were ~&&~~~&$- 1UY l=d~eh ‘m tne bundle sheath knecht et al. (1988). Chloroplasts isolated in a solu-cells. Microelectrode were made from soft or hard tion containing (mM) KCI, 20 Trizma, 10 Mgcl 5glass, hematocrit or 7052 AM-system, respectively (7.2pH), as described abobe, were oimotica;lyby two-step pulling. Soft glass electrodes requiredfurther intensive heat polishing to decrease the tip
shocked to rupture the envelope. After a while(- 15 min) blebs started to appear; measurement of
diameter. Patch pipettes were filled with a solution diameters began approximately 15min after the firstfiltered through 0.2pm filter and containing (mM). blebs appeared.KCl, 100; EGTA, 0.5; CaCl,; 1 5. and HEPES:KGH, 5 (PH = 7.2). After insertion ‘of the patch electrode into the solution, the electrode offsetPotential was corrected by electronic means via the
RESULTS
patch-clamp amplifier we were using, and tested bypatch disruption at the end of the experiment (drift
General Observations
less than f2mV). The successful recordings (n = 142) The tight seals usually were formed in two steps.were obtained with an electrode resistance of ll MR First, after the application of light suction the resis-aS an average. soft glass in most cases showed better tance increased up to 50-100 MR. Then it sponta-adhesion to the envelope membrane (82% of total neously increased further up to 0.5-10 Gh reachingsuccessful recordings). The standard patch-clamp the sustained level. However, in many cases ;he appli-technique in attached and inside-out modes was cation ofpositive holding potential (around 30 mV) orused for ion channel recording. Sequential disruption pulsed suction was helpful in improving the resistanceof envelope and thylakoid membranes gave access to at the second stage. The percentage of successfulthe thylakoid lumen, and it was possible to measure recordings of single-channel activity in the intactlight-induced current across the thylakoid membrane. envelopes of chloroplast obtained from 4-5 weeks oidThis recording configuration was considered similar Amaranthus plants was around 20%. No signincantto whole-cell recording. The amplifier was a home- changes in the channel activity were observed uponmade one designed according to F. J. Sigworth the patch excision, and the inside-out patches were“Electronic Design at the Patch Clamp” (in Single usually stable unless large (> 30mv) negative stepsChannel Recording, B. Sackmann and E. Neher, of potential were applied.eds., Plenum Press, New York, 1983). An example of single-channel recording at different
Photocurrents were induced by short flashes Potentials obtained with Amaranthus hybridus
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents 251
40 mV
0
0 m V
c
F--
30
20 mV
0 mV : -102
c IL-400
-20 0
Q
-L-
a - 2 0 m VVOLTAGE. m V
02 5 0 ms
F i g . 1 . Single-channel currents in the chloroplast envelope membrane. A and B: Recordsof ion channel activity in chloroplasts of Amaranthus hybridus and Zea mays, respectively.0 and C correspond to completely open and close states, respectively. Arrows indicate the
channel low-conductance states. C: Z/V plot for the open state of Amaranthus channel.Means obtained by averaging data collected from 10 samples, bars are S.E. Solid line islow-order polynomial fitted to the data. 100 mM KCl in patch pipette and 50 mM KCI in
the bath. Nernst potential for K’ was +17mV in these ion conditions. The reversa1potential was +7.8 mV, indicating a weak K+ over Cl- selectivity. The sign of the voltagedefined as positive corresponds to intrachloroplast side made more positive; the current
corresponds to the influx of cations into the chloroplast.
chloroplast is presented in Fig. 1A. Besides the fullyopen state, substates of smaller current amplitudewere detected. With long incubation, the occurrenceof the fully open state diminished irreversibly, while asubstate with a conductance of around 130 pS in lOO/50mM KCl was stable in time. Similar kinetic beha-vior (i.e., closure to substate) was observed when thepotential was stepped up to large positive values(> 40mV), with a slow (within seconds) recovery ofthe kinetics when the voltage was returned to lowervalues. Steps to negative potentials had a generallysmaller effect on channel’s kinetics, but the increaseof current noise (flickering) in the open state wasrecorded at these potentials (Fig. 1A).
The current-voltage (III’) relationships of thechannel in the open state were analyzed in lOO/50mM KCl gradient to access the channel selectivity(Fig. 1C). The reversa1 potential of the Z/ I/ curve, V,,was 7.8 f 1.4mV (n = lo), which implied slight
selectivity for K+ over Cll, PK+/Pclm = 2.8 as calcu-lated using the Goldmann-Hodgkin-Katz equation.Slight inward rectification of the Z/V curve was ob-served, which probably dealt with the larger cationflux from the side with higher salt concentration.Linear regression of the Z/V curve (not shown)gave a chord conductance of 730 f 40 pS for the fullyopen state in these ion conditions.
With maize chloroplasts we never obtained a sea1resistance > 100 MR. These chloroplasts generallyshowed much worse adhesion to the patch pipette,and we were unable, in most cases, to suck a sufti-cient envelope area inside the electrode to improvethe seal; at least the leak resistance and capacitanceartifact remained unchanged during the suction pulse.Finally, the apphcation of strong suction led to thebreakdown of the envelope and lysis of plastid. Inthree out of more than 100 attempts, however, wewere able to detect the single-channel activity with
252 Muñiz, Pottosin, and Sandoval
b
B
t
a l - - - - - -
t5oma
, I 2opA
b - - - -
t +iL
Fig. 2. Different types of photocurrent responses in chloroplasts. Holding poten-
tial is OmV, ionic composition of solutions as in Fig. 1. A: Different recordingconfigurations for the same chloroplast of Amarunfhus hybridus; (a) and (b) be-
fore, (c) and (d) after disruption of thylakoid membrane by short suction pulse;(a. c) and (b, d) are responses to short saturative flash and pulse of continuous light,respectively. B: Photocurrents in Zea muys chloroplast; (a) flash induced response,(b) response to continuous light. C: Complex kinetics of photocurrent in Amar-unthus: fast (F) and slow (S) components of the light transient, (U) upstroke of
current on the offset of illumination. Arrows indicate onset and offset of light.Light pulse duration was 0.5 s.
low-resistance seals (50-100 MR). An exaniple ofsuch a recording made at zero voltage is present inFig. 1B. The direction and magnitude of the single-channel current were close to that obtained withAmaranthus chloroplasts at 0 mV. Therefore, thesetwo channels probably have similar conductanceand selectivity, although we were unable to provethis as the ion currents in maize chloroplasts couldbe studied only in a narrow range of potentials closeto zero.
Forming of the initial 50-100 MR contact of thepatch pipette with the chloroplast envelop did notnecessarily give rise to a further increase of resis-tance. Instead, in many cases, the resistance sponta-
neously decreased to 20-50MR. This change wasaccompanied by the increase of capacitance artifact,which likely reflects the breakdown of envelope andaccess of pipette to the chloroplast interior. No photo-response was registered during this step. However,additional short suction usually produced a posi-tively directed response to the light (Fig. 2A, B).Then, a short and intense suction pulse was appliedwhich caused inversion of the photocurrent polarity.The magnitude of the photocurrents usually dimin-ished 2- to 3-fold in the first few minutes of record-ing, but responses of magnitude as in Fig. 2C and Fig.4A-E could be typically recorded for a longer time(up to 30-90min).
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents 253
Table 1. Kinetics of photocurrents
Parameter
Mean
S.E.Number o fexperiments
Continuous light
Peak current amplitude (PA)
Steady-stateDark adapted Preilluminated current (PA)
1 4 . 6 40.7 7.42.1 5 . 4 0.6
18 18 3 5
Light transient (ms)
7 fast 7 slow
5 . 5 1 1 0 . 90.7 9 . 5
18 3 5
Flashes
Amplitude Decay time
(PA) @sI
44.9 1 2 0 . 06 . 7 1 . 6 0
5 0 5 0
Chloroplasts from older plants (S- 10 weeks) gen-erally gave more stable photocurrents. However, withthese chloroplasts it was in some cases difficult toinvert the current; large voltage pulses (50-100mV)accompanied by strong suction were helpful in thiscase. Only a few recordings were obtained withmaize chloroplasts (example in Fig. 2B); theresponses were much smaller in magnitude as com-pared to the photocurrents measured in Amaranthus,and we were unable to invert the photocurrent byapplying large voltage and strong suction pulses.
Only inwardly directed photocurrents in Amar-anthus were used for further analysis. The reason fordoing so was that this recording configuration wasmore stable in time, while for positive currents thepolarity was usually spontaneously inverted in thefirst few minutes even without additional suctionpulse. The kinetics of photocurrent was complex: (1)partly resolved rapid rise, (2) biphasic decay in thelight to a steady-state level, and (3) further decay inthe dark. The latter was often accompanied by a smallupstroke of current better seen with a freshly preparedsample, with a slow decay (in a time scale of seconds)to the initial dark leve1 (Fig. 2C).
The kinetic parameters of the photocurrents aregiven in Table 1. Those parameters for light- and dark-adapted preparations are measured lo-50 min afterelectrode insertion into a thylakoid; for those prepara-tions for which the sample was kept in the dark over1 min or more, the amplitude of the fast component(7 r 6 ms) of the light transient, as estimated by fittingthe decay time course by a double exponential func-tion, did not exceed 25% of maximal (see next sec-tion). It was found that the amplitudes of the slowcomponent of the photocurrent (7 2 IOOms) as wellas the steady-state current decreased upon sampleaging (in severa1 10min intervals). The amplitude ofthe fast component also decreased, although thischange was relatively small. However, in addition,the increase of the nondadaptable fraction of the
fast transient (i.e., the fast component present bothin the l ight- and dark-adapted preparation) wasfound under these conditions.
The time course of flash-induced photoresponsecould in most cases be fitted by a monoexponentialfunction (see T in Table 1). The amplitudes and rvaried greatly from sample to sample (7-300pA andl-60ms, respectively). The amplitude of flash-induced response decreased during the flash series(flashes were given 2-3 s apart, not shown), and theamplitude of the response was partly restored whenthe sample was kept over a few minutes in the dark.However, at very long incubation times (severa1 lo-min intervals) an irreversible decrease of the ampli-tude of the flash-induced response and an accelera-tion of its decay kinetics (in some cases, severalfold)were observed. Hence, only the first flash in eachexperiment was taken into account, and the averageequivalent charge transferred per flash for ali experi-ments (n = 50) was calculated as
q = T x Ipeak = (3.84 f 0.57) x lo-l3 C
Effect of Pre-illumination on the Kinetices of Light-Induced Curren t Transien t
As shown in Table 1, the magnitude of the initialcurrent response to continuous light differs, on aver-age, by 64% in dark-adapted and preilluminatedchloroplasts . This occurred because in the dark-adapted preparation the amplitude of the fast compo-nent was usually small; the second pulse given 0.5- 1 .O sapart produced a large increase of the fast component
‘-06
200 ms
Fig. 3 . Effect of preillumination on the kinetics of photocurrent atOmV. Two 0.25-s light pulses are separated by 0.6-s dark interval.
Before the experiment sample was kept in the dark for severa1
minutes. The ionic composition of solutions is as in Fig. 1.
2 5 4 Muñiz, Pottosin, and Sandoval
3 0 6 0 9 0 1 2 0
D a r k o d a p t a t i o n t i m e ( s )
Fig. 4. Effect of dark adaptation on the amplitude of fast component of photocurrent transient. Theduration of dark interval preceding the pulse in sequence was (in seconds): (A) 62, (B) 8, (C) 22, (D) 26,and (E) 39. F: The amplitude of fast component expressed in percentage of control (test pulse given 0.5-
1 .O s apart preceding one) VS. dark interval duration. Dashed line is best fit to the data by monoexpo-nential fimction, r = 80s. Solid line is best fit for exponential power function, n = 35, r = los, andC = 25%. G: Summary of four individual experiments as the one in (F), lines as in (F). For monoexpo-nential function T = 39 s, and for power function n = 3.1, T = 16 s, and C = 20%. See text for explana-
tion of parameters. Other experimental conditions are as in Fig. 3.
amplitude (Fig. 3). In contrast, the amplitude of theslow component was smaller for the second pulse,while a complete restoration of the slow-component amplitude required severa1 seconds ofdark adaption. At the same time, the fast-componentamplitudes measured in 0.5 s and after a few secondsin the dark were usually the same. For longer adapta-tion times (10-30s) however, an abrupt decreaseof the fast-component amplitude was observed (Fig.4B-E). With 18 out of 25 samples the fast-componentamplitudes diminished to less than 25% of maximal orwere even completely abolished by keeping the samplein the dark for 30-60 s. The effect of dark adaptationon the fast component amplitude was studied in detailwith four samples (Fig. 4F-G). The time coursedshowed a sigmoid shape, i.e., no change of the
amplitude for the first lo-30 s, and an abrupt fa11 to alow sustained leve1 (O-20% of maximum) which re-mained unchanged up to 10min of dark adaptation.For very long incubation (> 1 hr) the fraction of“nonadaptable” fast transient increased irreversibly;thus, the experiment was stopped when it approacheda 30% level.
The pooled points from al1 experiments werebetter fitted by the exponential power function
f=c+(100-C)(1 -(l -&)“)
rather than by the monoexponential function. Here, Cis the fraction of the nonadaptable fast component, inpercent. The best fitted values of r and n were 16 s and3.1, respectively.
Because of variations in r with different samples,
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents
the transition region for the average curve is smeared.As a result, r was overestimated, while n was under-estimated, as compared to individual samples. As anexample, in Fig. 4F, the best fit was obtained withn=35andr= 10s.
The other objective of this study was to estimatethe duration of preillumination pulse necessary toproduce the maximum amplitude of the fast compo-nent. We found out that the short saturative flash wasnot sufficient in al1 cases, at least when the test pulse ofcontinuous light was given 200-1000 ms after theflash (n = 7). Strong white light of variable durationwas insufficient unless prepulses longer than 8 ms wereused. Thus, a time delay in the development of the fasttransient as a function of the preillumination periodwas observed (Fig. 5A). In two out of five experimentsthe transition region was analyzed more carefully (i.e.,all the time points in the interval where the amplitudeof fast transient changed from 10 to 90% were re-peated at least three times with each sample). Thisallowed an accurate fitting of the observed depen-dente by a model curve. In both cases the monoexpo-nential function gave poor fit to the points, while theexponential power function
f = lOO(1 - e-“7)”
provided good fit to the data with n = 7.8 (9.5) and7 = 12 (20)ms for the first and second samples,respectively. When the data of five individual experi-ments were pooled, an apparent increase of 7 (22 ms)and a decrease of n (1.6) were found, which is likely aresult of smearing of the transition region due to thevariation of 7 for different samples.
DISCUSSION
General Observations
The large-conductance cation channel describedin this paper closely resembles the 1-nS (in symmetri-cal 100mM KCI) cation channel found in N. obtusachloroplast envelop (Pottosin, 1992), with a minordifference in the K+/Cl- permeability ratio and aslightly smaller conductance (730 pS in lOO/ mMKCl), which is likely to be a consequence of lowersalt concentration. Both channels were mainly in thefully open state at negative (chloroplast inside) poten-tials, while at positive potentials they switched tolower conductance states. The plot of time-averageconductance as a function of membrane potential(Fig. 6) for N. obtusa and Amaranthus envelope
255
l A
0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 5 0 0 1 0 0 0
B
$ o.--r./.b1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
Duratíon o f l i g h t prepulse. ms
Fig. 5. Dependence of fast component amplitude on the prepulseduration. A three-pulse protocol was used: first pulse for darkadapted preparation was of variable duration, second and third of
250ms each. Dark interval between pulses in sequence was 0.5-1.0s. The amplitude of fast component measured for the secondpulse was taken relative to the one obtained for the third pulse (inpercent). A: Plot of single experiment; bars are S.E. for three values,solid line is best fit with exponential power function, n = 9.5 and
T = 20ms; dashed line is best fit with a monoexponential powerfunction, r = 80 ms. B: Summary of five experiments as the one in(A); S.E. are for means obtained in different experiments. Lines as in
(F). Parameter values for exponential power function and mono-exponential function are 7 = 22 ms, n = 1.6, and r = 33 ms, respec-tively. See text for explanation of parameters. Other experimental
conditions as in Fig. 3.
channels shows a similar pattern that implies thatthese channels might be an obligatory component ofthe chloroplast envelope studied in situ. This wouldfavor the influx of cations in chloroplast through thechannel.
Recent examination of detergent-solubilizedchloroplast envelopes reoconstituted into a planarlipid bilayer revealed voltage-independent cationchannels with a conductance of 120- 180 pS(Schwarz and Wagner, 1992; Mi et al, 1994). These
2 5 6
I / I / I I
- 0’ u O0
n O0
0’ I I- 6 0 - 4 0 -20 0 2 0 4 0 6 0 8 0
MEMBRANE POTENTIAL , mV
Fig. 6. Plot of time-averaged conductance for large cation chan-
nels in Nitellopsis obtusa and Amaranthus hybridus chloroplastenvelopes. The conductance was 1020~s (lOO/lOOmM KCI) forNitellopsis and 720 pS (1 lo/50 mM KCl) for Amaranthus channels,respectively. Each point represents the channel current averagedover lo-15 s of successful recording at given potential taken rela-
tive to maximal amplitude of single channel current at the samepotential. Filled and hollow symbols are for different samples. 0,n : Nitellopsis. 0, 0: Amaranthus.
properties are reminiscent of the behavior of the 130-pS substate of the large-cation channel recorded here,which was the most prominent upon preparationaging. A similar large-conductance multistate chan-nel (G = l-l.3 nS) in the inner membrane of mito-chondria was proposed to be formed by a numberof pores in the inner membrane and a large pore inthe outer one (Kinnally et al., 1992). This hypotheticalstructure implied a certain degree of flexibility, with avariety of conductance levels observed to be depen-dent on the integrity of a contact site. A similar modelmay serve as an attractive explanation for the changesof the conductance pattern in the chloroplast cationchannel both upon aging and upon reconstitution inartificial systems.
Our results confirmed the recent finding of Buly-chev et al. (1992) that the standard patch-clamp tech-nique could be applied to study light-induced currentsin photosynthetic membranes. The application of thistechnique for measurements of photocurrents may bevery general, with the possible exception of bundle-sheath chloroplasts in advanced C4 plants (Panicoidgrasses) which do not contain a well-developed thyla-koid system (Coombs and Greenwood, 1976; Staehelin,
Muñiz, Pottosin, and Sandoval
1986). Accordingly, in this study we obtained only afew recordings of photocurrents with chloroplasts ofZea mays, while with bundle-sheath chloroplasts of adicotyledon C4 plant Amaranthus possessing well-developed grana (Fisher and Evert , 1982) therecordings were made more readily and in a highlyreproducible manner.
To our knowledge, the chloroplasts of C4 plantshave been examined by means of electrophysiologicaltechniques only for the first time. Thus, it was inter-esting to find a qualitatively similar kinetics of photo-currents as compared with patch-clamp recordingsobtained by Bulychev et al. (1992) who used giantchloroplasts from the C3 plant Peperomia metallica.These authors compared the kinetics of photo-currents obtained with conventional microelectrodeand patch-clamp techniques as well as in current-and voltage-clamp modes, and found them to bevery similar. Their results suggested that the patch-pipette had a low-resistance access to a thylakoidlumen, and the electrogenic transfer across the thyla-koid membrane could be measured. We confirmedthis notion by verifying the sequence of steps thatfinally led to the registration of an inwardly directedphotocurrent in our preparation (Fig. 2). A positivelydirected photocurrent was considered to be recordedin the thylakoid-attached configuration, and a nega-tive one in the whole-thylakoid mode. As the currentamplitude in both modes should be proportional tothe membrane surface, the relatively large currentmeasured in the thylakoid-attached mode as com-pared to the current measured from the whole-thylakoid configuration (Fig. 2A: b and d) needs to beexplained. The thylakoid surface could be measuredby swelling thylakoids in hypotonic medium, whichresul ts in formation of large spherical vesicles(blebs). Our experiments with Amaranthus revealedblebs with an average diameter of 13.1 Pm (1L1.2,n = 55) or a membrane surface of around 540pm2.The fraction of membrane surface pulled into the pip-ette could be estimated only indirectly as intact thyla-koid membrane forms an intensively folded system. Thedistance between neighboring bilayers in the thylakoidstack is around 0.02pm while the average diameter ofthe stack is 0.5 Pm (Junge and Jakson, 1982). The thy-lakoids could be pulled as far as 10 Pm inside the patch-pipette, as it could be seen in the light microscope. Thus,the membrane area in the pipette could be at least100 pm2, providing a single string of stacks. Thisshould be an underestimate, however, while at a dis-tance of 10pm from the tip the pipette becomes
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents 257
II+ STROMAH+
LUMEN
Scheme 1
substantially wider and severa1 stacks could be placedin parallel.
Under voltage-clamp conditions any chargetranslocation across the membrane should be de-tected. The light-induced electrogenic reactions inthe photosynthetic membrane take place in trans-membranously located complexes of photosyntheticreaction centers of photosystems 1 and II (Junge andJakson, 1982). According to the simplified Z-schemeof photosynthesis (Witt, 1979; Junge and Jakson,1982), the light-induced electron transfer in the reac-tion center of PSI1 results in the release of H+ intothe thylakoid lumen and reduction of plastoquinonemolecule (PQ) which takes H+ from the outside anddelivers them in electroneutral form (PQH2) to theinner side of the membrane (Scheme 1). These pro-tons are released upon PQHZ reoxidation in bóf com-plex (a rate-limiting step), while electrons aretransferred to the reaction center of PSI, thus support-ing its electron transfer capacity.
By measurement of charge transfer across thethylakoid membrane induced by a short saturativeflash of light, one would obtain a direct estimate ofelectrogenesis in the reaction centers of PSI and IIduring a single turnover. The number of reactioncenters of PSI and PSI1 is 1200-1700 and 850-l 300per Pm’, respectively (Staehelin, 1986), which trans-forms to 1.2-1.7 x lo6 reaction centers for a 572.6-Pm2 thylakoid membrane surface. The charge trans-located at a single turnover should then be1.8-2.7 x lo-l3 C, which is close to the value of3.9 x lo-l3 C measured here.
Under continuous light the electron-transfer re-actions in PSI and II are coupled at the site of PQH2
reoxidation in b6f complex, which is a rate-limitingstep in the intersystem electron transfer. The rate ofthis reaction is slowed down upon accumulation ofH+ in the thylakoid lumen, with a typical value of15-20 ms at neutral pH and a linear decelerationwith a factor of approximately 2 per pH decrease byone unit (Junge and Jakson, 1982; Tikhonov et al.,1984; Van Kooten et al., 1986; Joliot et al., 1992).With the number of photosystems in the thylakoidmembrane given above, the transmembrane electrontransfer will result in a photocurrent in the range of9-18 pA. The value of 14.6 pA for the dark-adaptedpreparation obtained here (Table 1) fits these limits,while the smaller value of 7.6 pA measured at the endof the long light pulse could be a result of the “back-pressure” effect of protons accumulated in thethylakoid lumen at light. Upon microelectrode inser-tion the acidification of the thylakoid lumen shouldnot be as large as in intact thylakoids (by 3-4pHunits, Junge and Jakson, 1982). However, a decreaseof pH by up to 2pH units was measured also aftermicroelectrode impalement (Remi et al., 1986).
Effect of Preillumination on the Light-Induced CurrentKinetics
The most intriguing finding of this study was theeffect of preillumination on the photocurrent. Theamplitude of the photocurrent in preilluminatedchloroplasts transiently increased by a factor of 3(Table 1). Previous studies of electrogenesis by PSIand PSI1 separately and in series showed that thetransient and fast increase of photoresponse is deter-mined by PSI (Remid et al., 1981). This is a conse-quence of faster turnover of the PSI reaction center,providing the electron supply by the PSI donor pool(FeS Rieske protein, cytochrome f and plastocyanin,Scheme 1) is not limited (Junge and Jakson, 1982).However, this pool becomes empty after a few turn-overs because of the existense of the rate-limitingtransfer step before it, and the turnover rate of PSIat a steady state should be limited by PQH2 reoxida-tion. Thus, the transient component of the photo-current can be explained by answering the followingquestion: why is the fast transient of the photo-current observed only in preilluminated chloroplasts?Previous measurements of photoelectrogenesis inPeperomia chloroplasts under conditions where theelectron transfer between photosytems was shuntedby an externa1 electron acceptor showed the absenceof a fast transient in dark-adapted chloroplasts
258 Muñiz, Pottosin, and Sandoval
(RemiS et al., 1981). After preillumination of thechloroplast the fast transient reappeared, providingthe dark interval after preillumination was short.This was interpreted as patial photoreduction of PSIdonors. We think that the effect of preillumination onphotocurrent in Amaranthus chloroplasts has thesame origin. The plots in Figs. 4 and 5 show thatthe magnitude of the fast transient depends both onthe dark interval between pulses and on the durationof the light prepulse. The dependence on light pre-pulse duration correlates with the time course ofphotoreduction of the PQ pool under saturativelight (Joliot et al., 1992). The re-oxidation of thetotal intersystem redox pool was found to be apseudo-first order process with a characteristic timeof around 25s (Renger and Schulze, 1985). The de-pendence of the fast transient amplitude on the darkinterval was fitted by an exponential power functionwith a characteristic time of 16s, close to the abovevalue (Fig. 4). The reduction of PSI donors by PQH2is thermodynamically favorable and takes place bothin the light and in the dark. Therefore, the oxidationof PSI donors in the dark should be seen only aftercomplete re-oxidation of PHQ;?, which could explainthe observed delay in the time course presented in Fig.4. Because of the large variation of the parameter nfrom 3 to 35, no direct comparison with the size of thePQ pool could be made here. However, the value of 12equivalents per PSI1 reported by other authors (Joliotet al., 1992) is at least in this range.
Baler, D., and Latzko, E. (1975). Biochim. Biophys. Acta 396, 141-148.
Bulychev, A. A., Andrianov, V. K., Kurella, G. A., and Litvin, F. F.(1972). Nature (London) 236, 175-177.
Bulychev, A. A., Andrianov, V. K., Kurella, G. A., and Litvin, F. F.(1976). Biochim. Biophys. Acta 420, 336-351.
Bulychev, A. A., Niyazova, M. M., and Turovetsky, V. B. (1985).Biochim. Biophys. Acta 808, 186- 19 1.
Bulychev, A. A., Antonov, V. F., and Schevchenko, E. V. (1992).Biochim. Biophys. Acta 1099, 16-24.
Coombs, J., and Greenwood, A. D. (1976). In The Intact Chhwo-plast: Compartmentation of the Photosynthesis. Barber, J., ed.),Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. l-52.
Fisher, D. G., and Evert, R. F. (1982). Bot. Gaz. 143, 146-155.Fliigge, U. I., and Benz, R. (1984). FEBS Lett. 169,85-89.Heldt, H. W., Werdan, K., Milovancev, M., and Geller, G. (1973).
Biochim. Biophys. Acta 314, 224-241.Joliot, P., Lavergne, J., and Beal, D. (1992). Biochim. Biophys. Acta
1101, l-12.Junee. W.. and Jakson. B. (1982). In Photosvnthesis: Enerzv Con-
-versioi by Plants ‘and ‘Bactiria. Val. I:’ The Developient ofElectrochemical Potential Gradients across PhotosyntheticMembranes (Govindjee, ed.), Academic Press, New York, pp.589-646.
Keller, B. U., Hedrich, R., Vaz, W. L. C., and Criado, M. (1988).PJuegers Arch. 411, 94-100.
Kinnally, K. W., Antonenko, Yu, N., and Zorov, D. B. (1992).J. Bionerg. Biomember. 24, 99-100.
Mi, F., Peters, S. J., and Berkowitz, G. A. (1994). Plant Physiol. 105,955-964.
Pottosin, 1. 1. (1992). FEBS Lett. 308, 87-90.Pottosin, 1. 1. (1993). FEBS Lett. 330, 211-214.RemiS, D., Bulychev, A. A., and Kurella, G. A. (198 1). J. Exp. Bot.
32,979-981.RemiS, D., Bulychev, A. A., and Kurella, G. A. (1986). Biochim.
Biophys. Acta 852, 68-73.Renger, G., and Schulze, A. (1985). Photochem. Photobiophys. 9,
79-87.Schönknecht, G., Hedrich, R., Junge, W., and Raschke, K. (1988).
Nature (London) 336, 589-592.Schuurmans, J. J., Casey, R. P., and Kraayenhof, R. (1978). FEBS
Lett. 94, 405-409.
ACKNOWLEDGMENTS
We wish to thank Dr A. Bulychev (Moscow Uni-versity), Dr A. Mulkidjanian (University of Osna-brück), and Dr G. Schönknecht (University ofWürzburg) for stimulating discussions. I.I.P. waspartly s u p p o r t e d b y C O N A C Y T g r a n t N o .A128CCOE-930101 (CN-2).
Schwarz, M., and Wagner, R. (1992). In Book ofdbstracts “9th Int.Workshop on Plant Membrane Biology”Monterrey, California,July 19-24 1992, p. 159.
Staehelin, L. A. (1986). Chloroplast structure and supramolecularorganization of photosynthetic membranes. In Encylopedia ofPlant Physiology Vol. 19 (Staehelin, L. A., and Arntzen, C. J.,eds), Springer, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, pp. l-8 4 .
Tikhonov, A. N., Khomutov, G. B., and Ruuge, E. K. (1984).Photochem. Photobiophys. 8, 261-269.
Van Kooten, O., Snel, J. F. H., and Vredenberg, W. J. (1986).Photosynth. Res. 9, 21 l-227.
REFERENCESVredenberg, W. J. (1976). In the Intact Chloroplast (Barber, J., ed.),
Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 53-88.Witt, H. T. (1979). Biochim. Biophys. Acta 505, 355-427.
Auslander, W., and Junge, W. (1974). Biochim. Biophys. Acta 357,285-298.
